Quim. Nova, Vol. 25, No.

6B, 1096-1102, 2002

A
r
t
i
g
o
*e-mail: ladetec@iq.ufrj.br
ANLISE DE GLICOCORTICOSTERIDES POR CG-EM: UMA NOVA ABORDAGEM DE DERIVATIZAO
PARA O CONTROLE DE DOPAGEM NO ESPORTE
Henrique M. G. Pereira*, Marlice A. S. Marques, Jar N. Cardoso e Francisco R. Aquino Neto
Instituto de Qumica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Cidade Universitria, 21949-900 Rio de Janeiro RJ
Recebido em 30/10/01; aceito em 28/3/02
ANALISYS OF GLUCOCORTICOSTEROIDS BY GC-MS: A NEW APPROACH OF DERIVATIZATION STEP FOR DOPING
CONTROL IN SPORT. Glucocorticosteroids (CT) show a powerful anti-inflammatory effect. In view of this, they are extensively
used in sports medicine, but their misuse (systemic administration) can lead to severe injuries on athletes and has been restricted
by the IOC in recent years. For GC-MS analysis, a derivatization step is necessary in order to convert them to a stable form, thus
preventing thermal breakdown with the loss of the ketone side chain. Derivatization of CT is reviewed and a new approach of
silylation is presented for screening of CT in urine.
Keywords: glucocorticosteroids; GC-MS; doping control.
INTRODUO
Glicocorticosterides (CT) so esterides polifuncionais
secretados pela supra-renal que apresentam como funes principais
a homeostasia de eletrlitos como o on sdio (Na
+
) e potssio (K
+
),
a mediao no metabolismo de carboidratos, protenas e lipdios e,
principalmente, uma potente ao antiinflamatria
1
. Esta ampla gama
de efeitos gerada pela administrao de CT endgenos e sintticos
resulta em uma srie de aplicaes teraputicas que vo do trata-
mento da artrite at a teraputica de neoplasias malignas
1,2
. A Figura
1 esquematiza a biossntese dos esterides endgenos
1-3
.
A principal utilizao de CT em desacordo com a sua destinao
mdica est relacionada dopagem esportiva, tanto em humanos
como em animais (especialmente cavalos de corrida)
4,5
. A principal
razo para a utilizao de CT est relacionada sua ao
antiinflamatria e analgsica
6,7
. A utilizao de CT permite a partici-
pao de atletas (e animais) com leses articulares em provas espor-
tivas reprimindo provisoriamente a dor e a inflamao. Disto resul-
tam conseqncias gravssimas para o atleta, freqentemente
irreversveis.
Pelo exposto, o Comit Olmpico Internacional (COI) restringe
a utilizao sistmica de CT. Deste modo, administraes pelas vias
oral, retal, intravenosa e intramuscular ficam proibidas. Administra-
es intra-articulares e tpicas so permitidas, desde que previamente
declaradas por um mdico responsvel
8,9
.
Ao longo das ltimas duas dcadas, tcnicas analticas como a
cromatografia lquida com detector de ultravioleta (CLAEUV)
10,11
,
cromatografia lquida acoplada espectrometria de massas (CLAE
EM)
4,11-13
e cromatografia gasosa acoplada espectrometria de mas-
sas com ionizao negativa (CGEMIN)
5-7,14
e cromatografia gaso-
sa acoplada espectrometria de massas por ionizao positiva (CG-
EM)
15-27
tm sido empregadas na deteco de esterides polifun-
cionais.
A tcnica de CLAE-UV apresenta como maiores limitaes a
baixa sensibilidade e a baixa especificidade devido falta de infor-
mao estrutural sobre o analito de interesse. Tanto a CLAE-EM
como a CGEMIN tm merecido grande destaque por sua alta sen-
sibilidade. Entretanto, o emprego de tais tcnicas de triagem em la-
boratrios de controle de dopagem se torna crtico, uma vez que so
exigidos, entre outros requisitos, grande reprodutibilidade e
praticidade de manuseio devido ao elevado nmero de amostras.
Deste modo, a CG-EM tem sido a tcnica analtica mais utiliza-
da dentro do cotidiano de laboratrios de controle de dopagem na
anlise de CT e outros esterides.
Estruturalmente, CT apresentam grupos polares, hidroxilas ou
cetonas conjugadas, na posio 3 (anel A) e uma cadeia lateral
hidroxicetnica na posio 17 (anel D). Grupos cetona ou hidroxila
so tambm comuns na posio 11 (anel C), (Figuras 2a e 2b). Al-
guns CT sintticos apresentam substituies na posio 16, como a
dexamentasona (R = OH) e a triancinolona (R= CH
3
) (Figura 2c). O
metabolismo de CT envolve, normalmente, a hidroxilao da posi-
o 6, como no 6-hidroxicortisol e a reduo dos grupamentos
cetona presentes na posio 3, como no tetraidrocortisol e na
tetraidrocortisona).
Anlise de glicocorticosterides por CG
O emprego da tcnica de cromatografia gasosa (CG) na anlise
de CT preconiza a adoo de uma etapa de derivatizao na prepara-
o da amostra, uma vez que a ramificao hidroxicetnica na posi-
o 17 torna os analitos passveis de termodegradao
16
.
Os primeiros estudos de derivatizao de esterides datam do
incio da dcada de 1960
28
(os primeiros estudos de derivatizao
especificamente sobre CT foram gerados apenas em meados da d-
cada seguinte
16
). A presena de grupamentos hidroxila e cetona su-
geriram o emprego de derivados trimetilsilila, inicialmente atravs
de um mecanismo de catlise cida com trimetilbromosilano
17
. En-
tretanto, observou-se diferentes razes de reatividade de acordo com
o ambiente qumico dos grupos cetonas, com formao de
poliderivados e conseqente queda de rendimento.
Neste contexto, Fales e Luukainen
18
utilizaram a clssica reao
de formao de metoximas (MO derivados) para a proteo das
carbonilas de cetoesterides (Figura 3).
Os bons resultados observados conduziram Fales
18
a recomen-
dar o uso desses derivados na anlise estrutural de cetoesterides por
CG-EM. Porm, tal procedimento, como esperado, no protegia os
grupamentos OH presentes.
A presena de grupos hidroxila em conjunto com carbonilas
1097 Anlise de Glicocorticosterides por CG-EM Vol. 25, No. 6B
Figura 1. Biossntese e metabolismo dos esterides endgenos
2-3
Figura 2a. CT avaliados com anel A saturado
Figura 2b. CT avaliados com estrutura 3-ceto-4,5-eno
Figura 2c. CT avaliados com estrutura 1,2 / 4,5-dieno
Figura 3. Reao de formao de metoximas
18
1098 Quim. Nova Pereira et al.
cetnicas levaram Horning e colaboradores
28
a adotar uma reao
em duas etapas. A primeira envolvendo a reao dos CT com
hidrocloreto de metoxiamina. A segunda etapa consistindo da rea-
o da metoxima formada com N-N-bis-trimetilsililacetamida (BSA)
e trimetilclorossilano (TMCS) temperatura ambiente por at cinco
horas, gerando assim derivados metoximatrimetrilsilila (MOTMS).
A adoo de duas etapas de derivatizao apresentou como vanta-
gem a eliminao da formao de multiderivados atravs da prote-
o dos grupos cetonas e posterior silanizao dos grupos hidroxila.
Alm disso, o emprego dos derivados MOTMS mostrou-se conve-
niente devido sua estabilidade trmica. Entretanto, apesar da
derivatizao total dos grupos polares no carbono 3, ficou demons-
trada a possibilidade de formao de ismeros geomtricos sin e
anti da metoxima nessa posio, o que para anlise quantitativa
considerado uma desvantagem (Figura 4). No se observa
isomerizao na formao da metoxima na posio 20.
Em 1969, Chambaz e Horning
19
desenvolveram estudos siste-
mticos de silanizao com hidroxicetoesterides, atravs de rea-
es no catalisadas e catalisadas com o objetivo de avaliar os graus
de impedimento dos grupos hidroxilas, em relao sua posio na
molcula. Na avaliao da androsterona, a cetona em C17 foi previ-
amente protegida pela formao da metoxima, o que possibilitou a
formao de apenas um derivado (Figura 5).
Baillie e Brooks
16
avaliaram uma srie de derivados para CT
endgenos como o 11-desoxicortisol (Figura 6), comparando-os com
derivados MOTMS. Apesar da formao dos produtos propostos,
razes como baixos rendimentos e suscetibilidade hidrlise leva-
ram no aplicao de tais derivados na anlise de CT.
Uma nova abordagem foi introduzida por Chambaz e colabora-
dores
19
, quando da proposta de silanizao por diferentes reagentes
derivatizantes via catlise bsica, formando derivados TMSenol
TMS (Figura 7).
Os melhores resultados foram obtidos atravs do uso de piperidina
e acetato (de sdio ou potssio) como catalisador. Nessas condies,
observou-se a formao de uma srie de derivados de CT com total
silanizao da cadeia lateral em C17. Grupos hidroxila e cetona na
posio 11 no apresentaram reao. CT sintticos com dupla
insaturao no anel A (1,4-dieno) como a triancinolona e a
dexametasona no foram investigados. Alm disso, os autores discu-
tiram apenas os dados obtidos com acetato de sdio como catalisador.
A silanizao de CT tambm foi alvo da ateno de Simpson
20
atravs da avaliao de CT sintticos como a triancinolona,
betametasona e prednisolona em msculos de rato, utilizando uma
mistura de derivatizao contendo N-N-bis-trimetilsililacetamida
(BSA), N-trimetilsililimidazol (TSIM) e trimetilclorosilano (TMCS)
temperatura ambiente, durante toda a noite.
Observou-se a silanizao total dos grupos hidroxila e cetona,
inclusive em 1,4-dienoCT, ao contrrio do observado por Chambaz.
Alm de demonstrar a possibilidade de formao de um nico deri-
vado TMSenolTMS, sem proteo prvia das carbonilas cetnicas
atravs de metoximas, tal resultado sugere a ocorrncia de mecanis-
mos distintos de catlise cida (Simpson) e bsica (Chambaz).
Apesar do resultado de Simpson, derivados MOTMS foram
exaustivamente utilizados nas dcadas de 1970 e 1980. Segundo
Pfaffenberger e Horning, derivados MOTMS apresentavam os me-
lhores resultados em anlises quantitativas e qualitativas de
metablitos de esterides, uma vez que previnem a enolizao de
cetonas atravs da proteo pelo grupo metoxima. As principais van-
tagens destacadas so a estabilidade trmica, a volatilidade e a im-
possibilidade de desidratao com perda de simetria do pico
cromatogrfico. Porm, nada foi mencionado a respeito da forma-
o dos ismeros sin e anti.
Apesar da possibilidade de formao de ismeros geomtricos, de-
rivados MOTMS foram empregados por Leunissen e Thijsen
22
em
anlises quantitativas e avaliao do perfil urinrio de esterides, por
Rodchenkov e colaboradores na determinao de metilprednisonola
23
,
na elucidao do metabolismo de CT sintticos como a fluorometolona
24
,
betametasona
25
, dexametasona e triancinolona
26
(Figura 8), e na caracte-
rizao da prednisona, prednisolona, e metablitos
27
.
Entretanto, analitos com substituio na posio 16 apresentam a
posio 17 extremamente impedida, o que obriga a realizao de rea-
es por at 9 h
26
. Tal fato no chega a ser um inconveniente significati-
vo em estudos de elucidao de metabolismo de um frmaco. Entretan-
to, o excessivo tempo de reao impossibilita a utilizao de tal derivado
como estratgia de triagem no escopo do controle de dopagem. Apesar
do exposto, MOTMS derivados tm sido reportados na monitorao
de CT endgenos como nos trabalhos de Yap e colaboradores
29,30
.
Figura 7. Derivado TMSenolTMS do tetraidrocortisol relatado por
Chambaz
19
Figura 4. Cromatogramas dos ismeros geomtricos sin e anti na formao
de metoxima nas posies 3 na 6-metilprednisolona (m/z 617)
Figura 5. Derivatizao da androsterona em duas etapas. Formao da
metoxima na posio 17(A), seguida da silanizao na posio 3(B)
Figura 6. Derivados do 11-desoxicortisol. (A) 17,21-desidro, (B)
metilboronatos, (C) dimetilsilicondeos
1099 Anlise de Glicocorticosterides por CG-EM Vol. 25, No. 6B
A falta de um procedimento eficiente na derivatizao dos CT tem
levado pesquisadores da rea a evitar a CG na anlise de CT optando,
por exemplo, pela CLAEEMEM com a finalidade de evitar a etapa
de derivatizao. Porm, em um recente trabalho, Bailloux e colabo-
radores
31
propuseram a adoo de uma etapa de derivatizao antes da
anlise por CLAEEMEM, visando diminuir os limites de deteco
e reduzir alguns problemas inerentes anlise.
Por outro lado, outros esterides, principalmente aqueles com
atividade andrognica, tm sido extensivamente estudados por
Schnzer e Donike
32
. Somente aps um trabalho exaustivo de snte-
se do reagente de silanizao metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida
(MSTFA, Schnzer e Donike
32
) e da escolha do catalisador apropri-
ado (NH
4
I, trimetiliodosilano), tais esterides foram eficientemente
derivatizados. A enolizao total de carbonilas cetnicas na posio
3 foi ento explorada atravs do uso do catalisador trimetiliodossilano
(TMSI) na presena de MSTFA. Mais tarde, Opfermann e Schnzer
33
empregaram uma mistura de silanizao que envolve o uso de
MSTFA, iodeto de amnio, e eritriol. Posteriormente, o 2-mercap-
toetanol substituiu o eritriol por eliminar os problemas de polime-
rizao e conseqentes interferncias observadas na anlise. O me-
canismo de catlise cida est baseado na produo de cido ioddrico
in situ
34
. At o presente momento, tal mistura no foi avaliada para
anlise de CT.
Como a maioria dos estudos de derivatizao com CT foram
conduzidos empregando o reagente N,O-bis-trimetilsililtrifluo-
roacetamida (o MSTFA s foi sintetizado em 1969), e o iodeto usa-
do por Opfermann e Schnzer
33
na derivatizao de esterides
andrognicos induz uma via reacional por catlise cida, o objetivo
do presente trabalho foi avaliar o emprego desse procedimento na
derivatizao de CT. Para tal, comparou-se, para diversos CT
endgenos e sintticos, os resultados obtidos com a mistura MSTFA-
NH
4
I-2-mercaptoetanol (catlise cida), com os obtidos pelo mto-
do descrito por Chambaz (catlise bsica)
17
. Comparou-se ainda o
desempenho de derivados TMSenolTMS com os derivados da
metoxima, seguido de silanizao (duas etapas).
PARTE EXPERIMENTAL
Reagentes
Todos os padres de CT foram obtidos da Steraloids (NewPort,
EUA). N-metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida (MSTFA), N-
trimetilsililimidazol (TSIM), N,O-bis-trimetilsililtrifluoroacetamida
(BSTFA), iodeto de amnio, 2-mercaptoetanol, hidrocloreto de
metoxiamina e hidrocarbonetos padres para o clculo dos ndices
de reteno foram obtidos da Sigma (St. Louis, EUA). Piperidina foi
obtida da Aldrich (Milwaukee, EUA). Piridina foi obtida da Vetec
(Rio de Janeiro, BR). Acetato de sdio foi adquirido da Merck (Rio
de Janeiro, BR).
Condies de anlise no CG-EM
As anlises foram realizadas em um sistema cromatogrfico
Agilent 6890 Series, equipado com um injetor automtico 7683 com
controle eletrnico de presso e interfaciado com um detector de
massas Agilent 5973. Temperaturas de operao do detector: linha
de transferncia, 280
o
C; fonte inica, 230
o
C; interface, 280
o
C;
quadrupolo, 150
o
C. Deteco por monitoramento seletivo de ons
(SIM) com um tempo de varredura de 20 milisegundos. Ionizao
por impacto de eltrons a 75 eV. Condies de operao do
cromatgrafo: injetor, 280
o
C; coluna, 180
o
C (temperatura inicial,
0 min); seguido de um gradiente de 3,0
o
C/min at 229
o
C/min
(0 min) e 40
o
C/min at a temperatura final de 310
o
C (5,0 min);
fluxo total, 18,4 mL/min; presso, 16,0 psi; velocidade linear mdia,
38 cm/s; 1 L de amostra injetada com diviso de fluxo na razo de
1:10. Uma coluna capilar de slica fundida HP-1 (17,0 m x 0,2 mm x
0,11 m de espessura de filme) foi utilizada.
Condies de derivatizao
A formao dos derivados TMSenolTMS por catlise cida
foi avaliada utilizando soluo de MSTFANH
4
I2mercaptoetanol
(1000:2:6, v:m:v) a 60
o
C por 20 min. Os derivados MOTMS fo-
ram obtidos pela reao dos CT com uma soluo de metoxima
piridina (8 %) a 60
o
C por 30 min. A piridina foi removida sob fluxo
de N
2
e a silanizao foi conduzida com uma mistura MSTFATSIM
(2 %) a 70
o
C por 15 min. A formao dos derivados TMS-enol-
TMS por catlise bsica foi avaliada utilizando soluo de BSTFA-
piperidina (2:1) a 60
o
C por 30 min.
Clculo de ndice de Kovts
Os valores do ndice de Kovts foram calculados a partir da an-
lise de uma mistura de hidrocarbonetos lineares (n-alcanos entre C
8
C
36
), utilizando-se as mesmas condies de anlise de CG-EM
descritas acima, atravs da equao 1. Todos ao analitos eluiram
durante o gradiente de temperatura.
Equao 1: Clculo do ndice de Kovts. n o nmero de carbo-
nos do n-alcano com o tempo de reteno (t
Rz
) imediatamente anteri-
or ao padro, e t
Rz+1
o tempo de reteno do n-alcano localizado ime-
diatamente aps o padro avaliado
Clculo do fator de resposta
No clculo do fator de resposta dos derivados TMS-enolTMS e
MO-TMS o 9-fluoro-17-metil-4-androsteno-3,6,11,17-tetrol
(Fluoxy M
1
) foi utilizado como padro de referncia (Tabelas 1 e 2).
RESULTADOS E DISCUSSO
Formao de derivados TMS-enol-TMS via catlise bsica
A reproduo do experimento de Chambaz
19
, realizada pelo LAB
DOP utilizando piperidina como catalisador, mostrou que cetonas
Figura 8. Derivados MOTMS. (A) diMO-trisTMS-metilprednisolona, (B)
diMO-tetraTMS-triancinolona, (C) diMO-trisTMS-betametasona e (D)
diMO-diTMS-fluorometolona
1100 Quim. Nova Pereira et al.
Tabela 1. Resultados cromatogrficos, espectromtricos e fatores de resposta (FR) de derivados TMS-enol-TMS de CT
Glicocorticosterides Derivados ons Caractersticos m/z (int. rel. %) F.R. t
R
(min) I.K.
Tetraidrocortisona Tetrakis TMS (- 18) 634 (14) ; 619 (5); 529 (7) 0,62 18,13 3075,73
Tetraidrocortisol Tetrakis TMS (- 18) 636 (60); 546 (3); 282 (6) 4,01 18,33 3126,71
Prednisona Tetrakis TMS (- 18) 628 (91); 613 (4); 557 (6) 1,12 18,40 3152,82
11-Desoxicortisol Tris TMS (- 18) 544 (51); 529 (3); 272 (4) 4,49 18,43 3161,72
Desoxicorticosterona Tris TMS (- 18) 546 (50); 301(15); 230 (17) 4,18 18,48 3171,51
Cortisona Tetrakis TMS (- 18) 630 (9); 615 (22); 147 (15) 1,02 18,66 3219,83
Beclometasona Tetrakis TMS (- 18) 570 (35); 555 (4); 296 (15) 0,56 18,68 3233,80
Betametasona Tetrakis TMS (- 18) 662 (11); 456 (6); 206 (8) 1,91 18,77 3251,12
Dexametasona Tetrakis TMS (- 18) 662(11); 456(6); 206 (8) 2,25 18,77 3251,12
Prednisolona Tetrakis TMS (- 18) 630 (14); 615 (2); 191 (14) 0,70 18,90 3295,25
Corticosterona Tetrakis TMS (- 18) 634 (20); 283 (3); 230 (19) 3,55 18,95 3310,38
Cortisol Tetrakis TMS (- 18) 632 (100); 316 (5); 193 (4) 3,42 18,96 3313,52
Isoflupredona Tetrakis TMS (- 18) 648 (12); 442 (7); 206 (9) 0,20 18,99 3322,96
6-metilprednisolona Tetrakis TMS (- 18) 644 (7); 424 (6); 147 (10) 1,18 19,02 3332,39
Triancinolona Pentakis TMS (- 18) 738 (4); 736 (10); 147 (9) 0,13 19,18 3382,70
6-hidroxicortisol Pentakis TMS (- 18) 720 (31); 360 (7); 317 (4) 2,97 19,38 3418,98
Os ons em negrito foram utilizados no clculo dos fatores de resposta. O padro utilizado foi a fluoxi-M1 (t
R
= 6,77 min; m/z = 642). Clculo
do ndice de Kovts (I.K.) ver experimental.
Tabela 2. Resultados cromatogrficos, espectromtricos e fatores de resposta (FR) de derivados MOTMS de CT
Glicocorticosterides Derivados ons Caractersticos m/z (int. rel. %) F.R. t
R
(min) I.K.
Tetraidrocortisona MO Tris TMS 609 (23); 578 (100); 488 (64) 1,33 17,70 2665,85
Tetraidrocortisol MO Tetrakis TMS 653 (100); 562 (64); 472 (31) 0,89 17,98 2724,62
Desoxicorticosterona Bis MO - TMS 460 (93); 429 (100); 286 (61) 0,35 18,07 2748,97
11-Desoxicortisol
1
Bis MO Bis TMS 548 (17); 517 (100); 427 (18) 0,48 18,24 2792,05
11-Desoxicortisol
2
Bis MO Bis TMS 548 (16); 517 (100); 427 (22) 1,12 18,27 2800,00
Prednisona
1
Bis MO Bis TMS 560 (26); 529 (37); 309 (100) 0,06 18,56 2885,93
Prednisona
2
Bis MO Bis TMS 560 (20); 529 (31); 309 (100) 0,07 18,58 2893,11
Cortisona
1
Bis MO Bis TMS 562 (30); 531 (100); 441 (38) 0,15 18,60 2897,90
Cortisona
2
Bis MO Bis TMS 562 (31); 531 (100); 441 (38) 0,49 18,64 2910,03
Corticosterona
1
Bis MO Bis TMS 548 (100); 517 (89); 427 (52) 0,22 18,67 2920,06
Corticosterona
2
Bis MO Bis TMS 548 (100); 517 (89); 427 (49) -* 18,70 2927,59
Prednisolona Bis MO Tris TMS 634 (24); 603 (100); 262 (61) 0,35 18,83 2969,91
Cortisol
1
Bis MO Tris TMS 636 (19); 605 (100); 515 (36) 0,48 18,83 2969,91
6-metilprednisolone
1
Bis MO Tris TMS 648 (18); 617 (100); 276 (18) 0,20 18,84 2972,41
Cortisol
2
Bis MO Tris TMS 636 (19); 605 (100); 515 (30) 0,72 18,86 2979,94
6-hidroxicortisol
1
Bis MO Tetrakis TMS 725 (23); 694 (100); 603 (53) 0,08 18,88 2984,95
6-metilprednisolona
2
Bis MO Tris TMS 648 (13); 617 (100); 276 (91) 0,21 18,92 2997,49
6-hidroxicortisol
2
Bis MO Tetrakis TMS 725 (28); 694 (100); 603 (71) 0,19 18,98 3000,00
Isoflupredona Bis MO Tris TMS 652 (4); 621 (8); 350 (100) 0,79 19,04 3000,00
Os ons em negrito foram utilizados no clculo dos fatores de resposta. O padro utilizado foi a fluoxi-M1 (t
R
= 16,77 min; m/z = 642). Os
ndices 1 e 2 representam as formas isomricas anti/sin dos derivados MO TMS. Clculo do ndice de Kovts (I.K.) ver experimental.
* Integrado juntamente com o outro ismero.
na posio 3-ceto-4-eno (conjugadas) apresentam enolizao parci-
al, formando dois derivados (Figura 9). A formao de mltiplos
derivados um inconveniente analtico na deteco de CT endgenos
como o cortisol, cortisona e 11-desoxicortisol.
Como esperado 1,4-dienoCT no apresentam reao no anel A.
Neste estudo, observa-se a formao da dexametasonatrisTMS com
total silanizao do anel D, inclusive na posio 17, consideravel-
mente impedida pelo grupo metila na posio 16 (Figura 10). Com
relao aos catalisadores utilizados, o autor menciona as vantagens
da piperidina sobre os sais de acetato (mesma eficincia, porm mai-
or volatilidade e forma lquida). Foi observado, porm, que a
piperidina est sujeita a degradao pela exposio atmosfera, o
que preconiza a adoo de controles de derivatizao e cuidados na
manipulao, alm de purificaes peridicas, indesejveis no con-
texto de rotina.
Formao de derivados TMS-enol-TMS via catlise cida
O procedimento de formao de TMSenolTMS por catlise
cida com NH
4
I, apresenta maior praticidade se comparado ao uso
de metoxiamina, produzindo, com alto rendimento e em um tempo
de reao menor, apenas um derivado para cada CT avaliado (Tabela
1). Apesar do grupo hidroxila no carbono 17 no ser silanizado (a
perda de gua o processo mais significativo no espectro de massas,
1101 Anlise de Glicocorticosterides por CG-EM Vol. 25, No. 6B
Tabela 1 e Figura 11), os picos so simtricos e os resultados
reprodutveis.Nos CT sintticos e endgenos com grupos cetona no
anel A, observou-se enolizao total das carbonilas nas posies 3 e
20
35
. A enolizao do anel A em 3-ceto-4-eno conjugados (CT do
grupo 2), via catlise cida com MSTFA, iodeto de amnio, e 2-
mercaptoetanol, com formao do 3,5-dienol esquematizada na
Figura 12.
Parmetros como perfil cromatogrfico, fator de resposta e ndi-
ce de Kovts foram avaliados para vrios CT endgenos e sintticos
Figura 9. Resultados da anlise de CG-EM obtidos por varredura linear
dos derivados do 11-desoxicortisol formados pela reao com BSTFA
catalisada por piperidina. (a) Cromatograma do on m/z 562 do derivado
enol-Tris-TMS. (b) Cromatograma do on m/z 634 do derivado enol-Tetrakis-
TMS
quanto formao de derivados TMS-enol-TMS (Tabela 1). Os re-
sultados encontrados para os derivados MO-TMS so relatados com
o objetivo de servir como parmetro de comparao (Tabela 2).
Na anlise dos resultados do derivado MO-TMS para a
corticosterona, apesar da separao visual dos picos dos ismeros 3-
anti/sin, a rea referente aos derivados foi integrada como um nico
pico.
Para cada CT avaliado, os derivados TMS-enol-TMS apresenta-
ram um fator de resposta superior aos derivados MOTMS corres-
pondentes, excetuando-se para a tetraidrocortisona e a isoflupredona
(Tabelas 1 e 2). Nas condies cromatogrficas adotadas, a anlise
dos ndices de Kovts apresentou coeluio entre CT sintticos e
endgenos para alguns derivados MOTMS, como observado entre
a prednisolona e um dos ismeros geomtricos do cortisol (Figura
13), para o 6-hidroxicortisol (um metablito do cortisol) e a
isoflupredona. Tal fato pode se constituir em uma desvantagem con-
Figura 11. Cromatograma de ons totais e espectro de massas da
dexametasona-Tetrakis-TMS
Figura 10. Dexametasona enol-tris-TMS
Figura 13. Resultados da anlise de CG-EM por varredura linear. (A)
Cromatograma do ons m/z 603 da prednisona bis-MO-tris-TMS. (B)
Cromatograma do on m/z 605 do cortisol bis-MO-tris-TMS
Figura 12. Proposta de formao do 3,5-dienol em CT do grupo 2 por
catlise cida atravs da reao com MSTFA, NH
4
I e 2-mercaptoetanol
1102 Quim. Nova Pereira et al.
sidervel na deteco de CT sintticos, uma vez que se espera que os
CT endgenos sejam excretados em alta concentrao. Por outro lado,
dentre os derivados TMSenolTMS, apenas os epmeros
dexametasona e betametasona apresentam coeluio. Nenhuma
coeluio foi observada entre os derivados TMSenolTMS sintti-
cos e endgenos.
CONCLUSES
At o presente momento, no h na literatura um procedimento
eficiente para a derivatizao dos glicocorticides (CT). Embora a
formao de MO-TMS seja a estratgia mais freqentemente em-
pregada, tem-se observado a tendncia de substituir a CG por tcni-
cas como a CLAEEMEM com a finalidade de evitar a etapa de
derivatizao.
Os derivados TMSenolTMS obtidos atravs da silanizao via
catlise cida com NH
4
I, por outro lado, mostram comportamento
cromatogrfico nitidamente superior aos correspondentes derivados
metoxima trimetilsilila. Isto se deve, entre outros fatores, ao fato de
que a formao de derivados MOTMS em compostos que apresen-
tam impedimento estrico no anel D s possvel atravs de um longo
tempo e condies severas de reao. Portanto, tal procedimento tor-
na-se invivel no contexto de anlises de triagem. Em adio, para
derivados MOTMS, alguns CT exgenos mostram coeluio com
CT endgenos (excretados em altas quantidades), tornando difcil a
avaliao do perfil de endgenos e o diagnstico do abuso de CT
exgenos. Alm disto, o processo de derivatizao envolvendo a mis-
tura MSTFANH
4
2mercaptoetanol mostrou-se eficiente para todos
os CT considerados. Estudos posteriores sero realizados em urina
para avaliar a viabilidade deste procedimento na etapa de triagem de
CT em baixas concentraes no controle de dopagem.
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