MSTER DE MICROBIOLOGA

Tcnicas Avanzadas:
PRCTICAS DE VIROLOGA
CURSO 2009/2010
DEPARTAMENTO DE BIOLOGA MOLECULAR
UNIVERSIDAD AUTNOMA DE MADRID
NOMBRE DEL ALUMNO:
Firma:
1
NORMAS DE SEGURIDAD BIOLOGICA
Presentacin por el Instructor
- Recordar los grados de peligrosidad biolgica
- Distintos niveles de seguridad.
- Tipos de precauciones en cultivos.
NORMAS
- Est prohibido comer, beber o fumar en los laboratorios de cultivos.
- Est prohibido pipetear con la boca.
- Es obligatorio el uso de bata.
- Es obligatorio lavarse las manos antes de empezar el experimento con el material biolgico
(evita contaminaciones) y cuando se sale del laboratorio.
- Todo el material biolgico (clulas y virus, y en especial estos ltimos) debe inactivarse con
leja antes de tirarlo.
- Los cultivos celulares no infectados por virus debern manipularse en las mismas condiciones
de seguridad que aquellos infectados.
- Se debe trabajar siempre con material estril (puntas, botellas,...).
- La mesa se descontaminar antes y despus del trabajo experimental. El material biolgico
derramado debe ser inactivado inmediatamente con hipoclorito.
- A falta de cabinas de seguridad biolgica para todos, se deber trabajar siempre cerca de la
llama.
PROCESAMIENTO DEL MATERIAL Y LIMPIEZA
- Vasos de precipitado grandes con hipoclorito (leja).
- Todo material que haya estado en contacto con clulas o virus se debe retirar aadindole
leja, y ponindolo en la zona de material sucio.
- Luz ultravioleta al final del da.
- TODOS LOS DAS, al terminar la prctica, se debe limpiar la mesa con leja y etanol. As se
conseguir tener un ambiente ms propicio para empezar la prctica al da siguiente.
- Lavarse las manos con jabn a menudo. Y, por supuesto, al final de cada da de prcticas.
2
PRCTICAS DE VIROLOGA
Ttulo de las prcticas
1.- Pases y siembras de clulas animales. Recuentos.
2.- Inoculacin con virus. El efecto citoptico (ECP).
3.- Inhibicin del ECP por antivirales.
4.- Valoracin de virus por formacin de placas de lisis.
5.- Localizacin subcelular de antgenos virales por inmunofluorescencia.
6. Diagnstico de virus por ELISA.
EQUIPO INVENTARIABLE MATERIAL FUNGIBLE
Genrico y Prcticas 1-3
Incubadores - Medio Dulbecco (DMEM)
Microscopios invertidos - Suero fetal de ternera (FCS)
Microscopio de Fluorescencia - PBS
Cabinas de flujo laminar - Placas de cultivo P60, P100 y M-24
Vortex - Tubos de diluciones
Centrfuga de clulas
- Frascos lavadores
Nevera - Puntas azules y amarillas
Congelador -20C - Tubos Eppendorf
Balas de CO
2
con manoreductor - Pipetas
Lector de placas multipocillos - Pipeteadores de cabina
- Leja. Alcohol. Papel Albal
- Jabn. Papel de filtro y servilletas
- Bolsas de basura autoclavables
- Cmaras de Neubauer para contar clulas
- Sulfato de dextrano
3
Prctica 4
Agar
Medio Dulbecco 2x
Formaldehido
Cristal violeta
Prctica 5
Portaobjetos para Inmunos
Cubreobjetos circulares para Inmunos
Anticuerpos Primarios contra Virus MVM
Anticuerpo anti-Rabbit con Texas-Red
Anticuerpo anti-Mouse con Fluoresceina
Mowiol
Metanol
Acetona
Prctica 6
Antgeno
Anticuerpo primario (policlonal de conejo)
Anticuerpo secundario (cabra anti-conejo conjugado a peroxidasa de rbano, HRP)
Sustrato para HRP
PBS, Tween 20
Microplacas de 12 pocillos
Agua destilada
Tubos Eppendorf
4
ORGANIZACIN DE LAS PRCTICAS
El guin debe ser completado por cada alumno.
Plan de trabajo experimental.
Lunes Prctica 1: Sembrar las clulas para las prcticas 2, 3, 4 y 5.
Martes Prcticas 2, 3 y 5: Infectar.
Mircoles Prcticas 2, 3: Ver el efecto citoptico.
4: Hacer diluciones e Infectar.
5: Fijar las monocapas
Jueves Prctica 5: hacer la inmunofluorescencia
Practica 6: realizar el ELISA
Viernes Prctica 4. Fijar y contar las placas de lisis.
5: Observar los resultados al microscopio
6. Cuantificar los resultados
Seminario: Preguntas y cuestiones
5
Prctica 1.- Cultivo de clulas animales. Siembras y pases.
Concepto: En esta prctica se proceder a sembrar las clulas necesarias para el resto de los
experimentos. Se manejarn dos tipos celulares que pueden crecer en un medio de cultivo comn,
como es el DMEM, suplementado con suero fetal de ternera al 5%. Estas clulas crecen ancladas
al soporte del plstico y pueden levantarse por tratamiento con tripsina y EDTA. En suspensin, la
concentracin celular puede determinarse utilizando un hemocitmetro o cmara de recuento
Neubauer.
Objetivos: Cultivar clulas eucariticas, realizar subcultivos y determinar el nmero de clulas en
una monocapa.
Reactivos, tampones y materiales
Clulas HeLa (P100 confluente)
Placas P60
Placas de 6 pocillos
Medio + Suero
Placa de 24 pocillos
Tripsina + EDTA
Mtodo:
1. Resuspender clulas.
- Retirar medio de las placas (HeLa), evitando contaminaciones.
- Aadir 1 ml de tripsina por P100, mover y retirar.
- Aadir 0.5 ml de tripsina, dejar actuar hasta redondeamiento celular.
- Resuspender en 5 ml finales por P100, en medio con suero.
2. Contaje.
- Contar en cmara de Neubauer ambas suspensiones. El hemocitmetro est dividido en
nueve grandes cuadrados, a su vez cada uno subdividido en diecisis cuadrados pequeos.
- Generalmente se cuentan cuatro cuadrados grandes, y el valor medio multiplicado por 10
4
y por el recproco del factor de dilucin, nos da el nmero de clulas/ml en la suspensin
original.
3. Siembra de clulas Hela.
a. ECP y antiviral: sembrar doce pocillos de una placa M24 con 100.000 clulas cada uno,
en 0.5 ml de medio.
b. PFU: sembrar 1 placa de 6 pocillos con 300.000

clulas por pocillo en 2ml.
c. Inmunofluorescencia: sembrar 1 placa P60 sobre cubres con 300.000

clulas en 5 ml.
Las placas deben quedar marcadas con el tipo de clula, el nmero de pase, la fecha y el nombre
del subgrupo.
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RESULTADOS PRACTICA 1
Dibujar la cmara de Neubauer y detallar cmo se calcula la concentracin celular, en clulas/ml,
de las muestras a partir de los contajes efectuados al microscopio. Anotar:
Tipo celular N Recuento Dilucin Clulas/ml

HeLa

A partir de estos datos, calcular el volumen que se ha de sembrar en cada una de las placas para
cultivar el nmero de clulas que se indica en el apartado de Mtodo, e indicarlo en la siguiente
tabla:
Tipo celular ml/P6 ml/P60 ml/M24

HeLa

CUESTIONES
1. Cul es la funcin de la tripsina en el mtodo? Es necesario siempre su uso en cualquier
lnea celular?
2. Por qu en el incubador hay una atmsfera de C0
2
y humedad controladas?
3. Cmo calcularas el tiempo de duplicacin de estas clulas? Te atreveras a estimar su
duracin aproximada?
4. Cuando tratas con tripsina y las clulas se redondean y levantan, ests sincronizando en
alguna fase del ciclo celular? Cmo podras obtener clulas en mitosis?
8
9
Prctica 2.- El efecto citoptico por infeccin viral
Concepto:
Los virus necesitan entrar en la clula y utilizar su maquinaria de sntesis de
macromolculas y fuentes energticas para replicarse, siendo incapaces de hacerlo por s solos.
Los efectos dainos de la replicacin viral en la clula son una de las causas bsicas de las
enfermedades virales. La infeccin viral puede llevar a varios resultados posibles, dependiendo de
la naturaleza de la infeccin entre el virus y la clula:
- Infeccin no productiva: La replicacin viral est bloqueada y la clula puede sobrevivir o no.
- Infeccin productiva: la clula lisa.
- Infeccin persistente: la clula puede sobrevivir y contina produciendo virus a bajo nivel.
Una de las formas clsicas para detectar la replicacin viral en las clulas es la observacin de
cambios en la estructura celular o Efecto Citoptico (CPE). Algunos de los efectos ms comunes
en la infeccin viral son cambios morfolgicos tales como:
- Redondeamiento de la clula y desprendimiento de la placa (en el caso de clulas adherentes).
- Lisis celular.
- Formacin de cuerpos de inclusin.
Muchos de los cambios morfolgicos (CPE) pueden ser efectos secundarios producidos en la
clula por la necesidad del virus para replicarse, pudiendo no ser efectos txicos producidos por
productos virales contra la clula. Sin embargo, hay algunos productos gnicos virales que causan
efectos txicos per s en la clula aunque se desconozca an su mecanismo molecular. As,
debido al efecto citoptico causado por los virus citolticos, la simple observacin al microscopio
ptico de la monocapa celular nos permite determinar si la infeccin viral se est desarrollando.
Objetivos: Visualizar y cuantificar el efecto citoptico producido por la infeccin del virus de la
Estomatitis Vesicular en clulas HeLa.
Mtodo
Vamos a infectar a baja multiplicidad una monocapa de clulas susceptibles al virus VSV. Como
el ciclo vital del virus tiene un tiempo de duracin de 8 horas, esperamos dos ciclos al menos
antes de leer los resultados y determinar el nmero de clulas en la monocapa.
Pasos a seguir:
1. Retirar medio de las placas.
2. Aadir el virus VSV a una MOI (Multiplicidad de Infeccin, en ingls) de 0.5 y 0.05 unidades
formadoras de placas (UFP) por clula en 0.2 ml de medio con 1% de suero. ste es el
volumen por pocillo que se debe infectar.
3. Poner en el incubador y agitar cada 15 min durante una hora.
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4. Retirar los inculos. Aadir 1 ml de medio con 2% de FCS. Incubar 24 horas.
RESULTADOS PRCTICA 2
Observar al microscopio ambas placas. Anotar si el aspecto de las monocapas celulares es
comparable o son distintos. Cuantificar el CPE segn la escala siguiente: +++ 100% de
destruccin de la monocapa; ++ 75%; + 50%; +- 25%; - 0%.
Dibujar toda la placa, indicando los resultados obtenidos.
CUESTIONES
1.- Por qu el nmero de clulas es inferior en la placa infectada?
2.- Obtendramos el mismo resultado en otro sistema virus - clula?
3.- Qu otro procedimiento sugieres para determinar la infectividad de un virus?
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Prctica 3. Inhibicin del efecto citoptico por antivirales.
Concepto:
El control de las infecciones virales exige la utilizacin de medidas profilcticas y
medidas teraputicas. Entre las medidas profilcticas, las vacunas han demostrado ser una buena
herramienta en el caso de algunos virus. Sin embargo la carencia de una profilaxis eficaz exige la
disponibilidad de agentes antivirales cuya actividad est perfectamente caracterizada y no
presente toxicidad para el paciente. Un agente antiviral debe cumplir varios requisitos:
- El compuesto debe ser soluble en agua y capaz de entrar en la clula infectada
- La concentracin efectiva del compuesto en la reduccin del crecimiento viral no puede tener
actividad citotxica, citosttica ni inmunosupresora
- El efecto del compuesto debe ser especfico para el virus y en ningn caso debe tener
capacidad mutagnica
- El ndice antiviral (el cociente entre la concentracin mnima citotxica y la concentracin
mnima efectiva) debe ser superior a 100 en ensayos in vitro y a 10 en ensayos in vivo.
Sin embargo, ninguno de los antivirales encontrados hasta el momento posee todas las
caractersticas mencionadas. Esto ha motivado la restriccin de la utilizacin de drogas con
actividad antiviral en clnica.
Los cultivos celulares constituyen un modelo muy apropiado para la seleccin y el estudio del
mecanismo de accin antiviral de nuevos inhibidores. Existe una enorme variedad de ensayos
para determinar de forma ms o menos rutinaria la actividad antiviral de compuestos entre los que
podemos destacar:
- Cuantificacin del porcentaje de clulas no infectadas: Ensayo de proteccin de CPE y ensayo
de reduccin de placas de lisis
- Cuantificacin de la inhibicin de actividad metablica celular, mediante la determinacin de
la sntesis de macromolculas celulares
- Cuantificacin de la actividad metablica del virus: Ensayos de ELISA, Hibridacin del cido
nucleico de la clula infectada con sondas virales etc.
Polisacridos Naturales
Los polisacridos sulfatados, entre los que se encuentra el Dextran Sulfato (que utilizaremos en
esta prctica) son compuestos naturales que producen una fuerte inhibicin de la replicacin de un
gran nmero de especies virales, como el Herpes y el VIH. El mecanismo de accin de los
polisacridos sulfatados parece afectar a un paso temprano de la infeccin viral. Se han descrito
casos en los que se inhibe la adsorcin del virus a la clula. Sin embargo, tambin se ha observado
la entrada de Herpesvirus a la clula tratada con este antiviral, encontrando la inhibicin en un
paso inmediatamente posterior.

Objetivos: Visualizar y valorar cuantitativamente la inhibicin en el CPE y propagacin viral
que produce el sulfato de dextrano.
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Mtodo
- Dos pocillos de M24 se infectan con VSV a MOI 0.5, otros dos a MOI 0.05, y dos se dejan
como control sin infectar.
- Aadir en el medio, despus de la adsorcin viral 50 y 500 g/ml (el stock inicial est a 2
mg/ml) final de sulfato de dextrano, en pocillos infectados y controles. Incubar 24 horas.
RESULTADOS PRCTICA 3
Observar la morfologa de las clulas y obtener los datos como en la prctica anterior.
De la prctica en que se titulan estas muestras, calcular el grado de inhibicin producido por el
antiviral.
CUESTIONES
1.- Habramos obtenido el mismo resultado si este antiviral se hubiese utilizado en la infeccin
con otro virus?

2.- Se observa efecto txico del antiviral en las clulas no infectadas?
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Prctica 4.- Valoracin de virus animales por formacin de placas de lisis.
Concepto:
La presencia de los virus se reconoce por la manifestacin de alguna anormalidad en
los organismos o clulas del husped. En cultivos celulares, los sntomas de la infeccin viral
varan desde cambios morfolgicos y de crecimiento hasta efectos citopticos tales como
redondeamiento celular, rotura celular, desarrollo de inclusiones, formacin de sincitios y lisis.
Los virus pueden contarse por ensayos basados en su capacidad de infectar, multiplicarse y
producir progenie capaz de causar efectos citopticos visibles, esto es, en unidades infecciosas. La
estimacin del nmero de virus o unidades infecciosas por unidad de volumen se conoce con el
nombre de titulacin.
Para titular un virus, primero hay que definir muy bien las lesiones que produce. Estas lesiones
pueden ser: lisis, fusin, agigantamiento, proliferacin celular, etc. En el mtodo de las unidades
formadoras de placa (UFP), varias monocapas celulares se infectan con diluciones seriadas de la
suspensin del virus. Despus de una o dos horas se cubre la monocapa con un medio semislido.
All donde un virus ha infectado a una clula, aparece al cabo de 2-3 ciclos de infeccin una placa
visible, resultante de la infeccin de las clulas adyacentes a la inicialmente infectada. El medio
semislido evita que las nuevas partculas virales se difundan por toda la monocapa. El requisito
para que el mtodo funcione es que las clulas infectadas deben poderse distinguir claramente de
las no infectadas. El mtodo ms usado suele ser teir la monocapa con un colorante citolgico
inespecfico, o bien usar rojo neutro como colorante vital. De esta forma las placas podrn
contarse fcilmente y el ttulo se expresar en unidades formadoras de placa por mililitro
(UFP/ml). Existe una relacin directa entre el nmero de virus en una suspensin inicial y el
nmero de placas resultante.
Objetivos: Cuantificar el nmero de unidades formadoras de placas de lisis por ml de un pocillo
de la prctica anterior infectado con VSV y otro donde sea menor el ECP.
Mtodo
Una placa no se infecta y se lleva como control. Las otras placas se inoculan con las diluciones de
virus. Pasos a seguir:
1. Hacer diluciones hasta 10
-6
de virus control y 10
-5
de virus tratado con antiviral (en
condiciones anlogas al pocillo elegido solo con virus) en medio con 1% de suero.
2. Retirar el medio de las placas y lavar con 0.5 ml del mismo medio.
3. Inocular con 0.5 ml por pocillo de las diluciones 10
-4
, 10
-5,
10
-6
de VSV control y con 10
-4
y
10
-5
de VSV tratado con antiviral.
4. Poner en el incubador y agitar cada 15 min durante una hora.
5. Retirar el inculo y aadir 2 ml por pocillo de medio con suero y agar, previamente
estabilizado a 50C.
6. Incubar 48 horas.
7. Aadir 2 ml de formaldehdo 10% sobre el agar, esperar 15 min.
8. Levantar el agar con cuidado y teir 15 min con cristal violeta.
9. Recuperar el colorante. Lavar las placas con agua.
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RESULTADOS PRCTICA 4
UFP UFP/ml

UFP en la
Sin infectar muestra de virus

+ VSV

+ Antiviral
+ VSV

Tener en cuenta en los clculos las diluciones de partida.
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CUESTIONES
1.- Dara el mismo ttulo si se emplease otro tipo celular como monocapa indicadora?
2.- Son infecciosos todos los virus en el preparado?
3.- Es suficiente una hora de adsorcin?
4.- Son todas las placas de lisis idnticas? Qu parmetros podran afectar a su tamao?
5.- Cmo titularas un virus que infectase clulas no adherentes?
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Prctica 5. Localizacin subcelular y ensamblaje de protenas virales
Concepto: Anticuerpos contra protenas que forman las cpsidas de los virus, pueden permitir
localizar dentro de la clula los lugares de acumulacin y el ensamblaje de las partculas virales.
Si se emplean anticuerpos con distinta capacidad de reconocimiento de intermedios de
ensamblaje o cpsidas completas, se puede inferir los lugares de maduracin de las partculas
virales dentro de las clulas.
El parvovirus diminuto del ratn (MVM) es un virus carioflico cuya cpsida de un dimetro
de 25 nm est formada por 60 subunidades de protena estructural (VP), de las cuales alrededor
de 10 son VP1 (83 kDa) y 50 de VP2 (63 kDa). El virus MVM madura en el ncleo, al que se
transportan, en las etapas tardas del ciclo vital, las protenas VP como intermedios trimricos de
subunidades, gracias a secuencias especficas de transporte nuclear. Una vez las subunidades se
ensamblan en cpsidas vacas, el genoma se empaqueta a partir de intermedios replicativos de
DNA.
Figura . Seales reguladoras de transporte y ensamblaje del ciclo vital del Parvovirus MVM
Objetivo: Observar la sntesis y acumulacin de las protenas de la cpsida del parvovirus MVM
y el compartimiento celular donde se produce la formacin de las cpsidas, con anticuerpos
especficos e inmunofluorescencia.
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Anticuerpos primarios.
- Pab: Anti-VPs desnaturalizadas: anticuerpo policlonal de conejo obtenido frente a VP2
desnaturalizada. Se emplea 1/200 en las inmunofluorescencias (IF).
- Mab: Monoclonal (mc) anti-cpsidas de MVMp (B7): Reconoce especficamente la espcula
en el eje de simetra de orden 3 de cpsidas de MVM. Utilizado a dilucin 1:1.00 en IF.
Anticuerpos secundarios.
- Texas red anti-conejo: Empleado en IF 1/500.
- FITC anti-ratn: Empleado en IF a una dilucin 1/500.
Mtodo
Da 1: Sembrar Hela en P60 sobre cubres, a auna densidad aproximada de 2x10
4
cel/cm
2
.
Da 2: Pasar con pinzas flameadas dos cubres a pocillos de placas M24. Lavar dos veces con
PBS. Comprobar al microscopio un buen aspecto de las clulas, o en su caso seleccionar los
pocillos mejores.
Inoculacin con MVM: emplear una MOI aproximada de 0.1-1 PFU/cel a partir del tubo de virus
distribuido. Inocular en 0.2 ml por pocllo de PBS+ y mantener la adsorcin durante 30-60 min. a
37 C. Retirar el inculo, lavar dos veces con PBS+, y aadir medio con suero 2 ml por pocillo.
El otro cubre se debe procesar igual pero sin aadir virus (muestra Mock), como control negativo
en las immunofluorescencia.
Da 3: Retirar el medio, lavar con PBS+ dos veces. Fijar los dos cubres con metanol-acetona 1:1
mantenido a -20 C. Dejar en el congelador 8 minutos. Retirar y dejar a temperatura ambiente
para que se seque unos 2-3 minutos. Guardar a -20 C o proceder con la immunofluorescencia.
Inmunofluorescencia indirecta (IF).
Los cubreobjetos de 12mm de dimetro colocados en las placas al sembrar las clulas, se
rehidratan durante 10 minutos en PBS a temperatura ambiente (RT) y posteriormente se
preincuban con 20% de FCS en PBSi durante 10 minutos a RT. Tras dos lavados de 5min con
PBSi se incuban con uno o dos anticuerpos primarios diluidos en PBSi con 5% de FCS a las
diluciones apropiadas y se mantiene en una cmara hmeda durante 45min a 37C. A
continuacin se realizan dos lavados de 10min con PBS y se incuba con el/los anticuerpo/s
secundarios a las diluciones apropiadas y en las mismas condiciones que los primarios. Despus
de lavar nuevamente con PBS se sumergen en agua, se deshidratan en etanol absoluto y se
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adhieren al portaobjetos con Mowiol. Dejar secar durante la noche en la oscuridad a temperatura
ambiente o tras un mnimo de 1h a 37 C.. Las preparaciones se observaron en un microscopio de
fluorescencia (por ejemplo Zeiss Axioskop MC 80) con filtros adecuados para los flors
secundarios.
-Dia 4. Visualizar protenas y cpsdas de MVM al microscopio de ultravioleta.
RESULTADOS PRCTICA 5
% Clulas Pab+ % Clulas Mab+
N N/C C N N/C C


Sin infectar (MOCK)

+ MVM

Indicar adems si la tincin especfica sucede en el citoplasma (C) o en el ncleo (N) de las
clulas, o bien es mixta (N/C).
CUESTIONES
1.- Para qu se fijan las clulas con metanol-acetona? Valdra cualquier fijador, o se obtendra
resultados similares?
2. Dnde se obtiene tincin de las cpsidas dentro de las clulas? Qu implicaciones pueden
derivarse de este Resultado?
3. Qu resultados podramos obtener con Virus de desarrollo citoplasmtico? Se te ocurre un
ejemplo?
4. Cmo distinguir si los resultados obtenidos corresponden con un primer ciclo vital, o se estn
superponiendo ms de un ciclo a partir de re-infecciones sucesivas?
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5. Con los resultados obtenidos, puedes decir algo de la eficacia del proceso de ensamblaje para
este virus?
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6. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Deteccin de antgenos virales.
Conceptos: La tcnica inmunolgica denominada ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay) es un poderoso test, basado en el uso de anticuerpos, que se emplea para detectar agentes
patgenos que provocan enfermedades como el SIDA y el SARS, o para buscar trazas de
patgenos en el agua, en alimentos, o en el aire, cuando aparezcan estos agentes de forma natural
o como consecuencia de contaminacin intencionada de estos medios. La tcnica ELISA tambin
se utiliza para identificar organismos genticamente modificados (GMOs), o para rastrear la
presencia de alergenos alimentarios, marcadores moleculares de embarazos, o de drogadiccin,
etc.
Mediante el uso de anticuerpos especficos podemos reconocer posibles antgenos procedentes de
organismos patgenos con una altsima especificidad. Como balas mgicas, los anticuerpos
localizan y se pegan a las molculas diana. Al pegarse a estas molculas forneas, los anticuerpos
los convierten en reconocibles para las clulas del sistema inmune. Los anticuerpos constituyen
una herramienta muy til y por ello se usan en biotecnologa y en diagnstico de enfermedades y
su tratamiento.
Para la siguiente prctica, vamos a utilizar un Kit comercial especialmente diseado para la
rpida deteccin de un antgeno extrao. En nuestro caso, vamos a simular la deteccin de un
antgeno viral, tal y como podra llevarse a cabo en cualquier procedimiento de diagnstico
clnico. La tcnica del ELISA admite diferentes variantes: identificar un antgeno dado o
identificar la presencia de anticuerpos especficos contra un antgeno dado. Utilizar diferentes
reactivos de deteccin del ensayo, como fosfatasa alcalina o peroxidasa.
Por tratarse de un Kit ya preparado, simplemente se proceder a seguir detalladamente las
instrucciones dadas por la casa suministradora
Vdeo demostrativo:
http://www.bio-rad.com/LifeScience/jobs/2004/04-0522/04-0522_ELISA.html
Objetivos didcticos:
Aprender sobre las interacciones antgeno-anticuerpos
Entender cmo detectar HCV, HIV o cualquier otro virus en el laboratorio
Aprender cmo se transmiten los agentes patgenos, cmo se diagnostican y se rastrean
Entender cmo se producen en el laboratorio los anticuerpos para uso diagnstico
Estudiar la unin enzima-sustrato
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Mtodo:
1. Partir de una fila con 12 pocillos (procedentes de una placa multipocillos de 96)
2. Adsorber el Ag: 50 l!pocillo "siempre# 5 min
3 $a%ar %arias %eces con P&'
4 ()adir (c primario en control * "+,-, P,. +./P$/0(-,# y los sueros 1 y 2 -e1ar un
control "2# 5 min $a%ar %arias %eces
5 ()adir (c secundario en todos los pocillos 5 min $a%ar %arias %eces /3P,.+(4+5
6 ()adir reacti%o "sustrato# para reacti%ar color 0uanti6icar
RESULTADOS PRCTICA 6.
Mediante un sistema rudimentario de cruces (-, +/-, +, ++/-, ++, +++/-, +++) representa tus
resultados a continuacin.
Algunos materiales:
Ag: Protena viral en suero
1er Ac: Anti-protena de la cpsida
(Policlonal. Conejo)
2 Ac: Conejo anti-Ratn IgG-HRP (HRP: HorseRadish Peroxidase Peroxidasa de rbano
picante)
(Policlonal. Cabra)-HRP
Sustrato HRP: TMB (TMB: 3,3,5,5-TetraMethylBenzidine)
Error: Reference source not found
Lectura a 655 nm
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CUESTIONES
1.- Cmo tendramos que haber procedido para detectar antgenos en vez de anticuerpos?
2.- Si trabajaras en un hospital Se te ocurre algn test extra antes de decirle, por ejemplo, a
un paciente que tiene una infeccin viral?
3.- Consideras que la tcnica es cualitativa o cuantitativa?
4.- Explica la finalidad de cada uno de los controles utilizados. Por qu hacer el experimento
por triplicado?
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