YOGURT LIGHT

ESPECIFICACIONES DEL PRODUCTO

Descripcin
Es un producto lcteo, acidificado por accin biolgica de bacterias lcticas especficas (Lactobacillus acidophillus y
Streptococcus thermophillus). Es elaborado con leche descremada controlada y seleccionada, estabilizantes (440 /
1400), colorantes (120 / 160b), edulcorantes (951 y 950). La mezcla es sometida a tratamientos trmicos y de
homogenizacin, para despus inocular el cultivo lctico especfico, posteriormente el producto es envasado bajo
rigurosos controles de calidad e higiene. Los sabores que presenta son Durazno y Frutilla.
Uso
Producto de consumo directo, como postre o acompaado por cereales y todas aquellas preparaciones que requieran
alimentos con bajas caloras, no requiere tratamiento especial para su consumo. Destinado especialmente para jvenes y
adultos que requieran alimentos con bajas caloras.
Conservar el producto siempre en refrigeracin de 2 C a 8 C.






Informacin Nutricional Promedio por 200 gramos
Nutriente Unidad Cantidad
Aporte energtico kcal 88,8
Carbohidratos totales g 12,6
Protenas g 6,0
Grasa total g 1,6
Vitamina A Ul 800,0
Vitamina D Ul 100,0
Vitamina E mg 6,6
Calcio mg 232,0
Fsforo mg 204,0

ESPECIFICACIONES DE ENTREGA
Caractersticas del Envase
El producto esta envasado en botellas de alta densidad, el envase presenta dos tapas para otorgarle hermeticidad al
producto, la primera de aluminio y polietileno y la segunda de polipropileno, todos los materiales de primer uso y grado
alimenticio. La capacidad del envase es para 1 kg de producto.
Almacenamiento y Vida til
El producto debe almacenarse en lugares limpios.
Debe mantenerse refrigerado de 2 C o 8 C. No romper la cadena de fro.
Existe el riesgo de que el producto absorba vapores, mantener separado de productos que emitan olores o
vapores fuertes.
El producto debe ser protegido de la lluvia, la humedad y las altas temperaturas,
La accin directa de la luz solar.
Bajo estas condiciones de almacenamiento el producto tiene un tiempo de vida til de 60 das.

Determinacin de protenas
Procedimiento para determinar protenas por el Mtodo de Kjeldahl-Gunning en yogurt
1. REACTIVOS Y MATERIALES
1.1.
1.2. Sulfato de cobre (CuSO4.5H2O)
1.3. Granalla de zinc
1.4. Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4)
1.5. cido Brico (H3BO4) al 4% en agua.
1.6. Solucin concentrada de hidrxido de sodio (NaOH) 1:1 m/v
1.7. cido clorhdrico (HC1) 0.1N
1.8. Indicador de Wesslow
1.9. a) Rojo de metileno al 0.2% en una mezcla de 60 cm3 de alcohol etlico y 40 cm3 de agua.
1.10. b) Azul de metileno al 0.2% en agua destilada.
Mezclar dos partes de (a) y una parte de (b).
Matraz de Kjeldahl de 800 cm3
Matraz Erlenmeyer de 500 cm3
Bureta de 50 cm3
Pipetas volumtricas de 5 cm3
Probeta
Cuerpos de ebullicin
Material comn de laboratorio

2. APARATOS E INSTRUMENTOS
-Balanza analtica de sensibilidad de 0.1 mg.
-Digestor-Destilador de Kjeldahl.
3. PREPARACIN DE LA MUESTRA
Antes de proceder al anlisis homogeneizar el yogurt por agitacin e inversin repetida del recipiente que la
contiene, evitando la formacin de espuma.

4. PROCEDIMIENTO
4.1. Medir con una pipeta volumtrica 5 cm3 de muestra y colocarlos en un matraz de Kjeldahl.
4.2. Agregar 2 g de sulfato de cobre, 10 g de sulfato de sodio anhidro, 25 cm3 de cido sulfrico y cuerpos de
ebullicin.
4.3. Colocar el matraz en el digestor y calentar cuidadosamente a baja temperatura, hasta que todo el material
est carbonizado; aumentar gradualmente la temperatura hasta que el contenido del matraz est
completamente claro, dejar 15 minutos ms y enfriar.
4.4. Agregar 400 cm3 de agua destilada para disolver completamente el residuo del matraz y enfriar.
4.5. Conectar al destilador un matraz Erlenmeyer de 500 cm3, que contenga 50 cm3 de cido brico y unas gotas
del indicador de Wesslow, la parte terminal del tubo del destilador debe estar dentro del cido.
4.6. Agregar 6-7 granallas de zinc; estratificando y sin agitar agregar 50 cm3 de solucin de hidrxido de sodio,
colocar el matraz en el destilador y agitar.
4.7. Destilar hasta aproximadamente 300 cm3.
4.8. Retirar el matraz y titular con cido clorhdrico 0.1N

5. CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS
g/1 de protena = V x N x 0.014 x 1000 x 6.38M
En donde:
V = cm3 de cido clorhdrico 0.1N requeridos en la titulacin
N = Normalidad del cido clorhdrico
0.014 = Mili equivalentes del nitrgeno
M = cm3 de muestra
6.38 = Factor para convertir nitrgeno a protenas de la leche
6. BIBLIOGRAFA
a) Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical. AOAC 14thEdition 1984, pag. 282
(16.036).
b) Control Fsico-Qumico de leche pasteurizada. Series manuales tcnicos. Direccin General de Epidemiologa.
Laboratorio Nacional de Salud Pblica. 1988.
c) NMX-Z-13. Gua para la Redaccin, Estructuracin y Presentacin de las Normas Mexicanas. Direccin
General de Normas. SECOFI, Mxico, 1977.

DETERMINACIN DE GRASAS TOTALES

METODO DE GERBER
Separar, mediante acidificacin y centrifugacin, la materia grasa contenida en el yogurt analizado, y determinar el
contenido de grasa mediante lectura directa en un butirmetro estandarizado
1. Instrumentos
1.1 Pipeta aforada de 10 cm3, de seguridad, para cido sulfrico,
1.2 Pipeta aforada de 1 cm3, para alcohol amlico.
1.3 Pipeta aforada de 10,94 cm3, para medir la muestra.
1.4 Butirmetros Gerber, para leche y derivados
1.5 Centrfuga, con velocidad de 1100 100 r/min.
1.6 Bao de agua, con regulador de temperatura, ajustado a 65 2 C.
1.7 Bao Mara.
2. Reactivos
2.1 cido sulfrico, concentrado para anlisis, con densidad 1,815 0,003 g/cm3 a 20C.
2.2 Alcohol amlico, compuesto principalmente de 3-metil-butanol y 2-metil-butanol y prcticamente exento de
alcoholes amlicos secundarios o terciarios y furfural; deber tener una densidad de 0,811 0,002 g/cm3 a
20C.
2.3 Agua destilada.
3. Preparacin de la muestra
3.1 Llevar la muestra a una temperatura de aproximadamente 20C, y rnezclarla mediante agitacin suave hasta
que est homognea, cuidando que no haya separacin de grasa por efecto de la agitacin
3.2 Si se forman grumos de crema y stos no se dispersan, calentar la muestra en bao Mara hasta 35- 40C,
mezclando cuidadosamente e incorporando cualquier partcula de crema adherida al recipiente, y enfriar
rpidamente hasta 18-20C. Si quedan partculas blancas o grumos de grasa adheridos a las paredes del
recipiente, la determinacin no dar resultados exactos.
4. Procedimiento
4.1 Para la determinacin del contenido de grasa en el yogurt ) debe usarse el butirmetro Gerber para yogurt.
4.2 Verter 10 cm3, exactamente medidos, de cido sulfrico en el butirmetro respectivo, cuidando de no
humedecer con cido el cuello del butirmetro.
4.3 Invertir lentamente, tres o cuatro veces, la botella que contiene la muestra preparada, y pipetear 10,94 cm3
de yogurt, de tal manera que el borde inferior del menisco coincida con la lnea de calibracin de la pipeta
despus de limpiar con papel absorbente la parte exterior de su punta de descarga. Luego, sosteniendo la
pipeta con su punta pegada al borde inferior del cuello del butirmetro, descargar cuidadosamente la leche
en el mismo hasta que el menisco se detenga, dejar transcurrir 3 segundos y frotar la punta de la pipeta
contra la base del cuello del butirmetro.
4.4 Verter 1cm3, exactamente medido, de alcohol amlico en el butirmetro, cuidando de no humedecer con el
alcohol el cuello del butirmetro, El alcohol amlico debe aadirse siempre despus de la leche.
4.5 Tapar hermticamente el cuello del butirmetro y agitar en una vitrina de proteccin, invirtiendo lentamente al
butirmetro dos o tres veces durante la operacin, hasta que no aparezcan partculas blancas.
Inmediatamente despus de la agitacin, centrifugar el butirmetro con su tapa colocada hacia afuera. Si no
hay un nmero suficiente de butirmetros para llenar completamente la centrfuga, colocarlos
simtricamente, equilibrndolos con uno que contenga igual volumen de agua en caso de ser necesario. Una
vez que la centrfuga alcanza la velocidad necesaria, continuar la centrifugacin durante un tiempo no menor
de 4 min. ni mayor de 5 min, a tal velocidad.
4.6 Retirar el butirmetro de la centrfuga y colocarlo, con la tapa hacia abajo, en el bao de agua a 65 durante
un tiempo no menor de 4 min ni mayor de 10 min, manteniendo la columna de grasa completamente
sumergida en el agua.
4.7 Realizar una primera lectura de acuerdo Luego, ajustar la tapa si es necesario e, inmediatamente. Repetir
por segunda vez la centrifugacin, el calentamiento a 65 2C y la lectura. Si la segunda lectura difiere de
la primera, repetir por tercera vez la centrifugacin, el calentamiento a 65 2C y la lectura; la medida vlida
corresponde a la segunda o tercera lectura
4.8 Instrucciones adicionales. Si existe formacin de una capa esponjosa o no definida en la base de la columna
de grasa, debe repetirse el ensayo teniendo cuidado de aadir el volumen correcto de alcohol amlico y de
disolver completamente cualquier partcula del yogurt. Si la columna de grasa presenta una coloracin muy
obscura que dificulta la lectura, o hay carbonizacin en la interface, debe repetirse el ensayo luego de
verificar la densidad del cido sulfrico, El butirmetro debe lavarse perfectamente al final de la operacin
METODO DE RSE GOTTLIEB
Extraer con ter dietlico y ter de petrleo la grasa contenida en una solucin etanlica amoniacal de yogurt; evaporar
los solventes y pesar el residuo
1. Instrumentos
1.1 Balanza analtica. Sensible al 0,1 mg.
1.2 Centrfuga, provista con motor trifsico, apropiada para colocar los tubos de extraccin y capaz de mantener
una velocidad de 550 50 r/min. El uso de la centrfuga es opcional.
1.3 Estufa, con ventilacin y regulador de temperatura, ajustada a 102 2C, o estufa al vaco, ajustada a una
temperatura de 70 a 75C y presin menor de 66 kPa, (50 mm Hg).
1.4 Matraces Erlenmeyer, de 150 a 250 cm3 de capacidad.
1.5 Tubos o matraces de extraccin. Pueden usarse tubos de Rohring o matraces de Mojonnier, con tapones
hermticos de vidrio esmerilado, neopreno u otro material que no sea afectado por los solventes usados.
1.6 Material para facilitar la ebullicin, exento de grasa, no poroso, Pueden usarse perlas de vidrio o de otro
material adecuado.
1.7 Desecador, con cloruro de calcio anhidro u otro deshidratante adecuado.
1.8 Bao Mara.
2. Reactivos
2.1 Solucin al 25 % de amonaco, con densidad aproximada de 0,91 g/cm3 a 20C.
2.2 Alcohol Etlico. Solucin al 94-97 % (V/V).
2.3 ter di etlico, exento de perxido
2.4 ter de petrleo, con cualquier intervalo de destilacin comprendido entre 30 y 60C.
3. Preparacin de la muestra
3.1 Llevar la muestra a una temperatura de aproximadamente 20C y mezclarla mediante agitacin suave hasta
que est homognea, cuidando que no haya separacin de grasa por efectos de la agitacin.
3.2 Si se forman grumos de crema y stos no se dispersan, calentar la muestra en bao Mara hasta 35-40C,
mezclando cuidadosamente e incorporando cualquier partcula de crema adherida al recipiente, y enfriarla
rpidamente hasta 18-20C. Si quedan partculas o grumos de grasa adheridos a las paredes del recipiente,
la determinacin no dar resultados exactos.
4. Procedimiento
4.1 La determinacin debe realizarse por duplicado sobre la misma muestra preparada
4.2 Secar un matraz Erlenmeyer (que puede contener, si se desea, el material para facilitar la ebullicin) en la
estufa durante 30 a 60 min. Dejarlo enfriar en el desecador y pesarlo con aproximacin a 0,1 mg.
4.3 Invertir lentamente, tres o cuatro veces, la botella que contiene la muestra preparada e, inmediatamente,
transferir al matraz o tubo de extraccin y pesar con aproximacin a 0,1 mg, de 10 a 11 g de muestra.
4.4 Agregar a la porcin de ensayo 1,5 cm3 de solucin al 25 % de amonaco y mezclar completamente. Agregar
10 cm3 de alcohol etlico y agitar el contenido del matraz o tubo de extraccin, mantenindolo abierto.
4.5 Aadir 25 cm3 de ter dietlico y, despus de cerrar el matraz o tubo de extraccin con el tapn humedecido,
mezclar el contenido agitndolo enrgicamente e invirtindolo repetidamente durante 1 minuto; si es
necesario enfriar en corriente de agua. Quitar cuidadosamente el tapn y agregar 25 cm3 de ter de
petrleo, empleando parte de colocar nuevamente el tapn y mezclar el contenido agitndolo e invirtindolo
repetidamente durante 30 segundos. No debe agitarse enrgicamente si no se usa centrfuga.
4.6 Dejar en reposo el matraz o tubo de extraccin hasta que la capa superior etrea llegue a separarse
totalmente de la capa acuosa quedando completamente lmpida. Puede acelerarse la separacin mediante el
uso de una centrfuga adecuada.
4.7 Quitar cuidadosamente el tapn y enjuagar con unos pocos mililitros de ter de petrleo el interior del cuello
del matraz o tubo de extraccin. Transferir lo ms completamente posible, mediante decantacin o con
ayuda de un sifn, la capa superior etrea al matraz Erlenmeyer tarado, teniendo cuidado de no arrastrar
ninguna porcin de capa acuosa. A continuacin, enjuagar el tapn del matraz o tubo de extraccin y el sifn
con una pequea porcin de ter de petrleo, incorporando esta porcin al contenido del matraz Erlenmeyer.
4.8 Repetir la extraccin dos veces ms siguiendo el procedimiento indicado pero usando cada vez 15 cm3 de
ter dietlico y 15 cm3 de ter de petrleo y omitiendo el enjuague final en la ltima extraccin.
4.9 Evaporar o destilar cuidadosamente los solventes contenidos en el matraz Erlenmeyer y secar el residuo en
la estufa durante una hora, colocando el matraz en posicin horizontal.
4.10 Dejar enfriar el matraz Erlenmeyer en el desecador, pesarlo con aproximacin a 0,1rng. Repetir el
calentamiento por perodos, de 30 a 60 min, enfriando y pesando hasta que no haya disminucin en la masa.
4.11 Agregar 15 a 25 cm3 de ter de petrleo para verificar si el material extrado es completamente soluble.
Calentar suavemente y agitar hasta que toda la grasa se haya disuelto. Si el material extrado es
completamente soluble en el ter de petrleo, la masa de grasa es la diferencia entre la masa final del
matraz con el extracto y la masa original del matraz vaco
4.12 Si el material extrado no es completamente soluble en el ter de petrleo, o en caso de duda y siempre
en caso de discrepancia o litigio extraer la grasa del matraz mediante lavados sucesivos con ter de petrleo
tibio, dejando que el material insoluble se asiente antes de cada decantacin. Enjuagar la parte exterior del
cuello del matraz tres veces. Calentar el matraz con el material insoluble durante una hora en la estufa,
colocndolo en posicin horizontal. Enfriarlo en el desecador, pesarlo con aproximacin a 0,1 mg. La masa
de grasa, en este caso, es la diferencia entre la masa del matraz con el extracto total y la masa del matraz
con el material insoluble.
4.13 Debe realizarse un solo ensayo en blanco sobre 10 cm3 de agua destilada, usando el mismo
instrumental, los mismos reactivos en las mismas cantidades y el mismo procedimiento, en igual forma que
para la muestra. Si la materia extrada excede de 0,5 rng, los reactivos debern purificarse o desecharse y el
ensayo deber repetirse.
5. Clculos
El contenido de grasa en el yogurt se calcula mediante la ecuacin siguiente:

Siendo:
G = contenido de grasa, en porcentaje de masa.
m = masa de la muestra analizada, en g.
m1 = masa del Erlenmeyer con el extracto, en g.
m2 = masa del Erlenmeyer vaco, o del Erlenmeyer con el material insoluble, en g.
m3 = masa del Erlenmeyer con el extracto resultante en la determinacin en blanco, en g
m4 = masa del Erlenmeyer vaco empleado en la determinacin en blanco, o del
Erlenmeyer con material insoluble, en g.

Determinacin de la vitamina A
1. Vitamina A
La vitamina A se utiliza como un nombre genrico para describir al retinol, sus steres y los correspondientes ismeros.
La vitamina A se encuentra principalmente en productos animales tales como leche, crema, mantequilla, queso, huevos,
carne, hgado, rin y aceite de hgado de bacalao. Por lo general, se encuentra como steres de cidos grasos de
cadena larga pero tambin se encuentra como retinol. Los alimentos son fortificados normalmente con steres de retinol
tales como acetato, palmitato o propionato utilizando formulaciones especiales que mejoran la estabilidad.
a) Frmulas y propiedades
Frmula emprica
Retinol C
20
H
30
O
(P. molecular 286,5)
Descripcin
Retinol: Polvo cristalino amarillo
(P. fusin 62-64C)
Espectro de absorcin
La vitamina A y los correspondientes steres muestran un espectro de absorcin caracterstico, la posicin del pico
mximo depende del solvente; en isopropanol es a 326 nm, en ciclohexano es a 328 nm.
El retinol tiene un coeficiente de extincin (E 1% -1cm ) = 1835 en etanol (5) y de 1826 en n-hexano; este valor es vlido
slo para el solvente mencionado; puede cambiar significativamente con otros solventes.
Estabilidad
El retinol y sus steres son rpidamente destruidos por la luz, el oxgeno y los cidos. Deben almacenarse en frascos
mbar sellados con gas inerte (por ejemplo: nitrgeno).
Unidades biolgicas
Una Unidad Internacional (UI) corresponde a la actividad de 0,344 g de acetato de vitamina A puro cristalino; 0,300 g de
retinol o 0,550 g de palmitato de retinol corresponden a 1 UI. 1g de retinol es equivalente a 3,333 UI de vitamina A.
b) Mtodo
Primeramente, se determinaba la vitamina A mediante una reaccin colorimtrica de retinol con tricloruro de antimonio
(reaccin de Carr-Price).
El retinol obtenido despus de saponificar y extraer los componentes no saponificables tena que ser purificado utilizando
cromatografa de columna abierta con el fin de eliminar los componentes interferentes. La HPLC se ha convertido en la
actualidad en el mtodo de eleccin dado que esta tcnica acorta considerablemente el procedimiento del anlisis y
aumenta la reproducibilidad y exactitud.
Saponificacin y extraccin
Generalmente 2-10 g de la muestra se saponifican preferentemente bajo nitrgeno utilizando una mezcla de hidrxido de
potasio acuoso, etanol o metanol, agua y con la adicin de un antioxidante como cido ascrbico, pirogalol o BHT. Los
antioxidantes deberan ser agregados a la muestra antes de la adicin de la solucin de hidrxido de potasio. El Cuadro
1 muestra la proporcin de estos reactivos.

El tiempo normal de saponificacin es entre 15-45 minutos con temperaturas que fluctan de 80 a 100C (reflujo).
La vitamina A es extrada de la solucin de saponificacin por medio de un solvente adecuado por ejemplo: ter dietlico,
tertbutil metil ter, n-hexano 3 a 4 veces, con volmenes que fluctan de 50-150 ml. Los extractos combinados son
lavados a pH neutro con agua (2-4 veces, 50-150 m1).
Evaporacin y dilucin
Se agregan aproximadamente 2-5mg de BHT (Butil hidroxitolueno) al extracto antes de la evaporacin utilizando un
evaporador rotatorio bajo un vaco parcial y a una temperatura que no exceda 50C Deben tomarse medidas para
remover restos de agua tales como secar con sulfato de sodio, o destilacin azeotrpica con etanol o tolueno o el uso de
papel filtro para separacin de fases.
El residuo es redisuelto utilizando de preferencia la fase mvil u otro solvente compatible con HPLC de tal modo de
obtener una concentracin apropiada para la inyeccin dentro de la columna de HPLC. Esta la solucin final de la
muestra.
HPLC
Principalmente, pueden utilizarse dos modos de cromatografa (fase normal y fase reversa) para la cuantificacin de la
vitamina A. El Cuadro 2 muestra dos procedimientos de trabajo a partir de las mltiples posibilidades que existen para
lograr buenas separaciones.
Los estndares y soluciones estndares deberan controlarse espectromtricamente en cuanto a la pureza y la
concentracin corregida debera utilizarse para el clculo.
En algunos de los sistemas cromatogrficos, se logra una separacin entre el retinol "slo trans" y el 13-cis retinol. En
estos casos, los resultados deberan informarse como equivalentes de retinol "slo trans" lo cual es la suma del retinol
"slo-trans" y el 13-cis retinol despus de corregir considerando la menor biopotencia (75% del retinol "slo-trans"). Es
importante indicar claramente las unidades utilizadas para informar los resultados.


c) Resumen
1. La muestra y el extracto de la muestra deben protegerse de la luz y la oxidacin.
2. La saponificacin bajo reflujo debera llevarse a cabo preferentemente bajo nitrgeno utilizando antioxidantes.
3. Los antioxidantes (BHT) deben agregarse antes de la evaporacin de los solventes bajo un vaco parcial y sin
exceder 50C.
4. Separar adecuadamente el retinol y sus ismeros de los otros componentes.
5. Control espectromtrico de la pureza del estndar.
6. Informar las unidades relacionadas al resultado.
7. Hacer una referencia a los anlisis de carotenoides, dado que algunos tienen actividad de vitamina A tal como el
caroteno.


Determinacin de la vitamina D
Frmula emprica
Vitamina D C
28
H
44
O
(P. molecular 396,7)
Descripcin
Polvos cristalinos blancos a amarillos Punto de fusin
Espectro de absorcin
Las vitaminas D D
2
y D
3
exhiben una absorcin mxima a 265 nm en soluciones alcohlicas.
E 1%-lcm vitamina D
2
475 (etanol)(9)
vitamina D
3
480 (etanol)(9)
Estabilidad
La vitamina D se destruye relativamente rpido por luz, oxgeno y cidos. Por lo tanto, deben almacenarse bajo nitrgeno
en frascos sellados. Los compuestos cristalinos son relativamente estables al calor, pero tienden a isomerizarse en
solucin. El equilibrio de isomerizacin depende principalmente de la temperatura.
Unidades biolgicas
1 Unidad Internacional (UI) de vitamina D se define como la actividad biolgica correspondiente a la cantidad de 0,025 g
de vitamina D
2
o D
3
puras.
Mtodo
procedimientos de cromatografa de gas que incluan una saponificacin, extraccin del material no saponificable,
remocin de las interferencias mediante precipitacin seguida por una cromatografa en almina, Sephadex y Florisil,
luego la conversin de la vitamina D a la isovitamina previa a la formacin del derivado trimetilsililado y cromatografa de
gas Saponificacin y extraccin
la vitamina D es extrada mediante saponificacin utilizando una solucin alcohlica de hidrxido de potasio seguida de
una extraccin del solvente. La determinacin de vitamina D

en una solucin apropiada del extracto de la muestra se
realiza mediante HPLC de fase normal semipreparativa seguida por HPLC de fase reversa analtica. La cromatografa se
monitorea por UV y se logra la identificacin de los picos de acuerdo a los tiempos de retencin y la cuantificacin se
realiza por el mtodo de estndar interno utilizando las reas o las alturas de los picos.
De 10 a 30g de la muestra se saponifican preferentemente bajo nitrgeno utilizando una mezcla de etanol o metanol,
agua, un antioxidante tal como cido ascrbico, hidroquinona, pirogalol o BHT e, hidrxido de potasio acuoso. El
antioxidante debera agregarse a la muestra antes de la adicin de la solucin de hidrxido de potasio necesaria para la
saponificacin. Si ha de determinarse vitamina D
3
, se pipetea una cantidad apropiada de estndar de vitamina D
2
en la
solucin alcohlica dentro del frasco de saponificacin. La cantidad de estndar interno de vitamina D
2
agregada deber
ser similar a la cantidad de vitamina D
3
esperada en la muestra y viceversa. En el Cuadro 5, se muestran ejemplos de la
proporcin de reactivos utilizados para la saponificacin. El tiempo normal de saponificacin es de 20-45 minutos con
temperaturas que fluctan de 80 a 100C (reflujo).
La vitamina D
2
y D
3
son extradas de la mezcla enfriada de saponificacin por medio de un solvente adecuado, como ter
dietlico, tertbutil metil ter, n-hexano, ter de petrleo o mezclas, de 3 a 4 veces con volmenes que fluctan de 50-150
ml. Los extractos combinados son lavados a pH neutro con agua (2-4 veces, 50-150 ml).




Evaporacin y dilucin
Se agregan aproximadamente 2-5mg de BHT al extracto antes de la evaporacin utilizando un evaporador rotatorio bajo
un vaco parcial y a una temperatura que no exceda 50C. Deben tomarse medidas para remover restos de agua tales
como secar con sulfato de sodio, o destilacin azeotrpica con etanol o tolueno o el uso de papel filtro para separacin
de fases.
El residuo es redisuelto utilizando de preferencia la fase mvil del sistema HPLC semipreparativo u otro solvente
compatible con HPLC de tal modo de obtener una concentracin apropiada para la inyeccin dentro de la columna de
HPLC.
HPLC
Sistema semipreparativo (fase normal)
Un estndar mixto de vitamina D
2
y D
3
es cromatografiado en el sistema HPLC semipreparativo y la condiciones
optimizadas de tal manera de obtener con un tiempo de retencin reproducible un slo pico de vitamina D y tambin
tener una ptima separacin de otros componentes que interfieren. Esto permite una recoleccin precisa de la banda de
la fraccin de vitamina D.
Sistema analtico (fase reversa)
Un estndar mixto de vitamina D
2
y D
3
deber ser cromatografiado en el sistema analtico de HPLC ajustando las
condiciones cromatogrficas hasta que la resolucin de la vitamina D
2
y D
3
est al menos completada en un 98% y las
vitaminas sean resueltas de todas las interferencias de matriz de los alimentos.
Condiciones y cuantificacin de HPLC
Una alcuota del extracto de la muestra concentrada se inyecta en el sistema HPLC semipreparativo y la fraccin de la
vitamina D es recogida va corte de bandas. La ventana de tiempo para el corte de banda debe haberse determinado
previamente utilizando una mezcla estndar de vitamina D y debera ser lo ms angosta posible.
La fraccin del corte de banda obtenida en la HPLC semipreparativa debe llevarse a sequedad y redisolverse en un
solvente compatible con la fase mvil del sistema analtico de HPLC analtico. Se inyectan alcuotas de la solucin
obtenida y se identifican y cuantifican los picos de vitamina D
2
y D
3
utilizando el mtodo estndar interno. En el Cuadro 6
se presentan las condiciones de los dos sistemas:
Los estndares y soluciones estndares deberan controlarse espectromtrica-mente en cuanto a la pureza y utilizar la
concentracin corregida para el clculo.
Es importante mencionar claramente las unidades utilizadas para informar los resultados, por ejemplo en g de vitamina
D
3
/100 g de alimento.
c) Resumen
1. Las condiciones de saponificacin para la determinacin de la vitamina D
2
y D
3
son similares a aquellas
utilizadas para la vitamina A o E.
2. Se recomienda la HPLC de fase normal semipreparativa seguida por HPLC de fase reversa analtica.
3. La vitamina D
2
debera utilizarse como estndar interno para la determinacin de la vitamina D
3
y
viceversa para compensar las prdidas producidas durante la preparacin de la muestra.
4. Los estndares debern examinarse y determinarse espectromtricamente utilizando los correspondientes E 1%-
1cm.
5. Los resultados debern informarse claramente con las unidades correspondientes.



Determinacin de la vitamina E
Vitamina E
La vitamina E que se encuentra en la naturaleza abarca una serie de compuestos denominados tocoferoles y
tocotrienoles. Estos compuestos tienen diferentes actividades biolgicas y por lo tanto es importante que sean
cuantificados individualmente si ha de determinarse la actividad biolgica de la vitamina E.
a) Frmula y propiedades
Frmula emprica
-tocoferol C
29
H
50
O
2

(P. molecular 430,7)
Espectro de absorcin
-tocoferol
Max. a 292 nm; mn. a. 255 nm
(etanol)
Acetato de -tocoferol
Mx. a 284 nm; mn. a. 254 nm
(etanol)
E 1%-lcm en metanol (7) para:
-tocoferol 76 (292 nm)
-tocoferol 89 (296 nm)
Y-tocoferol 91(298 nm)
6-tocoferol 87 (298 nm)
Mtodo
reaccin de cloruro frrico que se reduca a iones ferrosos, los que forman un complejo de color rojo con ajaMipiridina, o
batofenantrolina (4,7-difenil-1,10-fenantrolina).
reaccin denominada Emmerie-Engel en extractos purificados cromatogrficamente despus de saponificar las muestras
y que era interferida por muchos componentes. Produca complejos ms bien inestables y el tiempo de manejo
complicaba el procedimiento, el cual requera mucho trabajo.
Se utiliz la cromatografa de gas por algn tiempo pero muy pronto se reconocieron las ventajas de HPLC, tambin
considerando la posibilidad de separar simultneamente a, , y, y 5-tocoferol con esta tcnica que estaba emergiendo.
Saponificacin y extraccin
El procedimiento ms comn para la determinacin de tocoferoles incluye la saponificacin alcalina de las muestras
seguida por la extraccin del material no saponificable con un solvente orgnico apropiado. Cualquier ster de a-tocoferol
que pueda haberse agregado como un suplemento a los alimentos ser convertido a t-tocoferol por este procedimiento.
Se saponifica 2-10 g de la muestra preferentemente bajo nitrgeno utilizando una mezcla de etanol o metanol, agua, un
antioxidante tal como el cido ascrbico, hidroquinona, piro-galol o BHT e hidrxido de potasio acuoso. Los tocoferoles
son muy sensibles al oxgeno en un ambiente alcalino. Por lo tanto, el alcohol y el antioxidante deberan agregarse a la
muestra antes de la adicin de la solucin de hidrxido de potasio necesario para la saponificacin y tiene que tenerse
cuidado en remover todo el oxgeno del recipiente de reaccin. A continuacin se muestra un ejemplo de la proporcin de
estos reactivos. (Cuadro 3)





El tiempo normal de saponificacin es de 15-45 minutos con temperaturas que fluctan de 80 a 100C (reflujo).
Los tocoferoles son extrados de la mezcla de saponificacin por medio de un solvente adecuado, por ejemplo, ter
dietlico, tertbutil metil ter, n-hexano, 3 a 4 veces con volmenes que fluctan de 50-150 ml. Los extractos combinados
son lavados a pH neutro con agua (2-4 veces, 50-150 ml).
Evaporacin y dilucin
Se agregan aproximadamente 2-5mg de BHT al extracto antes de la evaporacin utilizando un evaporador rotatorio bajo
un vaco parcial y a una temperatura que no exceda 50C. Deben tomarse medidas para remover restos de agua tales
como secar con sulfato de sodio, o destilacin azeotrpica con etanol o tolueno o el uso de papel filtro para separacin
de fases.
El residuo es redisuelto utilizando de preferencia la fase mvil u otro solvente compatible con HPLC de tal modo de
obtener una concentracin apropiada para la inyeccin dentro de la columna de HPLC. Esta la solucin final de la
muestra.
HPLC
Principalmente, pueden utilizarse dos modos de cromatografa (fase normal y fase reversa) para la cuantificacin de los
tocoferoles. El sistema de fase normal tiene claras ventajas dado que todos los vitmeros son separados mientras que
los sistemas de fase reversa no separan -tocoferol de y-tocoferol.
La deteccin se realiza preferentemente mediante fluorescencia debido a su mayor selectividad as como tambin por los
menores lmites de deteccin obtenidos si se compara con UV. A partir de las mltiples posibilidades para lograr buenas
separaciones, el Cuadro 4 muestra a continuacin las condiciones de dos procedimientos de trabajo. Los estndares y
soluciones estndares deberan controlarse espectromtricamente en relacin a la pureza y utilizar la concentracin
corregida para el clculo. Es importante mencionar claramente las unidades utilizadas para informar los resultados por
ejemplo, en mg -tocoferol/100 g de alimento.


c) Resumen
1. Las condiciones de saponificacin para la determinacin de tocoferoles son similares a aquellas utilizadas para la
vitamina A.
2. Debe tenerse cuidado en evitar el contacto con oxgeno en las soluciones alcalinas.
3. La deteccin de fluorescencia tiene claras ventajas as como tambin la cromatografa de fase normal.
4. Los estndares deberan examinarse y determinarse espectromtricamente utilizando el correspondiente E 1%-
lcm
5. Los resultados deberan informarse claramente ya sea como mg de los tocoferoles individuales o como
equivalentes de vitamina E.


Determinacin de calcio


Determinacin de fosforo