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ndice:
Controle de qualidade ................................................................................ 1
Envio ........................................................................................................... 3
Oligonucleotdeos modificados .................................................................... 3
Oligonucleotdeos degenerados ................................................................... 3
MLPA ........................................................................................................... 4
siRNA ........................................................................................................... 5
Cuidados e tratamento de oligos siRNA ........................................................ 6
HPLC de purificao de fase reversa .............................................................. 8
Purificao page ........................................................................................... 8
Molecular Beacon ......................................................................................... 9
Sonda duplamente marcada ......................................................................... 12
Quenchers .................................................................................................... 14
Alexa Fluor Dyes .......................................................................................... 17
Atto Dyes ...................................................................................................... 17
Informaes tcnicas .. 18
Fluorforos ................................................................................................... 18
Frmulas em biologia Molecular ................................................................... 20





Controle de Qualidade
Um sistema de controle de qualidade rigoroso garante que voc pode esperar a qualidade dos
nossos oligonucleotideos a ser do mais alto padro. Antes da sntese, todos os produtos
qumicos so verificados para atender o nosso padro de qualidade. Durante a sntese de oligo
totalmente automtico, todas as etapas da sntese so monitoradas por vrias funes de
controle em nossos sintetizadores DNA. Desta forma podemos garantir a eficincia de
acoplamento da sntese para atender s nossas demandas.
Depois de sntese e desproteo do oligo, eles so verificados mais para garantir que esto
conformes o nosso padro de qualidade. Todos os oligos so rotineiramente analisados pela
densidade ptica de medio (OD). Alm disso, oligos so aleatoriamente analisados por
eletroforese em gel. Qualquer oligo que no consegue atender s nossas especificaes
ressintetizado. O resultado do nosso processo de QC (controle de qualidade) rigoroso para
obteno de oligonucleotdeo de alta qualidade.

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Todos os oligos so entregues com a nossa folha de especificaes dos produtos que inclui:
seqncia, o rendimento em nmol e gram, temperatura de fuso e MW.
Escalas de sntese e Rendimento

Ns oferecemos seis diferentes escalas de sntese: 10 nmol, 40 nmol, 50nmol, 100, nmol, 200
nmol e 1000 nmol. Para oligos no marcados, oligos padro, at 30 bases, ns garantimos um
rendimento mnimo:
Escala de 10 nmol: 4,5 nmoles.
Escala de 40 nmol: 20 nmoles
Escala de 50nmol: 25nmoles
Escala de 100nmol: 50 nmoles
Escala de 200 nmol: 95 nmoles
Escala de 1000 nmol: 400 nmoles
Alm disso, voc tem a capacidade de escolher entre dois tipos diferentes de protocolos de
sntese, depende da aplicao de comprimento, e as caractersticas do oligo.

Mtodo de sntese econmico

Este mtodo usa perodos relativamente longos para a couplingsteps diferentes. Este mtodo
especialmente til para a sntese de curta durao (<30 bases) oligonucleotides.
Mtodo de sntese de alta pureza

A qualidade dos oligos sintetizado com este mtodo ser ainda maior do que as sintetizadas
com o mtodo de Economia. Este mtodo especialmente recomendado para oligonucleotides
mais longos (> 30 bases) e modificados.
Comprimentos disponveis vs Escalas

As escalas diferentes tm restries quanto durao do oligo que podem ser sintetizados.
25 nmoles escala: at 40 bases

50 nmoles escala: at 70 bases

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200 nmoles escala: at 90 bases *

1000 nmoles escala: at 150 bases *

10.000 nmoles escala: at 150 bases*
(*Para oligo longo do que recomendado para alguns aplicativos para t-los purificados. Ver
seo de purificao)
Envio
Os oligos so enviados liofilizados, dessalinizados, desbloqueados, acondicionados em tubos
individuais ou em placas de 96 poos.
Oligonucleotdeos modificados
Incorporao de uma modificao em um oligonucleotdeo pode ser realizada de vrias maneiras
diferentes, utilizando os grupos ativos do nucleotdeos ou a criao de nucletidos. Modificaes
podem ser (direta) ou aps a sntese (indireta).
Incorporao direta de nucleotdeos modificados durante a sntese de DNA automatizados.
Usando este mtodo, bases modificadas podem ser incorporados internamente ou na extremidade
5 '. Anlogos da timidina (que substituem T-bases na seqncia) so freqentemente usados
como bases modificadas. Este mtodo site-specific, mas limitado pela disponibilidade de
phosphoramidites especializados. Modificao extremidade 3 'utilizando suporte slido especial.
Mais uma vez, este mtodo baseia-se na existncia de colunas modificadas CPG.
Modificaes usando grupos funcionais (atravs de um modificador de aminocidos, atravs da 3
'ou 5' grupos hidroxila, grupo fosfato ou thiollinker). Embora os rendimentos so frequentemente
baixas, a reao de grupos funcionais ligados bases com as molculas de corantes ativados
amplamente utilizado para oligos rtulo ou nas extremidades ou internamente.
Oligos degenerados
Oligos degenerados so misturas de duas ou mais bases diferentes em uma determinada posio
dentro da sequncia. Degeneraes so muitas vezes incorporadas com sondas de
oligonucleotdeos projetados para hibridar com um gene desconhecido que codifica uma
seqncia de aminocido conhecido. Uma vez que o cdigo gentico degenerado, a sonda
preparada com degeneraes nos locais a degenerar.
O uso de adies base mista no design de um oligo degenerado melhor se o nmero de
degenerados sites pequena. As oscilaes, exceto para aqueles que esto no site 3'-so
sintetizados sem custos extra.

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O cdigo de letras padro para especificar uma degenerao :
R = A/G Y = C/T
M = A/C K = G/T
S = C/G W = A/T
B = C/G/T D = A/G/T
H = A/C/T V = A/C/G
N = A/C/G/T I = Inosin

Multiplex ligation-dependent probe amplification
MLPA foi introduzido por MRC-Holland em janeiro de 2002 como uma nova e muito sensvel
tcnica, para a quantificao relativa de at 40 diferentes seqncias de cido nuclico em uma
nica reao, extremamente fcil de executar. Durante um perodo de teste no segundo
semestre de 2001, MLPA foi utilizado com sucesso por cientistas holandeses no Cancer Institute
de duas universidades de Amesterd para a deteco de delees no exon BRCA1 humano,
MSH2 e MLH1 genes em amostras de DNA de mais de 1000 pacientes com suspeita de cncer
de mama ou cncer de clon hereditrio. Entre vrias outras aplicaes, MLPA tem sido usada
com sucesso para testar a amplificao do gene humano ERBB2 (HER2neu) em mais de 100
amostras de DNA de cncer de mama e derivados para a quantificao relativa de 35 mRNAs
diferentes em 160 preparaes derivadas de sangue total RNA.
A tcnica MLPA foi primeiramente descrita por: JP Schouten, McElgunn, CJ, Waaijer, R.,
Zwijnenburg, D., Diepvens, F e Pals, G. (2002) cido Nucleico Research 30, E57.
Para mais informaes: www.mlpa.com

Modificaes
A GenOne Biotechnologies fornece uma longa lista de modificaes, e esta lista ainda est
crescendo. H muitas maneiras de funcionalizar uma cartilha, e eles podem ser colocados
em posies diferentes dentro do primer. Modificaes podem ser adicionadas durante o
procedimento de sntese de DNA: rotulagem direta, ou indireta por meio da adio de um
thiollinker ou amino.
Alexafluor dyes
Amino modifier
ATTO dyes
Biotin
LC replacement dyes
Licor dyes
Molecular beacons
NED / PET replacement dyes

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Twice dyed probes
Cy labeling
FAM
Fluorescein
FRET probes
HEX
Inosin
JOE
Phosphorylation
Phosphorothioates
ROX
TAMRA
TET
Texas Red
Thiol modifier
Yakima Yellow

Sntese de RNA
A sntese em fase slida de fragmentos de RNA agora uma tcnica difundida em Biologia
Molecular. Oligonucleotideos RNA esto se tornando cada vez mais importante nos estudos
estruturais em que eles podem ser usados como sondas em Northern blotting ou por
hibridizao in situ. Na regulamentao, oligonucleotides RNA tm sido usados em um modo de
antisense. O papel do RNA cataltico (ribozimas e mais importante siRNA) como suposto
antisense teraputico tem suscitado um interesse considervel no RNA sinttico.
Embora no geral semelhante sntese de DNA do grupo 2'-OH adicionais reativas de RNA
apresenta uma complexidade considervel sntese e requer um grupo adicional de proteo.
O uso do grupo de TBDMS 2'-OH se tornou amplamente aceito como o melhor compromisso
para a sntese de RNA de oligonucleotdeos com at 80 bases de comprimento.
siRNA
Sntese de Oligonucleotdeos RNAi
RNA de interferncia (RNAi) um fenmeno em que a introduo de double-stranded RNA
(dsRNA) em uma gama diversificada de organismos e tipos celulares causa a degradao do
mRNA complementar. Descoberto em 1998, tornou-se claro agora que a interferncia de RNA
representa o grande avano tecnolgico em Biologia Molecular desde a descoberta do PCR e,
portanto, chamado de "a nova grande descoberta na biotecnologia"
Para knockdown bem sucedida de seu gene de interesse, a GenOne fornece-lhe uma
ferramenta poderosa. SiRNA GenOne sintetizado com produtos qumicos de alta qualidade. A
sntese realizada sob condies severas de controle. Funes de controle interno visam medir
a eficincia de acoplamento das bases e garantir que os oligos siRNA serem do mais alto padro
de qualidade, como voc pode esperar de todos os produtos da GenOne.
Todos os siRNAs contm 19 RNA + 2 DNA extremidades bases. Qualquer mistura de bases de
DNA e RNA possvel, no entanto por salincias dTdT padro so adicionados s extremidades

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3 '. Isso normalmente apresenta uma sntese mais confivel do que UU, bem como ajuda a
proteger o RNA da degradao. Por excesso de RNA, entre em contato conosco. Desproteo
otimizada e dessalinizao so procedimentos tratados para preservar a qualidade de seu
produto. A fim de assegurar a mxima estabilidade, todos siRNAs so fornecidos liofilizado em
tubos individuais.
siRNA padro desbloqueado, dessalinizado e pronto para uso. Alm disso, a purificao PAGE
est disponvel mediante solicitao para gerar um grau de pureza> 97%.
Cuidados e Tratamento de oligos siRNA
Instrues Gerais de Manuseio
Oligos RNA so suscetveis degradao por ribonucleases exgena introduzida durante o
manuseio. RNase reagentes e insumos deve ser usados.
Ressuspenso de Oligos single-stranded RNA
Oligonucleotdeos podem ser re-suspensos em uma concentrao conveniente em RNase gua
estril, o uso de gua tratada com DEPC-no recomendado. Armazenar a -20 C.
Oligos RNA so estveis durante 1 ano a -20 C. Uma vez re-suspenso, as solues so os
melhores oligonucleotides mantidas congeladas a -20 C por vrias semanas e pode
permanecer estvel por vrios meses. O fator mais importante no armazenamento de solues
de trabalho est usando gua livre de nuclease, estril. Secagem para baixo de seu oligos e
mant-los a -20 C recomendada para armazenamento de longo prazo.
Anelamento de RNA
Combine o sentido e oligonucleotdeos antisense RNA, gua e RNA 5X Annealing Buffer em
frasco estril. A concentrao final deve ser de 20 - 100um para cada oligo em 1X tampo de
anelamento para 1 min a 90C, seguido de incubao por 1 hora a 37 C. Uma vez anelado, a
dupla fita de RNA mais resistente nuclease e pronto para transfeco. Ele deve ser
armazenado a -20 C.
1 x tampo de anelamento:

Acetato de potssio 100mM
HEPES-KOH 30mm,
pH 7,4
2mM Acetato de Magnsio
Armazenar a -20 C



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Sntese em placa:

Para aplicaes que utilizam oligonucleotides em grande escala, GenOne Biotechnologies
oferece a possibilidade para a entrega de oligonucleotides em placas de 96 poos. A
GenOne oferece diferentes tipos de formatos de 96 poos, por exemplo:

Deepwell Plate

PCR Plate
Escalas personalizadas esto disponveis. Entre em contato com a GenOne para mais
informaes.

Purificaes:

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Embora a alta eficincia da sntese de Oligos de nossa empresa (um rendimento tpico por
sntese de 99%). Isto pode levar a produtos de alongamento truncado, o mais longo deles (n-
1) mer. A proporo relativa de aumentos de material indesejado aumenta com o comprimento
do oligo. Para algumas aplicaes ser desejvel enriquecer o produto final.
GenOne Biotechnologies oferece trs opes para purificar seu oligo: HPLC e purificao PAGE
e por fase reversa de purificao em cartucho (OPC). Que tipo de purificao escolhido
depende em grande medida as suas exigncias relativas pureza e rendimento do produto
final. Voc deve considerar que os resultados de purificao em menos rendimento do produto
final, e purificao PAGE, embora resultando em< um maior grau de pureza, geralmente d
rendimentos inferiores a purificao HPLC. O tipo de purificao que escolhido depende
tambm do comprimento de um oligo; oligos com um comprimento de mais de 50 bases so
purificados com PAGE para garantir a pureza do produto final.
Fase reversa cartucho de purificao (OPC)
Purificao com cartucho de fase reversa oferece o menor nvel de pureza (tipicamente 80%). O
nvel de pureza para RP1 quase equivalente ao proporcionado por HPLC e a recuperao
muitas vezes superior. A base da separao a diferena de hidrofobicidade entre o produto e
o comprimento total (que contm um 5'-DMT) e seqncias truncada (sem grupos DMT).
Porque as diferenas em hydophobicity entre o produto e a durao DMT integral e as
seqncias no-DMT truncadas so reduzidos como o comprimento do oligo, a purificao do
cartucho no recomendada para oligos> 50 bases.
HPLC de purificao de fase reversa
HPLC em fase reversa opera no mesmo princpio que os cartuchos de fase reversa, mas os
rendimentos tpicos de um produto de pureza de 90%. A capacidade de resolver e as
propriedades de colunas HPLC tambm so muito maiores do que os dispositivos de cartucho,
para HPLC o mtodo de escolha para a purificao de quantidades maiores de oligos (ie> = 1
mmol). Tal como acontece com os cartuchos, em fase reversa HPLC geralmente no
recomendado para purificar oligos com mais de 50 bases.
Purificao PAGE
Com a excelente resoluo de PAGE, uma pureza 95-99% pode ser alcanada. A base da
separao de carga e peso molecular. Na maioria dos casos, o comprimento total (n) oligo
pode ser separado da oligos apenas uma base menor (n-1). PAGE a tcnica recomendada para
purificar oligos> 50 bases de comprimento. Rendimentos do PAGE so mais baixos do que de
outros mtodos devido extrao relativa ineficiente de oligos em gel.


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Oligos Longos:
Novos mtodos e aplicaes aumentaram a demanda por oligonucleotideos com comprimentos
mais longos do que nunca. O sucesso de aplicaes como o MLPA e cadeado (abaixo) depende
em grande parte a pureza do tempo de oligo. Protocolos de sntese baratos com menor uso de
reagente muitas vezes no conseguem sintetizar oligonucleotdeos mais com o mnimo possvel
de subprodutos nx.
Por esta razo, ns desenvolvemos mtodos de sntese especiais para a fabricao de oligos at
300 bases de comprimento.
Recomendamos fortemente que qualquer oligonucleotdeo mais de 40-50 bases devem ser
purificados por eletroforese em gel de acrilamida poli (PAGE) para separar o material de longa-
metragem a partir das seqncias falhas mais curtas (excluses base aleatrio).
No entanto, para obter melhores resultados, recomendamos que os pesquisadores ainda
desenhem suas seqncias para ser o mais curto possvel.
Sondas cadeado so oligonucleotideos longos, cujas extremidades so complementares a
seqncias-alvo adjacentes. Aps a hibridizao para o alvo, as duas pontas entram em contato,
permitindo circularizao sondas Cadeado pela ligadura. Sondas cadeado proporcionam o
reconhecimento alvo extremamente especfico, que seguido pela amplificao universal e
deteco de microarray. Como o reconhecimento alvo separado do processamento downstream,
sondas cadeado permitem o desenvolvimento de flexvel e extensvel para sistemas de
diagnstico, visando diversos organismos.

Molecular Beacon
Para ensaios de molecular beacon funcionarem corretamente, estes devem ser de alta
qualidade.
Na GenOne Biotechnologies estudamos mtodos diferentes para fazer molecular beacons.
Esses estudos resultaram na produo de sinais de alta qualidade molecular. A pureza de cada
preparao em molecular beacons verificada e apenas uma frao a mais pura sero
selecionados para o seu produto final.
O Molecular Beacon vendidos por ns ter uma relao sinal-background-mnimo de pelo
menos 25 para 1 quando testado contra a seqncia alvo complementar.
Viso global:

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Em 1996 Tyagi e Kramer descreveram hairpin em forma de sondas de cidos nuclicos de
deteco, chamado "molecular beacons", que passam por uma transio conformacional
quando eles ligam-se ao destino que lhes permite e apresentam forte fluorescncia (1).
A poro loop de um molecular beacon uma seqncia da sonda que complementar a uma
seqncia alvo pr-determinado e o caule formado pelo anelamento de seqncias de brao
complementares que esto presentes em ambos os lados da seqncia de sonda. Um
fluorforo covalentemente ligado extremidade de um brao e um supressor no
fluorescente covalentemente ligado extremidade do outro brao. Na ausncia de alvo, o
tronco mantm o fluorforo e supressor na proximidade de cada fluorescncia, impedindo
outras. No entanto, quando o molecular beacon ligam-se ao destino que eles sofrem uma
mudana conformacional que restaura a fluorescncia do fluorforo internamente saciada.

Figure 1. Interaction of a molecular beacon with its target.
Multicolor molecular beacons para ensaios multiplex.
A estrutura hairpin de um molecular beacon permite o uso de uma ampla variedade de
diferentes fluorforos coloridos (Tyagi et al., 1998). Na conformao hairpin, o fluorforo e
supressor so to prximos uns dos outros, que a transferncia direta de energia possvel.
Portanto, o quencher, o DABCYL cromforo no-fluorescente, pode saciar qualquer fluorforo
(Fig.2). Esta extino independente da sobreposio entre o espectro de emisso do
fluorforo com o espectro de absoro da quencher. A soluo de cada molecular beacons foi
colocado em um par de tubos de ensaio. As balizas moleculares contidas (esquerda para
direita) cumarina (azul), EDANS (azul-verde), fluorescena (verde), amarelo, tetrametilrodamina
(laranja), e Texas Red. Todos os molecular beacons contm DABCYL como supressor.
Complementares single-stranded oligonucleotdeos foram adicionados ao tubo esquerdo de
cada par, e os tubos foram iluminados com uma lmpada ultravioleta ampla de comprimento
de onda. (Tyagi et al., 1998).


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Figura 2. Resposta fluorognica de cores diferentes de molecular beacons
para a adio de alvo.
A especificidade extraordinria de Molecular Beacons.
A haste de hairpin de molecular beacons tambm aumenta a especificidade. Molecular Beacons
podem facilmente distinguir alvos que diferem em apenas um nico nucleotdeo, e eles so
significativamente mais especfica do que as convencionais sondas de comprimento
equivalente (Tyagi et al. 1998, Marras et al. 1999, Tapp et al., 2000). A especificidade maior
devido sua capacidade para formar uma estrutura tronco-e-lao. A especificidade das balizas
moleculares pode ser modulada, alterando o grau de restrio colocada em sua conformao
(Bonnet et al., 1999). Um exemplo de um ensaio multiplex no qual em um tubo de tipo
selvagem tanto o alelo mutante so analisadas mostrado na figura 3 (O princpio da
genotipagem espectral. (Kostrikis et al., 1998)).
Em resumo, a haste hairpin de um molecular beacon aumenta a especificidade, permitindo a
deteco precisa de um nico nucleotdeo de diferena. Alm disso, a haste hairpin traz o
fluorforo to perto do quencher que uma paleta inteira de fluorforos coloridas podem ser
usadas. Assim, misturas multicoloridas de molecular beacon pode ser formulado que
identificam intimamente relacionado variantes allicas de uma meta pela cor do sinal
fluorescente.

Molecular Beacons tm sido aplicados com sucesso em diferentes estudos de diagnstico
molecular (Giesendorf et al, 1998;. Kostrikis et al, 1998;.. Piatek et al, 1998), por exemplo, sinais
multicor foram usados para desenvolver um ensaio extremamente sensvel, para ensaios
clnicos que detecta simultaneamente quatro diferentes retrovrus (Vet et al., 1999). Alm
disso, beacons molecular tm sido usadas para detectar diretamente RNAs mensageiros
especficos em clulas vivas (Matsuo et al, 1998;. Sokol et al, 1998).
Fluorforos disponveis
Molecular Beacons so sintetizadas com um supressor na 3'-site e um fluorforo na regio 5'-
site. O quencher mais utilizados neste momento Dabcyl, no entanto, existem outras
quenchers disponveis, por favor, consulte-nos. Como um fluorforo voc pode escolher entre
diferentes corantes. Os mais usados so FAM, HEX, TET, TAMRA, Cy3 e Cy5. Se voc necessita

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de um outro tipo de corante, entre em contato para as possveis possibilidades. Para mais
informaes, consulte a seo quenchers, Black Hole Quencher.
Literatura relevante
Bonnet, G., Tyagi, S., Libchaber, A., Kramer, F.R. 1999. Thermodynamic basis of the enhanced specificity of
structured DNA probes. Proc Natl Acad Sci USA 96:6171-6176.
Giesendorf, B.A.J., Vet, J.A.M., Tyagi S., Mensink, E.J.M.G., Trijbels, F.J.M., Blom H.J. 1998. Molecular
beacons: a new approach for semi-automated mutation analysis. Clinical Chemistry 44:482-486
Kostrikis, L.G., Tyagi, S., Mhlangha, M.M., Ho, D.D., and Kramer F.R. 1998. Spectral Genotyping of human
alleles. Science 279:1228-1229
Leone, G., van Schijndel, H., van Gemen, B., Kramer, F.R., and Schoen C.D. 1998 Molecular beacon probes
combined with amplification by NASBA enable homogenous, real-time detection of RNA. Nucl Acid Res
26:2150-2155.
Marras, S.A.E., Kramer, F.R., Tyagi, S. 1999. Multiplex detection of single-nucleotide variation using
molecular beacons. Genetic Analysis 14:151-156.
Matsuo, T. 1998. In situ visualization of messenger RNA for basic fibroblast growth factor in living cells.
Biochim Biophys Acta 1379: 178-184.
Piatek, A., Tyagi, S., Pol, A.C., Telenti, A., Miller, L.P., Kramer, F.R., and Alland, D. 1998. Molecular beacon
sequence analysis for detecting drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Nature Biotechnology
16:359-363.
Sokol, D.L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A.M. 1998. Real time detection of DNA.RNA hybridization in living
cells. Proc Natl Acad Sci U S A 95:11538-11543.
Tyagi, S., and Kramer, F.R. 1996. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nature
Biotechnology 14:303-308.
Tyagi, S., Bratu, D.P., and Kramer, F.R. 1998. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nature
Biotechnology 16: 49-53.
Vet J.A., Majithia A.R., Marras S.A., Tyagi S., Dube S., Poiesz B.J.,Kramer F.R. 1999. Multiplex detection of
four pathogenic retroviruses using molecular beacons. Proc Natl Acad Sci USA 96:6394-6399.
Tpp, I., Malmberg, L., Rennel, E., Wik, M., Syvnen. 2000. Homogenous scoring of single-nucleotide
polymorphisms: comparison of the 5-nuclease TaqMan assay and molecular beacon probes. Biotechniques
28: 732-738.
Sonda Duplamente Marcada
Sondas duplamente marcadas so sondas fluorognicas que consistem de um oligonucleotdeo
com um corante reprter-5'e um corante 3'-quencher. Quando esta sonda est intacta, a
proximidade do corante ao reprter quencher perto o suficiente, de modo que o quencher
suprime a fluorescncia do corante reprter.
Durante a PCR, quando a sequencia alvo de interesse est presente, esta anelado entre as
localizaes dos primers para a frente e o reverso. Agora, o 5'-3 'atividade nuclease do DNA
polimerase cliva a sonda duplamente marcada. (Veja figura 1) Isso s vai acontecer quando a
sonda hibridiza para o alvo, a DNA polimerase no se apega as sondas livres. A clivagem dos
resultados da sonda duplamente marcada tem um aumento da fluorescncia do corante
reprter. O sinal de fluorescncia gerado somente se a seqncia alvo da sonda amplificado
pela PCR. Nenhum sinal ser gerado devido amplificao inespecfica.

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Fig. 1-3: Representao gradual do cleaving do fluorforo do Probe Twice Pintado.
O quencher mais utilizados nesses testes TAMRA. Com a sua absoro mxima de ~ 555 nm,
eficiente sacia apenas um nmero limitado de, por exemplo corantes FAM, JOE, TET e HEX.
A GenOne oferece agora uma nova linha de quenchers: o QuenchersTM Black Hole. BHQsTM
oferecem muitas vantagens sobre TAMRA para uma variedade de razes. BHQsTM quenchers
so escuras e no tm fluorescncia nativa enquanto TAMRA fortemente fluorescente e
contribui significativamente para a fluorescncia de fundo. A famlia de BHQsTM tm espectros
de absoro que cobrem o espectro visvel. Isto significa que qualquer fluorforo pode ser
combinado com um BHQTM para sobreposio espectral e FRET tmpera pode ser maximizada.
Quenchers
Dabcyl Labeling
Dabcyl, devido s suas propriedades de absoro de luz e falta de fluorescncia residual, tem
sido mais comumente usado como um supressor de sondas de diagnstico, como Molecular
Beacons 0,4 A Molecular Beacons essencialmente uma sonda de hibridao que consiste
em um fluorforo, um supressor e um definida seqncia de oligonucleotdeos
complementares s do cido nucleico alvo. No estado inativo, quando a sonda no hibridizada
a sua seqncia alvo, a energia de fluorescncia do fluorforo transferido para o quencher
por um processo de tmpera esttica. Para a transferncia de energia da luz para ocorrer de
forma eficiente, tanto fluorforo e supressor tem que estar em estreita proximidade. Esta
exigncia contabilizada no projeto de Molecular Beacons. Hibridizao da sonda Molecular
Beacons aos seus resultados em uma seqncia alvo quebra do Hbonds mantendo fluorforo e
supressor justapostas, permitindo-lhes separado, resultando em fluorescncia.
Dabcyl pode ser facilmente introduzido em vrias posies no final 5'-, no final 3'-, ou
internamente, substituindo qualquer resduo dT adequado com Dabcyl-dT. Dabcyl propriedades
de absoro limitar a gama de corantes pode saciar, que restrita aos emitindo em 400-550nm
(mximo de absoro, 471nm). No projeto de Molecular Beacons, o fluorforo e Dabcyl so
trazidos perto o suficiente para permitir que um espectro um pouco mais amplo de corantes
para ser extinto, aumentando assim a versatilidade da molcula Dabcyl.

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5-Dabcyl

Internal Dabcyl (5', internal)
TAMRA (Rhodamine) Labelling
As propriedades de absoro de luz de TAMRA e sobreposio espectral com vrios fluorforos
comumente usados - incluindo FAM, HEX, TET e JOE, torn-lo til como um supressor para a
concepo de sondas duplamente marcadas. A utilidade de TAMRA , no entanto, limitado por
causa de seu amplo espectro de emisso, o que reduz sua capacidade de multiplexao. Sua
fluorescncia intrnseca contribui para o sinal de fundo, reduzindo potencialmente a
sensibilidade dos ensaios com base em TAMRA. Apesar destas limitaes, TAMRA tem sido
amplamente utilizado no projeto da sonda baseada em ensaios.

TAMRA (3')

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Black Hole Quenchers (BHQs)
As demandas de pesquisa genmica moderna e diagnsticos, que so tipicamente centrado em
torno de uma necessidade crescente de maior sensibilidade do ensaio, levou ao
desenvolvimento de uma srie de novos quenchers. Alguns dos mais conhecidos deles so o
Quenchers Black Hole (BHQs) que foram especificamente otimizados para FRET baseado em
tmpera.
Devido sobreposio espectral ampla abrangidos por cada corante, a eficincia do
resfriamento aumentada, quando comparado com molculas como Dabcyl. Este, por sua vez
significa que BHQs como um conjunto de corantes fornecer acesso a uma gama muito maior de
comprimentos de onda para fins de relatrio, cobrindo visvel em regies prximas IR do
espectro (480-730nm). Acoplamento isso com o fato de que essas molculas no tm
fluorescncia de fundo residual (elas so verdadeiras quenchers escuro) significa que uma
maior escolha de corantes est disponvel para uso em multiplexing, levando a uma maior
variedade de formulaes de sondas.
BHQ-1
normalmente utilizado na faixa de 480-580nm e pode ser usado em conjunto com os
fluorforos comumente utilizados, por exemplo, FAM, TET, JOE, Yakima Yellow e HEX.

BHQ-2
usado para na faixa de 559-670nm, e mais eficaz em fluorforos quenching como TAMRA,
ROX, Cy3, Cy3.5, Cy5 e LC Red 640.

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Alexa Fluor Dyes
Alexa Fluor Dye Abs * Em * Extinction Coefficient
Alexafluor 350 346 442 19,000
Alexa Fluor 405 401 421 34,000
Alexa Fluor 430 433 541 16,000
Alexa Fluor 488 495 519 71,000
Alexa Fluor 514 517 542 80,000
Alexa Fluor 532 532 553 81,000
Alexa Fluor 546 556 573 104,000
Alexa Fluor 555 555 565 150,000
Alexa Fluor 568 578 603 91,300
Alexa Fluor 594 590 617 73,000
Alexa Fluor 610 612 628 138,000
Alexa Fluor 633 632 647 100,000
Alexa Fluor 647 650 665 239,000
Alexa Fluor 660 663 690 132,000
Alexa Fluor 680 679 702 184,000
Alexa Fluor 700 702 723 192,000
Alexa Fluor 750 749 775 240,000
Atto Dyes
ATTO-Dyes esto disponveis para a rotulagem em grupos amino e Thiol. Corantes reativos
ATTO cobrem a regio espectral de 350 nm no UV para 750 nm no NIR.
Os reagentes reativos mais usados so amina N-hydroxysuccinimidyl (NHS)-steres. NHS-
steres reagem prontamente com a amina modificados oligonucleotideos ou grupos amino,
formando uma ligao amida quimicamente estvel entre o corante e os oligo.
Para a rotulagem de grupos Thiol reativo a mais popular e os mais comumente reagentes
usados so Maleimidas. Maleimidas ATTO reagem com grupos Thiol para formar uma ligao
Thio-ter estvel.

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Fluorescent Dye Ex (nm) Em (nm)
ATTO 390 390 479
ATTO 425 436 484
ATTO 465 453 508
ATTO 488 501 523
ATTO 495 495 527
ATTO 520 516 538
ATTO 532 532 553
ATTO 550 554 576
ATTO 565 563 592
ATTO 590 594 624
ATTO 594 601 627
ATTO 610 615 634
ATTO 611X 611 681
ATTO 620 619 643
ATTO 633 629 657
ATTO 635 635 659
ATTO 637 635 659
ATTO 647 645 669
ATTO 647N 644 669
ATTO 655 663 684
ATTO 680 680 700
ATTO 700 700 719
ATTO 725 729 752
ATTO 740 740 764

Informaes tcnicas

Fluorforos
Fluorescent Dye Ex (nm) Em (nm)
Alexa Fluor 405 401 421
Alexa Fluor 430 433 541
ATTO 425 436 484
DABCYL 452 0
ATTO 465 453 508

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Cy2 489 506
Fluoresceine 491 515
FAM 494 518
Alexa Fluor 488 495 519
MAR 495 525
ATTO 495 495 527
ATTO 488 501 523
ATTO 488 501 523
500 XXL 505 555
ATTO 520 516 538
Alexa Fluor 514 517 542
JOE 520 548
TET 521 538
R6G 524 557
Rhodamine 524 557
JUP 525 550
YAKIMA YELLOW 531 549
ATTO 532 532 553
ATTO 532 532 553
Alexa Fluor 532 532 553
HEX 535 553
CAL Fluor Orange 560 537 558
CY 3 546 572
QUASAR 570 550 570
TAMRA 550 575
ATTO 550 554 576
NED alternative 554 576
Alexa Fluor 555 555 565
SAT 555 580
Alexa Fluor 546 556 573
ATTO 565 563 592
PET alternative 563 592
ROX 575 602
Alexa Fluor 568 578 603
Cy 3,5 581 596
TEXAS RED 587 609
CAL Fluor Red 610 590 610
Alexa Fluor 594 590 617
ATTO 590 594 624
ATTO 590 594 624
ATTO 594 601 627
ATTO 611X 611 681
Alexa Fluor 610 612 628

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ATTO 610 615 634
CAL Fluor Red 635 616 637
ATTO 620 619 643
ATTO 633 629 657
Alexa Fluor 633 632 647
ATTO 635 635 659
ATTO 637 635 659
CY 5 643 667
ATTO 647N 644 669
ATTO 647 644 669
QUASAR 670 644 670
ATTO 647 645 669
Alexa Fluor 647 650 665
Beckman Dye D4 650 670
ATTO 655 663 684
Alexa Fluor 660 663 690
Cy 5,5 678 704
Alexa Fluor 680 679 702
ATTO 680 680 700
IRD 700 685 705
ATTO 700 700 719
Alexa Fluor 700 702 723
ATTO 725 729 752
ATTO 740 740 764
Alexa Fluor 750 749 775
Beckman Dye D2 750 770
IRD 800 795 819
Frmulas em Biologia Molecular
Quantidade de DNA por amostra
A amostra medida em 260 nm e a absorbncia usada no clculo de concentrao.
g/ml = *Abs at 260 nm * Dilution factor+ / * oligo * Pathlength+
(valor do coeficiente de extino) calculado pelo software Beckman Quant Oligo e com base
na composio base do oligonucleotdeo.
Temperatura de anelamento
GenOne Biotechnologies utilize duas formas de calcular a temperature de anelamento (Tm) dos
oligos.

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Para oligos curtos (< 30 bases) o modelo mais prximo do vizinho utilizado.
Tm = H/[S + 1.987 * In (C/4)] - 273.15 + 16.6 * log[Salt Conc.]
For long oligos (> 30 bases) the following equation is used.
Tm = 81.5 C + 16.6 * log [Salt Conc.] -675/N + 0.41 [% GC]
Determinao de peso molecular (mw) por cada oligo.
MW = MWA *[nA] + MWC * [nC] + MWG *[nG] + MWT *[nT] + MWN* [nN] +18.02
MWA = 313.20
MWC = 289.20
MWG = 329.20
MWT = 304.20
MWN=308.95
Cdigo Gentico Padro

U C A G
U UUU Phe UCU Ser UAU Tyr UGU Cys U
UUC Phe UCC Ser UAC Tyr UGC Cys C
UUA Leu UCA Ser UAA Stop UGA Stop A
First
Position
UUG Leu UCG Ser UAG Stop UGG Trp G Third
Position

C CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg U
CUC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg C
CUA Leu CGA Pro CAA Gln CGA Arg A
CUG Leu CCG Pro CAG Gln CGG Arg G

A AUU Ile ACU Thr AAU Asn AGU Ser U
AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser C
AUA Ile ACA Thr AAA Lys AGA Arg A
AUG Met ACG Thr AAG Lys AGG Arg G

First
Position
G GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly U Third
Position
GUC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly C
GUA Val GCC Ala GAA Glu GGA Gly A
GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly G

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Abreviao para Aminocidos

Ala Alanine M Met Methionine
B Asx Asparagine /
aspartic acid
N Asn Aparagine
C Cys Cysteine P Pro Proline
D Asp Aspartic acid Q Gln Glutamine
E Glu Glutamic acid R Arg Arginine
F Phe Phenylalanine S Ser Serine
G Gly Glycine T Thr Threonine
H His Histidine V Val Valine
I Ile Isoleucine W Trp Tryptophan
K Lys Lysine Y Tyr Tyrosine
L Leu Leusine Z Glx Glutamine / glutamic
acid
IUB codes
Para oligos degenerados, por favor, certifique-se de utilizar os cdigos padro dado abaixo.
G Guanine S (Strong) C or G
A Adenine W (Weak) A or T
T Thumine B (not A) C or G or T
C Cytosine D (not C) G or A or T
R (puRine) A or G H (not G) A or C or T
Y (pYrimidine) C or T V (not T) A or C or G
M (aMino) A or C N (aNy) A or C or G or T
K (Keto) G or T X Label