En estas pginas dedicadas a las tcnicas histolgicas vamos a describir los procesos

experimentales necesarios para obtener secciones teidas y listas para observar al microscopio
partiendo de tejidos vivos extrados de un animal o de una planta. Por tanto, dedicaremos espacios a
laobtencin, fijacin, inclusin, corte y tincin de los tejidos. Todos estos apartados seguirn el
mismo esquema que los captulos dedicados a los tejidos o a la clula, partir de un esquema bsico
y ampliar la informacin sucesivamente en pginas adicionales. No dedicaremos demasiado espacio
a los instrumentos, desde el punto de vista operativo, pero s a la conveniencia de su uso y a sus
capacidades.
La mayora de las tcnicas histolgicas van encaminadas a preparar el tejido para su
observacin con el microscopio, bien sea ste ptico o electrnico. Ello es debido a que la estructura
de los tejidos est basada en la organizacin de los tipos de clulas que los componen y, salvo
contadas ocasiones, las caractersticas morfolgicas de las clulas slo se pueden observar con
estos aparatos.
Existen procedimientos rpidos y simples para la observacin de tejidos y clulas vivas que
reciben el nombre de vitales. Por ejemplo, la observacin del flujo sanguneo en capilares del
sistema circulatorio. Otra forma de observar clulas o tejidos vivos es mediante las tcnicas
histolgicassupravitales, en los que las clulas y los tejidos se mantienen o se hacen crecer fuera del
organismo, como es el caso de los cultivos de clulas y de tejidos.
Las tcnicas histolgicas postvitales son aquellas en las que las clulas mueren durante el
proceso, pero las caractersticas morfolgicas y moleculares que posean en estado vivo se
conservan mejor o peor dependiendo del tipo de tcnica. Estas pginas estarn dedicadas a este
tipo de tcnicas, puesto que son las ms comnmente usadas en los laboratorios de histologa.
Denominamos proceso histolgico a una serie de mtodos y tcnicas utilizados para poder
estudiar las caractersticas morfolgicas y moleculares de los tejidos. Hay diversos caminos para
estudiar los tejidos, es decir, series de tcnicas que se utilizarn dependiendo de qu caracterstica
deseemos observar. En el siguiente esquema se muestran los mtodos y tcnicas comnmente
empleados para el procesamiento de los tejidos. Sin embargo, hay que tener en cuenta que existen
muchas variantes a estos "caminos" y su eleccin depender del resultado final que queramos
obtener.

Esquema del proceso histolgico.
El proceso histolgico comienza con la obtencin del tejido objeto de estudio. En el caso de los
tejidos vegetales se toman muestras de los distintos rganos que componen el cuerpo de la planta,
mientras que para los tejidos animales podemos optar por dos opciones: coger una porcin de dicho
tejido o procesar una parte, rgano o parte corporal, o el animal completo. En cualquier caso las
muestras son habitualmente fijadas con unos soluciones lquidas que contienen unas sustancias
denominadas fijadores, las cuales mantienen las estructuras celulares y moleculares en sus
posiciones iniciales durante el procesamiento posterior. Tambin podemos fijar las molculas de los
tejidos por congelacin rpida. Fijar un tejido es como si hicisemos una fotografa del tejido que se
mantendr hasta su observacin. Sin embargo, el uso de fijadores o medios de inclusin afectan a
veces las caractersticas tisulares que queremos observar y por tanto tenemos que recurrir a la
congelacin para endurecer el tejido para despus poder obtener secciones del mismo.
Normalmente, tras la fijacin se procede a incluir el tejido para posteriormente obtener
secciones. Cuanto ms delgada queramos que sea nuestra seccin ms tenemos que endurecer
nuestra muestra. Esto se consigue embebiendo el tejido con sustancias lquidas que posteriormente
polimerizarn (resinas) o se volvern consistentes (ceras). Tambin se puede conseguir el mismo
efecto mediante congelacin rpida. Cortes ms gruesos de 40 m se pueden cortar sin necesidad
de inclusin usando el vibratomo. Los medios de inclusin son normalmente no hidrosolubles por lo
que tenemos que sustituir el agua de los tejidos por solventes orgnicos liposolubles y
posteriormente aadir el medio de inclusin.
Tras la inclusin o la congelacin se procede a cortar los tejidos. Existen diferentes aparatos de
corte que permiten conseguir secciones ultrafinas (del orden de nanometros), semifinas (de 0.5 a 2
m), finas (entre unas 3 y 10 m) y gruesos (mayores a 10 m). Estas secciones hay que
procesarlas para poder observarlas, aunque ciertos tipos de microscopa, por ejemplo con contraste
de fase, permiten observar tejidos sin teir. Normalmente las secciones se tien con colorantes que
son hidrosolubles, por lo que hay que eliminar el medio de inclusin para que los colorantes pueden
unirse al tejido. Las secciones, secciones ultrafinas, que se observan con el microscopio electrnico
se pueden contrastar con metales pesados, opacos a los electrones, sin eliminar la resina.
Los tejidos procesados se observan con los microscopios. Existen dos tipos bsicos
de microscopios: electrnico y ptico. Los primeros permiten un gran poder de resolucin,
pudindose observar caractersticas ultraestructurales, mientras que los segundos, con menor poder
de resolucin, ofrecen una gran versatilidad en cuanto a modos de observar los tejidos :
fluorescencia, contraste de fase, polarizacin o contraste de interferencia diferencial.
Como dijimos al comienzo existen mltiples variaciones sobre este esquema general. Por
ejemplo, se pueden observar tejidos con el microscopio electrnico de barrido sin necesidad de
incluir ni cortar, pero slo observaremos superficies. En las siguientes pginas veremos con cierto
detalle algunas de las tcnicas ms empleadas para la observacin de los tejidos.
Fijacin
Todos los tejidos, cuando se extraen del organismo o el organismo muere, sufren dos tipos
deprocesos degradativos: autolisis (accin de enzimas intracelulares, es decir, autodigestin)
yputrefaccin (accin bacteriana). Adems, el procesamiento histolgico posterior del tejido para
poner de manifiesto y observar determinadas estructuras supone una metodologa que puede
degradar las estructuras tisulares. Fijar un tejido es preservar sus caractersticas morfolgicas y
moleculares lo ms parecidas posibles a las que posea en estado vivo. Es como hacer una
fotografa del tejido vivo y poder observarla, tras cierto tratamiento, con el microscopio. As, los
fijadores deben proteger frente a ataques bacterianos, evitar autolisis, insolubilizar elementos
solubles que se quieren estudiar, evitar distorsiones y retracciones tisulares, prenetrar y modificar el
tejido para poder llevar a cabo tinciones especficas posteriores, si es necesario, etctera.
No existe un fijador universal, ni un mtodo de fijacin nico. Incluso podemos usar varios
fijadores secuencialmente segn nuestras necesidades. La eleccin depende de las caractersticas
fijadoras que necesitemos. Por ejemplo, si queremos estudiar actividades enzimticas debemos usar
un fijador que no nos altere el centro activo de dichas enzimas, y quiz para ello tengamos que
sacrificar en cierta medida la morfologa tisular. Si queremos estudiar la ultraestructura celular
debemos usar fijadores que la preserven y que protejan a las membranas celulares durante el
procesamiento de inclusin en resinas, y quiz esto altere su apetencia por los colorantes generales.
Si queremos teir un determinado componente celular difcilmente teible quiz debamos usar un
fijador que lo modifique para que sea reconocido ms fcilmente por los colorantes.
En cualquier caso, hay caractersticas de los fijadores que tenemos que tener en cuenta antes
de su uso:
Velocidad de penetracin. El proceso de fijacin ha de ser rpido y la velocidad de difusin de
la sustancia fijadora en los tejidos es un factor determinante. Este parmetro condiciona el tamao
de la pieza que queramos fijar, ms pequea cuanto menor la velocidad de difusin, y el tiempo de
fijacin, mayor cuanto menor tiempo de difusin.
Velocidad de fijacin. Esta caracterstica no dependen de la velocidad de difusin sino de las
propiedades qumicas del fijador y condiciona el tiempo que debe permanecer el tejido en contacto
con el fijador.
Endurecimiento. Los fijadores generalmente endurecen los tejidos, lo cual depende del tipo de
fijador y del tiempo que el tejido haya estado expuesto a l.
smosis y pH. Es indispensable evitar cambios de volumen en la clulas producidos por una
osmolaridad del fijador diferente a la del tejido. Por tanto, hay que equilibrar la osmolaridad de las
soluciones fijadoras y la de los tejidos a fijar. No es necesario aadir sustancias complejas. Por
ejemplo, para los tejidos de animales terrestres basta con aadir 0.9 % de cloruro sdico. Son sales
que no afectan a la capacidad del fijador. Normalmente se suelen usar soluciones tamponadas a
un pH semejante al del tejido e isoosmticas con dicho tejido.
Efecto mordiente. Algunas estructuras tisulares son difciles de teir puesto que tienen poca
apetencia por los colorantes, pero puede ser incrementada con un tratamiento previo. Algunos
fijadores, adems de fijar, modifican qumicamente a ciertas estructuras celulares para que
posteriormente puedan unirse a ellas los colorantes. Este este tipo de modificacin qumica se le
denomina efecto mordiente.
Artefactos. Los procesos de fijacin pueden acarrear alteraciones tisulares como variaciones
morfolgicas, cristalizacin de compuestos, desplazamiento de sustancias, etctera. Estos cambios
pueden producirse por las caractersticas del fijador o por un mal uso de ste. En cualquier caso
deben tenerse en cuenta para no describir como caractersticas tisulares lo que es un artefacto
introducido durante la fijacin.
Mtodos de fijacin
Existen diferentes formas de fijar los tejidos, dependiendo del tipo de fijador, de la estructura a
fijar y de lo queramos observar. Los mtodos de fijacin se pueden clasificar en dos tipos: fsicos y
qumicos.
Los fijadores fsicos estn basados en una congelacin muy rpida del tejido, en la aplicacin
decalor o microondas. Se utilizan cuando el tipo de muestra lo requiere, cuando los fijadores
qumicos alteran la estructuras que queremos observar, o cuando necesitamos una fijacin muy
rpida. La congelacin rpida es un buen mtodo de preservacin de las caratersticas moleculares
y es conveniente que sea rpida puesto que as se impide la formacin de grandes cristales de hielo
que nos destrozaran la estructura del tejido. Existen variantes de esta tcnica como son la
criodesecacin o liofilizacin y la criosustitucin. La criodesecacin parte de tejido previamente
congelado, pero posteriormente se realiza una sublimacin del hielo, es decir, el agua pasa de
estado slido a gaseoso sin pasar por estado lquido. Al eliminar el agua se impide que se den
reacciones qumicas por lo que adems de la fijacin preserva el tejido en el tiempo.
La criosustitucin tambin parte de tejido congelado pero en este caso se produce una sustitucin
lenta del hielo por una solucin fijadora. Con ello se posibilita una fijacin qumica sobre un material
que no ha sufrido deterioro puesto que est congelado. Los mtodos de fijacin por calor de fijacin
no son frecuentemente usados, excepto para observar microorganismos.
Los mtodos qumicos utilizan soluciones acuosas compuestas por molculas fijadoras que
establecen puentes entre las molculas celulares, mantenindolas en sus lugares originales e
impidiendo su degradacin. Hay dos mtodos de fijacin con fijadores
lquidos: inmersin y perfusin. En cualquier caso el fijador debe entrar en contacto con el tejido lo
ms rpidamente posible.
Inmersin. Por el mtodo de inmersin las piezas de tejido se sumergen en la solucin
fijadora. Tenemos que tener en cuenta algunas precauciones.
1) Las piezas de tejido no deberan superar los 0.5 cm de espesor para que el fijador alcance
el interior de la pieza antes de que sta comience a deteriorarse. Esto depende de
la velocidad de penetracin del fijador y de las caractersticas del tejido, por ejemplo, si
tiene cavidades por donde penetre la solucin fijadora.
Fijacin por inmersin.
2) El volumen recomendado de fijador debe ser 20 vecessuperior al volumen de la pieza.
3) La osmolaridad entre tejido y solucin fijadora deben estar equilibradas.
4) El pH del fijador debe ser prximo al fisiolgico.
5) El tiempo de fijacin depende de cada tipo de fijador, pero generalmente existe un
tiempo mximo para cada uno de ellos que no debe ser excedido.

Fijacin por perfusin de un rgano. Mediante perfusin se consigue que la solucin
fijadora llegue a todas las clulas del rgano a travs del sistema sanguneo. Mediante una
bomba peristltica se introduce la solucin fijadora a travs de la arteria que irriga el rgano.
Se obturan todos aquellos vasos arteriales que no conducen al rgano.
Perfusin. Por este procedimiento la solucin fijadora se
introduce a travs del sistema circulatorio mediante el cual accede a
todas las clulas del tejido gracias a la red de capilares. Mediante este
mtodo se puede fijar un animal completo introduciendo la solucin fijadora a travs del ventrculo
cardiaco, con lo que el fijador llegar a todas las clulas irriegadas por la sangre bombeada por
dicho ventrculo (circuito pulmonar o corporal). Tambin podemos fijar un nico rgano en el caso de
que podamos aislar e introducir la solucin fijadora en la arteria principal que irriga dicho rgano. La
perfusin no siempre es posible llevarla a cabo, como es el caso de biopsias o tejidos vegetales.
Este mtodo es mucho ms efectivo que el de inmersin, ya que la solucin fijadora llega a escasa
distancia de todas las clulas de la estructura perfundida. Por tanto, la velocidad de penetracin del
fijador no es una condicin limitante. El volumen de fijador necesario tambin es menor puesto que
la solucin fijadora se va renovando constantemente y por tanto no se diluye con el medio acuoso
del tejido y no pierde potencial fijador.
Antes de introducir el fijador en el sistema de vasos sanguneos hay eliminar previamente la
sangre con una solucin de lavado oxigenada, de otra manera su interaccin con el fijador produce
trombos que impediran la fijacin de determinadas zonas del animal o del rgano. Respecto a las
precauciones mencionadas anteriormente en el mtodo de inmersin debemos cuidar aqu tambin
la osmolaridad, el pH y el tiempo de fijacin.


Fijacin por perfusin de un organismos completo. Mediante este tipo de perfusin se introduce
la solucin fijadora en el sistema sanguneo. La bomba peristltica aporta la presin suficiente
permitiendo al fijador entrar a travs del ventrculo izquierdo (Vi) y pasar a la aorta, desde la
cual se distribuye por todo el cuerpo (excepto por el circuito pulmonar). Tras pasar por la red
capilar, la solucin fijadora pasa a los vasos venosos que terminan por verter su contenido en la
aurcula derecha (Ad). A esta cavidad hay que hacerle una abertura para que la solucin
fijadora, una vez realizada su funcin, salga del circuito. Ai: aurcula izquierda; Vd: ventrculo
derecho.
Este mtodo de fijacin requiere conocer la presin a la que se va a introducir la solucin
fijadora en el animal o estructura, la cual debe ser similar a la que posee la presin sangunea
normal en estado vivo. La presin que ejercer la solucin fijadora se puede regular mediante
bombas peristlticas (ver figura) o por gravedad, es decir, variando la altura a la cual se coloca la
solucin fijadora respecto a la del animal. Esto es importante porque una presin muy baja prodra
impedir que la solucin fijadora alcanzara todas las partes de la estructura y un presin muy alta
podra provocar roturas de los vasos sanguneos y de la propia estructura tisular.
Fijadores
Existen multitud de fijadores en los manuales de tcnicas histolgicas. Aqu slo trataremos
aquellos que consideramos de uso ms comn para la observacin de tejidos al microscopio, es
decir, aquellos que mejor preserven la estructura celular. Los fijadores qumicos son los ms
frecuentemente empleados, bien con un solo tipo de sustancia fijadora o con mezclas de varias de
ellas.
Atencin! La mayora de las sustancias fijadoras son txicas por inhalacin o por contacto,
algunas de ellas cancergenas. Hay que seguir las indicaciones de seguridad para su manejo y
utilizacin.
Fijadores simples
Alcohol etlico. Fija por deshidratacin y se usa entre el 70 y 90 %. Es un buen elemento para
preservar molculas, como ciertas enzimas, propiedades antignicas, glucgeno, pigmentos y para
las extensiones citolgicas. Debido a que deshidrata, a la vez que fija, se puede usar tambin como
un conservante de las muestras. Tiene inconvenientes como el endurecimiento y la retraccin de los
tejidos. Carece de efecto mordiente.
cido actico. Su proceso de fijacin consiste en cambiar el estado coloidal de las protenas.
Se utiliza a una concentracin que vara entre el 1 y el 5 %. Es el fijador ideal para cidos nucleicos y
nucleoprotenas. Como inconvenientes cabe destacar la destruccin de las mitocondrias y mala
fijacin de membranas y citoplasma. Se suele usar en combinacin con otros fijadores
cido pcrico. La fijacin la produce porque sales del tipo picrato coagulan con las protenas
de los tejidos. Se suele usar el 2 % de una solucin saturada de cido pcrico. Preserva bien la
estructura celular, no produce retracciones cuando el tiempo de fijacin es ptimo, preserva bien
glucgeno y lpidos. Es un buen fijador para tinciones generales puesto que favorece la unin de los
colorantes. Hay que eliminarlo completamente antes de proceder a la inclusin en ceras como la
parafina. Se suele usar combinado con otros fijadores.
Formaldehdo. Acta mediante la formacin de puentes entre las molculas tisulares. Se
utiliza a concentraciones prximas al 4 %. Es un fijador ampliamente usado por la buena
preservacin del tejido, acta como conservante, produce poca retraccin tisular, es un buen fijador
para lpidos, es compatible con la mayora de las tinciones histolgicas, incluidas las de
inmunocitoqumica e hibridacin de cidos ribonucleicos. Normalmente se usa en solucin
tamponada e isotnica.
Glutaraldehdo. Forma puentes entre las molculas de los tejidos. Se usa a una proporcin de
entre el 0,5 y el 3 %. Tiene una alta capacidad para preservar la estructura celular, por lo que es el
fijador de referencia para observacin de ultraestructuras celulares con el microscopio electrnico.
Pero hay que tener cuidado con su baja penetracin tisular y puede producir retracciones. Se usa en
soluciones tamponadas isotnicas.
Tetrxido de osmio. Forma puentes entre molculas. Se emplea al 1 % en soluciones
tamponadas. Es buen fijador de la ultraestructura de la clula por lo que se emplea habitualmente
para las observaciones con el microscopio electrnico. Es un buen fijador para grasas y membranas
celulares. Por su fuerte carcter oxidante no se usa para tinciones convencionales, excepto para las
impregnaciones argnticas como el mtodo de Golgi.
Mezclas fijadoras
La mayor parte de los procesos de fijacin usan distintas sustancias fijadoras, bien mezcladas
en la solucin acuosa inicial o utilizadas sucesivamente en el tiempo. Con ello se aprovechan las
ventajas de cada una de ellas y se pueden contrarrestar sus desventajas. Hay multitud de formas de
usar los diferentes fijadores, tanto en sus componentes como en las proporciones de stos,
dependiendo de las necesidades posteriores, es decir, qu tipo de tejido queremos fijar y qu
queremos ver de dicho tejido. A continuacin vamos a mencionar algunas combinaciones usadas
frecuentemente porque tienen unas propiedades de fijacin que las hace apropiadas para las
observacin de una gran variedad de tejidos y de tcnicas de tincin.
Lquido de BOUIN: Est formado por cido pcrico, formaldehdo y cido actico glacial. Es
una solucin muy utilizada para el procesamiento de tejidos que se incluirn en parafina (ver captulo
de inclusin) y a cuyas secciones se le pueden aplicar un amplio espectro de tinciones. Es muy til
para tejidos blandos y embriones, y preserva bien el ncleo y el glucgeno. Hay que tener cuidado
con el tiempo de fijacin, que no debe exceder de 48 h en el caso de fijaciones por inmersin. Tras la
fijacin las muestras de tejido se pueden conservar en alcohol de 70. No est recomendado para el
rin ni para el estudio de mitocondrias. Antes de la inclusin en parafina es conveniente eliminar el
cido pcrico mediante lavados en alcohol de 70 porque puede hacer que no se produzca una
buena inclusin o que las tinciones no sean adecuadas.
Karnoy: Es un buen fijador para el glucgeno, para los hidratos de carbono simples y para las
protenas fibrosas. Es bueno para visualizar los cidos nucleicos, aunque no la morfologa nuclear, y
para los grumos de Nissl del sistema nervioso. Puede producir retracciones tisulares. Est formado
por etanol absoluto 60 %, cloroformo 30 % y cido actico glacial 10 %.
Mezclas con formaldehdo: El formaldehdo es quiz el fijador ms usado hoy en da, tanto
para tcnicas histolgicas rutinarias como para otras como la inmunocitoqumica o la hibridacin de
cidos nucleicos. Lo ms frecuente es utilizarlo en solucin al 4 % junto con otros fijadores. Por
ejemplo, el Bouin. Se suelen disolver en soluciones tamponadas que tienen una osmolaridad similar
a la del tejido que se pretende fijar. Para fijaciones de tejidos destinados a microscopa electrnica
se suelen utilizar soluciones fijadoras que contienen formaldehdo y glutaraldehdo. La funcin del
formaldehdo es iniciar una fijacin rpida, por su mayo capacidad de penetracin, mientras que el
glutaraldehdo realizar una fijacin ms poderosa, pero ms lenta que afectar a la estructura
tisular puesto que el formaldehdo ya ha realizado una fijacin previa.
Glutaraldehdo-tetrxido de osmio:Los fijadores en combinacin no tienen necesariamente
que usarse al mismo tiempo. Es habitual que los tejidos destinados a microscopa electrnica sean
inicialmente fijados en glutaraldehdo (1 al 3 %) y paraformaldehdo (2 al 4 %), para posteriormente
ser postfijados en tetrxido de osmio al 1 % en solucin tamponada. Este ltimo es un buen
preservador de la ultraestructura celular, sobre todo membranas, en cooperacin con los aldhedos.
Esto es importante porque el proceso para microscopa electrnica supone incubar el tejido en
solventes orgnicos y polimerizacin de resinas a 60 C, durante las cuales el tejido debe ser
preservado.
Inclusin
Una vez fijado el tejido tenemos que procesarlo para su observacin con el microscopio. Ello
implica hacer secciones para teirlas primero y posteriormente observarlas. Como regla general se
procede al endurecimiento de la muestra para poder obtener dichas secciones ya que lo normal es
quecuanto ms delgada queramos una seccin ms consistente debe ser la muestra de la que se
obtiene. Los tejidos se endurecen a consecuencia de la fijacin, pero sta no es muy alta e impide la
obtencin de cortes generalmente ms delgados que 20 o 30 m. Slo en el caso de que queramos
trabajar con secciones relativamente gruesas (entre 30 y 200 m) se puede aprovechar el
endurecimiento provocado por el fijador y obtener dichas secciones con el vibratomo, que se utiliza
en ciertas tcnicas donde es necesaria una buena preservacin molecular. Sin embargo, en muchos
casos necesitamos endurecer ms el tejido para obtener secciones ms finas y se puede hacer de
dos formas: congelacin e inclusin.
La congelacin de los tejidos previamente fijados permite la obtencin de secciones que
pueden ir desde unas 50 m hasta nm, para lo que se utilizan diferentes aparatos: microtomo de
congelacin para secciones de decenas de m, criostato para secciones de entre 5 y 20 m y
ultracriotomo para secciones ultrafinas del orden de nm. Para evitar los daos que se producen
durante los procesos de congelacin, formacin de cristales de hielo que nos agujerean los tejidos,
se han de tener en cuenta dos procesos: a) Anticongelantes que impidan la formacin de cristales. El
crioprotector ms usado es la sacarosa al 30 %, aunque tambin se usa el dimetil sulfxido, el
glicerol, etiln glicol y otros. La eleccin de uno u otro depende del tipo de muestra y de la tcnica
que se vaya a usar. b) Unacongelacin lo ms rpida posible, por ejemplo, con nitrgeno lquido.
Cuanto ms rpida es la congelacin menores son las dimensiones de los cristales de agua
formados.

Se pueden obtener secciones de grosor variable
utilizando diferentes mtodos. Secciones ms finas
se obtienen endureciendo ms el tejido. Esto se
puede conseguir mediante la congelacin o
embebiendo el tejido en sustancias que solidifican
como la parafina o resinas. Tngase en cuenta que
las dimensiones de los cortes y objetos del dibujo
no estn a escala. Una rejilla es mucho ms
pequea que un portaobjetos. Las dimensiones en
m y nm se refieren al espesor de las secciones.
La inclusin es el mtodo ms
comn de endurecer el tejido y
consiste en infiltrar la muestra con
sustancias lquidas que tras un
proceso de polimerizacin o
enfriamiento se solidifican, sin afectar a las caractersticas del tejido. Con ello se consigue obtener
cortes delgados (desde decenas de m a nm segn el medio de inclusin) sin que el tejido se rompa
o se deteriore. Adems son un buen mtodo depreservar las muestras durante largos periodos de
tiempo. Existen diferentes sustancias o medios de inclusin dependiendo del grosor del corte y de la
tcnica que necesitemos realizar. Cuando se quieren hacer secciones para su observacin con
el microscopio ptico los medios de inclusin ms frecuentemente usados son la parafina o la
celoidina, mientras que si vamos a realizar observaciones con el microscopio electrnico la inclusin
se realiza con resinas, principalmente de tipo acrclicas o epoxy. La mayora de los medios de
inclusin no son hidrosolubles, es decir, no miscibles con el agua, luego si queremos que la
sustancia en la que vamos a incluir ocupe todo el tejido tenemos que eliminar el agua y sustituirla por
un lquido miscible con nuestro medio de inclusin. Si una muestra no est completamente embebida
en el medio de inclusin se deteriorar y la obtencin de secciones homogneas ser imposible.
Inclusin en parafina
Para la inclusin de muestras que han de observarse con microscopa ptica se utiliza sobre
todo la parafina, y en menor medida la celoidina, como medio de inclusin. Vamos a describir los
pasos para la inclusin en parafina de muestras de tejido previamente fijadas.
La parafina es una sustancia de aspecto ceroso que est formada por mezclas de
hidrocarburossaturados. A temperatura ambiente es slida y su punto de fusin puede variar entre
40 y 70 C segn su composicin de la mezcla de hidrocarburos. Resultan distintos tipos de
parafinas a temperatura ambiente que se emplean segn las necesidades. As, parafinas ms duras
a temperatura ambiente tienen un punto de fusin mayor, mientras que las ms blandas uno menor.
Es recomendable una dureza mayor para incluir muestras ms duras. Las parafinas ms usadas
tienen un punto de fusin en torno a los 60 C. Podemos tambin modificar las caractersticas de las
parafinas aadiendo sustancias para variar su dureza, viscosidad, fragilidad, etctera.
La parafina no es miscible con agua, mientras que todos los tejidos estn formados
principalmente por agua. Adems, la mayora de los fijadores son soluciones acuosas. Esto implica
que para que la parafina lquida pueda penetrar completamente en el tejido ha de sustituirse el agua
por un solvente orgnico. Esto se consigue mediante la deshidratacin del tejido en alcoholes,
normalmente metanol, de gradacin creciente hasta alcohol de 100. Posteriormente se transfiere el
tejido a un lquido que sea miscible tanto con el alcohol de 100 como con la parafina,
denominado sustancia intermediaria, como es el benceno, xileno, tolueno o el xido de propileno,
entre otros. Estas sustancias son normalmente aclarantes por lo que comprobando la translucidez de
la pieza podemos cerciorarnos de la penetracin de la sustancia intermediaria en el tejido. El tiempo
de incubacin de la pieza algunos de estos lquidos intermediarios como el tolueno o xileno no debe
ser excesivo puesto que estas sustancias endurecen la pieza y provocar problemas hacer las
secciones.
Por ltimo se pasa el tejido a parafina previamente licuada en una estufa regulada a la
temperatura apropiada para dicho tipo de parafina. Se dan tres pasos por parafina para favorecer
una buena impregnacin. El tiempo que duran dichos pasos depende de lo voltil que sea el lquido
intermediario y lo grande que sea nuestra pieza. Ser mayor cuanto menos voltil es el lquido
intermediario o mayor sea la muestra de tejido. Hay que tener en cuenta que un tiempo excesivo en
parafina puede endurecer el tejido. Tras el embebimiento completo de la muestra se vierte parafina
lquida en un molde, se intruduce la muestra y se coloca segn la orientacin deseada de corte y se
deja solidificar a temperatura ambiente.
Un protocolo comn de inclusin en parafina es el siguiente:

Esquema de la inclusin en parafina de una muestra de tejido previamente fijada. Los tiempos de incubacin en cada sustancia
pueden variar en funcin del tamao de la muestra, tipo de tejido o, por ejemplo, el lquido intermediario. Sin embargo, los pasos
son comunes a cualquier inclusin en parafina.
Inclusin en Resina
Para la observacin de la ultraestructura celular es necesario hacer secciones de tejido muy
delgadas denominadas ultrafinas, del orden de nanometros, y usar un microscopio electrnico de
transmisin. La obtencin de secciones ultrafinas implica que tenemos que endurecer enormemente
el tejido. Esto se puede conseguir mediante congelacin, obteniendo entonces la secciones con un
ultracriotomo. Sin embargo, lo ms frecuente es incluir el tejido en un material de alta dureza como
son las resinas las resinas de tipo epoxy, y en menor medida las resinas acrlicas, como el
metacrilato. Ambas se infiltran en el tejido en forma lquida y posteriormente polimerizan sin afectar a
la ultraestructura celular.
El procedimiento estndar de inclusin en resinas es similar al descrito para la parafina con
algunas modificaciones. As, los pasos que se siguen son fijacin de las muestras, por inmersin o
perfusin, deshidratacin, lquido intermediario, infiltracin y polimerizacin en el medio de inclusin.
Algunos medios de inclusin de tipo acrlico, por ejemplo la resina LR white, son parcialmente
miscibles con el agua por lo que no es necesario pasar la muestra por solventes como el etanol
absoluto, acetona o el xido de propileno, y adems polimerizan con luz ultravioleta a bajas
temperaturas. Estos medios son buenos para estudios citoqumicos.
a) Las soluciones fijadoras suelen contener glutaraldehdo y es necesaria una postfijacin
posterior en tetrxido de osmio. Con ello nos aseguramos una fuerte fijacin para preservar la
ultraestructura celular y que no perderemos los lpidos que forman las membranas celulares durante
el proceso de inclusin, gracias al tetrxido de osmio.
b) Partimos de tamaos de muestras mucho ms pequeas, de unos pocos milmetros, puesto
que no nos interesa ver la organizacin general del tejido sino detalles del mismo. Si queremos
observar zonas diferentes de un rgano es conveniente hacer bloques de muestra pequeos e
independientes de cada una de ellas.
c) La resinas ms comnmente usadas para la inclusin no son hidrosolubles, por lo que
tenemos que sustituir el agua del tejido por un solvente orgnico que sea miscible con la resina. Para
ello se deshidrata el tejido mediante incubaciones sucesivas en gradaciones crecientes de etanol o
acetona, esta ltima es frecuentemente usada. Como lquido intermediario entre la acetona pura o
etanol de 100 y las resinas se suele utilizar el xido de propileno.
d) El endurecimiento del medio de inclusin no es por enfriamiento sino por polimerizacin,
normalmente a 60 C, como la resinas tipo epoxy, o por exposicin a rayos ultravioleta a
temperaturas en torno a los 20 C, con es el caso del metacrilato.
e) Al medio de inclusin, la resina, se le aaden aceleradores y plastificantes que regulan las
caractersticas de la polimerizacin y la dureza de la resina polimerizada.
El medio de inclusin ms usado para la observacin de la ultraestructura celular son
las resinas tipos epoxy puesto que son las que aportan una mayor homogeneidad en las
polimerizacin y ms facilidad a la hora de obtener secciones regulares. Por el contrario las resinas
acrlicas presentan algunos inconvenientes y hay que ser muy cuidadosos a la hora de elegir las
condiciones de polimerizacin, obtencin y tratamiento de los cortes ultrafinos.
A continuacin se muestra un proceso de inclusin habitual en resinas de tipo epoxy.

Esquema de la inclusin en resina de tipo epoxy de una muestra
de tejido previamente fijada. Los tiempos de incubacin en cada
sustancia pueden variar en funcin del tamao de la muestra o
tipo de tejido.








Corte
Las catersticas tisulares y celulares microscpicas internas se observan con microscopios
pticos o electrnicos de transmisin (excepto si queremos ver superficies, para lo que usamos el
microscopio electrnico de barrido). Con estos aparatos slo se pueden observar grosores muy
pequeos de tejidopor problemas de difusin y penetracin de la luz en el caso de los microscopios
pticos y de penetracin de los electrones en el caso del microscopio electrnico de transmisin. Por
tanto tenemos que hacer secciones de los tejidos que queremos estudiar, que pueden ir desde un
grosor de unos cuantos nanometros hasta centenares de micras. Algunos tejidos como los
vegetales, por sus caractersticas celulares, permiten su observacin en secciones de cientos de
micras. Como hemos mencionado en los captulos anteriores, podemos decir que cuanto ms
delgada queramos hacer una seccin de tejido ms endurecido ha de estar dicho tejido. La dureza
de los tejidos depende de sus caractersticas (por ejemplo, las paredes celulares hacen a los
vegetales tejidos duros), de la fijacin que hayamos realizado y sobre todo del material en que
hayamos incluido dicho tejido. Una manera ms directa de endurecer el tejido es mediante
congelacin.
Los aparatos mecnicos para hacer secciones de un grosor de micrmetros se
denominanmicrotomos y existen diferentes tipos segn el grosor que queramos conseguir en
nuestras secciones, el medio de inclusin en el que se encuentre el tejido o si se ha endurecido por
congelacin o por inclusin. Los microtomos ms usados son:
Microtomo para parafina: Se utiliza principalmente para material incluido en parafina y se
obtienen secciones de 5 a 20 m de grosor, para observar con el microscopio ptico.
Vibratomo: Corta material no incluido, aunque s fijado o duro, en secciones de 30 a
centenares de m de grosor, para observar con el microscopio ptico.
Microtomo de congelacin: Con l se consiguen secciones de 30 a unas 100 m de material
congelado para su observacin con el microscopio ptico.
Criostato: Consigue secciones a partir de material congelado y se obtienen grosores de 10 a
40 m, para observar con el microscopio ptico.
Ultramicrotomo: Con l se corta material incluido en resinas y se obtienen secciones del orden
de nanometros de grosor, para observar con el microscopio electrnico de transmisin.
Ultracriotomo: Su uso no est muy extendido pero se suele emplear cuando se necesitan
secciones del orden de nanometro de material que no se debe incluir, para observar con el
microscopio electrnico de transmisin.
Los aparatos de corte ms usados tradicionalmente para estudiar las caractersticas generales
de los tejidos y de las clulas son el microtomo para material incluido en parafina para observaciones
con el microscopio ptico y el ultramicrotomo para observaciones con el microscopio electrnico de
transmisin. El criostato se usa tambin frecuentemente en microscopa ptica por el ahorro de
tiempo que supone ya que no necesita incluir el tejido, incluso se puede cortar material no fijado.
Microtomos para parafina
Los microtomos para cortar material incluido en parafina son probablemente los ms usados en
los laboratorios de histologa. Todos poseen varias partes comunes: una cuchilla, un portabloques y
un sistema mecnico que permite acercar el bloque de parafina a la cuchilla una distancia que se
corresponde con el grosor de la seccin que pretendemos obtener y realizar el corte.
Hay dos tipos de microtomo para parafina: elde rotacin y el de deslizamiento. El microtomo de
rotacin provoca el corte gracias a la transformacin de un movimiento de rotacin en otro de
ascenso y descenso del portamuestras. En el movimiento de bajada sobre la cuchilla se produce un
acercamiento del portamuestras hacia la cuchilla segn el espacio seleccinado. En el
puertamuestras existe un sistema que permiteorientar la superficie de corte de la muestra respecto a
la cuchilla. En estos microtomos la cuchilla se mantiene fija durante el proceso de corte, pero puede
regularse el ngulo de ataque a la muestra. Con el microtomo de deslizamiento se obtienen cortes
mediante un movimiento de deslizamiento del bloque sobre la cuchilla, o viceversa. En estos
microtomos el movimiento lo proporciona directamente la mano y es de ida y vuelta, siendo en la
vuelta cuando se eleva la posicin del bloque, o de la cuchilla, una distancia que nos dar el grosor
del corte.
Tanto el microtomo de rotacin como el de deslizamiento tienen ventajas e inconvenientes. La
principal ventaja del de rotacin es su presicin, la posibilidad de obtener secciones seriadas con
facilidad y la automatizacin del proceso de corte. Los microtomos de deslizamiento son ms
sencillos mecnicamente y su disposicin permite cortar bloques ms grandes o bloques de
celoidina, aunque estn cayendo en deshuso.
Hay que llevar a cabo una serie de procesos sobre el bloque de parafina antes de hacer el primer
corte til a nuestra muestra. En primer lugar hay que retallar el bloque hasta hacer unapirmide
truncada. Antes de retallar hay que considerar cual de las caras de esta pirmide ser el frente de
ataque, es decir, cual ser la que primero se ponga
en contacto con la cuchilla. Esta cara deber ser
ms ancha que la opuesta, y ambas han de
ser paralelas. Con todo ello se consigue una buena
orientacin de nuestra muestra en las secciones,
que cada nuevo corte arrastre sin problemas al
previamente cortado y que se puedan obtener tiras
rectas de cortes. Una vez retallada la pirmide
nuestra muestra queda dentro de ella pero no est en contacto directo con la cara superior o de
corte, por lo que es necesario un proceso de desbastado, es decir, la eliminacin del espesor de
parafina que hay entre la superficie del bloque y nuestra muestra.
Otro aspecto que hemos de tener en cuentan antes de empezar a cortar es laorientacin de la
cuchillarespeto a la superficie de corte de la pirmide. Lo normal es orientar la cuchilla con un ngulo de
uno 10 respecto a la superficie de corte, aunque se puede modificar segn nuestras necesidades.
Una vez comenzado el corte de nuestra muestra se obtienen tiras de secciones unidas por las
caras paralelas a la cuchilla. Estas tiras se suelen manipular con pinceles o lancetas y, antes de su
fijacin definitiva en la superficie de un portaobjetos, han de estirarse para que nuestro tejido quede
perfectamente extendido. Aprovechando la hidrofocidad de la parafina, las secciones se colocan
sobreagua calentada a unos 35 C a 40 C y el calor las hace extenderse sin llegar a su punto de
fusin, que est en torno a los 60 C. El estiramiento se puede realizar en baos de agua con
regulacin trmica o sobre los propios portaobjetos cubiertos de agua y colocados sobre una
plancha trmica regulable.

Una vez se ha retallado y desbastado el bloque se obtienen las secciones en tiras que sern
colocadas sobre un portaobjetos cubierto con agua calentada a unos 40 C. El portaobjetos
ha sido tratado previamente son soluciones adhesivas. El calor y la hidrofobicidad de la
parafina hace que las secciones se estiren sobre la superficie del agua y una vez evaporada
queden adheridas al portaobjetos.
La superficie del portaobjetos donde se colocan las tiras de cortes
ha de estar previamente tratada para que nuestro tejido quede
adherido durante el procesamiento posterior. Para ello los portaobjetos se recubren consoluciones
de gelatina, albmina, u otras sustancias y se dejan secar, de manera que hacen de adhesivo entre
el cristal y nuestro tejido.
Una vez que el agua se ha evaporado y estn extendidas las tiras de cortes de parafina sobre
el portaobjetos, se procede a un secado exahustivoen una estufa a una temperatura de entre 35 C y
40 C durante toda la noche. Una vez secos, los portaobjetos con las secciones estn listos para el
procesamiento posterior.
Vibratomos
Puede haber varias razones para evitar la inclusin de un tejido del que posteriormente obtener
secciones. Durante los procesos de inclusin, como las inclusiones en parafina o en resinas tipo
epoxy, se ha de someter a las muestras a deshidratacin. Esto ocasiona a veces dao en algunas
molculas o regiones moleculares que son las que queremos detectar posteriormente con tcnicas
como la inmunocitoqumica. Adems, para observar algunas caractersticas tisulares o celulares se
requieren secciones gruesas del orden de 50 m, a veces de 100 o 200 m. Por ejemplo, para
estudiar la organizacin espacial de determinadas clulas como las neuronas es recomendable
hacer cortes de un grosor superior a las 50 m y emplear inmunocitoqumica o histoqumica para
ponerlas de manifiesto. La obtencin de secciones gruesas sin necesidad de inclusin se pueden
conseguir de dos manera diferentes: mediante congelacin de la muestra y corte en un microtomo
de congelacin o mediante el uso del vibratomo.

Vista lateral de la cubeta de un vibratomo.
El vibratomo es un aparato con el que se obtienen secciones de un
grosor que puede oscilar entre las 40-50 m hasta varios centenares de
m partiendo de una muestra animal endurecida slo mediante fijacin. El
mecanismo de corte consiste de una plataforma sobre la que se sita la muestra, que puede
regularse en altura y nos permite seleccionar el grosor del corte, y de una cuchilla de borde muy
afilado que se deplaza horizontalmente sobre la muestra realizando el corte. La caracterstica del
vibratomo es que la cuchilla, adems de avanzar sobre la muestra, posee un movimiento de
vibracin lateral a modo de sierra que facilita el corte y evita arrastrar el tejido. La muestra se
encuentra fijada, normalmente mediante pegamento de contacto, directamente a un bloque
portamuestras que se coloca sobre la plataforma elevadora.


Pegado de la muestra al bloque portamuestras.
No todas las muestras son apropiadas para
ser cortadas en un vibratomo. As, aquellas que
sean muy blandas o que posean porciones
demasiado duras o elsticas son normalmente
arrastradas por la cuchilla, a pesar de que
disminuyamos la velocidad de avance y aumentemos la oscilacin de la cuchilla. Es decir, la muestra
ha de tener una cierta consistencia y no poseer elementos distorsionadores del corte.
Otra caracterstica del vibratomo es que todo el proceso de corte se realiza bajo una solucin
acuosa que normalmente es una solucin tamponada o una solucin salina. Para ello tanto la
muestra como el borde de corte de la cuchilla han de estar sumergidos y los cortes que se obtienen
se denominan cortes en flotacin, es decir, no sujetos a ningn soporte. Estos cortes se pueden
procesar de esta manera, flotando, o adherirse a un portaobjetos y procesarlos despus. Sin
embargo, el proceso de secado necesario para la adhesin al portaobjetos suele conllevar
alteraciones de la calidad del tejido. As, los cortes se suelen procesar durante toda la tcnica en
flotacin y posteriormente se montan sobre portaobjetos para su observacin con el microscopio
ptico.
Criotomo
La congelacin de los tejidos es una manerarpida de endurecerlos sin necesidad de inclusin, por
lo que la preservacin molecular es mxima. Muy importante si el procesamiento posterior requiere
el reconocimiento molecular. Igual preservacin se consigue con los cortes de vibratomo, pero las
muestras congeladas pueden cortarse en secciones ms finas, del orden de varias m, cosa muy
difcil con el vibratomo. Otra ventaja de la obtencin de secciones mediante congelacin es que la
calidad de las secciones no depende del tipo de tejido (excepto tejidos mineralizados como el hueso
o aquellos excesivamente cornificados). Por ltimo, es posiblemente la manera ms rpida de
obtener secciones puesto que es posible congelar la muestra sin necesidad de fijacin y cortarla de
inmediato, como las biopsias. Pero para preservar correctamente la estructura del tejido ha de ser
una congelacin muy rpida, normalmente en isopentano enfriado con nitrgeno lquido, lo que evita
la formacin de cristales de hielo que deterioran las estructuras celulares.
En el caso de que no se requiera un corte rpido las muestras se fijan y posteriormente se
incuban en una solucin anticogelanteque contiene sacarosa y glicerol. Con ello se evita que durante
la congelacin se formen cristales de hielo grandes que puedan daar las estructuras celulares.
Como dijimos anteriormente, se puede congelar de manera muy rpida con nitrgeno lquido. Dicha
congelacin permite preservar incluso la ultraestructura celular y observarla al microscopio
electrnico, siempre con el uso previo de anticongelantes. Pero normalmente se suele realizar la
congelacin de la muestra a temperaturas superiores que dependen del aparato empleado para
realizar los cortes, lo cual hace necesario el uso de anticongelantes.
Los dos aparatos ms usados para realizar cortes por congelacin son el microtomo de
congelacin y elcriostato. El microtomo de congelacin realiza cortes de decenas de m de grosor y
consiste en una plataforma que se enfra a bajas temperaturas sobre la que se coloca la muestra.
Tras cada corte la plataforma se eleva un espacio correspondiente al grosor de corte seleccionado.
En los microtomos de congelacin antiguos se produca la congelacin mediante gas carbnico que
haba que suministrar regularmente. Actualmente se produce la congelacin (de -30 a menos -40 C)
de la plataforma mediante tubos que parten de un sistema de refrigeracin externo al propio
dispositivo de corte. Adems, existe la posibilidad de congelar tambin la cuchilla si se desea. En los
apartos actuales la muestra se congela por contacto directo con la plataforma y su temperatura es
constante durante todo el tiempo de corte. Las secciones que se obtienen, de decenas a cientos de
m, se recogen con un pincel, se aaden a un recipiente con tampn de trabajo y se trabaja con
ellas en flotacin, igual que en el caso del vibratomo.


Criostato. Proceso mediante el que se pegan las secciones a un portaobjetos.
El criostato se utiliza para obtener secciones por congelacin de 10 a
30 m, aproximadamente. En este aparato todo el sistema de corte se
encuentra encerrado en una cmara refrigerada cuya temperatura se puede
regular, normalmente entre -20 y -30 C. La congelacin se suele hacer en
una plataforma dentro de la propia cmara refrigerada que se encuentra a
una temperatura inferior, en torno a -50 C. Tambin se puede congelar el
tejido externamente con la rapidez que deseemos, por ejemplo con
nitrgeno lquido, pero es conveniente colocar la muestra en la cmara del
criostato hasta que consiga igualar su temperatura con la de sta para
obtener secciones homogneas. Antes de la congelacin, la muestra se
encastra en un medio que es lquido a temperatura ambiente y slido a la
de corte. Por tanto, tenemos nuestra muestra en un bloque slido,
encastrado pero no incluido. Esto permite manipular la muestra y adherirla
a un soporte portamuestras, el cual se fijar a un eje que avanza sobre la cuchilla. La preparacin
del bloque y el mecanismo de corte es similar al que se describi para el microtomo de rotacin para
parafina. Las secciones que se van obteniendo se adhieren por contacto a portaobjetos con
superficies adhesivas. Las secciones se descongelan rpidamente en este proceso de pegado
puesto que los portaobjetos estn a temperatura ambiente y una vez secas pueden procesarse para
las tcnicas que deseemos.
Ultramicrotomo
Para la observacin con detalle de la ultraestructura celular es necesario realizar secciones muy
delgadas denominadas ultrafinas, del orden de nanometros, y observarlas con el microscopio
electrnico de transmisin. Para ello se incluye nuestra muestra en resina, generalmente de tipo
epoxy, que una vez polimerzada resulta en un bloque de gran dureza. La obtencin de secciones
ultrafinas se lleva a cabo con un aparato denominado ultramicrotomo. Otra manera menos habitual
de obtener secciones ultrafinas es mediante elultracriotomo, para lo cual la muestra se congela y se
corta en una cmara refrigerada a muy bajas temperaturas. Este ltimo es un mecanismo similar al
visto para el criostato. Es un aparato que slo se usa cuando queremos detectar con microscopa
electrnica molculas que son daadas durante el proceso de inclusin.
El ultramicrotomo tiene un diseo de corte similar al microtomo de parafina de rotacin, pero
mucho ms preciso y sofisticado. Quiz el sistema ms delicado sea el que hace avanzar el bloque
sobre la cuchilla pues debe hacerlo a intervalos de varios nanometros. Actualmente este sistema de
avance es mecnico pero en los ultramicrotomos ms antiguos era por calor, que produca dilatacin
del eje sobre el que se sujetaba la muestra. Tambin tiene un sistema completo de orientacin de la
muestra sobre el borde de la cuchilla para que el plano de corte se pueda orientar perfectamente a la
superficie de nuestra muestra. Al realizar cortes muy delgados cualquier vibracin o cambio de
temperatura afecta la homogeneidad del grosor del corte, por tanto el ultramicrotomo debe situarse
en una habitacin donde no haya vibraciones y mantenerla a temperatura constante para evitar
dilataciones del brazo que porta la muestra, dentro de lo posible. Adems, estos aparatos se colocan
sobre mesas especiales paradisminuir las vibraciones. Todos los ultramicrotomos actuales tienen
un panel de control externo al aparato desde donde se controla electrnicamente el proceso de
corte: inicio de corte, grosor de la seccin, velocidad de corte, ventana de corte, iluminacin de la
muestra, etctera.
Antes de realizar el primer corte ultrafino de una muestra, al igual que ocurra con los cortes de
parafina, es necesario retallar y desbastar el bloque para crear una pirmide truncada. Aunque todo
este proceso se puede hacer con una cuchilla se suele utilizar un aparato
denominado piramitomo que lima y crea las caras de la pirmide con un disposivo a modo de torno,
adems de producir el desbastado para obtener la superficie de corte. Hay que tener en cuenta que
este proceso ha de ser preciso porque lasuperficie de corte debe ser muy pequea, en torno a unos
0,5 mm
2
. Los lados de la superficie de corte deben ser similares a los descritos para el corte en
inclusiones de parafina, dos lados han de ser paralelos y uno ms grande que el otro. Con esto nos
aseguramos que una nueva seccin empujar a la previa del borde de la cuchilla y que
conseguiremos tiras rectas de secciones. Antes de hacer las secciones ultrafinas se suele hacer
una seccin semifina, de 1 o 2 m para tener una imagen de la muestra observable al microscopio
ptico.


Proceso por el que se obtiene una cuchilla para hacer cortes en el ultramicrotomo.
Las cuchillas empleadas para hacer secciones ultrafinas son
especficas para este tipo de aparatos puesto que han de tener
unos filos muy agudos. Las ms comnmente usadas son de
vidrio especial y se otienen mediante unos aparatos que mediante
ralladuras con puntas de diamante y golpes secos sobre barras de
vidrio son capaces de producir dichas cuchillas. Sin embargo, la
mejor calidad de corte se consigue con cuchillas con filo de diamante, pero son mucha ms caras.
Aunque los ultramicrotomos actuales tienen mecanismos de corte precisos, durante el proceso de
corte se pueden obtener secciones de distinto grosor. El grosor de una seccin ultrafina se conoce
por el colorque produce el reflejo de la luz sobre su superficie. Este color puede ser gris (menos de
60 nm), plata (60 a 90 nm), oro plido (90 a 120 nm), oro intenso (120 a 150 nm), prpura (150 a 190
nm), etctera.


Corte y recogida de secciones en una rejilla.
Las secciones ultrafinas recin obtenidos quedan flotando sobre una balsa de agua que posee
la propia cuchilla y no se recojen sobre portaobjetos sino directamente sobre soportes de nquel o
cobre denominados rejillas. Son discos circulares con un enrejado de hilos que dejan cavidades, las
cuales son de distino tamao segn el tipo de rejilla, normalmente desde 100 a varios cientos de m
cuadradas. Estas rejillas tienen la ventaja de que permiten una gran nitidez de las imgenes del
tejido que ofrece el microscopio electrnico puesto que los electrones slo atraviesan la seccin
antes de incidir sobre la pantalla de visualizacin. Sin embargo, presentan el problema de que la
porcin de seccin que caiga sobre el hilo de la rejilla quedar oculto. Por ello existen las "rejillas" de
ojal, que tienen una sola cavidad y suficientemente grande como para que quepa un corte entero.
Obviamente es necesario suministrar un soporte para que la seccin no se cuele por la cavidad que
es normalmente una membrana muy fina hecha de una sustancia denominada formvar, la cual deja
pasar los electrones y sostiene a las secciones.
Tincin
Los tejidos animales son en su gran mayora incoloros, excepto aquellos que poseen algn tipo
de pigmento como la sangre o la melanina de la epidermis. En las plantas, sin embargo, existe una
mayor variedad de pigmentos naturales que permiten su observacin directa con el microscopio
ptico, a lo que tambin ayuda la presencia de las paredes celulares, las cuales facilitan la
delimitacin celular y la discriminacin entre diferentes tejidos. Cuando se inventaron los primeros
microscopios hubo que descubrir cmo teir los tejidos para poder desentraar sus caractersticas
morfolgicas. Se observ que algunos pigmentos como el carmn o la eosina, disueltos en agua, se
unan a determinados componentes de las clulas. La expansin de la industria textil y su necesidad
de colorear las telas provoc un rpido desarrollo de los tintes o pigmentos en el siglo XIX. Muchas
de estas sustancias fueron usadas como colorantes en la histologa de los animales y de las plantas
desde mediados del siglo XIX hasta la actualidad, alcanzndose un enorme desarrollo y
perfeccionamiento de nuevas tcnicas y molculas sintticas que se usan segn las necesidades del
investigador. Con la llegada de labiologa molecular se han puesto en marcha otras tcnicas mucho
ms sofisticadas para observar elementos celulares, entre las que se pueden destacar aquellas que
usan anticuerpos, inmunocitoqumicas, las que usan sondas de ADN o ARN, hibridaciones "in situ", o
ms sofisticadas an como las que mediante el diseo de animales transgnicos permiten identificar
y observar a las clulas que expresan un determinado gen, incluso en el organismos vivo, gracias a
la fluorescencia de la protena verde fluorescente (GFP).
No vamos a describir con detalle las tcnicas ms complejas, al menos no en estas pginas
bsicas, sino las ms comunes, las que se suelen emplear en un laboratorio para el estudio general
de los tejidos. Dividiremos el conjunto de tcnicas histolgicas en cuatro categoras.
a) Tinciones generales. Aquellas que usan sustancias coloreadas que se unen a componentes
tisulares por afinidad qumica.
b) Histoqumica. Son aquellas tcnicas de tincin que implican la modificacin qumica de
algunas molculas tisulares para posteriormente ponerlas de manifiesto con colorantes. En este
apartado incluiremos tambin a los mtodos de tincin basados en la capacidad cataltica de algunas
enzimas presentes en los tejidos que queremos estudiar.
c) Lectinas. Las lectinas son dominios de protenas, como las selectinas, que son capaces de
reconocer glcidos que forman parte de polisacridos. Tienen una gran especificidad y se usan para
determinar el tipo de glcido que aparece en las glucoprotenas de la membrana plasmtica o de la
matriz extracelular de los diferentes tejidos.
d) Inmunocitoqumica. Son tcnicas histolgicas muy potentes basadas en la alta especificidad
de unin de los anticuerpos a los antgenos contra los que se produjeron. Estos antgenos pueden
ser cualquier molcula tisular que, purificada en inyectada en un animal, sea capaz de desarrollar
una respuesta inmune. Estos anticuerpos aadidos a una seccin de tejido reconocern y se unirn
especficamente a dicha molcula.
e) Hibridacin. Son tcnicas basadas en la unin complementaria de las bases de cidos
nucleicos (adenina con la timina, o con el uracilo, y de la guanina con al citosina). Esto hace que dos
cadenas complementarias de cidos nucleicos se unan entre s de forma muy especfica, es decir,
hibriden. Siguiendo este principio se pueden sintetizar sondas marcadas, cadenas de ADN o ARN
con una secuencia de bases determinada que llevan una molcula unida para poder detectarlas. La
secuencia de bases de la sonda es complementaria a otra que est presente en la clula,
normalmente en forma de ARNm. Con ello podemos observar qu clulas expresan un determinado
gen.
Tinciones generales
La mayora de los tejidos, sobre todo los de los animales, son incoloros y por ello necesitamos
teirlos para observar sus caractersticas morfolgicas. Las tinciones generales estn basadas en el
uso decolorantes, sustancias mediante las cuales se consigue colorear a los tejidos. Los colorantes
son normalmente hidrosolubles y se caracterizan por unirse a ciertas molculas presentes en los
tejidos gracias a afinidades qumicas. Se utilizan normalmente para teir a las clulas y
componentes tisulares que van a ser observados con el microscopio ptico y por ello se realizan
habitualmente sobre secciones de tejido, siendo las ms utilizadas las secciones obtenidas a partir
de inclusiones en parafina u obtenidas en el criostato. Los colorantes son los elementos principales
de las tinciones generales. Son molculas que poseen tres componentes importantes: un esqueleto
incoloro, que normalmente es un anillo aromtico de benceno, al cual se le unen dos tipos de
radicales: uno que aporta el color, denominado cromforo, y otro que posibilita la unin a elementos
del tejido denominado auxocromo. Al conjunto de estos tres elementos unidos en una molcula se
denomina cromgeno.
Segn la naturaleza qumica del cromforo hay varios tipos de colorantes: nitrosos, ozoicos,
derivados de la antroquinona, derivados de la acridina, derivados de iminas quinnicas, derivados de
diferrilmetano y triferrilmetano, derviados del xanteno y derivados de las talocianinas.
Segn la naturaleza qumica del radical auxocromo los colorantes se clasifican en:
Bsicos: son sales en las que la base aporta el color, mientras que la parte cida es incolora.
Tienen apetencia por sustancias cidas del tejido como el ADN o ciertos componentes de la matriz
extracelular como los glucosaminoglucanos. As, ponen de manifiesto el ncleo y el ARN, sobre todo
el ARNr presente en los ribosomas por ser muy abundante, as como ciertas matrices extracelulares
ricas en componentes cidos. Ejemplos de colorantes bsicos son la tionina, safranina, azul de
toluidina, el azul de metileno o la hematoxilina
cidos: son sales con el anin coloreado y la base incolora. Tienen apetencia por sustancias
bsicas, sobre todo estructuras proteicas localizadas en el citoplasma celular y tambin el colgeno
de la matriz extracelular. Ejemplos de colorantes cidos son la fucsina cida, verde rpido, naranja G
o la eosina.
Neutros: poseen una porcin cida y otra bsica, ambas con capacidad para aportar color. Por
tanto un mismo colorante puede teir tanto las partes bsicas como las cidas de los tejidos. Por
ejemplo, el eosinato de azul de metileno.
Indiferentes: realmente no se unen a elementos de los tejidos por afinidad qumica sino porque
se disuelven en ellos. Por ejemplo, el colorante sudn se disuelve en los lpidos y por tanto teir a
las gotas de lpidos, especialmente en los adipocitos.
En algunas ocasiones necesitamos resaltar elementos tisulares de manera especfica y para
ello usamos colorantes que tienen apetencia por dichas estructuras. Por ejemplo, la tincin
denominada azn contiene azocarmn y anilina-naranja-cido actico que tie los ncleos de rojo y
sobre todo destaca el conectivo intensamente teido de azul. Otra tincin combinada es el tricrmio
de Mallory que tie el colgeno de verde, las clulas musculares de rojo.
Cuando un colorante se une al tejido y refleja un color diferente al que tiene en solucin se dice
que ha ocurrido un fenmeno de metacromasia. Esto se debe a que las propiedades de absorcin de
la luz del colorante cambian al unirse a componentes celulares. Por ejemplo, el azul de toluidina se
vulve prpura cuando se une a ciertos grnulos de los mastocitos. Cuando el colorante unido al
tejido tiene el mismo color que en solucin se denomina ortocromasia.
Tincin general. Una de las tinciones ms comnmente usada en histologa es
la hematoxilina-eosina sobre cortes de parafina. Como vemos se usa un colorante bsico y otro
cido para teir de diferente color a las estructuras cidas y bsicas de la clula. Antes de proceder
a la tincin, si partimos de cortes de parafina, tenemos que llevar a cabo unos tratamientos previos
sobre las secciones como es el desaparafinado, puesto que estos cortes son hidrosolubles. Si
partimos de cortes de criostato esto no se lleva a cabo.

Seccin de un glomrulo de un rin de mamfero obtenida a partir de una inclusin en
parafina y teido con hematoxilina-eosina. Los ncleos aparecen de color violceo
(hemtoxilina) y el citoplasma de color rosado (eosina).

Pasos que se siguen durante una tincin general de
hematoxilina-eosina. Los tiempos son aproximativos
porque dependen del grosor de los cortes y de la
concentracin de los colorantes. El desparafinado permite
eliminar el medio de inclusin, la parafina. El paso por
agua de grifo es tpico de la hematoxilena y se
denomina diferenciacin. Las sales del agua permiten
obtener una coloracin ms violcea, en vez de prpura.
La deshidratacin final es necesaria porque el medio de
montaje no suele ser hidrosoluble. Estos medios de
montaje no afectan al tejido, ni a los colorantes y tienen
unas propiedades pticas excelentes. Adems, conservan
las preparaciones durante aos en buenas condiciones.
Tras el montado y secado (evaporacin del xileno), las
secciones se puede observar con el microscopio ptico.
Tincin de semifinos. Cuando se
procesa material para microscopa
electrnica es necesario, a veces, hacerse
una idea de qu zona del tejido vamos a
cortar. Tngase en cuenta que el rea de
una seccin para observar con el
microscopio electrnico es muy pequea.
Adems, el proceso de osmificacin que ha
de llevarse a cabo previamente a la inclusin
acarrea el oscurecimiento del tejido, con lo
que dificulta an ms la orientacin de la
muestra. Por ello es frecuente hacer
secciones de 0.5 a 1 m de grosor con el
ultramicrotomo, para orientarnos en la
muestra y seleccionar la zona a partir de la cual haremos las secciones ultrafinas. Los semifinos
suelen tener reas ms ms grandes que las que posteriormente vamos a usar para la obtencin de
las secciones ultrafinas. El colorante usado para teir secciones semifinas es normalmente el azul de
toluidina, el cual puede infiltrase en la resina calentada en un plancha y llegar hasta el tejido

Proceso de tincin de una seccin semifina. La porosidad de la resina,
el calor y las propiedades del colorante (azul de tolouidina) hacen que
se pueda ter el tejido sin necesidad de eliminar previamente la resina
.





Contraste de ultrafinos. El contraste no es estrictamente una tincin, puesto que no aporta
color a la muestra, pero s es un proceso para poder observar los componentes ultraestructurales de
la clula, por ese motivo lo incluimos en este apartado. Aunque las secciones para microscopa
electrnica se pueden observar directamente con el microscopio electrnico se suelen tratar
previamente con metales pesados en un proceso denominado contraste, obteniendo as una imagen
ptima de la ultraestructura celular. Tngase en cuenta que en la microscopa electrnica lo
importante no es aadir sustancias coloreadas sino molculas que puedan interferir con el camino de
los electrones emitidos por el microscopio y que atraviesan la muestra. Los electrones que
atraviesan la muestra inciden sobre una pantalla fosforescente que emitir destellos de luz cuando
reciban el impacto de un electrn y permite observar las caractersticas del tejido. Los metales
pesados unidos al tejido impedirn que pasen los electrones y por tanto se ver una zona negra en
la pantalla fosforescente, mientras que en aquellas zonas de la clula donde no estn estos metales
provocaran reas luminosas en dicha pantalla. Por ello todas las imgenes originales de
microscopa electrnica son en blanco y negro, aunque se puedan colorear posteriormente con un
ordenador.

Proceso de contraste de secciones semifinas. Los tiempos de incubacin en citrato de plomo y
acetato de uranilo son aproximativos. Las lentejas de hidrxido sdico eliminan humedad del
aire y dificultan la pricipitacin del citrato de plomo. Los lavados en agua se llevan a cabo
sumergiendo repetidas veces (en ingls, "deeping") la rejilla en el agua durante un tiempo de
aproximadamente 30 segundos en cada pocillo con agua destilada.




Histoqumica
Vamos a incluir dentro de las tcnicas histoqumicas a aquellas que supongan una reaccin qumica
en la que intervienen molculas pertenecientes al propio tejido (trataremos la deteccin de glcidos
mediante lectinas y la inmunohistoqumica en apartados diferentes a ste, aunque algunos autores
las incluyen como tnicas histoqumicas). El objetivo de la histoqumica es poner de manifiesto una
molcula o familia de molculas presentes en una seccin histolgica y estudiar su distribucin
tisular "in situ". Estas molculas son difcilmente discernibles con colorantes generales. Durante el
procesamiento del tejido previo a la reaccin histoqumica, como la fijacin o la inclusin, hay
que evitar daar a la molcula que queremos detectar porque de otra manera resultara en falsos
negativos, es decir, no tener tincin cuando en realidad la molcula de inters s est presente en el
tejido, aunque deteriorada. En algunas ocasiones es necesario realizar pasos previos a la reaccin
histoqumica para descubrir la molcula que queremos detectar, por ejemplo usando un fijador
adecuado, ya que de otra manera no reaccionara con los reactivos qumicos. Vamos a dividir las
tcnicas histoqumicas en dos grupos: reacciones qumicas e histoqumica enzimtica.
Las reacciones qumicas consisten en la modificacin qumica de molculas del tejido para
posteriormente poder colorearlas. Existen tcnicas histoqumicas para detectar glcidos, protenas y
nucletidos. La tcnica histoqumica ms empleada es la reaccin de PAS (Periodic Acid Schiff). Se
utiliza para la deteccin de hidratos de carbono, libres o conjugados, en los tejidos cuando estn en
cantidades relativamente grandes. La modificacin qumica del tejido consiste en la oxidacin
mediante el cido peridico de los enlaces entre los carbonos prximos que contienen grupos
hidroxilos. Esto provoca la formacin grupos aldehdos que sern reconocidos por el reactivo de
Schiff, el cual se combinar con ellos para dar un color rojizo brillante. Entre los componentes del
reactivo de Schiff est la pararosanilina (un componente de la fucsina bsica) tratada con cido
sulfrico. Una gran ventaja de la tincin histoqumica PAS es su capacidad de discriminacin de
tipos de glcidos con pequeas modificaciones de la tcnica.

Tincin con hematoxilina-eosina (imagen de la izquierda) y PAS-
hematoxilina (imagen de la derecha) de las vellosidades del intestino de
humano cortadas transversalmente. Se puede apreciar a las clulas
caliciformes teidas de rosado con la tnica de PAS por su alto contenido en
mucopolisacridos, mientras que en una ticin general aparecen
transparentes, sin teir.

Pasos de la tincin histoqumica PAS-Hemtaoxilina sobre
cortes de parafina. Los pasos con letras en color verde son
los especficos para esta tincin.
La histoqumica enzimtica o
histoenzimologa se basa en la capacidad que
tienen algunos enzimas del tejido de mantener
funcional su centro activo tras el proceso de
fijacin. Estos enzimas y las clulas que los
poseen se ponen de manifiesto mediante
una reaccin enzimtica que convierte a unos
sustratos solubles e incoloros en productos
insolubles y coloreados. Los sustratos son
especficos para el enzima y los productos se
depositan en el lugar preciso donde se produjo
la reaccin, es decir, donde se localiza el
enzima. Las enzimas que se pueden detectar
son variadas como las peroxidasas, fosfatasas,
deshidrogenasas, diaforasas, acetilcolinesterasa, etctera. Hay que tener en cuenta que cuando
queremos detectar una actividad enzimtica es recomendable no incluir el material para obtener
secciones puesto que la deshidratacin y la temperatura elevada pueden daar la conformacin de
la enzima y por tanto la actividad de su centro activo. Por ello estas tcnicas se realizan
normalmente en secciones obtenidas por congelacin o con el vibratomo.
En el esquema de abajo se muestra el proceso para la deteccin de la actividad NADPH
diaforasa, que actualmente se asocia a la enzimas sintasas del xido ntrico en sistema nervioso y
vascular. A estos enzimas se les ha relacionado con el control del flujo sanguneo y con ciertos
aspectos de la fisiologa del sistema nervioso. Esta tcnica permite detectar neuronas que expresan
la enzima sintasa del xido ntrico de una forma sencilla y rpida. La reaccin es NADPH + tetrazolio
= NADP
+
+ formazn. Es el formazn el producto coloreado e insoluble que se puede observar con
el microscopio ptico, incluso con el electrnico.

Imagen de un corte de 60 m de grosor de cerebro obtenida con un criostato y procesada para histoqumica
enzimtica que pone de manifiesto una actividad diaforasa perteneciente a la enzima xido ntrico sintasa
neuronal que aparece en algunas neuronas (clulas con un color azul intenso).

Los pasos para la deteccin histoqumica de la actividad
diaforasa es muy sencilla. Tras una fijacin,
preferentemente por perfusin, hay que permeabilizar el
tejido con un disolvente de lpidos como el Triton-X100.
El revelado se produce a 37
o
C y el final de la reaccin
se controla mediante observaciones peridicas. La
concentracin de los sustratos (NADPH y azul de
tetrazolio) vara segn el tejido o el proceso de fijacin.


Lectinas
Aparte de las tcnicas de tincin generales y las histoqumicas, ms especficas, existen otras que
se usan para detectar molculas tisulares con una alta especificidad. Ello es posible gracias a la
capacidad que tienen ciertas molculas como las lectinas o las inmunoglobulinas para reconocer y
unirse slo a una molcula determinada presente en el tejido. En esta pgina vamos a tratar sobre el
uso de las lectinas para la deteccin en los tejidos de distintos tipos de glcidos de manera
especfica. En muchos textos la tcnica de las lectinas se incluye dentro del apartado de la
histoqumica.
Las lectinas son protenas que tienen dominios o secuencias de aminocidos que son capaces
de reconocer y unirse a glcidos terminales que forman parte de cadenas de oligosacridos, bien
libres o formando parte de glucoprotenas. Por ello se dice que las lectinas reconocen
glucoconjugados. Las lectinas estn ampliamente distribuidas en los tejidos animales y vegetales y
sus funciones son muy variadas. Por ejemplo, la salida de los linfocitos desde el torrente sanguneo
hacia los tejidos daados se produce gracias a la accin de unas lectinas denominadas selectinas
que expresan las clulas endoteliales prximas al lugar de la lesin. Es decir, el linfocito puede salir
por la pared endotelial gracias a la unin de las selectinas endoteliales a los glcidos de la
membrana del linfocito. En el laboratorio de histologa las lectinas se usan, sin embargo, para
estudiar la distribucin tisular de distintos tipos de azcares de manera especfica. Se pueden usar
diferentes tipos de lectinas en base a su especificidad de reconocimiento de azcares determinados.
Hay al menos cinco grupos de lectinas segn se unan a manosa (Man), a galactosa/n-
acetilgalactosamina (Gal/GalNAc), a N- acetilglucosamina (GllNAc), a fucosa (Fuc) o a cido silico
(Neu5Ac), respectivamente.
Comercialmente hay disponibles docenas de lectinas diferentes que se nombran segn el
organismo animal o la planta de la que se obtienen. En el siguiente cuadro se listan las lectinas
usadas comnmente segn el glcido que reconocen.
Para poder observar el lugar de unin especfica entre la lectina y su glcido tenemos que unir
a la lectina un marcador que nos produzca una seal visible con el microscopio ptico o electrnico
de transmisin. Normalmente el marcaje consiste en la unin de una enzima como la peroxidasa de
rbano o la fosfatasa alcalina. Es el resultado de la reaccin enzimtica lo que se puede observar.
Tambin se usa como marcador una molcula fluorescente que se puede observar directamente en
el tejido con un microscopio de fluorescencia. Cuando la enzima o la molcula fluorescente estn
directamente unidas a la lectina se denomina mtodo de deteccin directa y cuando se unen a la
lectina mediante una molcula interpuesta se denomina deteccin indirecta. Las molculas
interpuestas ms comunes son la biotina o anticuerpos especficos (inmunoglobulinas tipo G)
obtenidos contra la lectina.

Pasos para la deteccin de glcidos con lectinas. Los tiempos pueden variar segn el material o la lectina usada. En este ejemplo
se usa un mtodo de deteccin indirecta puesto que la lectina lleva unida una protena intermendiaria que es la biotina, la cual
ser reconocida por la avidina del complejo ABC ("avidin-biotin-complex") que contiene molculas de la enzima peroxidasa. Es
la reaccin de este enzima tras aadir los sustratos apropiados, diaminobencidina ms perxido de hidrgeno, la que produce
productos insolubles y visibles con el microscopio ptico. El paso de BSA (albmina de suero bovino) sirve para saturar posibles
sitios de unin inespecficos de la lectina. Si en vez de cortes en parafina hubisemos usado cortes de vibratomo podrmos
procesar, tras la reaccin de la peroxidasa, dichos cortes para observar el producto de reaccin con el microscopio ptico y
tambin con el electrnico de transmisin.
La tcnica con lectinas se suele complementar con una serie de tratamientos que sirven para
obtener ms informacin acerca de la composicin sacardica de los glicoconjugados. Por ejemplo,
la desulfatacin se usa para demostrar las uniones tipo steres de sulfato de las cadenas terminales
y la eliminacin tipo beta permite conocer si las cadenas sacardicas son uniones con enlaces tipo O
(uniones covalentemente a grupos hidroxilo) o tipo N (enlaces convalentes a grupos amino). En este
ltimo caso la alcalinizacin de los cortes elimina las uniones tipo O.
Lectinas
La inmunocitoqumica es una tcnica para la localizacin de molculas en los tejidos mediante
el empleo de anticuerpos (protenas del tipo inmunoglobulina G). Es una tcnica que gracias a la
oferta comercial de anticuerpos y a la estandarizacin de su protocolo se ha convertido en un
mtodo sencillo, rpido y muy potente. Se basa en la gran especificidad y alta afinidad que tienen los
anticuerpos para reconocer a molculas y unirse a ellas. Adems, la conjugacin o combinacin de
los anticuerpos con enzimas o con sustancias fluorescentes permite detectar cantidades nfimas de
molculas presentes en el tejido.
Los anticuerpos o inmunoglobulinas que se usan en las tcnicas inmunocitoqumicas son del
tipo G, producidas por unas clulas del sistema inmunitario denominados linfocitos B. La produccin
masiva deanticuerpos se produce en un animal cuando le inyectamos una molcula que reconoce
como extraa, es decir, nuestra molcula problema. Estos anticuerpos pasan al suero sanguneo
que se extrae del animal inmunizado y a partir del cual se purifican los anticuerpos producidos, los
cuales se usarn posteriormente en la tcnica inmunocitoqumica. Las molculas complejas como la
protenas tienen en su estructura varios determinantes antignicos, es decir, lugares que son
capaces de desencadenar una respuesta inmune. Ello implica que cada determinante antignico
activar un clon, grupo de de linfocitos B, que producir anticuerpos contra l. Los anticuerpos de
todos los clones de linfocitos B activados por la molcula inyectada irn a parar al suero. Cuando se
emplean sueros purificados de este tipo en inmunocitoqumica se dice que se estn
empleando anticuerpos policlonales. Existe una tcnica que perimite aislar y cultivar en el laboratorio
(in vitro) de forma inividualizada a cada uno de los clones activados durante la respuesta inmune.
Cada uno de esos cultivos producir un tipo de inmunoglobulina G que reconocer slo a uno de los
determinantes antignicos de la molcula inyectada. A estos anticuerpos se les
denomina monoclonales ya que proceden de linfocitos que producen inmunoglobulinas idnticas.

Esquema resumido de las diferencias en la obtencin de anticuerpos policlonales (izquierda) y monoclonales (centro y derecha).
Las inmunoglobulinas tipo G pueden dividirse en dos dominos: la fraccin cristalizable y la
variable. El dominio variable es el que se encarga de reconocer al determinante antignico de
nuestra molcula. Hay dos sitios de unin por lo que cada inmunoglubulina podra reconocer a dos
molculas o determinantes antignicos, que han de ser iguales y estar muy prximos entre s. La
fraccin cristalizable tiene una estructura similar para todas las inmunoglubulinas G producidas por
los individuos de una misma especie.
Para que un anticuerpo se una a su determinante antignico localizado en una molcula, sta
no debe alterarse. De otro modo ese determinante antignico no ser reconocido por el anticuerpo.
Por ello el proceso de fijacin del tejido debe elegirse para preservar al mximo a la molcula que
queremos detectar. Por ello se usan diferentes fijadores segn el tipo de molcula en la que estemos
interados. Tambin es necesario considerar el mtodo de obtencin de los cortes. Inclusiones en
parafina pueden daar las molculas por lo que en la mayora de los casos se suele trabajar con
cortes de vibratomo o con secciones obtenidas por congelacin.
Las inmunoglobulinas, aunque se unan a la molcula que queramos detectar, no son visibles
con el microscopio por lo que la tendremos que conjugar (unirla) a otras molculas que nos den una
seal visible. Estas molculas que aportan visibilidad a los anticuerpos suelen ser de dos
tipos: molculas fluorescentes y enzimas. Las primeras se pueden observar con el microscopio de
fluorescencia mientras que las segundas pueden convertir determinados sustratos solubles en
productos insolubles y coloreados. La seal aparece all donde est la sustancia fluorescente o el
enzima, que es donde se ha unido la inmunoglubulina.
El mtodo del marcado con sustancias fluorescentes tiene una serie de ventajas que veremos
ms adelante, pero tiene la desventaje de que no son marcajes permanentes puesto que la luz
emitida por la molcula fluorescente se desvanece con el tiempo. Sin embargo, las secciones
procesadas con anticuerpos unidos a enzimas pueden deshidratarse, montarse y mantenerse
permanentemente para su obeservacin. Las enzimas habituales que se unen a las
inmunoglobulinas son la peroxidasa y lafosfatasa alcalina.

Mtodos de marcaje para detectar los anticuerpos primarios unidos especficamente a una molcula del tejido.
La conjugacin directa de un marcador (enzima o fluorescente) con la inmunoglobulina se
denominamtodo de deteccin directa. Hoy en da se suele emplear el mtodo de deteccin
indirecta, que consiste en colocar una serie de intermediarios entre la inmunoglobulina y la molcula
marcadora. Inicialmente se us el mtodo indirecto denominado peroxidasa-antiperoxidasa (PAP;
ver figura anterior), pero actualmente es ms frecuente usar el mtodo del complejo avidina-biotina-
peroxidasa (ABC; ver figura anterior). El mtodo indirecto permite una mayor versatilidad de la
tcnica y mayor intensidad de seal frente a una misma cantidad de antgeno.
La inmunofluorescencia se basa en las propiedades de los fluorocromos. Son molculas que
emiten luz visible cuando se les ilumina con una determinada longitud de onda. Aunque la
inmunofluorescencia se puede usar para detectar a una sola molcula tisular, su verdadero potencial
se muestra cuando necesitamos una mltiple inmunodeteccin, es decir, dos o ms molculas
presentes en una misma clula o matriz extracelular de forma simultnea. Esto es posible porque
existe una gran variedad de fluorocromos que son capaces de emitir luz visible tras ser excitados
con diferentes longitudes de onda, luego seleccionando el intervalo de longitudes onda con el que
iluminamos un tejido podemos excitar de modo individual, y secuencial, varios fluorocromos que
hayamos usado, unidos a inmunoglubulinas diferentes, para detectar molculas diferentes. Tomando
fotografas tras cada excitacin y superponiendo dichas imgenes podemos averiguar si las
molculas se expresan, por ejemplo, en la misma clula.

Deteccin de la molcula tirosina hidroxilasa mediante inmunocitoqumica usando un anticuerpo primario sin marcar, un
anticuerpo secundario conjugado con biotina y el complejo avidia-biotina-peroxidasa.

Inmunocitoqumica con deteccin indirecta y enzimtica. La seccin se obtiene de tejido previamente fijado. Inmediantemante
despus se incuban en una solucin de bloqueo que satura los posibles sitios de unin inespecfica, gracias a una alta
concentracin de protena como la albmina de suero bovino. Tras cada paso de unin de anticuerpos o del complejo avidina-
biotina-peroxidasa se procede a lavar los cortes en una solucin tamponada de fosfato (tampn fosfato), en la que tambin van
disueltos los anticuerpos. La reaccin de la peroxidasa convierte unos sustratos, la diaminobencidina y el perxido de hidrgeno,
en un producto insoluble y coloreado visible con el microscopio tico.

Deteccin con inmunofluorescencia de dos antgenos en una seccin de tejido nervioso: la molcula tirosina hidroxilasa (a la
izquierda) y el neuropptido Y (a la derecha), usando fluorescena y texas red como fluorocromos, respectivamente, mediante un
mtodo de marcaje indirecto. En esta seccin la tirosina hidroxilasa aparece en cuerpos celulares (flecha) mientras que el
neuropptido Y aparece en fibras. El asterisco indica donde est la clula con tirosina hidroxilasa, pero no emite luz visible
porque la foto se ha tomado iluminando la seccin con una longitud de onda que no excita a la fluorescena.

Deteccin simultnea de dos molculas situadas en el mismo tejido mediante inmunofluorescencia. La razn de que los dos
anticuerpos primarios procedan de dos animales diferentes es que los anticuerpo secundarios, obtenidos de otro animal,
normalmente cabra u oveja, inmunizados con las inmunoglobulinas de ratn y conejo, respectivamente, es lo que permite a cada
anticuerpo secundario reconocer y unirse a un anticuerpo primario determinado y no al otro.

Hibridacin In Situ
No se puede considerar a la hibridacin in situ como una tcnica de uso general. Sin embargo,
aporta una informacin sobre la fisiologa de las clulas y los tejidos que no es posible obtener con
otras tcnicas. La hibridacin in situ se usa ampliamente en investigacin en desarrollo embrionario,
diferenciacin de clulas madre, manipulaciones genticas o cambios en la fisiologa celular frente a
seales externas, entre otras.Permite descubrir la expresin de un gen mediante la deteccin de su
producto, el ARN mensajero. Podemos descubrir qu clulas expresan un gen determinado y
cundo lo expresan. La expresin gnica es un testimonio directo de la funcionalidad celular. Existe
otra aplicacin de la hibridacin y consiste en la localizacin fsica de un gen sobre un cromosoma.
La hibridacin in situ se basa en la complementariedad de bases de nucletidos. Del mismo
modo que en la inumocitoqumica se usan los anticuerpos, en la hibridacin in situ se usa
una secuencia de nucletidos, denominada sonda, que es complementaria a la secuencia del ARN
mensajero que queremos detectar y que est marcada con una molcula que luego pondremos de
manifiesto.
Quiz una de las razones por las que la hibridacin in situ no es comn todava en los
laboratorios de histologa es porque sintetizar una sonda es complicado y generalmente no se puede
usar en una especie animal o vegetal distinta para la que se ha producido dicha sonda. Ello es
porque un mismo gen (ARN mensajero), por ejemplo un mismo receptor de membrana, de distintas
especies tienen secuencias que no son idnticas y por tanto impiden la hibridacin de sondas que no
sean especficas. Sin embargo, una vez obtenida la sonda el proceso es sencillo.
Para obtener una sonda hay primero que clonar la secuencia de bases del gen (ARN
mensajero) que queremos detectar. Clonarl implica realizar una serie de pasos: 1) Una vez
purificado el ARN de nuestro tejido, los ARN mensajeros se retrotranscriben (transcripcin inversa),
es decir, se hacen copias complementarias de ADN de todos los fragmentos de ARN mensajero. Se
obtienen hebras de ADN denominadas cDNA. 2) Mediante la tcnica de PCR ("polymerase chain
reaction") se consiguen multitud de copias de manera especfica de la secuencia de ARN mensajero
que queremos estudiar. 3) Dichas copias se integran en un plsmido y posteriormente se introduce
en bacterias. 4) Se cultivan las bacterias para que proliferen y as tambin conseguir gran cantidad
de plsmidos, que se duplican en cada divisin bacteriana. 5) Los plsmidos se extraen y purifican.
6) Mediante un proceso de transcripcin similar al que ocurre en el ncleo de las clulas, a partir de
estos plsmidos se consiguen numerosas rplicas complementarias a nuestra secuencia inserta, que
ser tambin complementaria a la secuencia del ARN mensajero que queremos detectar. El
resultado de la transcripcin realizada repetidas veces es un gran nmero de cadenas de ARN
denominadas sondas. Durante su sntesis es cuando se aaden los nucletidos conjugados con las
molculas marcadoras que nos servirn para detectarla una vez la hibridacin se haya producido.
Normalmente son molculas pequeas como la digoxigenina y labiotina, aunque tambin se pueden
utilizar molculas fluorescentes, que se une a los nucletidos que formarn parte de la sonda.

Esquema resumido del proceso de hibridacin in situ. NBT (nitro blue tetrazolium) y el BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl
fosfato, sal de toluidina) son los sustratos de la fosfatasa alcalina.

Imagen que muestra neuronas (de color azul) que expresan el receptor D1 para la dopamina en el cerebro basal de una lamprea.

Esquema del proceso de hibridacin in situ sobre secciones de criostato.
La hibridacin in situ se puede combinar con otras tcnicas como la inmunocitoqumica o
tinciones generales.
Observacin
El ltimo paso de todo proceso histolgico es la observacin del resultado producido por la
tcnica realizada. El poder de resolucin del ojo humano es de 0.2 mm (poder de resolucin:
distancia mnima a la que se discriminan dos puntos), mientras que una clula eucariota tpica suele
tener unas dimensiones que oscilan entre 10 y 50 micrmetros (m. 1 m=10-6 mm). Adems, si
queremos estudiar la ultraestructura celular hay que tener en cuenta que el grosor de una membrana
celular es de unos 70 nanometros. Todo ello implica que necesitamos aparatos que nos permitan
aumentar al imagen de las muestras para discriminar estructuras tisulares diminutas como son las
clulas o sus compartimentos. Estos aparatos se llaman microscopios.
Hay dos tipos de microscopios: los pticos y los electrnicos.
Los microscopios pticos, o de campo claro, ultilizan la luz visible y lentes de cristal que
permiten un aumento de las muestras de unas 1000 veces, con un poder de resolucin de unos 0,2
micrmetros. Esto es la mxima resolucin que permite la luz visible, por sus propiedades de onda.
Se usan para observaciones generales, caractersticas celulares y tisulares, y estn presentes en
todos los laboratorios de histologa.
Los microscopios electrnicos se basan en la alta frecuencia de los electrones para conseguir
un poder de resolucin de 1 nanometro. Se usan para observar la ultraestructura de la clula y los
tejidos, es decir, para estudiar el nivel subcelular, como orgnulos, membranas u organizaciones
moleculares (por ejemplo, se pueden observar los ribosomas). Hay dos tipos de microscopios
electrnicos: los de transmisin, que se usan para estudiar la ultraestructura membranosa y
molecular de la celula, y el de barrido, que permite estudiar superficies.
A los microscopios, sobre todo los pticos, se les puede aadir dispositivos que permiten
ampliar su potencialidad. Por ejemplo, al microscopio ptico se le puede adaptar una fuente
luminosa y una serie de filtros para observar molculas fluorescentes, o filtros para destacar cambios
de densidad en el tejido, etctera. A las diferentes formas de utilizar los microscopios para la
observacin de caractersticas de los tejidos se les llama microscopa. As podemos hablar de
microscopa ptica, de contraste de fase, de fluorescencia, electrnica, etctera.
Microscopio Optico
El microscopio ptico es un elemento esencial para los estudios generales de histologa puesto
que es el que nos permite observar las diferentes caractersticas morfolgicas de las clulas y los
tejidos. Se basa en el uso de lentes para aumentar los rayos de luz que atraviesan una muestra de
tejido. Su invencin se remonta al siglo XVII. Desde entonces se ha ido perfeccionando hasta llegar
a los moderno microscopios. Durante estos siglos, el mayor avance en cuanto a perfeccin y calidad
se ha producido en su principal elemento, las lentes, las cuales aumentan la imagen de las
secciones de tejido y permiten hacer visibles al ojo humano detalles ntidos que de otra manera sera
imposible observar.
Los microscopios pticos tienen un lmite mximo de resolucin de 0,2 m. El poder de
resolucin es la distancia mnima a la que se pueden discriminar dos puntos. Este lmite viene
determinado por la longitud de onda de la fuente de iluminacin, en este caso la luz visible.
Contiene normalmente dos lentes: el objetivo y el ocular. El primero recoge la luz que atraviesa
la seccin de tejido, mientras que el ocular es el que forma la imagen que observamos. El aumento
total que permite un microscopio ptico se calcula multiplicando la magnificacin que producen el
objetivo por la que producen los oculares. Por ejemplo, si estamos usando un objetivo de 40x
(aumenta 40 veces) y un ocular de 10x (aumenta 10 veces), el resultado final sera de 400x, es decir,
vemos la muestra aumentada 400 veces. Usando microscopios pticos avanzados se consiguen
unos 1000-1500 aumentos (objetivo de 100x ms oculares de 10x o 15x). Algunos microscopios
pticos tienen lentes internas que producen aumentos adicionales que tendremos que tener en
cuenta para calcular la magnificacin de la imagen que se observa. No debemos confundir los
aumentos con el poder de resolucin. Por ms que consigamos aumentar una imagen tomada de un
microscopio, incluso con metodologa digital, no se puede aumentar la resolucin de la imagen.
PARTES del MICROSCOPIO
Un microscopio ptico bsico est formado por las siguientes partes:
Oculares. Son las lentes que forman la imagen que observaremos con nuestros ojos. Todos
los microscopios actuales poseen dos oculares, uno para cada ojo. Por eso a los microscopios
actuales se les llama binoculares. Los primeros microscopios eran monoculares, es decir, posean
una sola lente. Hay que tener en cuenta que en los microscopios ms avanzados tanto el objetivo
como el ocular suelen estar compuestos por varias lentes. En los microscopios ms bsicos al
menos uno de los oculares puede regularse, alejarse o acercarse al objetivo. Esto permite ajustar el
enfoque a las condiciones de visin, dioptras, de cada observador.

Partes de un microscopio simple.
Objetivos. Los objetivos son las lentes que reciben la imagen directamente de la seccin
histolgica y quiz sean los elementos ms importantes del microscopio. Hoy en da los
microscopios pticos poseen un tambor o revlver donde se encuentran varios objetivos. Cada uno
de ellos posee lentes que permiten diferentes aumentos. Las magnificaciones de los objetivos ms
usados suelen ser de 10x, 20x, 40x y 100x. Rotando el revlver se puede seleccionar el objetivo y
por tanto el aumento al que queremos observar la preparacin. Aparte de los aumentos, los objetivos
tienen una serie de caractersticas para mejorar la imagen. As, pueden ser acromticos, de fluorita o
apocromticos, los cuales corrigen alteraciones cromticas, de campo plano que eliminan la
curvatura del campo de observacin, etctera.
Cuando se usan objetivos de 100 aumentos (100x) es necesario emplear un lquido
denominado aceite de inmersin entre el objetivo y la muestra. Esto es debido a que la refraccin de
la luz es alta en el aire y provoca alteraciones en la imagen que se ponen de manifiesto con objetivos
con esta capacidad de aumento. El aceite de inmersin reduce enormente esta refraccin
permitiendo imgenes mucho ms ntidas.

Imgenes resultantes del uso de objetivos con diferentes aumentos (especificados en las imgenes) al observar un epitelio
estratificado plano queratinizado.
Platina. Es la plataforma donde se coloca el portaobjetos con nuestro tejido. Posee un
dispositivo para sujetar al portaobjetos, el cual se puede desplazar en el plano de la
platina, movimiento controlado manualmente.
Condensador. Es un dispositivo que contiene una lente que concentra y focaliza la
luz proveniente de la fuente sobre la seccin de tejido.
Diafragma. Se sita entre la fuente luminosa y el condensador. Permite aumentar el contraste
de la muestra y la profundidad de campo, es decir el espesor de la muestra que est enfocado.
Lmpara luminosa. Es la que proporciona la luz que atraviesa la seccin de tejido. Incialmente
se usaba la luz natural, la cual se poda concentrar en la seccin de tejido mediante espejos
cncavos. Actualmente se usa una lmpara cuyo haz de luz atraviesa, atraviesa el diafragma, el
condensador, la muestra, y tras ello penetra por el objetivo y atraviesa los oculares hasta nuestros
ojos. La intensidad de la fuente luminosa se puede regular mediante un reostato.
Macromtrico y micromtrico. El enfoque de la muestra se consigue variando la distancia de
la muestra a la lente del objetivo. Esta distancia depende de los aumentos que produzca el objetivo,
mayor cuando menores aumentos produzca, y del tipo de objetivo. Esto se controla mediante dos
ruedas denominadas macromtrico y micromtrico, respectivamente. La primera permite
movimientos ascendentes y descendentes amplios de la platina y la segunda ajustes finos.

Recorrido de la luz desde la fuente, a travs de los diferentes lentes de un microscopio bsico, hasta el observador.
MODIFICACIONES
Contraste de fase. Esta modificiacin del microscopio de campo claro necesita de objetivos
especiales y se basa en ligero retraso que sufre la luz cuando pasa por unas estructuras tisulares en
funcin de la densidad. De esta manera se consiguen diferentes luminosidades para distintas
estructuras tisulares. Se emplea para ver muestras sin teir o acuosas, as como clulas vivas, por
ejemplo en tejidos celulares.
Campo oscuro. La observacin en campo oscuro es un buen sustituto del contraste de fase
para observar especmenes sin teir o medios acuosos. Consiste en la incorporacin de un objeto
opaco bajo el condensador, entre la fuente luminosa y la seccin de tejido. Este objeto slo deja
pasar la luz ms lateral que incidir sobre la muestra de forma oblicua y slo aquella luz que sea
reflejada por la muestra llegar a los objetivos. All donde no haya tejido aparecer obscuro y
distintas densidades o propiedades del tejido reflejarn diferente cantidad de luz.
Contraste de interferencia y Nomarsky. Este tipo de microscopa aparece slo en los
microscopios ms avanzados y suponen tener objetivos especiales. Estos mtodos dan a los tejidos
un aspecto tridimensional, es decir, aumentan la profundidad de campo (espesor de tejido que est
simultnemente enfocado, es decir, que se ve ntidamente). Se basa en el uso de filtros que
polarizan la luz, lo cual consiste en dejar pasar slo a las que vibran en un determinado plano.
Posteriormente pasan por un prisma que reagrupa esta luz en elementos separados por una
distancia que es similar al poder de resolucin del objetivo que se est usando. Existe un prisma
para cada objetivo. Entonces la luz pasa por el muestra y las diferencias de densidad del tejido,
como los bordes de las clulas o densidades del interior celular o matriz extracelular, provocarn
alteraciones en la luz que se dirige hacia los objetivos, los cuales transformarn esas diferencias
en cambios en la luminosidad. Todava existe una lenteadicional entre el objetivo y los oculares que
permiten modular la luminosidad an ms.
FLUORESCENCIA
El microscopio de fluorescencia se usa para observar sustancias fluorescentes
denominadas fluorforos. Una molcula fluorescente es aquella que es capaz de captar radiacin
electromagntica con una longitud de onda determinada y emitir otra radiacin electromagntica con
otra longitud de onda diferente,normalemente dentro del espectro de la luz visible. Los fluorforos se
utilizan como marcadores para la deteccin de otras molculas tisulares, normalmente mediante la
tcnica de inmunofluorescencia. Los usados en microscopa absorven en el rango de la luz
ultravioleta, normalmente producida por una lmpara de mercurio, y emiten en el rango de la luz
visible. Para seleccionar el rango de longitud de onda con que sern iluminados se utilizan filtros
especficoslocalizados entre la fuente y la muestra que slo dejan pasar un determinado rango de
frecuencias. Con un tambor de filtros se consigue iluminar la muestra con diferentes rangos de
ondas electromagnticas y por tanto activar selectivamente a diferentes fluorforos.
La microscopa de fluorescencia nos permite usar ms de un fluorforo para detectar varias
molculas tisulares de forma simultnea siempre que el espectro de emisin de estos fluorforos no
se solape, puesto que entonces sera imposible discriminarlos.

Imgenes de fluorescencia. A la izquierda, inmunocitoqumica para el neuroppido Y en cerebro de rata, utilizando el fluorforo
Texas-Red. A la derecha, motoneuronas en cerebro de lamprea marcadas con el trazador neuronal fluorescena que es en s
mismo un fluorforo. Cada uno de los fluorforos se ha estimulado con frecuencias diferentes y lo que se observa es la emisin
en el espectro de la luz visible de cada uno de ellos, rojo y verde, respectivamente.
Una aplicacin ms avanzada de la fluorescencia se da en los microscopios confocales, los
cuales permiteneliminar la luz difusa procedente de fluorforos que estn en el tejido fuera del plano
de enfoque. Esta luz difusa, que aparece en los microscopios de fluorescencia convencionales,
provoca una difuminacin y prdida de nitidez de la imagen. Por tanto, con el microscopio confocal
se consiguen imgenes mucho ms ntidas y mediante la digitalizacin y solapamiento de planos de
foco sucesivos se pueden conseguir imgenes tridimensionales.

Microscopio electrnico
Cuando se quieren observar estructuras celulares que estn por debajo del lmite de resolucin del
microscopio ptico como orgnulos, membranas, estructuras citoslicas, complejos moleculares de
la matriz extracelular o virus, se recurre al microscopio electrnico. Se invent en la primera mitad
del siglo XX y su aplicacin a la histologa desvel las estructuras celulares ms pequeas
denominadas en su conjunto ultraestructura celular. Por tanto, observar ultraestructuralmente a la
clula significa observarla con el microscopio electrnico. Este tipo de microscopio tiene un lmite de
resolucin ms pequeo que 1 nanometro gracias a que no usan la radiacin electromagntica de la
luz visible sino la alta frecuencia de un haz de electrones que incide sobre la muestra, y permiten
aumentos de varios millones de veces.
El microscopio electrnico no usa lentes sino imanes que concentran los haces de electrones
emitidos por un filamento. Normalmente son aparatos grandes puesto que el viaje de los electrones
tiene que ocurrir en vaco. Por eso, aparecen grandes tubos dentro de los cuales se crea y manipula
el haz de electrones.
En histologa se usan dos tipos de microscopios electrnicos: de transmisin y de barrido.
Microscopio electrnico de transmisin
En este tipo de microscopio se produce el haz de electrones en un filamento de tungsteno, que
funciona como ctodo. Los electrones se condensan mediante electroimanes y se focalizan sobre
una seccin de tejido. Las secciones de tejido deben ser muy finas y se denominan ultrafinas (de
unas decenas de nanometros) para permitir que sean atravesadas por los electrones y para
conseguir imgenes ntidas. Previamente las secciones deben ser tratadas con metales
pesados como el osmio, el plomo y el uranilo. La funcin de estos metales es similar a las tinciones
usadas en el microscopio ptico, dar color a las estructuras celulares ya que se concentran en
ciertas estructuras celulares, fundamentalmente membranas y complejos macromoleculares. Los
electrones que chocan con estos metales rebotarn y no cruzarn el tejido. Aquellos que consigan
atravesar el tejido chocarn contra una pantalla fluorescente que emitir un destello luminoso tras
cada choque. Esa imagen emitida por la pantalla fluorescente es la que podemos observar nosotros.
Por ello las imgenes observadas con el microscopio electrnico son siempre en blanco y negro,
aunque posteriormente se pueden colorear con un ordenador.

Comparativa de la composicin bsica de un microscopio ptico (izquierda), electrnico de transmisin (centro) y electrnico de
barrido (derecha).

Imgenes tomadas en con microscopio electrnico de transmisin. Se puede ver la capacidad de estos microscopios observando
el incremento de resolucin de las imgenes de izquierda a derecha. Las lneas negras de la imagen de la derecha corresponden a
las membranas celulares
Microscopio electrnico de barrido
Los microscopios electrnicos de barrido sirven para observar superficies tisulares. Ello es
posible porque los electrones no atraviesan la muestra sino que interaccionan con su superficie.
Para que esto ocurra hay que cubrir a la muestra con una mscara de metales que se adapta
perfectamente al relieve de la muestra. La muestra se barre con el haz de electrones y los electrones
reflejados por ese punto de la superficie son captados por una pantalla receptora que crear un
punto de una imagen en una pantalla digital. La imagen completa se formar cuando el haz recorra
toda la superficie de la muestra y se consiga informacin de cada uno de los puntos. Es decir, se
escanea la muestra y de ah el nombre microscopio de barrido o en ingls "scannig".
Por supuesto, las muestras que se observan no son secciones, o al menos no son secciones
incluidas en resinas, sino que son trozos de tejido o superficies de secciones obtenidas con
vibratomo.

Imgenes obtenidas con un microscopio electrnico de barrido. Muestran el interior del canal central de una mdula espinal de
lamprea. Se pueden observar numerosos cilios (con ms detalle en B) y pequeas microvellosidades en los dominios apicales de
las clulas que forman las paredes de dicho canal. (Ver imagen de barrido de estomas de una hoja =>).