TESIS Reaccion Cadena Polimerasa Diagnostico Tuberculosis

TESIS DE DIPLOMA
Aplicacin de la Reaccin en Cadena de la

Polimerasa en el diagnstico rpido de
Mycobacterium tuberculosis.

Autor: Moiss Puma Yance Morales.

UNIVERSIDAD DE LA HABANA
Facultad de Biologa
INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL PEDRO KOURI
Centro Colaborador OPS/OMS para la Referencia e Investigaciones en
Tuberculosis y Micobacterias
2009

UNIVERSIDAD DE LA HABANA

Facultad de Biologa

TESIS DE DIPLOMA

Empleo del gen hsp65 en el diagnstico rpido de Mycobacterium
tuberculosis.

AUTOR: Moiss Puma Yance Morales.

TUTORES: Lic. Iliana Valds Hernndez, MSc.

Lic. Sergio L. Yzquierdo Silverio, MSc.

ASESOR: Dr. Ernesto Montoro Cardoso, PhD.

INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL PEDRO KOURI

2009

"Muchas veces debemos cambiar todos nuestros conceptos, no solamente los
conceptos generales, los conceptos sociales y filosficos, sino tambin, a veces, los
conceptos mdicos, y veremos que no siempre las enfermedades, se tratan como se
trata una enfermedad en un hospital, en una gran ciudad; veremos entonces, cmo el
mdico tiene que ser tambin agricultor,... un poco pedagogo .... cmo tendremos que
ser polticos tambin; como lo primero que tendremos que hacer no es ir a brindar
nuestra sabidura, sino ir a demostrar que vamos a aprender con el pueblo".
Ernesto Guevara (El Che)

A mi querida familia, Mario, Carmen, Ernesto,
Sarina, Salvador, Abuela Eva, Micaela y Camila,
por todo el apoyo incondicional. Gracias
LO LOGRAMOS!

AGRADECIMIENTOS

Mis ms sinceros agradecimientos a:

Mario Yance Sullca y Carmen Mara del Rosario Morales Ponce. Los
promotores de mi existencia.(agradecimiento muy especial)

Ernesto, Sarina, Salvador, Micaela, Mi abuelita Eva, Camilita (la nueva joya
familiar) y mis tos Queca y Lucho Pecho. Quienes colaboraron en mi
formacin y me ensearon el sentido de la vida, solidaridad, la unin familiar y
el deseo de superacin. (agradecimiento muy especial)

To Fernando Morales Ponce, que la oscura soledad en la que te encuentras no
destruya tus ideales de cambio y justica.

Eleine Rodrguez C., mi compaera de toda la vida, Elvia y Alvarito por sus
consejos y su gran apoyo.

Odalys y Simn por guiar mis primeros pasos en este hermoso pas.

Todo el plantel de investigadores de Bacteriologa-Micologa del instituto Pedro
Kouri, especialmente a:
Mis queridos tutores, Mara Teresa, Carlos Fernndez, Ral, Lili, Gerardo,
Rosi, Yosli y Ernesto Montoro por la asesora.

Mis compatriotas y amigos de la beca, quienes me soportaron en los momentos
ms difciles de la carrera, en especial a Yoandri Hinojosa y Natacha Carlos

A todos los que de alguna manera contribuyeron en la realizacin de este material,
Muchas gracias!

RESUMEN

La tuberculosis es causa de elevada morbilidad y mortalidad a nivel mundial, con 8
millones de casos nuevos y entre 2-3 millones de muertes, cada ao. El problema
mundial de la Tuberculosis empeora cada ao con la diseminacin de la enfermedad
multidrogoresistente y el incremento de la susceptibilidad de los individuos VIH
positivos para desarrollar la enfermedad. Durante un siglo el diagnstico de la
tuberculosis, basado en la baciloscopa y el aislamiento e identificacin de
Mycobacterium tuberculosis en los cultivos, ha sido lento y poco sensible. La mejora
en el control de la tuberculosis depende del desarrollo y aplicacin de mejores medios
para diagnosticarla. En este trabajo se emple un mtodo para la identificacin rpida
de micobacterias, basado en la utilizacin de la reaccin en cadena de la polimerasa
del gen que codifica para la protena de 65 kDa. Se realiz el anlisis de los patrones
de restriccin del gen amplificado y las pruebas bioqumicas convencionales a 40
cepas de bacilos cido-alcohol resistentes crecidas en medio de cultivo slido,
aisladas en el Laboratorio Nacional de Referencia de Tuberculosis, del Instituto de
medicina Tropical Pedro Kour, en el perodo comprendido entre enero y diciembre
del 2008. Los resultados se obtuvieron al cabo de 48 horas correspondindose con el
patrn especfico del complejo M. tuberculosis. El PRA-hsp65 mostr un 100% de
sensibilidad y concordancia en comparacin con las pruebas bioqumicas. Basados en
nuestra experiencia prctica, creemos que esta tcnica provee de una alternativa
rpida para el diagnstico de la Tuberculosis.

Palabras Clave: Complejo Mycobacterium tuberculosis, Reaccin en cadena de la
polimerasa, patrones de restriccin.

ABSTRACT

Tuberculosis is a major cause of morbidity and mortality worldwide, with 810 million
new cases and 23 million deaths each year. The global problem of Tuberculosis is
worsening with the spread of multidrug-resistant disease and the increased
susceptibility of HIV-infected individuals to developing tuberculosis. For a century, the
diagnosis of tuberculosis, based on bacilloscopy and the isolation and identification of
Mycobacterium tuberculosis in cultures, has been slow and not very sensitive.
Improved control of TB depends on development and application of better means of
diagnosing it. A method for the rapid identification of mycobacteria to the species level
was used on the basis of evaluation by the polymerase chain reaction of the gene
encoding for the 65-kDa protein. PCR restriction enzyme pattern analysis and
conventional biochemical test were performed on 40 strains from solid culture media of
acid-fast bacilli, isolated in the National Reference Laboratory of tuberculosis from
Tropical Medicine Institute Pedro Kouri, between January and December 2008. We
obtained specific patterns belonging to the M. tuberculosis complex in 48 hours. The
PRA-hsp65 technique showed 100% sensibility and concordance in comparison with
biochemical test. Based on our practical experience, we believe that PRA-hsp65 has
the potential to provide a rapid alternative to diagnosis tuberculosis.

Key words: Mycobacterium tuberculosis complex, polymerase chain reaction,
Restriction enzyme pattern

NDICE

1. INTRODUCCIN:...................................................................................................... 1
1.1 Objetivos .............................................................................................................. 4
2. REVISIN BIBLIOGRFICA.................................................................................... 5
2.1 Antecedentes histricos: ...................................................................................... 5
2.2 Taxonoma: .......................................................................................................... 6
2.3 Caractersticas generales: ................................................................................... 6
2.4 Virulencia: ............................................................................................................ 8
2.5 Gentica:.............................................................................................................. 9
2.6 Diagnstico convencional: ................................................................................. 11
2.6.1 Baciloscopa: ............................................................................................... 11
2.6.2 Cultivo microbiolgico:................................................................................. 12
2.7 Nuevas tcnicas de identificacin: ..................................................................... 15
2.7.1 Mtodos genticos de identificacin:........................................................... 16
3. MATERIALES Y METODOS................................................................................... 20
3.1 Cepas:................................................................................................................. 20
3.1.1 Cepas de trabajo: ......................................................................................... 20
3.2 Identificacin por Pruebas Bioqumicas: ............................................................. 20
3.2.2 Tcnica del PRA:.......................................................................................... 22
3.3 Anlisis estadstico:............................................................................................ 25
4. RESULTADOS........................................................................................................ 26
5. DISCUSIN............................................................................................................. 29
6. CONCLUSIONES.................................................................................................... 38
7. RECOMENDACIONES ........................................................................................... 39
8. REFERENCIAS....................................................................................................... 40

INTRODUCCIN

1. INTRODUCCIN:

Durante toda su historia, la especie humana ha sido peridicamente atacada por
diferentes agentes biolgicos que han puesto en peligro su propia existencia. Uno de
estos microorganismos es precisamente Mycobacterium tuberculosis, causante de la
enfermedad infecciosa denominada tuberculosis (TB).

Se ha estimado que la tercera parte de la poblacin mundial, en su mayora
pertenecientes a los pases del tercer mundo se encuentra infectada por esta bacteria.
Sin embargo, solamente entre el 5-10% de esta poblacin desarrolla la enfermedad en
su forma activa, mostrando sntomas clnicos en los primeros 2 aos (TB primaria) o
ms tarde (reactivacin) (Santiago et al., 2005; Al-Attiyah et al., 2006).

La TB es considerada en la actualidad emergencia mundial por la Organizacin
Mundial de la Salud (OMS), la cual ha reportado la existencia de 8 millones de nuevos
casos, con una mortalidad estimada de 3 millones de personas por ao (Jimnez et
al., 2001; Castro et al, 2005). Segn el reporte publicado en el 2008 por esta
organizacin, frica, fue el continente que mostro mayor tasa de incidencia mientras
que en las Amricas, el ndice de mortalidad fue de 5 casos por cada 100 000
habitantes, siendo Brasil, Hait, y Per los pases con ms alto ndices de fallecidos.
En Cuba, la tasa registrada en el 2007 fue de 6.7 x 100 000 habitantes, la mortalidad
en los ltimos 7 aos no ha tenido variaciones significativas y se ha mantenido por
debajo de 1 x 100 000 habitantes (World Health Organization, 2008; MINSAP, 2008).

El alto ndice de nuevos casos se debe a diversos factores como el descuido de los
programas de control, los altos ndices de pobreza y el aumento de pacientes
coinfectados con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH/TB) (Garca, 2007)

Introduccin

1

Afortunadamente se han venido realizado grandes esfuerzos para dar una respuesta a
esta enfermedad, la cual puede ser curable, siempre y cuando se detecte a tiempo,
mediante un diagnstico preciso y que el paciente se mantenga dentro de un rgimen
de tratamiento estrictamente supervisado (TAES) (Guevara et al., 2003).
En la actualidad la TB es identificada por los procedimientos clsicos de microbiologa,
los cuales incluyen la tincin de Ziehl-Neelsen y el cultivo en medio de Lwestein
Jensen, ambos considerados como tcnicas de referencia en el diagnstico de TB
(Barrn et al., 2006).

Sin embargo, gracias a los grandes adelantos tecnolgicos y al surgimiento de los
estudios de biologa molecular, nuevos mtodos de diagnstico se estn
desarrollando, e inclusive se aplican de forma rutinaria en algunos pases del primer
mundo. Entre ellos se encuentran los mtodos de cultivo automatizado (BACTEC TB-
460, MGIT-960, Versa TREK, BacT/ALERT 3D), el diagnstico fenotpico no
convencional, el anlisis de los cidos miclicos de la pared celular y las pruebas de
identificacin genotpica (Tortoli, Palomino, 2007).

Dentro de las pruebas fenotpicas, los mtodos basados en el anlisis lipdico, tales
como la cromatografa lquida de alta eficiencia (siglas en ingles, HPLC), la
cromatografa en capa delgada (siglas en ingles, TLC) y la cromatografa de gas
lquido (siglas en ingles, GCL), han sido aplicadas en la identificacin de
M. tuberculosis. Estos procedimientos suelen ser caros, engorrosos, no son lo
suficientemente discriminativos y slo se encuentra accesibles para algunos
laboratorios clnicos (Uribe et al., 2001).

Las tcnicas serolgicas pueden ser de gran utilidad en determinadas ocasiones, sin
embargo estas no logran discriminar entre los estados de infeccin y enfermedad, lo
cual constituye una gran limitacin de estas pruebas. A este inconveniente se adiciona
la presencia de actividad cruzada como consecuencia de la infeccin causada por
micobacterias ambientales (Castro et al., 2005).

Introduccin

2

En la pasada dcada, se han logrado mayores avances en el conocimiento de la
composicin gentica micobacteriana. Como consecuencia, se han desarrollado
diversos sistemas de amplificacin y sondas genticas para emplearlas en el
diagnstico de la TB. Dentro de estos sistemas se encuentran las pruebas comerciales
Accuprobe (Gen-Probe, Inc., San Diego, California, EUA) e INNO-LiPA
(Mycobacteria, Inmunogenetics, Blgica) los cuales son muy confiables; pero con la
limitante de ser extremadamente costosas para pases de bajos recursos (Gmez et
al. 2007).

En 1989, Hance et al. reportaron, la amplificacin de un fragmento del gen de la
protena de estrs trmico de peso molecular 65 kDa (hsp65), el cual acoplado con
pruebas especficas para especies permita la identificacin de micobacterias
provenientes de muestras clnicas. Posteriormente, Plikaytis et al. (1992) y Telenti et
al. (1993), perfeccionaron el mtodo mediante la amplificacin de dicho fragmento por
reaccin en cadena de la polimerasa (RCP) y el anlisis del polimorfismo de la longitud
de los fragmentos de restriccin (PLFR). Esta tcnica fue denominada PRA (Laborn et
al., 2001; Yzquierdo et al., 2007).

En la actualidad, los mtodos de identificacin bioqumicos contina siendo la tcnica
de referencia para el diagnstico de la TB. Sin embargo presentan serias limitaciones
en cuestiones de tiempo y una precisa identificacin, retardando el diagnstico y un
tratamiento adecuado del paciente.

Dado el incremento progresivo del nmero de casos de la TB, su elevada peligrosidad
en pacientes portadores del virus de inmunodeficiencia adquirida (VIH), y la necesidad
de un diagnstico temprano para su posterior tratamiento con las drogas de primera
lnea, nos hemos propuesto evaluar la tcnica del PRA-hsp65, en el Laboratorio
Nacional de Referencia e Investigacin de Tuberculosis y otras Micobacterias del
Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kour" (LNRTB-IPK).

OBJETIVOS
Objetivos
4

1.1 Objetivos

General:

Contribuir al diagnstico rpido de la Tuberculosis en el LNRTB del Instituto de
Medicina Tropical Pedro Kour.

Especficos:

1. Aplicar la tcnica del PRA-hsp65 en la identificacin de especies
micobacterianas.

2. Realizar las principales pruebas bioqumicas de identificacin de Micobacterias.

3. Determinar la sensibilidad y coeficiente de concordancia del PRA-hsp65 con
respecto a las pruebas bioqumicas de identificacin.

REVISIN BIBLIOGRFICA

Revisin bibliogrfica

5

2. REVISIN BIBLIOGRFICA

2.1 Antecedentes histricos:

La TB presenta una larga historia. Se presume que se origin hace 150 millones de
aos atrs. Fue documentada en Egipto, India y China en los aos 5000, 3300 y 2300,
respectivamente. En la antigua literatura griega existen indicios de la enfermedad
refirindose a esta como Tisis, definida por Hipcrates como la ms grande
enfermedad de todos los tiempos, pues fue casi siempre fatal para los que la
padecan. A inicios del siglo XVII se produjo en Europa una epidemia de TB a la cual
se le dio el nombre de Gran plaga blanca, considerndola como una muerte
inevitable. En el siglo XVIII surgen los primeros indicios sobre el principal agente
causal de la TB. El fsico ingles Benjamin Marten (1704-1722) conjetur, por primera
vez, que la TB era provocada por criaturas de vida diminuta. Posteriormente los
doctores Jean-Antoine Villemin (1827-1892) y William Budd (1811-1880), concluyeron,
a travs de estudios epidemiolgicos, que la TB se difunda por la sociedad a travs
de grmenes especficos (Leo, Portaels, 2007).

No fue hasta la tarde del 24 de Marzo de 1882, en Berln, ante una escptica
audiencia compuesta por prominentes hombres de ciencia alemanes pertenecientes a
la sociedad fisiolgica que, Robert Koch (1843-1910), realiz la famosa presentacin
de Mycobacterium tuberculosis como agente causal de la TB, lo que marc el primer
hito en el estudio de esta enfermedad (Kaufmann, 2003). Estos hallazgos, seguidos
por el desarrollo y refinamiento de las tcnicas de coloracin y cultivo realizadas por
Paul Erhlich (1854-1915), Franz Ziehl y Friedrich K.A. Neelsen proporcionaron las
primeras herramientas para combatir racionalmente la TB. A ms de un siglo de la
introduccin de estas herramientas, se desarroll una vacuna y varios agentes
quimioteraputicos para combatir esta enfermedad. Aun as, en la actualidad, la TB
sigue siendo la mayor causa de muerte en el mundo debida a un nico agente
infeccioso (Chacn et al., 2004).


6

2.2 Taxonoma:

La clasificacin de las micobacterias se inici en 1896 cuando Lehman y Neumann
propusieron por primera vez el gnero Mycobacterium incluyendo a M. tuberculosis y
M. leprae, ubicndolos en la familia Mycobacteriaceae orden Actinomycetales y clase
Actinomycetes (Leo et al., 2004).

El gnero Mycobacterium, el cual incluye ms de cien especies, se divide en 3
grandes grupos: Complejo M. tuberculosis, complejo leprae y las Micobacterias no
tuberculosas o atpicas (MNT). El complejo Mycobacterium tuberculosis incluye
M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG (derivado atenuado de la cepa de M. bovis
comnmente utilizado como vacuna para la proteccin contra M. tuberculosis),
M. africanum (causante de la TB humana en el continente africano), M. canetti
(subespecie de M. tuberculosis) y M. microti. Todas estas causan la TB en humanos.
Tambin alguna de ellas presentan otros reservorios de infeccin como son: M. bovis
que infecta principalmente el ganado bovino y M. microti es patognica en roedores
(Arriz et al., 2006).

2.3 Caractersticas generales:

M. tuberculosis es un patgeno intracelular facultativo de crecimiento lento que puede
sobrevivir y multiplicarse dentro de los macrfagos y otras clulas animales como
clulas dendrticas, mastocticas, etc. (Persson et al., 2008). Es gram-positivo, aerobio
estricto y no forma esporas, su morfologa es delgada de forma recta o ligeramente
curvada en frotis teidos, y su tamao suele ser de 1-4 micras de largo por 0,3-0,5
micras de ancho. El tiempo de duplicacin de M. tuberculosis en condiciones ptimas
de cultivo es de 15 a 18 horas, tardando varias semanas (de 1 a 3) en aparecer
colonias visibles en medios de cultivo (Casal et al., 1999). Estos bacilos al igual que
otros pertenecientes al mismo gnero poseen una composicin nica de su pared
celular.

La pared micobacteriana es una efectiva barrera frente a muchos de los agentes
antimicrobianos convencionales y est constituida por el complejo macromolecular

7

formado por cidos miclicos arabinogalactano-peptidoglucano (mAGP). La misma
est separada por un espacio periplsmico y posee un elevado contenido en lpidos,
confirindole un carcter hidrofbico que la hace refractaria al ataque por hidrlisis
enzimtica (Gorocica et al., 2005). Estudios de difraccin de rayos X, han demostrado
que los cidos miclicos se encuentran orientados en paralelo y perpendicular al plano
de la superficie celular (Song et al., 2008). Las caractersticas de esta pared la
convierte en una bacteria cido-alcohol resistente (BAAR), ya que retiene los
colorantes en presencia de alcohol cido (North, Jung, 2004).

La membrana celular tiene las caractersticas biolgicas y bioqumicas de cualquier
membrana, aunque en las micobacterias los derivados de los fosfolpidos se
caracterizan por estar altamente glicosilados dando lugar a molculas como el
lipoarabinomanano (LAM), que tienen un papel fundamental en la patognesis de la
tuberculosis (Gorocica et al., 2005).

Figura 1: Estructura de la pared celular de las Micobacterias


8

2.4 Virulencia:

Los atributos importantes de la virulencia de M. tuberculosis incluyen su posibilidad de
sobrevivir y multiplicarse intracelularmente, la habilidad de entrar en estado de latencia
infeccin (incluso dcadas) y la capacidad de interferir en la respuesta inmune del
hospedero (Bokum et al., 2008).

El ms notable atributo biolgico de este patgeno lo constituye la composicin de la
pared celular, como mencionamos anteriormente compuesta por el complejo mAGP, la
cual le confiere una hidrofobicidad, proteccin y sobrevivencia dentro de la clula
infectada. Se ha demostrado tambin la presencia de lpidos libres los cuales tienen
una gran participacin en la virulencia, entre ellos se encuentran: el factor cuerda y los
sulfolpidos (Brennan, 2003).

El factor cuerda se encuentra ubicado en la capa ms externa de la membrana celular
y presenta una elevada toxicidad. El mecanismo bioqumico que ejerce este factor est
relacionado con la actividad de la enzima NADasa. Esta enzima acta sobre la
coenzima nicotinamida adenn dinuletido (siglas en ingles, NAD+) que se encuentra
involucrada en los niveles de energa de distintos rganos del hospedero,
especialmente en el pulmn, hgado y tejido del bazo. Acta tambin reduciendo la
actividad enzimtica microsomal NAD-dependiente que participa en la produccin de
perxido de hidrogeno (H
2
O
2
). Su accin es tambin atribuible a un efecto directo
sobre las membranas mitocondriales, resultando en la interrupcin del flujo de
electrones de la cadena respiratoria mitocondrial y la fosforilacin oxidativa. Por otra
parte los sulfolpidos se piensa que est involucrado en el bloqueo de la fusin
fagosoma-lisosoma, sin embargo esta teora est siendo cuestionada en la actualidad
(Brennan, 2003).

La secuenciacin completa del genoma de M. tuberculosis H
37
Rv, ha conducido a
innumerables avances. Una fuerte evidencia indica que los genes presentes dentro de
la regin de diferenciacin 1 (DR1, siglas en ingles) son esenciales para la virulencia
en los miembros del complejo M. tuberculosis. Esto queda evidenciado con la delecin
de esta regin en M. bovis, originada por una mutacin, provocando una atenuacin

9

de su virulencia y derivando en la cepa vacunal bacilo Calmett Gerin (BCG). Estos
genes intervienen en la codificacin de las protenas CFP-10 (Rv3874) y ESAT-6
(Rv3875), que en la actualidad son evaluadas como candidatos vacunales y como
antgenos, en la estandarizacin de nuevos mtodos de diagnstico de la TB. Estas
protenas tambin juegan un doble rol en el mecanismo de patognesis de la
micobacteria tanto en el empleo vacunal como la virulencia produciendo la
desactivacin del macrfago y la activacin de clulas T (Guinn et al., 2004; Ernst et
al., 2007; Ganguly et al., 2008).

Otros genes que se encuentran en estudio son el de la protena MgtC (Rv1811),
involucrada en la sobrevivencia intracelular del bacilo en el macrfago y la adaptacin
a las limitaciones de magnesio (Alix et al., 2006) y el operon mce4 que es expresado
durante la fase estacionaria de crecimiento en cultivos y durante el curso de infeccin
en mamferos hospederos. Como la protena Mce4A es expresada durante la fase
tarda del crecimiento esto sugiere la posibilidad de que juegue un rol en la
persistencia de la infeccin tuberculosa (Saini et al., 2008).

2.5 Gentica:

El estudio de la gentica micobacteriana ha florecido en los ltimos aos, por el
desarrollo en los diversos mtodos genticos, secuenciamiento del cido
desoxirribonucleico (ADN), y la secuenciacin del genoma de M. tuberculosis H
37
Rv
que fue completada en 1998 por The Institute for Genomic Research y por the Sanger
Center-Pasteur Institute consortium (Cole et al., 1998).

El genoma de M. tuberculosis consiste de 4.4 x 10
6
pares de base (pb) con un alto
contenido de Guanina y Citocina (Blackwood et al., 2000). Presenta aproximadamente
4000 genes que codifican protenas y 50 que codifican cido ribonucleico (ARN). La
secuenciacin del genoma mostr que esta bacteria tiene caractersticas nicas.
Presenta regiones bien conservadas de ADN las cuales contienen las caractersticas
de gnero (RD) y regiones hipervariables propias de cada especie por lo que estas
ltimas son usadas para su identificacin. Entre las regiones hipervariables se

10

encuentran el gen hsp65, que codifica la protena de 65 kDa (estrs trmico), regiones
genmicas de la subunidad ribosmal 16S, la regin intergnica 16S-23S y los
elementos de insercin o transponibles (IS) siendo el ms conocido el IS6110. De los
4000 genes que codifican para protenas, 200 codifican para enzimas que intervienen
en el metabolismo lipdico y de estos, 100 son predecesores para la funcin de la
oxidacin de cidos grasos, a diferencia de E. coli que presenta solo 50. Esta
caracterstica est estrechamente relacionada con la peculiar composicin de la pared
de M. tuberculosis (Curtiss, Haydel, 2003)

Tabla I: Distribucin general de los genes de M. tuberculosis en base a su funcin.

Otra inusual caracterstica del genoma de M. tuberculosis es la presencia de genes
que codifican para familias de protenas acdicas, Pro-Glu (PE) y Pro-Pro-Glu (PPE),
que con secuencias encontradas en dos regiones conservadas N-terminal. Ests son
nicas en los miembros del complejo M. tuberculosis y muchas se encuentran
localizadas en la pared y membrana celular. Algunas de estas protenas juegan un
papel importante en la variacin antignica de M. tuberculosis durante la infeccin
(Smith, 2003).
FUNCIN N de genes % del total
Metabolismo lipdico 225 5.7
Vas de informacin 207 5.2
Pared celular y procesos celulares 517 13.0
codificacin de ARNs 50 1.3
Elementos de IS y bacterifagos 137 3.4
Protenas PE y PPE 167 4.2
Respiracin e intermediarios del metabolismo 877 22.0
Proteinas regulatorias 117 4.7
Virulencia, detoxificacin y adaptacin 91 2.3
funcin hipottica conservada 911 22.9
funcion desconocida de proteinas 607 15.3

11

Figura 2: Mapa circular del cromosoma de M. tuberculosis H
37
Rv.

2.6 Diagnstico convencional:

2.6.1 Baciloscopa:

Dentro de las tcnicas para el diagnstico de la TB, la baciloscopa que incluye la
tincin microbiolgica de ZiehlNeelsen ha sido la tcnica de referencia en la mayora
de los laboratorios. Se basa en la capacidad de las micobacterias para formar
complejos estables con ciertos colorantes de arylmetano como la fucsina, la cual
penetra en la pared celular unindose a los complejos micolil-arabinogalactano. Este
complejo retiene el colorante an despus de su exposicin al alcohol cido o cidos
minerales (Araujo, Waard, 2004). Esta tcnica diagnostica a los enfermos con TB que
son bacilferos, o sea, que son fuente de diseminacin de la enfermedad, Sin
embargo, es en este sentido donde se han observado las mayores limitaciones, ya que
este sistema necesita un nmero superior a 10
4
bacterias por mililitro para arrojar un
diagnstico positivo. Un dato adicional que complica la aplicacin de este mtodo
como el nico sistema para diagnosticar a pacientes tuberculosos, es la estimacin de

12

que ms de la mitad de los 10 millones de casos reportados anualmente, son
infecciones pulmonares y extrapulmonares con baciloscopas negativas, los cuales
pueden diagnosticarse con un criterio clnico, histopatolgico, epidemiolgico,
radiolgico e inmunolgico (Cuevas, 2003).

2.6.2 Cultivo microbiolgico:

En respuesta a lo anterior, se propuso como segundo frente de batalla en el
diagnstico de la TB, el cultivo bacteriano lquido o slido, que se emplea para
confirmar o descartar baciloscopas negativas as como para identificar de qu agente
se trata, apoyndose en un diagnstico clnico y radiolgico positivo. El medio ms
usado en los laboratorios de TB es el Lwenstein-Jensen, el cual contiene sales
definidas, glicerol y sustancias orgnicas complejas como huevo fresco o yema de
huevo o harina de papa y verde malaquita (para inhibir el crecimiento de otras
bacterias y hongos contaminantes), entre otros componentes. Otros medios
propuestos son el agar semisinttico Middlebrook 7H10 y 7H11, los cuales dentro de
su composicin presentan hidrolizados de casena y albmina que actan inhibiendo
los efectos txicos de los cidos grasos. Por otra parte los medios lquidos
Middlebrook 7H9 y 7H12 requieren de la adicin de Tween (steres hidrosolubles de
cidos grasos), para un crecimiento ms disgregado del bacilo en el medio lquido. No
obstante, estos mtodos tienen la desventaja de que tardan entre dos a ocho semanas
para arrojar un resultado (Montoro et al., 2001).

A principios de la dcada de los 80 sali al mercado un sistema denominado BACTEC
460, hoy en da comercializado por la compaa Becton Dickinson (BD). Este consiste
en frascos con medio lquido Middlebrook 7H12 que contienen cido palmtico como
nica fuente de carbono, ste marcado radioactivamente. Constituye el patrn de
referencia con el que se comparan todos los medios antes de ser aprobados para su
uso diagnstico. La principal ventaja de este sistema es el incremento de la
sensibilidad y la reduccin en tiempo para el diagnstico; sin embargo su uso se
encuentra limitado por la necesidad de una infraestructura adecuada para trabajar con
material radiactivo (Harvell et al., 2000).


13

A partir de 1995 empiezan a salir al mercado medios lquidos que obvian el problema
de la radiactividad y del tener que inyectar el frasco (con la terica posibilidad de
contaminar un frasco con bacterias del frasco anterior). Estos medios se introducen en
equipos que incuban los frascos y a su vez realizan una monitorizacin continua de la
actividad metablica que hay en su interior con el objetivo de determinar la presencia o
no de crecimiento. El primero en salir al mercado fue el medio de cultivo liquido,
llamado tubo indicador de crecimiento micobacterial (siglas en ingles, MGIT) el cual
contiene Middlebrook 7H9 modificado y utiliza un sensor de fluorescencia (Somoskvi,
Magyar, 1999). Seguido a este, nuevos sistemas se han puesto a prueba, como son:
el sistema MGIT BACTEC 960 (Kontos et al., 2003), el ESP Culture System II (Trek
Diagnostic Systems) y el MB/BacT ALERT 3D (BioMerieux). ESP y MB/BacT utilizan
sensores de presin y color respectivamente para detectar el crecimiento. Estos
sistemas se han introducido en la mayor parte de los laboratorios ya que reducen el
tiempo de deteccin de crecimiento con una alta sensibilidad lo que constituye un gran
avance (Piersimoni et al., 2001; Hines et al., 2006; Dorronsoro, Torroba, 2007;
Nyendak et al., 2009). La principal desventaja contina siendo el alto costo para
pases de bajos ingresos, donde la TB constituye un creciente problema de salud.

14

2.6.3 Pruebas bioqumicas:

La diferenciacin entre las micobacterias del complejo M. tuberculosis y las MNT, est
determinada por tres pruebas bioqumicas fundamentales: niacina, catalasa
termoestable a 68C y reduccin del nitrato.

Prueba de la Niacina:

La niacina (cido nicotnico) juega un papel vital en las reacciones de oxidacin-
reduccin que ocurren durante el metabolismo de todas las micobacterias.
M. tuberculosis la produce muy activamente y la acumula en gran cantidad porque no
puede procesarla posteriormente. En dicha prueba, el cido nicotnico reacciona con el
bromuro de ciangeno dando lugar a una sustancia que, al unirse a una amina
aromtica como la anilina o la bencidina, forma una compuesto final que se colorea de
amarillo o rosado, respectivamente. Las cepas de M. tuberculosis negativas a la
niacina son muy poco frecuentes. La acumulacin del cido nicotnico se produce en
gran medida en la fase exponencial del crecimiento de la micobacteria es decir en la
fase comprendida entre la cuarta o quinta semana del cultivo (Konno, 1956).

Prueba de la catalasa termoestable a 68 C:

La catalasa es una enzima que presentan los microorganismos para protegerse del
perxido de hidrgeno, compuesto secretado por las clulas del organismo hospedero.
En las micobacterias pertenecientes al complejo M. tuberculosis la actividad de esta
enzima es inhibida a 68 C. Para evaluar su termoestabilidad, en los laboratorios se
adicionan a todos los medios analizados perxido de hidrgeno al 3%. Esta adicin
produce un abundante burbujeo en aquellas cuya enzima sea termoestable. La falta de
burbujeo es interpretado como la inactivacin de la enzima y la consiguiente
negatividad de la prueba (Kubica et al., 1966).

Prueba de reduccin de nitrato:

Es una prueba complementaria a las anteriores y est fundamentada en la capacidad
de M. tuberculosis y algunas micobacterias ambientales de asimilar el nitrato como

15

una fuente de nitrgeno (estas prefieren el amonio o la asparagina). Consiste en la
presencia de la enzima nitrato reductasa a nivel de membrana que tiene la capacidad
de reducir rpidamente el nitrato a nitrito (Virtanen, 1960).

Tabla II: Esquema de diferenciacin de M. tuberculosis de las MNT.

2.7 Nuevas tcnicas de identificacin:

Si bien las tcnicas de identificacin convencionales en la actualidad continan siendo
consideradas como las tcnicas de referencia para el diagnstico microbiolgico, dado
su accesibilidad en costo a todos los laboratorios de TB, queda claro que presentan
limitaciones en cuestiones de tiempo, identificacin exacta y oportuno diagnstico para
un tratamiento adecuado. A travs de los aos, con los avances tecnolgicos y el
estudio molecular, se han desarrollado diversos mtodos con el objetivo de corregir
estas limitaciones. Nuevas tcnicas de identificacin no convencionales se han puesto
a disposicin de los laboratorios microbiolgicos como: La TLC, usado en los
laboratorios de rutina para identificar aislados micobacteriales, la HPLC y la GCL.
Estos se basan en el anlisis metil ster de los cidos miclicos de la pared celular
(Chou et al., 1998; Queico et al., 2005).

M. tuberculosis MNT
Velocidad de crecimiento
Lenta a partir de la tercera semana
luego de inoculada una muestra en
medio a base de huevos
Lenta o rpida
Aspecto macroscpico de la colonia
Rugosa no pigmentada
Lisa puede tener pigmentacin
Aspecto microscpico
Bacilos dispuestos en "cuerdas"
Bacilos muy grandes,
filamentos cortos, cocoides,
mayormente desagregados
Niacina
Positivo Negativa/ Positiva
Catalasa termoestable a 68C Negativo Positiva/Negativa
Reduccin de nitrato a nitrito Positivo Negativa/positiva

16

Las tcnicas cromatogrficas presentan varias limitantes entre las que se encuentran
la necesidad de abundante biomasa bacteriana, no es diferenciable del todo, por la
continua descripcin de nuevas cepas, la necesidad de personal altamente capacitado
y equipos costosos (Dorronsoro, Torroba, 2007).

En el ensayo de amplificacin de fagos, se emplea el micobacterifago D29, virus ADN
que tiene la habilidad de infectar micobacterias de crecimiento lento como
M. tuberculosis. Este es capaz de replicarse en el interior de estas micobacterias,
provocando la lisis de la pared celular y la liberacin por ende de la nueva progenie de
fagos. En el ensayo, los fagos exgenos son inactivados por tratamiento qumico
mientras que el nmero de fagos endgenos, el cual es un indicador del nmero de
clulas viables de M. tuberculosis, es determinado despus de ciclos de infeccin,
replicacin y liberacin en una placa indicadora que contiene Mycobacterium.
smegmatis. Los resultados se obtienen en 24-48 horas a travs de la aparicin de
zonas claras o lisis (Park et al., 2003; McNerney et al., 2004; Yzquierdo et al., 2008).

2.7.1 Mtodos genticos de identificacin:

Hibridacin en fase slida:

La prueba de identificacin AccuProbe Mycobacterium Tuberculosis (Gen Probe, Inc.
SanDiego, Calif) puede ser usado para la confirmacin de cultivos de M. tuberculosis.
Esta se basa en la degradacin de acridinium sobre una sonda, que hibridiza con el
ARN ribosomal (ARNr) 16S. Los resultados de cultivos positivos se pueden obtener
por el empleo del luminmetro Gen-Probes en alrededor de 2 horas (Somoskvi et al.,
2000).

El INNO LiPA Mycobacteria, comercializado desde 1997, es una extensin del ensayo
de sondas de lnea. Este consiste en una prueba de hibridacin reversa con diferentes
sondas de ADN inmovilizadas en lneas paralelas en una tira de papel que luego es
sometida a un ciclo trmico. En el caso de las micobacterias, son fragmentos
especficos, de espaciadores transcritos internos (siglas en ingles, ITS), que no son

17

ms que regiones interpuestas entre genes de RNAr 16S y 23S. Este sistema incluye
sondas del complejo M. tuberculosis y otras especies y puede ser empleada en la
deteccin de resistencia a Rifampicina, siendo especfica pero poco sensible. Una
defiencia que presenta este es ensayo, es que no puede discriminar entre los
diferentes miembros del complejo M. tuberculosis ya que presentan idnticas
secuencias en el espacio intergnico del ARN 16S y 23S (Miller et al., 2000; Tortoli,
Marcelli, 2007).

Genotipaje Mycobacterium tuberculosis:

La prueba comercial Genotipaje MTBC, fue diseada para diferenciar entre las
especies del Complejo M. tuberculosis (Richter et al., 2003). Este sistema est basado
en la tecnologa de hibridacin reversa de ADN sobre tiras de nitrocelulosa
(GenoType MTBC; Hain Diagnostika, Nehren, Germany) para detectar la secuencia
polimrfica del gen gyrB y la delecin RD1 de M. bovis BCG. Consiste en 11 sondas
de las cuales 1 pertenece a la regin del ADN que codifica para el ARNr 23S (para
confirmar que pertenece al Complejo M. tuberculosis), 9 para cuatro regiones del gen
gyrB que permite la discriminacin, mas no la diferenciacin entre M. bovis y M. bovis
BCG (la sonda hibrida en la delecin detectada en RD1) y una flanquea la regin de
RD1 (Gomz et al., 2007)

Secuenciacin basado en RCP:

Se basa en una amplificacin inicial por RCP seguido del anlisis de la secuencia
nucleotdica de lo amplificado en un secuenciador automtico. La identificacin de una
cepa desconocida es completada por la comparacin de la secuencia nucleotdica con
una librera de secuencias conocidas. La base de datos para este propsito est
disponible en internet (Gen Bank, Microsystems database (RIDOM), European
Molecular Biology es (EMBL)). Diversos genes blancos se emplean en este
procedimiento; pero el ms comn es el gen ARNr 16S, el cual puede ser secuenciado
porque contiene regiones conservadas y variables. A pesar de que este gen contiene
ms de 1500 pb, los primeros 500 pb son adecuados para la identificacin de especies
comunes al gnero. Otro blanco gnico importante es el que codifica para la protena

18

de estrs trmico de 65 kDa, la protena de 32 kDa, el gen que codifica para la sub
unidad de la ARN polimerasa rpoB, el gen recA (presenta un intrn proteico que al
ser escindido da lugar a la protena madura Rec A) y los espaciadores transcritos
internos (ITS) del ARNr 16S-32S. De este ltimo los resultados demuestran que las
secuencias espaciadoras pueden diferenciar a micobacterias de crecimiento lento con
una idntica o cerrada relacin en la secuencia de bases de la regin del ADN que
codifica para el ARNr 16S. La ocurrencia de elementos estructurales primarios y
secundarios conservados en secuencias ITS indica su potencial utilidad en la
identificacin micobacteriana. En la actualidad el sistema comercial de
secuenciamiento de la regin del ADN que codifica para el ARNr, MicroSeq System
(Applied Biosystems, CA), presenta buenos resultados y ofrece la posibilidad a los
laboratorios de identificar micobacterias descritas recientemente (Neonakis et al.,
2008).
Anlisis del polimorfismo del gen hsp65 (PRA-hsp65):

En 1992, Plikaytis et al. desarrollaron un mtodo para identificacin de micobacteria
que combina la amplificacin por RCP en una secuencia conservada de ADN del
gnero Mycobacterium, y el anlisis con enzimas de restriccin, de la secuencia
amplificada. Esta secuencia de ADN corresponde a una porcin de 1380 pb del gen
que codifica para la protena de estrs trmico hsp65. El anlisis de los perfiles de
restriccin de la secuencia amplificada muestra los patrones de restriccin para cada
especie en particular (Chimara et al., 2004). En1993, Telenti et al. usando cebadores
de amplificacin para el gen hsp65 con 439 pb y otras enzimas de restriccin (HaeIII,
BstEII), plante un algoritmo de identificacin al que denomin PRA-hsp65. En el 2008
Chimara et al., amplificando un segmento de 441 pb del mismo gen, incorporaron un
nuevo algoritmo, tomando en consideracin caractersticas fenotpicas de las especies
(grupos de Runyon), obtenindose una aproximacin ms exacta de la talla de los
fragmentos, resultando en una identificacin mucho ms precisa de las especies
(Chimara et al., 2008).

En la actualidad se realizan estudios de la tcnica del PRA-hsp65 con el uso de otros
genes como el rpoB, mediante el uso de las enzimas de restriccin MspI y HaeIII. Se

19

estn obteniendo importantes resultados, inclusive nuevos algoritmos de identificacin
(Lee et al., 2000).

MATERIALES Y MTODOS

Materiales y mtodos

20

3. MATERIALES Y METODOS

3.1 Cepas:

3.1.1 Cepas de trabajo:

Se estudiaron 40 cepas aisladas al LNRTB-IPK en el periodo comprendido entre Enero
y Diciembre del 2008.

3.1.1.1 Cepas controles:

M. tuberculosis H
37
Rv ATCC 27294
M. avium ATCC 25291
M. bovis ATCC 12210

3.2 Identificacin por Pruebas Bioqumicas:

Para cumplir el objetivo propuesto se realizaron tres pruebas de identificacin,
catalasa, reduccin de nitratos a nitritos y niacina. Para descartar entre MNT y las
pertenecientes al complejo M. tuberculosis. Las cepas se identificaron por medio de la
negatividad o positividad a estas pruebas.

Las pruebas se llevaron a cabo con cepas cultivadas en el medio Lwenstein Jensen
(L-J), de tres a cuatro semanas de crecimiento.

Prueba de la catalasa termoestable a 68 C:

Se identificaron 3 tubos, uno conteniendo 0,5 ml de solucin tampn fosfato pH 6,8
estril con el nmero del aislamiento a identificar, y dos conteniendo solucin tampn
con el nmero de una cepa de referencia de M tuberculosis H
37
Rv (control negativo de
la prueba) y M. avium que se us como control positivo. Se transfiri una asada
abundante de los cultivos a cada uno de los tubos con solucin tampn identificado
Materiales y mtodos

21

con su nmero. Seguidamente se colocaron los tubos en bao mara a 68C durante
20 minutos. Se enfri a temperatura ambiente y se agreg a cada uno de ellos,0.5 ml
de una mezcla preparada en el momento con partes iguales de la solucin acuosa de
Tween 80 al 10% y perxido de hidrgeno al 30%, comprobando que las tapas de los
tubos estuvieran bien cerradas. Los tubos se observaron a trasluz para detectar el
desprendimiento de burbujas desde la masa bacilar hacia la superficie del lquido,
evitando generar burbujas por agitacin o movimientos bruscos que pudieran interferir
con el resultado. En caso de tener tubos negativos se observ nuevamente a los 20
minutos para verificar si no haba actividad de catalasa (Kubica et al., 1966).

Reaccin positiva: Se identific por el desprendimiento de burbujas, producto de la
descomposicin del perxido de hidrgeno por la actividad enzimtica.

Reaccin negativa: No se observ desprendimiento de burbujas.

Reduccin del nitrato a nitrito:

Se prepar un tubo con el sustrato compuesto por nitrato de sodio (NaNO
3
0,01M).
Seguidamente se transfiri y disgreg a este una asada con abundante masa bacilar
del cultivo a identificar. Se repiti el procedimiento con la cepa control positivo M
tuberculosis H
37
Rv y control negativo M. bovis. Posteriormente se agitaron
suavemente los tubos y se incubaron a 37C durante 4 horas. Seguidamente se
agreg a cada tubo una gota de Solucin A (cido clorhdrico 1:1), 2 gotas de Solucin
B (Sulfanilamida 0,2%) y 2 gotas de Solucin C (Nnaftil etilendiamina 0,1%). Se agit
manualmente luego de comprobar que los tubos estuvieran bien cerrados (Virtanen,
1960).

Reaccin positiva: El desarrollo de color rosa a fucsia indica que se redujo el nitrato
presente en el sustrato por la accin de la enzima nitrato reducatasa.

Reaccin negativa: No se observa desarrollo de color.

Materiales y mtodos

22

Prueba de la niacina:

Se deposit 1 ml de agua destilada estril en el tubo con crecimiento en medio L-J.
Posteriormente se repiti la operacin en el control positivo y un tubo sin inocular
(control negativo). Se rompi el medio con el asa para facilitar la disolucin de cido
nicotnico y se dej el tubo inclinado al menos 15 minutos. Seguidamente se extrajeron
0,5 ml del lquido y se transfirieron a un tubo de ensayo con tapa de rosca. El revelado
de la reaccin, se llev a cabo agregando 0,5 ml de Bencidina al 3% y 0,5 ml de
Bromuro de Ciangeno al 10%. Los tubos se agitaron manualmente para permitir la
reaccin durante los siguientes 5 minutos. Al final de la lectura se adicion NaOH al
4% para inactivar el Bromuro de Ciangeno (Konno, 1956).

Reaccin positiva: La presencia de cido nicotnico en alta concentracin en el medio
de cultivo se visualiz con el desarrollo de una coloracin rosado plido.

Reaccin negativa: No se desarroll color.

Interpretacin de los resultados:

La positividad de las pruebas de la niacina y reduccin de nitrato a nitrito, adems de
la negatividad de la prueba de la catalasa termoestable a 68C indic la presencia de
M. tuberculosis en el medio de cultivo. La negatividad de la prueba de la niacina dio la
presuncin de la presencia de MNT.

3.2.2 Tcnica del PRA:

La tcnica de PRA fue aplicada a las 40 cepas del estudio siguiendo el protocolo
establecido por Telenti et al. en el ao 1993 (Telenti et al., 1993).

Materiales y mtodos

23

3.2.2.1 Extraccin de ADN micobacteriano:

El procedimiento de extraccin se llev a cabo segn el trabajo descrito por Van
Soolingen (1992). Se tom una asada de masa micobacteriana y se resuspendi en
400 L de solucin tampn TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4) en viales de 1,5
mL. Estos fueron sometidos a 80C por 20 minutos. Posteriormente se dejo enfriar a
temperatura ambiente y se adicionaron 50 uL de lisozima (Sigma), incubndose
durante 1h, en agitacin. Seguidamente se adicionaron 70 uL de SDS (Dodecilsulfato
sdico) al 10 % y 5 l de proteinasa K (Promega) incubndolo a 65 C durante 10
minutos. Se adicionaron 100 L de NaCl 5 M y 100 L de CTAB/NaCl, se agit e
incub a 65C por 10 minutos. A continuacin se adicionaron 750 L de
cloroformo/alcohol-isoamlico (24:1) y se centrifug a 14,000 g por 5 minutos a
temperatura ambiente.

Para precipitar el ADN se adicionaron 450 L de isopropanol, el sobrenadante se
incub a -20C por 30 minutos y se centrifug a 14,000 g por 15 minutos,
posteriormente se lav el precipitado con 1 mL de etanol 70%, y se procedi a
centrifugar a 14,000 g por 5 minutos. La conservacin de la muestra se realiz en
agua destilada estril (20-30 L) y se conserv a 4C para su uso inmediato o a -
20C para su uso posterior.

3.2.2.2 Reaccin de amplificacin:

Mezcla de reaccin:

En un tubo de reaccin se aadieron 0.5-1L de ADN micobacteriano. La composicin
de la mezcla de reaccin consisti en: Solucin tampn fosfato de RCP 10X (5 L),
MgCl
2
1.5 mM (3 L), dNTP 100 mM c/u (1,5 L), los cebadores se emplearon a una
concentracin de 25 pmoles (1L) y se utilizaron 2U (0.4L) de Taq polimerasa, para
obtener un volumen final de 50 L.

Materiales y mtodos

24

Programa:

La reaccin estuvo sujeta a 1 ciclo de desnaturalizacin de 5 minutos a 95C, 35 ciclos
de hibridacin a 94C durante 1 minuto, 60C 1 minuto, 72C 1 minuto y un paso de
extensin final de 7 minutos a 72C.
Se emplearon como cebadores: Tb11 (5-ACCAACGATGGTGTGTCCAT) y Tb12 (5-
CTTGTCGAACCGCATACCCT), ambos descritos por Telenti et al. Estos fueron
proporcionados por el centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa (CIGB, La
Habana, Cuba) los cuales estn dirigidos a amplificar un fragmento de 441 pares de
base entre las posiciones 398 y 836 de la secuencia nucleotdica publicada del gen
que codifica para la protena de 65 kDa. Para la reaccin de amplificacin se emple el
termociclador PTC 150 (MJ Research).

Anlisis de los productos de la RCP:

Se realiz mediante electroforesis submarina en gel de agarosa al 1 % teido con
bromuro de etidio (1%). Se utiliz como marcador de peso molecular ADN 100 pb (100
bp DNA Letter (Promega)), que abarca un rango desde 100 a 1500 pb y se utiliz en la
aplicacin Orange G como indicador de corrida electrofortica. Esta se realiz a 90
Volts con Solucin tampn fosfato Tris Borato EDTA (TBE) pH 8, durante 45 minutos.
Los geles fueron observados bajo exposicin a la luz ultravioleta en un transluminador
UV (VILVER LOURMAT, TFX-20-MC).

3.2.2.3 Anlisis de restriccin:

Luego de comprobar la amplificacin del segmento gnico, se realiz la digestin
enzimtica a partir de 15 L del producto amplificado, con las respetivas enzimas
BstEII y HaeIII, por separado. En cada caso, la mezcla contena 2.5 L de solucin
tampn especfica para cada enzima (buffer D para BstEII, y buffer C para HaeIII),
1 uL de enzima, 0.3 L de albmina de suero fetal bovino y 6.2 uL de agua, para un
volumen final de 25 L. La digestin con la enzima BstEII fue incubada a 60C,
mientras que con HaeIII la temperatura fue de 37C. En ambos casos, la incubacin se
realiz durante toda la noche.
Materiales y mtodos

25

Los resultados de ambas reacciones se analizaron mediante electroforesis submarina
en gel de agarosa 3%, teido con bromuro de etidio. Se utiliz el marcador de ADN de
50 pb (50 bp DNA Letter (Promega)) que comprende un rango desde 24 a 726 pb y el
indicador Orange G para corrida electrofortica, la cual se efectu a 80 Volts durante 2
horas y 30 minutos. Los geles fueron observados bajo exposicin a la luz ultravioleta
en un transluminador UV (VILVER LOURMAT, TFX-20-MC).

3.2.2.4 Anlisis e interpretacin de Resultados:

Se analizaron los fragmentos de restriccin obtenidos a partir de las digestiones con
cada una de las enzimas y se determin la talla de los mismos de acuerdo al marcador
de peso molecular empleado. Posteriormente mediante el algoritmo reportado por
Chimara et al. en el 2008 se procedi a la identificacin. (ANEXO 1).

3.3 Anlisis estadstico:

Con los resultados obtenidos en la identificacin bioqumica y la del PRA, se calcul la
sensibilidad y el coeficiente de concordancia entre la prueba evaluada y las pruebas
bioqumicas, tcnica de referencia en la identificacin de M. tuberculosis.

3.4. Normas de Bioseguridad
Todos los procedimientos que implicaron el manejo de las cepas vivas de
Micobacterias fueron realizados en gabinetes de seguridad biolgica Clase II (BSL II),
como se encuentra dispuesto en los Procedimientos Normalizados de Operacin
(PNO) del LNRTB del IPK. Las tareas que involucraron la manipulacin de sustancias
txicas como el Bromuro de ciangeno y el Bromuro de etidio se llevaron a cabo en
campana de extraccin.

RESULTADOS

Resultados

26

4. RESULTADOS

Se aplic la tcnica del PRA-hsp65 a cada una de las cepas, obtenindose los
resultados de la pruebas aproximadamente en 48 horas. Se observ la correcta
amplificacin del segmento gnico de 441 pb del gen hsp65 mediante electroforesis
submarina en gel de agarosa al 1%. La talla del segmento amplificado fue medida por
la aplicacin del un marcador de peso molecular de ADN (figura 1).

Figura 3: Patrones de amplificacin del segmento gnico hsp65 de algunas cepas,
medidos con el marcador de peso molecular.

Luego de realizada la digestin mediante las enzimas de restriccin BstEII y HaeIII se
visualizaron las bandas por medio de una electroforesis submarina en gel de agarosa
al 3%. Los patrones fueron correctamente observados y medidos mediante la
aplicacin del marcador de peso molecular para cada enzima (figura 2).
Resultados

27

Figura 4: Patrones de digestin enzimtica de BstEII y HaeIII de algunas cepas.

La interpretacin de la digestin, se realiz mediante el algoritmo propuesto por
Chimara et al. (2008), logrando identificar a las 40 cepas como pertenecientes al
Complejo M. tuberculosis

La figura 3 muestra los patrones de las pruebas bioqumicas realizadas. La reduccin
de nitrato a nitrito se observa en la figura 3c. La totalidad de las cepas analizadas por
esta prueba fueron positivas, observndose desarrollo de color en los tubos que
contenan las mismas.

El 100% de las cepas en estudio fueron negativas para la prueba de catalasa
termoestable a 68C. Como se observa en la figura 3b, no se apreci burbujeo en
ninguno de los tubos correspondientes.

Resultados
28

Figura 5: Resultados de las pruebas bioqumicas fundamentales para la identificacin
de M. tuberculosis. (a) Niacina (b) Catalasa termoestable a 68 C (c) Reduccin de
nitrato a nitrito.

La presencia de cido nicotnico (figura 3a) se detect en 38 cepas. Dos de las cepas
estudiadas no desarrollaron color. Teniendo en cuenta el resultado de las dos pruebas
bioqumicas anteriores, correspondientes con el patrn tpico de las especies del
complejo M. tuberculosis, estas constituan resultados discordantes.

Estas cepas discordantes se subcultivaron nuevamente. Luego de obtener un
crecimiento abundante (4 semanas) se procedi a la repeticin de la prueba de la
niacina y el PRA-hsp65, obtenindose resultados compatibles con M. tuberculosis.

Los resultados del PRA-hsp65 mostraron un 100% de sensibilidad y concordancia al
compararlos con las pruebas bioqumicas de identificacin.

a c b

DISCUSIN

Discusin

29

5. DISCUSIN

La TB sigue planteando en la actualidad importantes problemas epidemiolgicos, de
diagnstico clnico-microbiolgico, y teraputicos. La alta incidencia de la enfermedad
en los pases en vas de desarrollo y el impacto que sobre ella est teniendo la
coinfeccin con el VIH imponen urgencia en el correcto cumplimiento de las pautas de
tratamiento, el desarrollo de nuevos candidatos vacunales y la implementacin de
nuevas alternativas diagnsticas (Casal et al., 1999).

La identificacin rpida y correcta de micobacterias a nivel de especie resulta crucial
para la aplicacin de una efectiva terapia con drogas antituberculosas. En los ltimos
100 aos, la nica prueba rpida para el diagnstico de TB ha sido el examen
microscpico directo, cuya sensibilidad es aceptable cuando la muestra analizada
contiene ms de 100 000 BAAR/mL, Las pruebas basadas en las caractersticas
fenotpicas y bioqumicas de estos bacilos demoran semanas en conocer los
resultados y son extremadamente laboriosas, fundamentalmente para MNT,
conduciendo en ocasiones a errores en la identificacin (Barrera et al., 2008).

En nuestro estudio se realiz la identificacin por PRA-hsp65 de 40 cepas aisladas de
esputos de pacientes con sospecha clnica de TB pulmonar. Paralelamente se
realizaron las pruebas bioqumicas, como patrn de referencia en la identificacin de
Micobacterias, con el objetivo de evaluar la aplicacin del PRA-hsp65 en el LNRTB-
IPK.

Previo a la realizacin de la reaccin de amplificacin se realiz la extraccin del ADN
de los aislamientos micobacterianos. Para esto se emple el mtodo de extraccin
propuesto por Van Soolingen y colaboradores, en el ao 1992. Este mtodo emplea la
digestin enzimtica con lisozima y Proteinasa K (Van Soolingen et al., 1992). La
primera acta catalizando la hidrlisis de las uniones 1,4 entre los residuos de cido
N-acetilmurmico y N-acetil-D-glucosamina del peptidoglicano de la pared bacteriana
(Vocadlo et al., 2001). Por otra parte, la Proteinasa K es una serina proteasa de amplio
espectro y su funcin bsica radica en la digestin de protenas asociadas al cido
Discusin
30

nucleico bacteriano, as como la inactivacin de nucleasas que pudieran degradar el
ADN, durante el experimento (Hilz et al., 1975).

Este mtodo de extraccin emplea el detergente catinico CTAB (Cetyl Trimethyl
Ammonium Bromide, por sus siglas en ingls). Este tiene la propiedad de precipitar
cidos nuclicos y polisacridos, siendo especialmente til para precipitar ADN
genmico de organismos que producen grandes cantidades de polisacridos como las
bacterias (Van Soolingen et al., 1992).

A pesar de que el mtodo de extraccin empleado consume tiempo, permite obtener
un ADN de mayor calidad. No obstante, pueden ser usadas otras alternativas como
son el empleo de un estrs trmico o la ruptura mecnica de las clulas con perlas de
vidrio o sonicacin, obtenindose rendimientos similares de ADN (Telenti et al., 1993;
Leao et al., 2005; Somerville et al., 2005).

El primer algoritmo descrito para el PRA-hsp65 fue reportado por Telenti et al. hace
ms de 10 aos. Sin embargo, en nuestro estudio se sigui el protocolo publicado por
Chimara et al. en el 2008. Este ltimo incluye especies de reciente identificacin, as
como, se apoya en las pruebas fenotpicas de pigmentacin y velocidad de
crecimiento para aquellas especies que presenten patrones de restriccin similares
(Chimara et al., 2008).

Luego de realizada la RCP se observ, la amplificacin del fragmento de 441 pb del
gen hsp65 ubicndonos en que todas las cepas pertenecan al gnero Mycobacterium.
El anlisis de restriccin con las enzimas BstEII y HaeIII arroj bandas de 235,120, 85
pb y 150, 130 y 70 pb, respectivamente. Estos patrones se corresponden con las
especies del complejo M. tuberculosis (Chimara et al., 2008).

El antgeno de 65 kDa ha sido descrito, por algunos autores, como una protena
asociada a la pared celular, debido a que esta se ha encontrado en la fraccin
insoluble remanente de su ruptura. Sin embargo, otros investigadores proponen una
localizacin periplasmtica, demostrando su presencia en el sobrenadante de cultivos
Discusin
31

de M. bovis, bajo condiciones deficientes de zinc (Young et al., 1987). Esta ha sido
identificada como la protena ms inmunorreactiva presente en las micobacterias y
contiene eptopes comunes al gnero Mycobacterium y otros nicos para una especie
determinada. Es precisamente esta caracterstica la que la hace el sitio blanco del
PRA-hsp65, en la identificacin de las micobacterias y sus especies (Shinnick, 1987).

El hecho de encontrar que el 100% de las cepas pertenecan al complejo
M. tuberculosis result ser un hallazgo lgico si tenemos en cuenta que estas
provenan de esputos de pacientes sintomticos respiratorios, con sospecha clnica de
tuberculosis pulmonar.

Nuestros resultados son similares a los obtenidos por Bannalikar et al., en el 2006.
Estos investigadores reportaron un 82.6% de cepas correspondientes a
M. tuberculosis, tras emplear el PRA-hsp65, en cultivos bacterianos provenientes de
esputos de pacientes sospechosos de TB (Bannalikar et al., 2006).

Por su parte Da Silva et al. en el ao 2001 realizaron la identificacin de 103
aislamientos clnicos de micobacterias empleando esta misma tcnica. En este estudio
se report la presencia del complejo M. tuberculosis solamente en un 25% de los
aislamientos, igual cifra se correspondi con el complejo M. avium, seguido por
M. kansassi y otras especies de MNT. En este caso creemos necesario sealar que, a
diferencia de nuestro estudio, las cepas provenan de una gran variedad de muestras
clnicas como esputos, pus, lavado bronquioalveolar, lavado gstrico, biopsias de
ndulos linfoides y piel, lquido peritoneal, cefalorraqudeos y aspirados de mdula
sea. Estas muestras, provenientes de localizaciones extrapulmonares, justifican el
aislamiento en gran medida de MNT (Da Silva et al., 2001).

Aunque el PRA-hsp65 involucra procedimientos relativamente simples en comparacin
con otras tcnicas de identificacin, esta incluye la RCP cuyos valores de sensibilidad
y especificidad estn influenciados por un gran nmero de variables de laboratorio. Por
otra parte la interpretacin de la posicin de las bandas generadas por las enzimas de
restriccin es una tarea delicada, que se ve afectada por la calidad de la agarosa, las
Discusin
32

condiciones de corrida, la subjetividad de la interpretacin y la frecuente descripcin
de patrones para nuevas especies. Por lo tanto la evaluacin de la reproducibilidad
inter-laboratorio ayuda a mejorar la credibilidad del PRA-hsp65 (Hafner et al., 2004;
Leo et al. 2005).

Un estudio multicntrico realizado en la regin de Amrica Latina y el Caribe, con la
participacin de laboratorios de Argentina, Brasil, Colombia, Chile y Guadalupe, centr
su objetivo en el control de calidad de la identificacin por PRA-hsp65, de especies de
MNT. Los resultados obtenidos les permitieron afirmar que en esta regin, la tcnica
estaba lista para implementarse pero era necesario mejorar algunos aspectos, entre
los que se encontraban las condiciones de corrida y el entrenamiento en la
interpretacin de los patrones con vistas a mejorar la precisin de la tcnica (Leo et
al. 2005).

Desde el punto de vista de la identificacin bioqumica de las cepas en estudio, se
obtuvo que el 100% fueron negativas en la prueba de catalasa termoestable a 68C y
positivas en la prueba de reduccin del nitrato a nitrito, resultado consistente con
M. tuberculosis.

La catalasa es una enzima cuya funcin radica en la detoxificacin de los compuestos
superoxigenados generados por las clulas del hospedero durante la respiracin. Esta
cataliza la descomposicin del perxido de hidrgeno en agua y oxgeno, siendo
inhibida su actividad a 68C en las cepas de M. tuberculosis y M. bovis. El resto de las
micobacterias (con la una nica excepcin de M. gastri, que es muy poco frecuente)
conservan la actividad catalasa despus del calentamiento a 68C. Por esta razn esta
prueba es muy til para diferenciar a M. tuberculosis del resto de las micobacterias. A
esto se le suma que es una prueba sencilla de realizar, no genera riesgos por
toxicidad y utiliza reactivos normalmente disponibles en un laboratorio de
bacteriologa. Al ser esta una prueba basada en la deteccin de actividad enzimtica,
puede ser realizada en cuanto se detecta el desarrollo del cultivo (Barrera, 2008).

Discusin
33

Aun cuando M. tuberculosis prefiere el amonio y la asparagina, puede utilizar el nitrato
y nitrito como fuente de nitrgeno. Para esto cuenta con la enzima nitrato reductasa
unida a la membrana celular que rpida y activamente reduce nitrato a nitrito. Esta
actividad enzimtica es muy estable y otorga una herramienta que ayuda a la
identificacin de distintas especies. En particular M. tuberculosis y algunas
micobacterias ambientales tienen actividad de nitrato reductasa mientras que M bovis
y BCG no la presentan, debido a mutaciones que determinan la inactividad de los
genes que la codifican (Casal et al., 1999).

Contradictoriamente, obtuvimos dos cepas que mostraron resultados negativos para la
prueba de la niacina. Estos resultaban discordantes teniendo en cuenta que por las
pruebas descritas anteriormente se haba obtenido un patrn tpico de
M. tuberculosis.

La niacina (cido nicotnico) juega un importante papel en el metabolismo de todas las
micobacterias. Aunque todas ellas tienen la capacidad de producirla, la mayora lo
hace en cantidad moderada y la emplea en la sntesis de otras molculas. Slo
M. tuberculosis la produce activamente y la acumula en gran cantidad porque no
puede procesarla posteriormente (Barrera, 2008).

Estas dos cepas fueron subcultivadas nuevamente y repetidas tanto las pruebas
bioqumicas como el mtodo de identificacin molecular. Esta vez, ambos mtodos
empleados coincidieron en la deteccin del bacilo tuberculoso.

Est descrito en la literatura que la prueba de la niacina, al igual que muchas pruebas
bioqumicas, requiere realizarse en un determinado estadio biolgico del crecimiento.
La acumulacin de niacina puede ponerse en evidencia con mayor seguridad luego de
3-4 semanas de la aparicin del crecimiento y cuando este es abundante.

Con el objetivo de agilizar el diagnstico, esta prueba puede ser realizada cuando se
detecta el cultivo positivo pero es necesario considerar que el resultado puede ser
Discusin
34

negativo porque el crecimiento an es muy joven y no se ha acumulado suficiente
cantidad de cido nicotnico en el medio, como para ser detectado. Debido a esto, ante
un resultado negativo de un cultivo joven, es necesario repetir la prueba a partir de un
cultivo con un tiempo de incubacin entre 3-4 semanas.

Consideramos que estas dos cepas no tenan un crecimiento lo suficientemente
abundante como para realizarles la prueba y por tal motivo, la presencia de cido
nicotnico en el medio era pobre. Esta, es una de las principales limitantes de las
pruebas bioqumicas pues se requiere de suficiente biomasa para realizar al menos
una de estas pruebas y un abundante crecimiento para realizarlas todas a partir de un
mismo cultivo. Por el contrario, el PRA-hsp65 es tan sensible que a partir de un escaso
nmero de colonias se puede realizar la extraccin del ADN y obtener una exitosa
amplificacin del fragmento hsp65. Esta ventaja permite al Laboratorio una reduccin
sustancial del tiempo de diagnstico, ya que esperar por un segundo crecimiento para
la realizacin de las pruebas bioqumicas se traducira en la espera de otras 4
semanas para obtener un resultado fidedigno por los mtodos convencionales.

Por otra parte, la identificacin de estos dos aislamientos discordantes, como
M. tuberculosis, tiene una gran importancia si tenemos en cuenta que tanto la
combinacin de las drogas, como las dosis empleadas en los tratamientos difieren
significativamente entre los pacientes con aislamientos pulmonares del bacilo
tuberculoso y micobacterias atpicas (Katoch, 2004)

Los resultados del PRA-hsp65 mostraron un 100% de Sensibilidad y Concordancia al
compararlos con los resultados de las pruebas bioqumicas. Estos valores concuerdan
con los obtenidos por Da Silva et al. en el 2001 y Chaeunoy et al. en el 2005. Ambos
grupos encontraron un 100% para ambos parmetros evaluados (Da Silva et al.,
2001; Cheunoy et al., 2005).

De forma general los valores de sensibilidad disminuyen cuando se trata de la
identificacin de MNT (Da Silva et al., 2001; Davies, Pai, 2008). Un reporte realizado
por investigadores belgas demuestra que los niveles de concordancia entre las
Discusin
35

pruebas bioqumicas y el PRA-hsp65 puede caer por debajo del 90 % para MNT
(Martin et al. 2000) aunque existen trabajos publicados donde esta correlacin es
mayor (Hafner et al., 2004; Castro et al., 2007)

Bannalikar et al. demostraron que el PRA-hsp65 era una herramienta til para la
identificacin del complejo M. tuberculosis y M. avium, sin embargo est tcnica no
lograba distinguir entre las especies pertenecientes al complejo M. tuberculosis. En
este reporte se refleja que los patrones de RFLP de M. tuberculosis (incluyendo H
37
Rv)
y M. bovis (incluyendo BCG) son idnticos. Este resultado pudiera ser atribuido a la
gran homologa existente en el ADN de estas especies, hecho que se encuentra
extensivamente documentado en la literatura cientfica (Bannalikar, Verna, 2006).

El tiempo consumido para la realizacin del PRA-hsp65, hasta la obtencin del
resultado final, fue de 48 horas, de forma tal que se redujo el tiempo para emitir el
diagnstico definitivo. Esta reduccin viene dada, fundamentalmente, porque no se
necesita esperar las cuatro semanas de crecimiento, ya que esta tcnica puede
realizarse a partir de un cultivo con escaso nmero de colonias. Por su parte, la
identificacin bioqumica requiere entre 2 y 3 semanas despus de obtenido el
crecimiento micobacteriano.

En el caso de aislamientos de MNT, las pruebas bioqumicas, aun cuando sean
realizadas por personal experimentado, pueden arrojar resultados incorrectos debido a
su baja reproducibilidad, a que los fenotipos esperados no son propiedad absoluta de
una sola especie y a que la base de datos reportada que contiene las caractersticas
fenotpicas est limitada a las especies ms comnmente aisladas (Chimara et al.,
2008)

Otra de las ventajas de la tcnica molecular radica en que la manipulacin de las
bacterias vivas es mnima a diferencia de las pruebas bioqumicas, con los
consiguientes riesgos de bioseguridad que este manejo implica (Da Silva et al., 2001;
Wang, 2005). Todos los procedimientos empleados en nuestra investigacin fueron
realizados siguiendo los protocolos descritos en los Procedimientos Normales de
Discusin
36

Operacin del LNRTB, en gabinete de seguridad clase II, con el objetivo de minimizar
los riesgos de bioseguridad que conllevan los trabajos de investigacin con
micobacterias virulentas.

Algunos autores plantean que adems de la ganancia en el tiempo y considerando
solamente los reactivos usados en ambos mtodos de identificacin, el PRA-hsp65 es
un 50% ms barato que la identificacin bioqumica en MNT. Adems puede ser
realizado por una sola persona, mientras que las pruebas bioqumicas involucran,
usualmente, varias personas que intervienen en la esterilizacin, preparacin de
medios de cultivo y manejo de los cultivos (Da Silva et al., 2001; Wang, 2005).

Existen estudios a nivel internacional comparan el PRA-hsp65 con tcnicas
alternativas de diagnstico como son el HPLC, obteniendo mayores niveles de
sensibilidad, precisin y menor tiempo de realizacin para la primera (Mondragn et
al., 2000)

Uno de los mtodos moleculares ms empleados en el diagnstico de TB es la
secuencia de insercin IS6110, presente solamente en M. tuberculosis y capaz de ser
detectada por una simple RCP. Sin embargo, se han reportado micobacterias atpicas
que presentan esta secuencia as como cepas de M. tuberculosis con bajo o ningn
nmero de copias de IS6110, provocando el fallo de la tcnica (McHugh et al., 1997).

En Cuba existen antecedentes del uso de esta tcnica para la identificacin de MNT.
El reporte realizado por Yzquierdo et al., en el 2007 comprendi la evaluacin del
PRA-hsp65 en la identificacin de 47 cepas de MNT pertenecientes a una coleccin
internacional. En este trabajo se obtuvo un 100% de concordancia. Sin embargo la
realizacin en paralelo de un batera de pruebas bioqumicas arroi cuatro resultados
discordantes entre ambos mtodos (Yzquierdo et al., 2007).

El diagnstico est llamado a convertirse en la piedra angular dentro de la lucha contra
la TB Las tcnicas de biologa molecular han sido probadas como herramientas tiles
Discusin
37

en el diagnstico de esta enfermedad. Ellas pueden estimar el nmero de casos
atribuido a infeccin reciente con M. tuberculosis, identificar factores de riesgo,
documentar reinfecciones exgenas, estudiar patrones de resistencia, detectar
diferencias fenotpicas rpidamente y con mayor precisin que la obtenida por los
mtodos tradicionales (Coelho et al., 2008; Lima et al., 2008). Los beneficios de poder
contar con nuevos y ms eficaces sistemas de diagnstico de TB ser de un gran
significado en la salud pblica de la poblacin en su contexto regional, nacional y
global (Guevara et al., 2003).

CONCLUSIONES
Conclusiones

38

6. CONCLUSIONES

1. Se comprob la amplificacin del gen hsp65 en todas las cepas estudiadas. La
digestin con las enzimas de restriccin BstEII y HaeIII mostraron patrones
compatibles, en todos los casos, con el complejo M. tuberculosis.
2. Se evidenciaron las limitaciones de las pruebas bioqumicas en funcin del
crecimiento bacteriano
3. Los valores de sensibilidad y concordancia fueron del 100% al comparar el
PRA-hsp65 con las pruebas bioqumicas de identificacin demostrando la
aplicabilidad de esta tcnica para el diagnstico de la tuberculosis.

RECOMENDACIONES

Recomendaciones

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7. RECOMENDACIONES

1. Incluir la tcnica de PRA-hsp65 en el algoritmo de identificacin de
Micobacterias empleado en el LNRTB del Instituto de Medicina Tropical Pedro
Kour

2. Estandarizar el PRA-hsp65 a partir de muestras biolgicas con el objetivo de
disminuir, de manera considerable, el tiempo de diagnstico de la tuberculosis.

3. Extender la aplicacin de la tcnica de PRA-hsp65 a la identificacin de MNT
con la finalidad de evaluar su especificidad en comparacin con las pruebas de
identificacin bioqumicas.

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ANEXOS
Anexos

ANEXO 1
Patrones reportados por Chimara et al 2008

TESIS Reaccion Cadena Polimerasa Diagnostico Tuberculosis

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