2.- CROMATOGRAFA DE GASES.

En esta tcnica cromatogrfica, la muestra se inyecta y volatiliza en la cabeza de una

columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de un gas
inerte y a diferencia de la mayora de las tcnicas cromatogrficas la fase mvil no
interacciona con las molculas del analito; su nica misin es transportar el analito a travs
de la columna.
Existen dos tipos de cromatografa de gases:
Cromatografa Gas - Slido: La fase estacionaria es un slido de gran rea superficial sobre el que
se adsorbe el analito. Actualmente slo se aplica a la separacin de especies de bajo peso molecular
(CO2, O2, N2 e hidrocarburos). Los compuestos ms polares son retenidos en la fase estacionaria de
manera semipermanente.
Cromatografa Gas - Lquido: La fase estacionaria es un lquido no voltil inmovilizado sobre la
superficie de un soporte slido inerte. La velocidad de migracin de un analito est determinada por
su distribucin entre la fase lquida inmovilizada y la fase gaseosa. La temperatura, la volatilidad del
analito (Peb) y su solubilidad en la fase estacionaria son los factores que regulan su retencin.
En la cromatografa de gases (que uno de los objetos de estudio en este trabajo:
Cromatografa Gas - Lquido), se usa como fase estacionaria un compuesto orgnico
polimrico de baja volatilidad, estable trmicamente y con adecuadas caractersticas de
disolvente. Es preciso sealar que deben usarse fases estacionarias, similares
funcionalmente al compuesto a analizar.

Fig 1: Algunos ejemplos de fases estacionarias comunes en cromatografa gas - lquido.
2.1.- Componentes bsicos de un Cromatgrafo Gas - Lquido:
De forma muy esquemtica podemos resumirlos en:
Gas portador Sistema de Inyeccin de muestra Columna Detector Registrador
O tambin como indica esta imagen:
Fig 2: Esquema Cromatgrafo de gases.

Vamos a ver los componentes uno a uno:
GAS PORTADOR
El gas portador debe ser inerte y de alta pureza (He, Ar, N2, CO2, H2). Su eleccin vendr
determinada por el tipo de detector que se use. Este gas estar en la botella de gas
portador que son botellas con manureductores para poder controlar el caudal.
SISTEMA DE INYECCIN DE MUESTRAS.
Las muestras estn formadas por un disolvente, compuestos voltiles (analito) y
compuestos no voltiles (suciedad).
El mtodo ms comn de inyeccin de muestra implica el uso de una microjeringa que
inyecta la muestra lquida o gaseosa a travs de unseptum de goma de silicona en una
cmara de vaporizacin instantnea situada en la cabeza de la columna. Esta cmara
normalmente est a unos 50 C por encima del punto de ebullicin del componente menos
voltil de la muestra.
Al inyectar con microjeringas el sistema debe asegurar:
Que la muestra se vaporice en la cabeza de la columna sin distorsin del gas portador.
Que la muestra ocupe la mnima longitud posible de la columna.
Tambin se encuentra el inyector en columnas empaquetadas es una cmara de vidrio
o cuarzo denominada glass insert, colocada en un bloque termostatizado a 200 - 300 C.
El gas portador circula a travs del bloque, penetra caliente en el inyector por una parte
lateral y arrastra la muestra vaporizada al interior de la columna.
Otro tipo de inyector es el usado en columnas capilares donde la muestra vaporizada
debe ser mucho ms pequea. Se inyectan volmenes similares a los de las columnas
empaquetadas que, o bien dejan pasar slo una pequea fraccin de la muestra inyectada
a la cabeza de la columna (inyeccin Split), o bien reconcentra el analito gas en la cabeza
de la columna (inyeccin Splitness), o bien vaporizan los analitos una vez que lo ha hecho
el disolvente (inyeccin on - column).


Fig 3: Inyector en columnas empaquetadas. Fig 4: Inyector usado en columnas capilares
COLUMNAS
Las columnas cromatogrficas varan en longitud desde menos de 2 hasta 60 metros. Se
construyen de acero inoxidable, vidrio, slice fundida, o tefln. A fin de poder ser colocadas
en el interior del horno termostatizado, normalmente son configuradas como helicoides con
dimetros de 10 a 30 cm.
La temperatura de trabajo es una variable importante para realizar un trabajo preciso, por
ello son introducidas dentro de un horno termostatizado.
La temperatura ptima de la columna depende del punto de ebullicin de la muestra y del
grado de separacin requerido. Normalmente con una temperatura igual o ligeramente
superior al punto de ebullicin promedio de la muestra, se obtienen tiempos de elucin
razonables (2 a 30 minutos).
En cromatografa de gases se usan dos tipos generales de columnas, las empaquetadas y
las capilares.
En las columnas empaquetadas la fase estacionaria se impregna en un soporte slido
poroso. Este soporte slido debe mantener inmvil la fase lquida proporcionndole la
mxima superficie. Estos soportes slidos suelen ser tierra de Diatomeas que son
fuertemente adsortivas.
Las columnas Capilares son de slice fundida con una capa protectora exterior de
poliamida. Su longitud varia entre los 10 y 60 metros. Su dimetro interior oscila entre 0,1 -
0,32 mm. Su fase estacionaria recubre las paredes internas de la slice y permiten
conseguir mejores eficiencias que las empaquetadas aunque su uso es ms complicado.
Este tipo de columna requiere sistemas especiales de inyeccin de muestra y detectores
ms sensibles.
En ambas columnas, su fase estacionaria est unida qumicamente al soporte slido, lo
que las lleva a ser ms estables frente a la temperatura y prdida de fase estacionaria que
aquellas en las que la fase estacionaria est inmovilizada por adsorcin fsica.
DETECTORES
La funcin bsica de un detector es que debe producir respuestas muy rpidas a
pequeas concentraciones de soluto.
Las caractersticas ideales de un detector en cromatografa de gases son:
1. Adecuada sensibilidad. En general, las sensibilidades de los detectores actuales se
encuentran en el intervalo de 10-8 a 10-15 g de analito/s.
2. Una respuesta lineal para los analitos que se extienda a varios rdenes de magnitud.
3. Buena estabilidad y reproducibilidad
4. Un intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente
hasta al menos 400 C.
5. Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del caudal.
6. Alta fiabilidad y fcil manejo. Hasta el punto de estar a prueba de la impericia de
operadores inexpertos.
7. Respuesta semejante para todos los analitos, o por el contrario, una respuesta selectiva
y altamente predecible para una o ms clases de analitos.
8. No sea destructivo de la muestra.
Actualmente no existe el detector que rena todas esas caractersticas, y tampoco parece
probable que pueda llegar a disearse nunca.
Los detectores ms generalizados son:
Detector de conductividad trmica (TCD): Es totalmente universal y muy sencillo, aunque no es
muy sensible. Se emplea bsicamente en el anlisis de gases. Su baja sensibilidad impide usarlo con
columnas capilares. Los gases que salen de la columna entran en un compartimiento en el que se
encuentra un filamento caliente, cuya temperatura depende de la capacidad del gas que le rodea en
disipar calor, esto es, su conductividad trmica. En el momento en que se eluye de la columna un
compuesto con diferente conductividad trmica que el gas portador, la temperatura del filamento
vara, y por tanto su resistencia elctrica, lo que es registrado en forma de aumento o disminucin de
la corriente.
Detector de ionizacin a la llama (FID): Es como detector, el ms usado. Esto se debe porque es
prcticamente universal para los compuestos orgnicos, donde es bastante sensible y tiene un
comportamiento excelente. Los gases que efluyen de la columna son introducidos en una llama
formada por H2 y aire cuya conductividad elctrica est permanentemente registrada. En el
momento es que un compuesto de carbono se eluye de la columna, se quema y durante la reaccin de
combustin se generan electrones y otras especies cargadas que alteran la conductividad elctrica de
la llama.
Detector de captura de electrones (ECD): Este detector es selectivo para las molculas que
contienen tomos electronegativos, como perxidos o halgenos e insensible a compuestos como
aminas, alcoholes, o hidrocarburos. Por lo que se emplea en el anlisis de pesticidas halogenados. Se
trata de un detector tremendamente sensible y en algunos casos hasta inestable. El efluyente de la
columna se hace circular entre un pequeo ncleo de un metal radiactivo que emite electrones
(partculas ), y un electrodo cargado positivamente que los recibe.
En el momento en que de la columna eluye una especie de tomos electronegativos, capaces de
capturar a dichos electrones, se detecta una disminucin de la corriente del electrodo.
Detector Termoinico (TID): Se trata de un detector selectivo de los compuestos orgnicos que
contienen fsforo y nitrgeno. En comparacin con un FID, el TID es 500 veces ms selectivo para
los compuestos continentes de fsforo y 50 veces ms con los compuestos continentes de nitrgeno.
Un detector termoinico tiene una configuracin similar al detector de llama. El efluente de la
columna se mezcla con hidrgeno, pasa a travs de la llama y se quema. El gas caliente fluye
alrededor de una bola de silicato de rubidio calentada elctricamente, la cual se mantiene a unos 180
con respecto al colector. La bola caliente forma un plasma que alcanza una temperatura de 600 a 800
C. Esto provoca que se produzcan una gran cantidad de iones a partir de las molculas que
contienen fsforo o nitrgeno, lo que resulta en una gran corriente de iones, la cual se utiliza para la
determinacin de compuestos que contienen esos dos elementos.
Detector de Emisin Atmica (AED): Es el detector ms reciente y se encuentra a la venta. En este
detector el eluyente se introduce en un plasma de helio obtenido por microondas que se acopla a un
espectrofotmetro de emisin con series de diodos. El plasma es suficientemente energtico como
para atomizar todos los elementos de una muestra, excitarlos, y as obtener los espectros de emisin.
Estos espectros son recogidos en un espectrmetro.
2.2.- Aplicaciones de la Cromatografa de Gases.
La cromatografa de gases se puede aplicar a gases y cualquier compuesto que pueda ser
volatilizado o convertido en un derivado voltil.
Con carcter general se puede aplicar en los siguientes casos:
Para separa muestras analticas complejas.
En el anlisis cualitativo: Por ejemplo para determinar el criterio de pureza, la presencia o ausencia
de compuestos, el nmero de tomos de carbono en una serie homloga...
En el anlisis cuantitativo: para realizarlo se requiere es uso de patrones o estndares.
Centrndonos en el tema que nos compete que son los alimentos, podemos destacar las
siguientes aplicaciones o ejemplos:
Aminas aromticas heterocclicas (HAA) formadas durante la coccin de alimentos proteicos (carne
y pescados). Donde estos compuestos son mutagnicos potentes bien conocidos y algunos de ellos
son carcingenos. Se han formado en alimentos cocinados, y tambin se han detectado en las
muestras ambientales (aerotransportadas partculas, aire de interior, humo del cigarrillo...) y en las
muestras biolgicas (orina, plasma). Por lo tanto, el aislamiento y la medida de HAA son muy
importantes para el gravamen de riesgo para la salud humana.
Control de los procesos de destilado de aguardientes a escala industrial: Se identifica y cuantifica,
mediante cromatografa en fase gaseosa aquellos componentes que definen la calidad bsica de los
orujos y cuyo control exige la administracin: grado alcohlico, acidez total, acetato de etilo,
metanol, acetaldehido, acetal y alcoholes superiores.
Determinacin de enantiomeric de compuestos chiral en aceites de mesa ( aceites de oliva, avellana,
cacahuete y nuez) haciendo uso de HPLC inversa y CG.
Estudio de vinos monovarietales.
Caracterizacin de avellanas por su composicin en cidos grasos.
Identificacin d compuestos voltiles en granos de cacao.
Determinacin del perfil del cido graso, acidez y valor del perxido en la calidad del aceite de
oliva contra el almacenaje.
Determinacin cuali y cuantitativa de componentes voltiles en hierbas y especias.
Separacin de compuestos voltiles del queso.
Anlisis de compuestos terpnicos de la uva de la variedad albario.
Estudio de compuestos azufrados voltiles pesados es vinos tintos de la denominacin de origen
ribeira sacra.
***** Se adjuntan al final del trabajo los artculos que corresponden a cada aplicacin aqu
expuesta *****
3.- CROMATOGRAFA DE LQUIDOS.
En cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que circula a travs de una columna
en la que est contenida la fase estacionaria. La fase mvil no slo arrastra al analito, sino
que existen interacciones intensas entre el analito y la fase mvil.
La retencin cromatogrfica es funcin de:
La fase mvil.
La fase estacionaria.
El analito.
Todas las especies que pueden disolverse pueden separarse eligiendo la combinacin
adecuada de fase mvil y fase estacionaria.
La cromatografa lquida se clasifica segn el lecho cromatogrfico:
Cromatografa Lquida Clsica: La columna es de vidrio y se usa para mezclas complejas.
Cromatografa de alta resolucin o HPLC: La columna es de acero inoxidable. Va a ser objeto de
estudio en este trabajo.
La HPLC consta de una columna de acero inoxidable de 10 30 cm de longitud, y un
dimetro interno de 4 - 10 mm. Las partculas de la fase estacionara son de un tamao
aproximado a las 5 - 10 m.
Cabe destacar que separa con gran eficacia, identifica los compuestos separados por la
columna y adems lo cuantifica por su altura o rea de picos en el cromatograma.
3.1.- Componentes bsicos en un equipo de HPLC:
De forma esquemtica los componentes bsicos son:
Sistema de suministro, Inyector Columna Detector Registrador
Bombeo y conducciones
de la fase mvil
En esta figura pueden observarse con ms detalle:

Fig. 5: Esquema de un aparato de HPLC.
SISTEMA SUMINISTRO DE LA FASE MVIL:
Se trata de un reservorio o varios reservorios para los disolventes. Sirve para desgasificar
y eliminar partculas en suspensin de los disolventes que interfieren formando burbujas
en los sistemas de deteccin.
SISTEMA DE BOMBEO DE LA FASE MVIL:
Se usan bombas para impulsar a la fase mvil y deben cumplir los siguientes requisitos:
Deben vencer altas presiones.
Proporcionar caudales estables entre 0,1 y 10mL/min.
Deben estar libres de pulsaciones y tener volmenes muertos pequeos.
Deben estar construidas de materiales resistentes a la presin y a las agresiones qumicas.
Fcil manejo y mantenimiento.
Se utilizan tres tipos de bombas :
Bombas recprocas
Bombas de desplazamiento
Bombas neumticas.
INYECTORES:
Son los encargados de introducir la muestra en la cabeza de la columna de forma
reproducible y adecuada.
Hay dos tipos de inyectores
Septum: Inyecta la muestra mediante una jeringa. Se usa poco y no permite mucha presin.
Bucle de muestreo: Este dispositivo normalmente se encuentra integrado en el equipo
cromatogrfico y existen bucles intercambiables que permiten la eleccin de tamaos de muestra.
PRECOLUMNAS
Se colocan delante de la columna para eliminar la materia en suspensin y los
contaminantes de los disolventes. La composicin del relleno debe ser semejante al de la
columna. Aunque el tamao de partcula es mayor para minimizar la cada de presin. En
muchas ocasiones se usan para aumentar la vida de la columna.
COLUMNA:
Normalmente son de acero inoxidable de dimetro interno uniforme aunque en ocasiones
se encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes.
La mayora de las columnas de cromatografa de lquidos tienen una longitud entre 10 y 30
cm. Generalmente son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o ms
columnas. El dimetro interno de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaos
de las partculas de los rellenos ms comunes son 3, 5 y
10 m.
Los empaquetados ms comunes son de partculas de slice pero tambin se usa la
almina, polmeros porosos y resinas de intercambio inico.
La columna ms utilizada es la de 25 cm de longitud y 4,6 mm de dimetro interno,
empaquetada con partculas de 5 m. Estas columnas tienen
de 40.000 a 60.000 platos/metro.
Desde hace poco, se han empezado a fabricar columnas de alta resolucin ms rpidas,
las cuales tienen menores dimensiones que las anteriormente descritas. Estas columnas
pueden tener dimetros internos que oscilan entre 1 y 4,6 mm y se rellenan con partculas
de 3 o 5 m.A menudo su longitud es de 3 a 7,5 cm. Pueden
tener hasta 100.000 platos/metro y presentan la ventaja de la rapidez y del mnimo
consumo de disolvente caracterstica muy importante ya que los disolventes de alta pureza
que se requieren en cromatografa de lquidos son muy caros.
DETECTORES:
A diferencia de la cromatografa de gases, en HPLC no existen detectores tan
universalmente aplicables, ni tan fiables tampoco. En lo que si coinciden cromatografa de
gases y HPLC, son las cualidades enumeradas en los detectores de cromatografa de
gases.
En HPLC existen dos tipos bsicos de detectores:
Los basados en una propiedad de la disolucin: Que corresponden a una propiedad de la fase
mvil, como el ndice de refraccin, la constante dielctrica, la densidad...
Los basados en una propiedad del soluto: Es decir, responden a alguna de las propiedades del
soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, intensidad de difusin, que no son propias de la fase
mvil.
En la siguiente tabla se presentan los detectores ms comunes empleados en HPLC y
algunas de sus propiedades ms importantes:

Fig.5: Detectores ms comnmente usados en HPLC.
Paso a hacer una breve descripcin de algunos de ellos:
Detectores de Absorbancia: Miden la absorbancia de los efluyentes de una columna
cromatogrfica. Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, uno de los haces
pasa por la cubeta de flujo y el otro a travs de un filtro que reduce su intensidad. Para comparar las
intensidades de los dos haces se usan detectores fotoelctricos contrastados. En cualquier caso, el
cromatograma consiste en una representacin en funcin del tiempo del logaritmo del cociente de las
dos seales transducidas. Tambin se utilizan instrumentos de un solo haz, en cuyo caso, las medidas
de intensidad del disolvente se almacenan en la memoria de un ordenador y al final se recuperan
para el clculo de la absorbancia.
Detectores de Fluorescencia: La fluorescencia es detecta por medio de un detector fotoelctrico
colocado perpendicularmente respecto al haz de excitacin. Los detectores ms sencillos utilizan una
fuente de excitacin de mercurio, y uno o ms filtros para aislar la radiacin fluorescente.
Detectores de ndice de refraccin: Los detectores de ndice de refraccin tienen la ventaja de que
responden a casi todos los solutos. Es decir, son detectores universales anlogos a los detectores de
llama en cromatografa de gases. Se aade que son fiables, no dependen del caudal, son muy
sensibles a los cambios de temperatura, y se han de mantener a una temperatura constante. Por otra
parte, no son tan sensibles como la mayora de los otros detectores, y por lo general no se pueden
utilizar en la elucin con gradiente.
Detector de dispersin de luz: El efluyente de la columna pasa a un nebulizador donde se convierte
en una fina niebla gracias a un flujo de nitrgeno o aire. Estas finas gotitas pasan por un tubo de
conduccin a una determinada temperatura de forma que se evapora la fase mvil y se originan
partculas de analito. Estas partculas pasan a travs de un lser y por un fotodiodo de silicio se
detecta la radiacin dispersada perpendicularmente al flujo. Su principal ventaja es que resulta ser
ms sensible que el detector de ndice de refraccin.
Detectores Electroqumicos: Actualmente hay varios tipos de detectores electroqumicos, que se
basan en cuatro mtodos: amperometra, voltamperometra, coulombimetra, conductimetra.
Detectores por espectrometra de masas: Consiste en el acoplamiento de la cromatografa de
lquidos con la espectrometra de masas. De forma general se pueden obtener tanto cromatogramas a
tiempo real como reconstruidos por ordenador hasta los espectros de los picos eluidos.
4.- MTODOS CROMATOGRFICOS EN HPLC
Hay cinco mtodos cromatogrficos:
Cromatografa de Reparto:
o Cromatografa en fase normal.
o Cromatografa en fase reversa.
Cromatografa inica.
Cromatografa de Exclusin.
Cromatografa de adsorcin.
4.1.- Cromatografa de Reparto:
La cromatografa de reparto es hoy en da el mtodo ms utilizado. La cromatografa de
reparto se divide en fase normal, y fase reversa, cuyas principales diferencias radican
en las distintas polaridades de sus fases estacionarias y mviles.
4.1.1.- Cromatografa en fase reversa:
En la cromatografa de fase reversa su fase estacionaria en apolar, y la fase mvil polar.
Las fases estacionarias han sido obtenidas haciendo reaccionar qumicamente los centros
silanoles activos de la slice con un trialquilclorosilano.
La retencin se produce en esta especie de capa lquida depositada qumicamente como
consecuencia de la distinta solubilidad relativa entre la fase estacionaria ( apolar) y la fase
mvil (polar).
Los compuestos ms retenidos son los ms apolares. La retencin y selectividad se
controlan fundamentalmente con la composicin de la fase mvil. Para obtener una fase
mvil de fuerza de elucin ptima, se ensayan mezclas de metanol, acetonitrilo o
tetrahidrofurano en agua.

Fig 6: Las polaridades de los solutos son A> B > C
Actualmente, el 75% de los anlisis con HPLC se realizan en fase reversa. Permite un
anlisis directo de muestras acuosas y de compuestos solubles en agua o en disolventes
relativamente polares (metanol) y con peso molecular no superior a 2000 o 3000 ua.
Si se compara con la de adsorcin, su comportamiento cromatogrfico es excelente.
4.1.2.- Cromatografa en fase normal:
En esta cromatografa a diferencia de en fase reversa, la fase estacionaria es polar y la
mvil apolar. Las fases estacionarias se obtienen haciendo reaccionar qumicamente los
centros silanoles activos de la slice con un trialquilclorosilano.
La retencin tambin (como la de fase reversa) tiene lugar en esa especie de capa lquida
depositada qumicamente, como consecuencia de la distinta solubilidad relativa en la fase
estacionaria (polar) y la fase mvil (apolar). Donde el analito menos polar ser el primero
que se eluye y el ms polar el ltimo en eluir.

Fig.7: Polaridades de los solutos A > B > C
Se deduce que los analitos A, B, C tardan ms tiempo en eluirse si se usa una fase mvil
poco polar. Es decir, cuanto ms polar sea el analito, ms tardar en eluir.
4.1.3.- Aplicaciones de la Cromatografa de Reparto:
Como aplicaciones de la cromatografa de reparto en productos de alimentacin :
edulcarantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos en bebidas refrescantes,
colorantes, aminocidos, proteinas, carbohidratos, lpidos.
4.2.- Cromatografa inica:
La cromatografa inica se usa para separar y determinar especies inicas. La fase mvil
es un lquido acuoso y salino que contiene un disolvente orgnico como metanol o
acetonitrilo y un compuesto inico que aporta un contraion de carga opuesta al analito. La
elucin de los pares inicos se consigue mediante una disolucin acuosa de metanol u
otro disolvente orgnico soluble en agua. La fase estacionaria es una resina de
intercambio inico. Se trata de un material polimrico (Ej: poliestireno), que contiene
muchos grupos funcionales por molcula y prcticamente insoluble en agua.
Hay dos tipos de cromatografa inica, que se clasifican segn el mtodo empleado, para
evitar que la alta conductividad de la fase mvil interfiera en la medida de conductividad
del analito. Estos dos tipos son:
Con detector conductimtrico y supresin qumica: Se coloca una columna supresora del eluyente
inmediatamente despus de la columna analtica (de baja capacidad). Esta columna supresora es un
intercambiador inico de alta capacidad y de signo opuesto a la columna analtica, que convierte los
iones del eluyente en especies moleculares poco ionizadas y no retiene los iones del analito. La
columna supresora se debe regenerar peridicamente. Veamos las reacciones entre el eluyente y el
supresor:
La primera reaccin de la imagen se corresponde a cuando la columna analtica es
catinica.
La segunda reaccin de la imagen corresponde a cuando la columna analtica es aninica:

Fig. 9:Reacciones en cromatografa con detector conductimtrico y supresin qumica.
Con detector conductimtrico y supresin electrnica: Se utilizan fases mviles de conductividad
muy baja y diluidas. Su conductividad se corrige de forma electrnica. Comparada con la supresin
qumica, requiere un equipo ms sencillo, pero menos sensible.
4.2.1. Aplicaciones de la Cromatografa Inica:
Como aplicaciones de la cromatografa inica est el anlisis de drogas y sus metabolitos,
sueros, conservantes de alimentos, mezclas para vitaminas, azcares, y preparaciones
farmacuticas.
4.3.- Cromatografa de Exclusin por Tamaos:
Tambin conocida como cromatografa en geles permeables o de filtracin en geles. Es
una tcnica que se aplica particularmente a especies de alto peso molecular.
La fase estacionaria est compuesta de partculas de slice o polmeros en forma de gel,
que contienen una red de poros uniformes. La retencin est basada en el tamao de las
molculas. Si las molculas con ms grandes que los poros, no pueden penetrar en ellos
(slo pasan las partculas), y son las primeras que se eluyen. Si las molculas son ms
pequeas que los poros, penetran en ellos recorriendo caminos mucho ms largos, y
sern las ltimas en eluir. Si las molculas tienen un tamao intermedio, podrn penetrar
en los poros ms grandes (camino recorrido intermedio). Por tanto, el tiempo de residencia
medio en los poros, depende del tamao afectivo de las molculas de los analitos.
La retencin no se controla con la fase mvil, se controla eligiendo la fase estacionaria,
cuya eleccin vendr determinada por:
Si la separacin se realiza en fase acuosa (filtracin en gel), o en fase orgnica.
El rango de pesos moleculares (tamaos) que contienen la muestra que queremos analizar.
Cabe observar, que este tipo de separacin difiere de los dems que han sido
considerados, en que no implica una interaccin qumica o fsica entre los analitos y la fase
estacionaria. De hecho, se procura evitar este tipo de interacciones, dado que originan una
mala eficacia de la columna.
4.3.1.- Aplicaciones de la Cromatografa de exclusin de tamaos.
Como aplicacin referida a productos alimenticios en cromatografa por exclusin de
tamaos: separacin de cidos grasos, determinacin de glucosa fructosa y sacarosa en
zumos enlatados.
5.- COMPARACIN ENTRE CROMATOGRAFA DE GASES Y HPLC:
Como caractersticas de ambos mtodos:
Son eficientes, muy selectivos, ampliamente aplicables.
Slo se requiere una muestra pequea.
Pueden utilizarse sin destruir la muestra.
Se adapta fcilmente al anlisis cuantitativo.
Ventajas de la HPLC:
Puede acomodar muestras no voltiles e inestable trmicamente.
Es aplicable a iones inorgnicos.
Ventajas de la CG:
Se trata de un equipo sencillo y barato en comparacin con HPLC.
Es rpido.
Tiene resolucin en paralelo (columnas capilares).
Se conecta fcilmente con la espectroscopia de masas, (MS).
La CG, ofrece la ventaja de la velocidad y simplicidad del equipo, pero la HPLC es
aplicable a sustancias no voltiles y materiales trmicamente inestables.
Algunas diferencias instrumentales:
En HPLC no existen detectores tan aplicables universalmente, ni tan tampoco tan fiables como en
CG.
El detector en HPLC no es necesario que sea sensible en un intervalo tan grande de temperaturas.
El detector usado en HPLC debe tener un volumen interno mnimo a fin de reducir el
ensanchamiento de banda.
6.- APLICACIONES DE CG Y HPLC
En el desarrollo del trabajo, cuando han sido descritos de cada uno de los mtodos, tanto
CG como HPLC (en todas sus variantes), se han incluido sus aplicaciones
correspondientes. Algunas van a ser renombradas y otras, van a ser incluidas y descritas
en este apartado. Se han recogido artculos que son adjuntados en este apartado del
trabajo.
Aplicaciones en Cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC) : Como
aplicaciones de la cromatografa de reparto en productos de alimentacin : edulcorantes
artificiales, antioxidadntes, aflatoxinas, aditivos, colorantes, aminocidos, proteinas,
carbohidratos, lpidos.
Las aplicaciones de la cromatografa inica est el anlisis de drogas y sus metabolitos,
sueros, conservantes de alimentos, mezclas para vitaminas, azcares, y preparaciones
farmacuticas.
Respecto a las aplicaciones referidas a productos alimenticios en cromatografa por
exclusin de tamaos: separacin de cidos grasos, determinacin de glucosa fructosa y
sacarosa en zumos enlatados.
Aplicaciones de La cromatografa de Gases. Se pueden destacar las siguientes
aplicaciones o ejemplos.
Aminas aromticas heterocclicas (HAA) formadas durante la coccin de alimentos proteicos (carne
y pescados). Donde estos compuestos son mutagnicos potentes bien conocidos y algunos de ellos
son carcingenos. Se han formado en alimentos cocinados, y tambin se han detectado en las
muestras ambientales (aerotransportadas partculas, aire de interior, humo del cigarrillo...) y en las
muestras biolgicas (orina, plasma). Por lo tanto, el aislamiento y la medida de HAA son muy
importantes para el gravamen de riesgo para la salud humana.
Control de los procesos de destilado de aguardientes a escala industrial: Se identifica y cuantifica,
mediante cromatografa en fase gaseosa aquellos componentes que definen la calidad bsica de los
orujos y cuyo control exige la administracin: grado alcohlico, acidez total, acetato de etilo,
metanol, acetaldehido, acetal y alcoholes superiores.
Determinacin de enantiomeric de compuestos chiral en aceites de mesa ( aceites de oliva, avellana,
cacahuete y nuez) haciendo uso de HPLC inversa y CG.
Estudio de vinos monovarietales.
Caracterizacin de avellanas por su composicin en cidos grasos.
Identificacin d compuestos voltiles en granos de cacao.
Determinacin del perfil del cido graso, acidez y valor del perxido en la calidad del aceite de
oliva contra el almacenaje.
Determinacin cuali y cuantitativa de componentes voltiles en hierbas y especias.
Separacin de compuestos voltiles del queso.
Anlisis de compuestos terpnicos de la uva de la variedad albario.
Estudio de compuestos azufrados voltiles pesados es vinos tintos de la denominacin de origen
ribeira sacra.
***** A continuacin adjunto los artculos encontrados de las aplicaciones en alimentos de
CG y HPLC *****
7.- GLOSARIO.
CONTRAIN: (Termino usado en HPLC, cromatografa inica), Un contrain es un in que
se combina con el in analito para formar una pareja de iones, que es una especie neutra
que es retenida por el relleno de la fase inversa.
CROMATOGRAMA: Es una grfica de alguna funcin de concentracin de soluto contra el
tiempo o el volumen de elucin.
EFECTIVIDAD O SELECTIVIDAD DE UNA COLUMNA CROMATOGRFICA: Se dice
que una columna es efectiva cuando las especies a separar se eluyen a velocidades
relativas suficientemente diferentes (los picos estn suficientemente separados).
EFICACIA DE UNA COLUMNA CROMATOGRFICA: Se dice que una columna es tanto
ms eficaz cuanto menos sea el ensanchamiento de los picos. La eficacia ser mayor
cuanto ms pequea sea la altura de plato y mayor sea el nmero de platos.
ELUCIN: Es un proceso en el cual los solutos son lavados a travs de una fase
estacionaria por el movimiento de una fase mvil.
ELUYENTE: Se trata de un disolvente que se usa para llevar los componentes de una
mezcla a travs de una fase estacionaria.
RESOLUCIN DE UNA COLUMNA: Parmetro que proporciona una medida cuantitativa
de su capacidad para separar dos solutos. Debe ser mayor a 1,5 para que se considere
buena.
TIEMPO DE RETENCIN:( TR ) Es el tiempo entre la inyeccin de una muestra y la
aparicin de un pico de soluto en el detector de una columna cromatogrfica.
TIEMPO MUERTO: ( TM ) Es el tiempo que tarda en salir de la columna una sustancia no
retenida.