Estacin de Viticultura e

Enoloxa de Galicia
Microorganismos en la industria enolgica
y su relacin con la calidad del vino
Pilar Blanco Camba
Las levaduras y el vino
CARACTERSTICAS GENERALES
Hongos microscpicos unicelulares
Clulas eucariotas
Morfologa variada: esfricas, elpticas , ovaladas, alargadas,
apiculadas
Reproduccin vegetativa o asexual por gemacin (algunas por
biparticin)
Reproduccin sexual. Formacin de esporas
Responsables de la fermentacin alcohlica (transformacin de
azcar en alcohol +CO
2
)
Alteraciones (flor, refermentaciones)
Organizacin de una clula procariota (A) y eucariota (B)
A
B
Principales levaduras vnicas
Nombre: Saccharomyces cerevisiae
Caractersticas:
Morfologa elpticas u ovoides
Alta capacidad fermentativa
Formadora de esporas (ascosporas con 4 esporas)
No asimila nitratos ni escinde arbutina
Crecimiento en presencia de etanol
Fermenta y asimila glucosa, galactosa, maltosa,
sacarosa y rafinosa.
No fermenta ni asimila lactosa
Principales levaduras vnicas
Nombre: Kloeckera apiculata
Hanseniaspora guillermondii
Morfologa: apiculadas (forma de limn)
Aparece al inicio de la fermentacin
Fermenta la glucosa
Bajo poder fermentativo (4%)
Fuerte produccin de cidos voltiles
No esporula (Hanseniaspora si esporula)
No asimila nitratos
No escinde la arbutina
Principales levaduras vnicas
Nombre: Metschnikowia pulcherrima
Morfologa: clulas ovoides aisladas o en parejas. A
veces clulas grandes con un grueso grnulo central de
grasa.
Fermenta la glucosa
Bajo poder fermentativo (1%)
No asimila nitratos
Escinde la arbutina
Crece bien en presencia de alcohol
No esporula
En placa colonias blancas, brillantes con ligera
coloracin rojiza
Principales levaduras vnicas
Nombre: Schizosaccharomyces pombe
Morfologa : Clulas alargada o cilndricas
aisladas o en parejas (3-5 X 6-16) m
Divisin por fisin
Esporulada
No asimila nitratos ni escinde la arbutina
Buena capacidad fermentativa
Capacidad para degradar cido mlico a
etanol y CO
2
(fermentacin maloalcohlica)
Otras levaduras vnicas
Debaryomyces hansenii
Brettanomyces
Torulaspora
Cryptococcus
Debaryomyces hansenii
Rhodotorula
Levaduras formadoras de velo
Saccharomyces (flor)
Candida
Pichia
Hansnula
Zygosaccharomyces
Requerimientos nutricionales de las levaduras
Fuente de carbono: azcares
Fuente de nitrgeno
Sustancias minerales
Factores de crecimiento (vitaminas)
El mosto rene los requisitos adecuados para el desarrollo de las
levaduras (Excepciones: maduracin inadecuada, el ataque por botritis-
falta de nitrgeno, etc). pH cido-impide el desarrollo de muchas
bacterias
Origen de las levaduras de vinificacin
Uva (flora epiftica)
Material de bodega
Inculo (LSA)
Sucesin de la poblacin de levaduras a lo largo de la
fermentacin
Fase inicial
Predominio de levaduras apiculadas y de
otras morfologas con baja produccin de
alcohol y elevada produccin de cidos
voltiles (actico) Ex: Kloeckera apiculata,
Metschnikowia pulcherrima, Candida
sp,etc.
Fase tumultuosa
Saccharomyces invade el medio, acaba
dominando la fermentacin y desaparecen
las levaduras de la fase inicial
Fase final
Predominio de especies del gnero
Saccharomyces. Produce ms alcohol y
menos productos secundarios
Albario
900
950
1000
1050
1100
1150
1 3 5 7 9 11 13 15
Tiempo (das)
D
e
n
s
i
d
a
d
Evolucin de la poblacin de levaduras viables durante
la fermentacin
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
10,00
0 5 10 15
Tiempo (das)
L
o
g

N
L
V
Fase inicial : 10
4
-10
5
Fase tumultuosa: 10
7
-10
8
Fase final: 10
5
La fermentacin alcohlica
Glucosa Acido pirvico
Glucolisis
Acetaldehido
Etanol
Piruvato descarboxilasa
Alcohol deshidrogenasa
CO
2
NADH2
NAD+
Fermentacin alcohlica: Influencia del
temperatura y O
2
Rango de Temperatura para fermentacin en blancos: 14-20C
Rango para fermentacin en tintos: 25-30C
Temperatura crtica >35C
TREIXADURA
980
1000
1020
1040
1060
1080
1100
1120
0 10 20
Tiempo (Das)
D
e
n
s
i
d
a
d
nTT16
nTT19
nTT22
O
2
: Las levaduras requieren O
2
para su multiplicacin ya que interviene en
la sntesis de AG y esteroles, constituyentes de la membrana celular y
responsables de su permeabilidad (prctica de remontado)
Productos secundarios originados durante
la fermentacin alcohlica
Glicerina suavidad y aterciopelado
Succnico- es el cido que ms impresiona el gusto (sabor a bebida
fermentada, entre salado y amargo)
cidos orgnicos (mlico, ctrico, lctico, cidos voltiles
Actico y su ster, acetato de etilo- producido por las levaduras de la 1
fase y levaduras oxidativas. Efecto negativo sobre el vino
Metabolitos del ciclo diacetilo-acetonico (a concentraciones elevadas son
negativos)
glucosa Glicerina + pirvico
Fermentacin gliceropirvica
BACTERIAS LCTICAS
Gram +, catalasa -, no esporuladas, no mviles
Divisin por biparticin
Microaerfilas o anaerobias facultativas y fermentadoras
de azcares
Morfologa: cocos y bacilos
Segn el metabolismo de la glucosa pueden ser:
-Homofermentativas- c. lctico
-Heterofermentativas-c. lctico, actico, CO
2
,
etanol, acetaldehido, acetona, diacetilo,etc
Responsables de la fermentacin malolctica
Bajo ciertas condiciones pueden causar alteraciones
Metabolismo de aminoacidos-origina sustancias peligrosas
para la salud
Oenococcus oeni
BACTERIAS LCTICAS
aldolasa
Metabolismo homofermentativo de la glucosa (va
glucoltica de Embden-Meyerhof)
BACTERIAS LCTICAS
Metabolismo heterofermentativo de la glucosa
(ruta de Warburg-Dickens)
Clasificacin de las bacterias lcticas
L. oeni (O.oeni)
L. mesenteroides
(ssp. mesenteroides)
Heterofermentativos Leuconostoc
No descritas en vino
L. casei
L. plantarum
L. brevis
L. hilgardii
I. Homofermentativos estrictos
(No fermentan pentosas
Glucosa- 2 c. Lctico)
II. Heterofermentativ. facultativos
(Fermenta las pentosas y la glucosa)
II. Heterofermentativ. obligatorios
(No poseen el enzima aldolasa,
fermentan la glucosa mediante la va
de las pentosa fosfato)
Lactobacillus Bacilos
P. damnosus
P. pentosaceous
Homofermentativos Pediococcus Cocos
Especies Metabolismo de la glucosa Gnero Forma
Caractersticas de los principales gneros de bacterias lcticas
Algunas sp
contienen cidos
teicoicos
Sin cido
teicoico
Sin cido
teicoico
Pared celular
36-47% 34-42% 38-44% (G+C)%
No No Algunas cepas Hidrlisis de la
arginina
lctico, etanol,
actico, CO
2
DL L lctico
No carbnico
CO
2
, lctico,
etanol
Metabolismo de
la glucosa
0,5-1,2 X 1,0-10
m
1-2 m 0,5-0,7 m Tamao
Alargadas en
pares e en
cadenas
Esfricas
Divisin en dos
planos-ttradas
Esfricas o un
poco alargadas
En pares o en
cadenas
Morfologa de
las clulas
Lactobacillus Pediococcus Leuconostoc Caracterstica
BACTERIAS LCTICAS: ecologa
Origen
Uva
Material de bodega
Inculo (Cultivos iniciadores de Oenococcus oeni. Se trata de cultivos
puros o mezclas de 2-3 cepas)
Evolucin durante la fermentacin
En uva- poblacin muy baja
Mosto- 10
2
-10
4
UCF/ml. Disminuyen por proliferacin de las levaduras
durante la fermentacin alcohlica
Fase final Empieza a aumentar la poblacin de bacterias lcticas (lisis
de las levaduras), desaparecen los bacilos homofermentativos, luego los
heterofermentativos y acaba predominando O. oeni, mejor adaptado a las
condiciones de bajo pH y elevada concentracin de etanol
La fermentacin malolctica se inicia cuando las UFC/ml= 10
6
FERMENTACIN MALOLCTICA
Mlico Lctico + CO
2
Enzima malolctica
(Bacterias lcticas)
Repercusiones en el vino
Desadificacin biolgica del vino
Disminuye la acidez total y el mlico (sabor astringente)
Aumenta el cido lctico (suavidad)
Protege al vino de las enfermedades por bacterias lcticas
Otras: Produccin de diacetilo (aroma a mantequilla)
A bajas concentraciones bouquet
A elevadas concentraciones - rancio
Posibles rutas del cido mlico
BACTERIAS LCTICAS: fermentacin malolctica
Factores que influyen en la fermentacin malolctica
Caractersticas de la variedad (relacin tartrico/mlico), residuos
fitosanitarios
pH del medio (Actan mejor a pH> 3.5; T ptima 4.2-4.5). El pH
condiciona el crecimiento bacteriano y los sustratos que van a metabolizar
(*enfermedades del vino). A mayor pH mayor facilidad para que se
desarrolle la FML pero tambin mayor peligro de que aparezcan
enfermedades.
temperatura (19-25)
Aireacin (la presencia de una pequea proporcin de O
2
es favorable)
Etanol (< 13%)
SO
2
(no superior a 50 mg/L)
Prcticas de vinificacin (El tiempo de contacto del vino con los hollejos,
contacto con las las, trasiegos, etc. determinan la poblacin de bacterias
lcticas al final de la fermentacin alcohlica)
Interaccin de las bacterias con otros microorganismos
BACTERIAS LCTICAS: fermentacin malolctica
Aplicacin de la fermentacin malolctica
En tintos Mejora gustativa
Color menos rojo vivo
Aroma evolucionado (menos a uva y ms a
vinosidad)
En blancos Puede ser deseable:
Repercute en el equilibrio grado/acidez
Disminuye la sensacin de dureza y verdor
Peligroso en vino dulce
BACTERIAS LCTICAS: fermentacin malolctica
Ventajas e inconvenientes de la fermentacin malolctica
Formacin de aminas bigenas y
carbamato de etilo
Mayor complejidad y atributos de
envejecimiento
Aparicin de olores y sabores
anmalos
Reduccin de amargor y astringencia
Incremento de acidez voltil Incremento aromtico
Reduccin de aromas varietales Garanta de estabilidad
Reduccin del color Reduccin de la acidez y suavizacin
organolptica
Inconvenientes Ventajas
Metabolismo del ctrico
Bacterias acticas
Gram negativas, Catalasa positivas, no esporuladas
Morfologa variable (clulas elpticas o con forma de bastn corto
agrupadas en pares o en cadenas)
Tamao: 0.6-0.8 x 1-4 m
Inmviles o mviles por flagelos:
polares (G. Gluconobacter)
peritricos (G. Acetobacter)
Aerobias estrictas*(sobrevive en barrica)
Oxidan el alcohol a cido actico e incluso a CO
2
y H
2
O
Produccin de polisacridos extracelulares (celulosa-afecta la
filtrabilidad del vino) y pigmentos
Tolerancia a la acidez, al etanol y moderada al SO
2
Formacin de velo
En el vino pueden dar lugar al picado actico y su desarrollo es
indeseable en todas las etapas de vinificacin
.
Bacterias acticas
ECOLOGA DE LAS BACTERIAS ACTICAS
Muy extendidas en la naturaleza, especialmente en bebidas fermentadas
alcohlicas como el vino, la cerveza o la sidra
En uva la poblacin de bacterias acticas depende del estado sanitario de la
vendimia.
En uva sana: 10
2
-10
3
UFC/mL (G. oxydans)
En uva atacada por Botrytis: 10
5
-10
6
(mezcla de Guconobacter y
Acetobacter)
Durante la fermentacin alcohlica la adicin de sulfuroso y el desarrollo de las
levaduras no afecta la poblacin de bacterias acticas. Existe una sucesin de
bacterias acticas: G. oxydans predomina al inicio y va siendo reemplazado por
A. pasteurianus y A. aceti.
Durante la fermentacin malolctica se mantiene la poblacin
Durante la conservacin la poblacin de bacterias acticas puede aumentar y
causar enfermedades.
Clasificacin de las bacterias acticas
A. aceti
A. pasteurianus
A. liquefaciens
A. hansenii
G. oxydans Especies
53-65 56-64 (G+C)%
+ - Oxidacin de actico hasta CO
2
+ + Oxidacin de etanol a actico
+ + Crecimiento a pH 4.5
peritrica polar Flagelacin
Acetobacter Gluconobacter Caracterstica
Metabolismo de las bacterias acticas
Oxidacin del etanol a cido actico (Gluconobacter y Acetobacter)
etanol acetaldehido cido actico
Alcohol
deshidrogenasa
Aldehido
deshidrogenasa
Oxidacin del cido actico a CO
2
(Acetobacter)
CO
2
+H
2
O cido actico
TCA
*Gluconobacter carece de algunos enzimas del TCA, la -cetoglutarato
deshidrogenasa y la succinato deshidrogenasa
Metabolismo de las bacterias acticas
Metabolismo de los azcares
Oxidacin de los azcares va
hexosas monofosfato
Oxidacin de azcares a cetonas
Glucosa cido 2-5
dicetoglucnico
Fructosa-cetofructosa
Xylosa-cetoxylosa
Metabolismo del cido lctico
Oxidacin a pirvico,
acetaldehido y actico
Metabolismo del glicerol
Oxidacin a dihidroxiacetona
ALTERACIONES DEL VINO DE ORIGEN MICROBIANO
Introduccin
Alteraciones microbianas
Bacterias lcticas
Picado lctico
Amargor
Vuelta
Grasa o ahilado
Bacterias del cido actico: Picado actico
Levaduras
Flor
Refermentaciones
Brettanomyces
Sustancias txicas de origen microbiano
INTRODUCCIN
Las alteraciones microbianas del vino pueden aparecer durante la
elaboracin y/o durante la conservacin del vino
Se producen por el ataque de componentes del vino y/o formacin
de sustancias indeseables
Evidencias: Turbidez, Gas, Transformacin del color
Factores a favor:
Composicin del vino (cidos orgnicos, azcares, factores
de crecimiento y sales minerales)
Factores en contra:
Grado alcohlico elevado
pH bajo
Baja temperatura
Las bacterias lcticas
Producen alteraciones graves porque atacan la totalidad de la masa del
vino aunque haya sido bien elaborado
Microaerfilos o anaerobios facultativos
Importancia de la higiene en la bodega
Alteraciones producidas
Picado lctico- fermentacin de azcares residuales
Amargor- fermentacin del glicerol
Vuelta fermentacin del tartrico
Grasa o ahilado formacin de polisacridos en el vino
Bacterias lcticas: PICADO LCTICO
PICADO LCTICO
Fermentacin de azcares residuales con formacin de actico y
lctico
Puede aparecer en vinos con azcares residuales por cese de la
fermentacin alcohlica (Ex. Por altas temperaturas)
Efecto en el vino: sabor agridulce (por el actico y el azcar) y
aumento de la acidez voltil
Tambin tiene lugar la fermentacin mantica formacin de
manitol a partir de fructosa (Vuelta mantica)
Prevenir las paradas fermentativas y envasado apropiado, sulfitado
racional control de la temperatura
Bacterias lcticas: AMARGOR
AMARGOR
Fermentacin del glicerol formando lactico, actico, cidos grasos
y acrolena (reacciona con compuestos fenlicos como los taninos
dando sabores amargos)
Efecto en el vino: sabor amargo
Muy rara, aparece e casos de mala cosecha
Afecta a vinos con poco grado y pH bajo (3.2-3.3); La fermentacin
de tartrico (vuelta) afecta a vinos de pH alto (3.5-3.3)
Bacterias lcticas: VUELTA
VUELTA
Origen: Fermentacin del cido tartrico para dar lctico, actico
y CO2
Efecto en el vino:
No apto para el consumo
Disminuye la acidez fija y aumenta la acidez voltil y el pH
Pierde sabor (inspido, flojo)
Color apagado
Turbidez
Formacin de gas, vino con aguja
olor a ratn (vuelta + otras causas-formacin de 2-
acetiltetrahidroxipridina )
Ataca a vinos poco cidos, los mejores vinos son los ms propensos
No suele darse.
Bacterias lcticas: GRASA
GRASA O AHILADO
Causa: formacin de polisacridos en el vino que le dan aspecto
oleoso.
Efectos en el vino: aspecto de aceite, vino pesado que se desliza sin
ruido. La acidez voltil no siempre es elevada.
Peligro: puede ir seguido de otras alteraciones
Prevencin: empleo racional de sulfuroso que no impida la
Fermentacin Malolctica pero s la formacin de grasa
Correccin: con sulfuroso y agitado
Bacterias lcticas: Otras alteraciones
Metabolismo de la arginina Formacin de
carbamato de etilo
Metabolismo de los aminocidos del mosto Formacin de aminas
bigenas
Formacin de 2-etoxi-3,5-hexadieno a partir
del cido srbico
Olor a geranio
Formacin de 2-acetil-tetrahidropiridina Olor a ratn
Produccin de diacetilo a partir del ctrico o
del piruvato
Olor a mantequilla
Causa Alteracin
Bacterias acticas: PICADO ACTICO
PICADO ACTICO O AVINAGRAMIENTO
Oxidacin del alcohol a cido actico- Necesitan O
2
Causado por las bacterias acticas o del vinagre que constituyen parte de la
microflora de la uva y pernanecen durante todo el procesado. Desaparecen
tras el embotellado por las condiciones de anaerobiosis
Picado- inicio del proceso , solo afecta a las capas superficiales
Avinagramiento- afecta a ms volumen
Efecto en el vino:
En cata- olor a acetaldehido
Enturbiamento y formacin de velo
Aumento de la acidez voltil (Mxima permitida 0,65 g/L)
Producen actico (retrogusto, final de boca spero y agrio) y acetato
de etilo (indicativo de mala calidad)
Bacterias acticas: PICADO ACTICO
Enfermedad muy corriente, perjudicial y difcil de corregir
Prevencin: Relleno de los depsitos y cierre hermtico
Evitar trasiegos en perodos clidos (la elevada
temperatura aumenta la probabilidad de picado
actico)
Sulfitado a dosis adecuadas (25-30 mg/l)
Higiene de la bodega y los depsitos
Aparece con mayor frecuencia en uvas atacadas con Botritis
LEVADURAS: Flor
FLOR
Enmohecimiento de la superficie del vino, velo
Causado por levaduras que requieren O
2
Candida mycoderma
Pichia membranifaciens
Hansenula anmala
Zygosaccharomyces
Crecen en vino con alcohol < 13 y no tienen capacidad fermentativa
Saccharomyces-flor til para crianza biolgica de los vinos
Diferenciacin: morfologa al microscopio, aspecto del velo, capacidad
fermentativa
LEVADURAS: Flor
Buena. En mosto dan
turbidez y carbnico
Nula o muy baja. En mosto
forman velo
Capacidad fermentativa
Velo grueso, color crema y
rugoso
Velo delgado, blanco o
grisaceo, liso o poco
plegado
Aspecto del velo
Clulas elpticas-ovoides
En parejas o flculos
Clulas cilndricas,
alargadas. A veces forman
cadenas ramificadas
Observacin a
microscopio (forma y
agrupacin)
Saccharomyces Flor Levaduras de velo Caracterstica
LEVADURAS: Flor
Efectos en el vino:
Disminuye la acidez fija y voltil
Disminuye el alcohol
en caso exagerado da lugar a un sabor soso u acuoso del
vino y origina turbidez
La aparicin de flor no es grave
Recomendaciones para su prevencin:
Filtracin amicrbica
Cerrar bien los depsitos
Sulfitado adecuado
LEVADURAS: Refermentaciones
Refermentaciones
Provocan enturbiamiento y formacin de gas
No se forma velo
Causadas por Saccharomyces, va anaerobia
Ocurren cuando hay azcares residuales (<2 g/L)
Control microbiolgico: observacin directa a microscopio
En vinos con pocos azcares residuales puede aparecer sedimentos
en el fondo de la botella. Metabolismo de otros componentes del
vino.
LEVADURAS: Brettanomyces
Brettanomyces (forma asexual)/Dekkera (esporgena)
Frecuente en barrica y vinos de crianza (rara en uva y fermentacin)
Se desarrolla en vinos de elevado grado alcohlico con o sin azcares
Especie ms frecuente: Brettanomyces bruxellensis
Origina fenoles voltiles
p-cumrico 4-vinil-fenol 4-etil-fenol
p-ferlico 4-vinil-guayacol 4-etil-guayacol
VPR
*VRP-vinil fenol reductasa
descarboxilasa
LEVADURAS: Brettanomyces
Afecta las caractersticas organolptica del vino
Defectos causados por Brettanomyces:
Olores fenlicos (cuero, sudor de caballo) *Debido al
metabolismo de bacterias y levaduras
4-etil-fenol: bajo contenido- complejidad
Alto contenido-defecto
Gusto a ratn (ms raro)- derivados de la tetrahidropirina.
*Tambin originados por bacterias lcticas Lactobacillus y
Pediococcus
Produccin de aminas bigenas
Puede causar acidez voltil elevada
Prevencin: limpieza y desinfeccin de las barricas
Sustancias txicas de origen microbiano
Origen de sustancias txicas en el vino
Contaminantes (fungicidas, pesticidas, etc)
Aditivos (SO
2
)
Metabolismo microbiano
Etanol
Metanol
Aminas bigenas (descarboxilacin de aminocidos)
Carbamato de etilo (Metabolismo de la arginina)
Ocratoxina A
Peligrosas para la salud humana
Aminas bigenas
Se originan por descarboxilacin de los aminocidos
Principales aminas bigenas en el vino:
Histidina-Histamina
Ornitina-Putrescina (diaminobutano)
Tirosina-Tiramina
Etilamina
Feniletilamina
Cadaverina
Origen de las aminas bigenas:
Bacterias lcticas
Levaduras
Aminas bigenas
Efectos sobre la salud:
Dolor de cabeza
Problemas respiratorios
Problemas de corazn (Palpitaciones)
Hipertensin, hipotensin
Cuadros de alergia
La sensibilidad a estos compuestos depende de cada
individuo y puede alterarse con el consumo de alcohol
y/o drogas.
La histamina es la ms txica.
Aminas bigenas: papel de las bacterias lcticas
Histamina, tiramina y putrescina son las principales aminas
bigenas presentes en el vino.
Baja concentracin despus de la F. Alcohlica
El contenido aumenta durante la FML
El contenido de aminas en vino vara de unas zonas a otras
Depende de la microflora (vara con la cepa bacteriana) y de la
presencia de aminocidos en el vino (composicin del mosto,
metabolismo levaduras, prcticas enolgicas-contacto con las las)
La microflora es ms compleja cuanto ms alto es el pH
Pedioccocus, Oenoccocus, Lactobacillus ,
La descarboxilacin de aminocidos tiene lugar en condiciones de
estrs, como va alternativa para obtencin de energa
Carbamato de etilo
Se forma en el vino por reaccin entre:
Etanol+compuesto carbamlico
El precursor en el vino es la urea que procede del metabolismo de la
arginina, relacionado con la actividad arginasa de las cepas de levaduras
que conducen la fermentacin. Las bacterias lcticas tambin degradan la
arginina
Tambin se forma urea a partir de la degradacin de cidos nucleicos o de
componentes de la uva
Prevencin
Limitar el contenido de nitrgeno en los mostos (evitar abonos
nitrogenados y terrenos muy frtiles)
Limitar activadores de fermentacin y controlar las levaduras utilizadas
Control de la temperatura durante las fermentaciones
Eliminacin de la urea con ureasa cida
Baja acidez y alta temperatura inducen aumento de carbamato de etilo
Alteraciones causadas por mohos
Los mohos atacan el grano de uva, especialmente durante la maduracin
Botrytis cinerea, Penicillium, Aspergillus, Mucor, Cladosporium, otros
Efectos causados en el mosto y/o vino:
Reduccin de la cosecha
Afecta el contenido de nitrgeno
Presencia de enzimas como la lacasa (oxidasas)-quiebra
oxidsica
Alteraciones organolpticas
Afecta la estabilidad fisico-qumica del vino
Olor y sabor a moho
Aspergillus niger
Penicillium citroviride
Ocratoxina A
Micotoxina producida por sp de Aspergillus y Penicillium (A. ochraceous,
P. verrucosum, A. carbonarum)
Efectos sobre la salud: Persistencia en sangre- 35 das
Nefrotxico
Cancergeno (Grupo 2B-IARC International Agency for
Research on Cancer
Nivel tolerado establecido OMS: 100 ng/Kg peso y semana (1995); 5
ng/Kg dia (1998).
Contenido mximo en vinos para el 2005 (2g/L). (Propuesto en la 82
asamblea de la OIV)
Deteccin : ELISA HPLC
Incidencia:
Mayor en los pases calidos, mediterrneos que en zonas fras
Mayor en vinos tintos que blancos
Ocratoxina A
Presencia de Ocratoxina A en mostos y vino
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE
MICROORGANISMOS EN ENOLOGA
Toma de muestras
Tratamiento de las muestras
Siembra en medios de cultivo adecuados
Recuento de clulas viables
Aislamiento de microorganismos en cultivo puro
Identificacin de los microorganismos aislados
Controles microbiolgicos: Toma de muestras
Via (de uva, suelo, madera...)
Bodega (suelo, paredes, material de bodega, agua...)
Mosto (antes y despus de sulfitar)
Fermentacin (diariamente o en las distintas fases)
Vino (despus de la estabilizacin, clarificacin, filtrado,
embotellado...)
NOTA: Utilizar un recipiente estril y manipular todo lo ms
aspticamente posible
Tratamiento de las muestras
Uva-Incubacin en medio lquido apropiado durante 1h
y siembra en placa para el recuento de clulas
Mosto- Recuento al microscopio y clculo de la
dilucin adecuada para siembra en placa y recuento de
clulas
Muestras de fermentacin-Recuento, dilucin apropiada
y siembra
Vino-filtracin
Recuento del n de clulas viables por mL
Medios de cultivo
Generales (YEPD, Agar mosto, WL)
Selectivos- suplementados con compuestos que inhiben el
crecimiento de los distintos grupos microbiano
Bacterias-antibiticos como el cloranfenicol
Bacterias lcticas- estreptomicina, penicilina, nisina
Levaduras-cicloheximida, pimaricina
Hongos- propionato sdico
Microorganismos viables, no cultivables (Seguimiento mediante
microscopa con epifluorescencia)
Conservacin de las cepas (a -80C)
Bacterias: (medio de cultivo+ 40% glicerol)
Levaduras: YEPD+15% glicerol
Aislamiento de levaduras
Toma de muestras
Uva
Mosto (sulfitado y sin sulfitar)
Fermentacin
Fase inicial
Fase tumultuosa
Fase lenta o final
Recuento y dilucin adecuada de la muestra
Siembra en un medio de cultivo (suplementado con un inhibidor de
crecimiento bacteriano y de hongos)
YEPD
Agar malta
Agar Mosto
WL nutrient agar
Aislamiento en cultivo puro y conservacin
Aislamiento: YEPD // Conservacin: YEPD+15% glicerol
Identificacin de levaduras
Pruebas de identificacin:
Morfolgicas (en placa, medio lquido y al microscopio)
Esporulacin
Fisiolgicas y Bioqumicas (dependen del estado fisiolgico
y del medio de cultivo)
Asimilacin y fermentacin de azcares
Asimilacin de compuestos nitrogenados
Produccin de enzimas
Requerimiento de factores de crecimiento
Resistencia a cicloheximida,etc
Identificacin de levaduras
Pruebas de biologa molecular:
Anlisis del cariotipo
Anlisis de DNA mitocondrial
Secuenciacin y anlisis de restriccin del rDNA
PCR
Mtodos rpidos de deteccin y cuantificacin:
(Especialmente tiles para microorganismos de crecimiento
lento o para clulas viables pero no cultivables)
Bioluminiscencia: (actividad metablica; Ex. luciferasa)
Epifluorescencia: (tincin con un colorante fluorescente,
Ex. Naranja de acridina)
PCR a tiempo real: seguimiento de mRNA mediante RT-
PCR
Hibridacin in situ con sondas especficas marcadas con
un fluorocromo
Anlisis del cariotipo
Mediante electroforesis de campo pulsante
Detecta polimorfismo del DNA genmico
Diferenciacin entre especies y cepas, mediante
diferencias de nmero y tamao de los
cromosomas (S. cerevisiae- 16 cromosomas de
tamao entre 250 y 2500 Kpb)
Equipamiento especfico, costoso y largo
Requiere personal especializado y cepas
aisladas
Ms discriminante que la tcnica de PCR y
DNA mitocondrial
Schuller et al. 2003
Anlisis del DNA mitocondrial
Anlisis del polimorfismo del DNA
mitocondrial (muy polimorfo y estable)
Requiere poca infraestructura de
laboratorio
Relativamente rpida y econmica
Diferenciacin entre especies
Diferenciacin entre cepas de S.
cerevisiae
Requiere cepas aisladas y personal
especializado
EVEGA 2004
Anlisis de restriccin del rDNA
Implica la comparacin de secuencias de genes que
codifican el rRNA y de los espaciadores entre ellos
(ITS
Comparacin de secuencias
Comparacin de fragmentos de restriccin
(PCR-RFLP)
Requiere previa amplificacin mediante PCR
PCR
Amplificacin de secuencias especficas utilizando un
termociclador
Equipamiento costoso, personal especializado
Tcnica rpida que permite actuar en caso de necesidad
Seguimiento de implantacin de levaduras inoculadas
en fermentacin (Permite diferenciar LSA)
Schuller etal. 2003
RAPDs- amplificacin de regiones genomicas al azar utilizando primers
cortos e inespecficos (poco reproducible)
ITS
Amplificacin de secuencias delta- flanquean el retrotransposn Ty
Aislamiento e identificacin de Brettanomyces
Filtracin de la muestra
Siembra en un medio especfico (crecimiento lento, en medios
convencionales las otras levaduras crecen ms rpido)
Medio DBDM
Crecimiento 25 C, 2 semanas
Identificacin : mtodos convencionales
Mtodos moleculares: PCR, hibridacin in situ con fluorescencia,
PCR a tiempo real
Aislamiento e identificacin de bacterias acticas
Medios de cultivo
Suplementados con inhibidor del crecimiento de
levaduras y de bacterias lcticas
WL+ 2% etanol ( 10% de vino estril). Colonias color
verde
GYC (Glucosa 5%, extracto de levadura 1%, , CaCO
3
3%, agar %)
Mannitol medium (manitol 2,5%, extracto de levadura
1%, agar 1,5%)
MRS + 2% etanol
Temperatura de incubacin: 25-28 C (5-7 das)
Condiciones aerbicas
Aislamiento e identificacin de bacterias acticas
Pruebas de identificacin
Gram +, Catalasa
Oxidacin del etanol, glicerol y lactato
Formacin de compuestos cetnicos
Crecimiento en acetato sdico o etanol como nica
fuente de carbono
Crecimiento en dulcitol
Produccin de pigmentos marrones en GYC
Produccin de celulosa (filtrabilidad del vino)
Mtodos moleculares (PCR y secuenciacin de rRNA 16S)
Aislamiento e identificacin de bacterias lcticas
AISLAMIENTO
Medios de Cultivo
AGB (acidic grape broth, pH4,8) (O. oeni)
MRS
Incubacin en estufa de anerobiosis
Temperatura y tiempo de incubacin. 30 durante 48 h
Pruebas de Identificacin
Gram +
Morfologa (coco o bacilo)
Homofermentativa o heterofermentativa
Fermentacin de azcares
Crecimiento en determinadas condiciones de pH, T
Tcnicas moleculares
PCR especfica (primers del gen-enzima malolctica) (O. oeni)
Aislamiento e identificacin de bacterias lcticas
Caractersticas identificativas de Oenoccocus oeni
Control microbiolgico de vinos embotellados
Filtracin de una cantidad de vino conocida
utilizando un sistema adecuado
Colocacin de la membrana en un medio de cultivo
adecuado
Crecimiento a temperatura adecuada
Recuento de microorganismos viables presentes en la
muestras
Identificacin de los microorganismos encontrados
Evaluacin del riesgo
Como prevenir las enfermedades microbianas de los vinos
Mantener unas condiciones higinicas adecuadas en la
bodega
Procurar que la uva entre en buenas condiciones
Evitar paradas fermentativas procurando obtener vinos con
una concentracin de azcar < 2g/l
Sulfitado adecuado (25-30 mg/L)
Conservacin adecuada: Mantener los depsitos llenos y
cerrados y a baja temperatura
Filtracin amicrbica de los vinos antes del embotellado
Seleccin de levaduras y bacterias en
enologa
Papel en la calidad del vino
Bacterias
Criterios de seleccin
Uso de bacterias seleccionadas
Levaduras
Criterios de seleccin
Levaduras seleccionadas
Levaduras autctonas: ventajas e inconvenientes
Seleccin de bacterias
Caractersticas deseables para cultivos iniciadores de bacterias lcticas
Elevada degradacin de cido L-mlico
Resistencia a grado alcohlico elevado (en torno al 15%)
Resistencia a SO
2
(a concentracin 50 mg/L)
Capacidad de crecimiento a bajo pH (Resistencia a la acidez)
Capacidad de crecimiento a bajas temperaturas
Baja produccin de acidez voltil
Buenas propiedades organolpticas (ausencia de caracteres sensoriales -)
Metabolismo limitado de azcares
Resistencia al ataque de bacteriofagos
No produccin de polisacridos extracelulares
No produccin de compuestos txicos (Ej: aminas bigenas)
Fcil obtencin de biomasa y resistencia a los procesos de congelacin y
liofilizacin
Seleccin de bacterias
Obtencin de cultivos iniciadores de bacterias
Obtencin de biomasa, centrifugado y liofilizacin
Utilizacin de bacterias comerciales
Siembra directa o con rehidratacin y/o reactivacin previa
Control de calidad de las cepas comerciales
Caracterizacin de la especie
Viabilidad (UFC/g)
Determinacin de la actividad malolctica
Verificacin de la ausencia de contaminantes (coliformes,
estreptococos, sulfitoreductores, leavduras y mohos)
Verificacin de caracteres fisiolgicos sobre medios sintticos
y vinos
Verificacin de la ausencia de fagos
Seleccin de levaduras autctonas
Criterios generales:
Ser autctona
Buena capacidad fermentativa (rpido arranque y acabado)
Alta produccin de etanol y regularidad fermentativa
Alta tolerancia al etanol
Produccin baja de acidez voltil
No formacin de espuma
Resistencia a sulfuroso
Baja produccin de sulfhdrico
Otras: fenotipo killer
Seleccin de levaduras autctonas
Levaduras seleccionadas para elaboracin de blancos
Tolerancia a bajas temperaturas
Potenciacin de aromas varietales y expresin de aromas
secundarios
Capacidad de acidificacin y desacidificacin biolgica
Crecimiento disperso en medio lquido
Levaduras seleccionadas para tintos
Alta produccin de acetaldehido y pirvico-estabilizacin del
color
Baja capacidad de adsorcin de antocianos a la PC
Produccin de glicerol- suavidad
Degradacin del cido mlico
Seleccin de levaduras autctonas
Uso de levaduras comerciales (LSA)
Ventajas
Calidad ms uniforme, garantiza repetitividad
Ayuda a resolver problemas de posible arranque, ralentizacin o
paradas de fermentacin
Homogeneidad en los vinos
Inconvenientes
Prdida de complejidad en el vino final
No son propias de la regin
Pueden no implantarse por competencia entre las levaduras
presentes en el mosto
Seleccin de levaduras autctonas
Ventajas de las levaduras autctonas
Especficas del rea
Totalmente adaptadas a las condiciones climticas de la zona
Totalmente adaptada al tipo de mosto
Responsables de caractersticas nicas de los vinos (tipicidad)
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