UNIVERSIDADE DE SO PAULO

INSTITUTO DE QUMICA







BIOQUMICA QBQ230N
Biologia Noturno



Professores :
Alexander Henning Ulrich, Bloco 8 sup., sala 853,
e-mail: henning@iq.usp.br.
Mario Jose Politi, Bloco 12 sup., sala 1258,
e-mail: mjpoliti@usp.br

Monitores:
Ariane Ferreira Nunes Alves email:anunesalves@usp.br
Arquimedes Cheffer email: arquiqbq@iq.usp.br
Erika de S. Molina email: molina.kk@gmail.com
Talita Glaser email:talita.glaser@usp.br


2013


2
NDICE

BIOQUMICA QBQ230N ...........................................................................................................................Erro! Indicador no definido.
INTRODUO E NORMAS GERAIS .......................................................................................................................................................3
NORMAS E RECOMEDAES NO LABORATRIO ............................................................................................................................3
AVALIAO ..............................................................................................................................................................................................4
BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA ..........................................................................................................................................................4
CALENDRIO DE MDULOS E ATIVIDADES 2008 ............................................................................................................................5
MDULO 1: GUA; REAO CIDO-BASE, PH E SISTEMA TAMPO ..........................................................................................6
MDULO 2: AMINOCIDOS: ESTRUTURA, PROPRIEDADES QUIMICAS ......................................................................................7
MICROPIPETADORES ............................................................................................................................................................................ 10
Laboratrio 1: COLORIMETRIA E ESPECTROMETRIA ...................................................................................................................... 12
I. FUNDAMENTOS ......................................................................................................................................................... 12
II. OBJETIVOS ........................................................................................................................................................... 14
III. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ...................................................................................................................... 14
Laboratrio 2: TITULAO E FRACIONAMENTO DE AMINOCIDOS ........................................................................................... 16
I. FUNDAMENTOS ......................................................................................................................................................... 16
II. OBJETIVOS ........................................................................................................................................................... 18
III. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ...................................................................................................................... 19
MDULO 3: PROTEINAS: ESTRUTURA PRIMARIA ........................................................................................................................ 20
Laboratrio 3: FRACIONAMENTO DE PROTENAS ........................................................................................................................... 22
I. FUNDAMENTOS ......................................................................................................................................................... 22
II. OBJETIVOS ........................................................................................................................................................... 25
III. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ..........................................................................................................................
V. APNDICE .................................................................................................................................................................. 26
MDULO 4: PROTEINAS: ESTRUTURA 3D E CONFORMAO .................................................................................................... 30
MDULO 5: INTRODUO CINTICA E TERMODINMICA QUIMICA .................................................................................. 30
MDULO 6: CINTICA ENZIMTICA ................................................................................................................................................ 38
Laboratrio 4: CINTICA DA INVERTASE .......................................................................................................................................... 41
I. FUNDAMENTOS ......................................................................................................................................................... 41
II. OBJETIVOS ........................................................................................................................................................... 43
III. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ...................................................................................................................... 43
Laboratrio 5: REAO DE TRANSAMINAO ................................................................................................................................ 45
I. FUNDAMENTOS ......................................................................................................................................................... 45
II. OBJETIVOS ........................................................................................................................................................... 47
III. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ...................................................................................................................... 47
MDULO 7: ACARES; ESTRUTURA E FUNO .......................................................................................................................... 45
MDULO 8: GLICLISE ........................................................................................................................................................................ 53
MDULO 9: ACETIL-COA e CICLO DE KREBS .................................................................................................................................. 56
MDULO 10: CADEIA RESPIRATRIA E FOSFORILAO OXIDATIVA ..................................................................................... 57
MDULO 11: GLICONEOGNESE ........................................................................................................................................................ 59
MDULO 12. CIDOS GRAXOS: ESTRUTURA, FUNO E METABOLISMO .............................................................................. 60
MDULO 13: LPIDEOS, MEMBRANA & TRANSPORTE .................................................................................................................. 62
MDULO 14: CICLO DAS PENTOSES .................................................................................................................................................. 65
MDULO 15. FOTOSSNTESE ............................................................................................................................................................... 66
MDULO 16: METABOLISMO DO GLICOGNIO E CONTROLE HORMONAL DO METABOLISMO ....................................... 68
MDULO 17: METABOLISMO DE AMINOCIDOS ........................................................................................................................... 73
MDULO 18: CICLO DO NITROGNIO ............................................................................................................................................... 74

3

INTRODUO E NORMAS GERAIS

A disciplina de Bioqumica (QBQ230-noturno) compreende o programa de 18 mdulos
apresentado no calendrio abaixo. Cada mdulo focaliza um tpico a ser desenvolvido
em um dia de aula, envolvendo 2 atividades:
a) Aula expositiva pelo professor, eventualmente complementada por um
dos monitores;
b) Grupos de discusso centrada em questes objetivas, coordenados
pelos monitores.
Alm destes mdulos, desenvolvidos em sala de aula, haver tambm um conjunto de
5 mdulos de laboratrio, consistindo na execuo de tarefas de bancada com
protocolos antecipadamente preparados.
No primeiro dia de aula sero organizados conjuntos de no mximo 5 estudantes que
permanecero fixos por todo o curso tanto para os grupos de discusso como para as
prticas de laboratrio..
NORMAS E INSTRUES PARA O LABORATRIO
USO DE AVENTAL NAS AULAS PRTICAS OBRIGATRIO. COMER, BEBER E
FUMAR NO RECINTO DO LABORATRIO NO PERMITIDO.
- Leia cuidadosamente os protocolos experimentais e atente para as instrues
dos monitores antes de iniciar o experimento.
- Familiarize-se com o ambiente do laboratrio, particularmente, com os
reagentes, vidraria e equipamentos disponveis, procurando utiliza-los com
propriedade para evitar erros experimentais, desperdcios de material e
acidentes.
- Mantenha sua bancada de trabalho organizada e livre de objetos e uso
pessoal. Ao terminar o experimento passe gua na vidraria utilizada e a
coloque no local indicado.
- Qualquer dvida ou acidente pea auxlio aos monitores, ao professor ou
tcnica do laboratrio.
- Registre seus resultados em caderno, pois sero indispensveis nas PROVAS
LAB (veja no calendrio).

4

AVALIAO

A avaliao de desempenho ser composta dos seguintes itens:
a) Provas em grupo (PROVAS LAB e PG), envolvendo trabalho em
grupo para resoluo de questes objetivas por um perodo de 4 h,
com consultas a livros, apostilas e anotaes de caderno. Notem que
os registros das observaes qualitativas e resultados quantitativos
das prticas de laboratrio sero necessrios e obrigatrios nas
PROVAS LAB.
b) Provas escritas individuais de avaliao (Av1, Av2 e Av3).

O clculo da mdia final consistir na soma das seguintes parcelas: [(mdia das
PROVAS LAB) X 2 ] + [(mdia dos GDs) X 0,5] + [ Av1 X 2] + [Av2 X 2,5] + [Av3 X 3,0]
dividida por 10.

Haver uma nica prova substitutiva para substituir uma das avaliaes individuais.
Reposies das PROVAS LAB E PG no sero possveis. A presena em todas as
atividades obrigatria e ser registrada em lista diria de presena. importante
destacar que faltas a laboratrio incorrero em reduo de nota na PROVA LAB
correspondente. Alunos que alcanarem a mdia final > 5,0 e mostrarem freqncia
> 70% estaro aprovados. Aqueles cuja mdia for no mnimo igual a 3,0 e
apresentarem freqncia > 70% podero fazer a prova de recuperao.

BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA

Dois bons livros texto em portugus:
TORRES, B. B. & MARZZOCCO, A. Bioqumica Bsica;
VOET, D. ; VOET, J. & PRATT, C. W. Fundamentos de Bioqumica;
e mais 3 outros, tambm excelentes, em ingls:
VOET, D. & VOET, J. Biochemistry;
BERG, J. M., TYMOCZKO, J. L. & STRYER, L. Biochemistry;
LEHNINGER, A. L. Principles of Biochemistry;
estaro disponveis para consulta na sala de aula durante as discusses em grupo.



5
CALENDRIO DE MDULOS E ATIVIDADES 2010

DATA PROF ATIVIDADE TTULO AVALIAO
A
G
O
S
T
O

1
HENNING
T
gua; Reao cido-base, pH e Sistema tampo. Equilbrio
qumico

2 HENNING T Aminocidos: Estrutura, propriedades qumicas provinha
8
POLITI
T+MM
Protenas: anlise de sequncias e mtodos de separao e
anlise

9 POLITI MM+ED Protenas: Estrutura (software) Provinha
15 HENNING P Prtica: Fracionamento de protenas Relatrio
16 HENNING T Introduo Cintica e Termodinmica Qumica
22 POLITI P Prtica: Colorimetria e espectrofotometria Relatrio
23 POLITI T Cintica enzimtica Provinha
29 HENNING T+MM cont. Cintica enzimtica
30 HENNING AVALIAO 1 AVALIAO
S
E
T
E
M
B
R
O

5-6 Feriado SEMANA DA PTRIA
12 HENNING T+MM Lipdeos, membranas e transporte
13 HENNING T Acares: estrutura e funo Provinha
19 POLITI ED+MM Introduo ao metabolismo
20 POLITI P Prtica: Cintica da invertase Relatrio
26 HENNING ED+T Gliclise Provinha
27 HENNING T Ciclo de Krebs Provinha
O
U
T
U
B
R
O

3-4 Feriado Semana Temtica da Biologia no haver aula
10 HENNING T+MM Cadeia respiratria e fosforilao oxidativa
11 HENNING T+MM Cadeia respiratria e fosforilao oxidativa Provinha
18 HENNING AVALIAO 2 AVALIAO
24
HENNING
T
Oxidao de cidos graxos, metabolismo do etanol e de corpos
cetnicos

25 HENNING T Via das pentoses e sntese de cidos graxos Provinha
31 HENNING T Metabolismo do glicognio e controle hormonal Provinha
N
O
V
E
M
B
R
O

7 HENNING T Metabolismo de aminocidos e ciclo da uria
8 POLITI P Prtica: Reao de transaminao Relatrio
14
POLITI
ED+T Integrao do Metabolismo
Provinha
15 Feriado NO HAVER AULA
21 HENNING T Fotossntese
22 HENNING T Ciclo do Nitrognio Provinha
28 HENNING Planto de Dvidas
29
HENNING
AVALIAO 3
AVALIAO
D
E
Z
.
6 HENNING Planto de Dvidas
7
POLITI
AVALIAO SUBSTITUTIVA
AVALIAO
6
MDULO 1: GUA; REAO CIDO-BASE, pH E SISTEMA TAMPO

1. A molcula de gua, H
2
O, apresenta um ngulo de 104,5 graus entre as duas
ligaes OH, dando-lhe um carter altamente polar. Alm disso, o tomo de O possui
2 pares de eltrons livres, permitindo a formao de ligaes (ou pontes) de H entre
molculas vizinhas. Esta estrutura d gua propriedades fsicas e qumicas de
enorme importncia biolgica.

2. A gua se ioniza atravs de uma reao cido-base:
H
2
O + H
2
O H
3
O
+
+ OH
-

A reao cido-base se caracteriza pela troca de prtons entre pares conjugados de
cidos e bases. A gua pode se comportar como cido e como base:
AH + H
2
O H
3
O
+
+ A
-

B + H
2
O BH + OH
-


Estas so reaes de equilbrio, s quais correspondem constantes de equilbrio
definidas. Por exemplo: K = [H
3
O
+
] [A
-
]
[AH] [H
2
O]
K mede a afinidade relativa das bases, de cada par cido-base conjugados (AH/ A
-
e
H
3
O
+
/ H
2
O), por prtons. Fala-se comumente em constante de dissociao de um
cido (K
a
), significando:
K
a
= K [H
2
O] = [H
+
] [A
-
], onde [H
2
O] essencialmente constante (55 M).
[AH]

3. [H
+
] a concentrao hidrogeninica e os valores de [H
+
] para a maioria das
solues so muito baixos e difceis de serem comparados. Um valor mais prtico
conhecido como pH: pH = - log [H
+
] como 1/[H
+
] = 1/K x [A
-
]/[AH] pode-se obter
pH = - logK + log [A
-
]/[AH] por analogia - log K = pK e pH = pK + log [A
-
]/[AH]
Conclui-se que pK numericamente igual a pH da soluo na qual as concentraes
molares do cido e sua base conjugada so iguais (ie log [A
-
]/[AH] = 0).
A igualdade pH = pK + log [A
-
]/[AH] conhecida como Equao de Henderson-
Hasselbach.

4. cidos so classificados de acordo com sua fora relativa, ou seja, de acordo com
sua capacidade de transferir um prton para a gua. cidos com constantes de
dissociao menores do que aquela de H
3
O
+
(que, por definio, igual a 1 em
solues aquosas (v se consegue confirmar por que!)) so s parcialmente ionizados
em solues aquosas e so conhecidos como cidos fracos (K < 1). J os cidos
fortes tm constantes de dissociao maiores que a de H
3
O
+
, sendo quase
completamente ionizados em solues aquosas (K>1).
5. Tampes so sistemas aquosos que tendem a resistir a variaes no seu pH
quando pequenas quantidades de cido (H
+
) ou base (OH
-
) so adicionadas. Um
sistema tampo consiste de um cido fraco (o doador de prtons) e sua base
7
conjugada (o aceptor de prtons). comum encontrar os seguintes smbolos para
representar um cido (AH ou BH
+
) e sua base conjugada (A
-
ou B:)

6. A adio de cido forte (H
+
) ou base forte (OH
-
) a uma soluo aquosa de um
cido fraco, por exemplo, cido actico (pK
a
= 4,76), causa pequenas variaes de pH,
se a soluo estiver a um pH prximo do pK do cido. Este comportamento define um
tampo cido-base.

MDULO 2: AMINOCIDOS: ESTRUTURA, PROPRIEDADES QUIMICAS

1. Aminocidos, bases purnicas e pirimidnicas, nucleosdeos e nucleotdeos,
hexoses (como glicose), so componentes monomricos dos principais polmeros
biolgicos, ou seja, protenas, cidos nuclicos (DNA e RNA) e polissacardeos
(glicognio, amido e celulose). Aminocidos, bases, nucleosdeos e nucleotdeos so
muito solveis em gua e possuem grupos funcionais que participam em reaes
cido-base. Glicose tambm altamente solvel em gua, mas no participa em
reaes cido-base.
i. H 20 aminocidos que compem protenas (Tabela 1, p.10), todos mostrando a
frmula geral:
R
+
H
3
N C
o
COO
-
on dipolar ou zwitterion encontrado em gua pH 7
H
2. Aminocidos podem ser agrupados em classes com base nas propriedades dos
seus grupos radicais (R), em particular sua polaridade ou tendncia de interagir com
gua em pH biolgico ( 7,0).

3. Todos os aminocidos livres comportam como cidos poliprticos. Quando um
aminocido cristalino dissolvido em gua, ele pode agir como um cido ou como
uma base. O grupo carboxlico mostra um pK em torno de 2,0, enquanto o grupo
amino tem um pK entre 9,0 e 10,0. Portanto, no pH fisiolgico (pH 7,0), a maioria das
molculas de todos os aminocidos est na forma de ons dipolares (zwitterions).
Chama-se pI de um aminocido o pH da soluo na qual suas molculas
possuem carga lquida nula. Na cadeia lateral (-R) os aminocidos apresentam
grupos funcionais, entre os quais existem grupos cido-base.

4. Titulao de aminocidos: A curva de titulao mostra como varia o pH em funo
de equivalentes do titulante (cido ou base forte) adicionados. Para um aminocido,
deve-se observar no mnimo dois patamares nessa curva correspondendo titulao
dos grupos carboxilato e o-amino, respectivamente. No meio de cada um desses
patamares h um ponto de inflexo, cujo valor de pH numericamente igual ao pKa
8
do grupo correspondente. Essa relao numrica entre pH e pKa facilmente
compreensvel da anlise da equao de Henderson-Hasselbalch.

5. O carbono o dos aminocidos, excetuando-se a glicina, assimtrico, fazendo
com que estas substncias tenham atividade ptica e, portanto, apresentem pares de
ismeros pticos.


9

10
MICROPIPETADORES





11











Fonte: http://www.analiticaweb.com.br/





12
LABORATRIO 1: COLORIMETRIA E ESPECTROMETRIA

I. FUNDAMENTOS

A Colorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um procedimento
analtico atravs do qual se determina a concentrao de espcies qumicas mediante
a absoro de energia radiante (luz).
Fotometria uma tcnica de anlise quantitativa que envolve a medida de
intensidade de absoro de luz monocromtica de um composto qumico em soluo.
Serve para identificar o comprimento de onda caracterstico para cada composto e
para quantificao do composto atravs de 1) absoro direta e 2) atravs de mtodo
colorimtrico. Essa intensidade de absoro depende:
1) do comprimento de onda escolhido (normalmente usa o
mx
- onde o
composto absorve mais luz),
2) do percurso que o feixe de luz percorrer na soluo e
3) da concentrao do composto nessa soluo.
A lei de Lambert-Beer estabelece que a absorbncia diretamente proporcional
concentrao da espcie absorvente. A frao de luz que passa por uma amostra (a
transmitncia = I
t
/I
0
) est relacionada logaritmicamente, e no linearmente, com a
concentrao da amostra (figura 1).
A lei de Lambert-Beer relaciona esses trs fatores e estabelece que:
A = c.l.c
Onde:
A = absorbncia definida pela reao seguinte: A = - log I
t
/I
0
, que por ser
uma razo, no possui unidade (I
o
intensidade de luz incidente; I
t

intensidade de luz transmitida);
c = absortividade molar (caracterstico de cada substncia), em L.(mol.cm)
-1
;
l = caminho ptico (percurso da luz monocromtica na soluo), em cm;
c = concentrao da substncia em mol/L.

13









Figura 1 I
o
intensidade de luz incidente; I
t
intensidade de luz transmitida aps
percorrer o caminho ptico (l) pela soluo da amostra.

Desta forma, mantendo-se o caminho ptico constante, a absorbncia torna-se
diretamente proporcional concentrao da substncia no respectivo
mx
.
Nestas condies, podemos utilizar uma soluo de concentrao conhecida do
composto a ser analisado (ou outra substncia de caractersticas qumicas
semelhantes) para construir um diagrama de absorbncia em funo da concentrao
da substncia em questo. Com este diagrama, denominada curva padro, podemos
medir a quantidade do composto em amostras de concentrao desconhecida, pela
simples medida de suas absorbncias desde que, estas estejam nas mesmas
condies utilizadas para a construo da curva padro (mesmos reagentes, mesma
temperatura, etc).
Um exemplo de uma curva padro:



Absorbncia


Concentrao (mol/L)

Um dos mtodos utilizados para dosagem de protena chamado de mtodo
do Biureto. Esse mtodo faz uso da propriedade de ons Cu
2+
em meio alcalino de
formar ligaes com o nitrognio das ligaes peptdicas. Desta reao (reao de
biureto) resulta uma colorao prpura intensa. Este fato pode ser explorado para se
determinar por colorimetria a quantidade de protena de uma soluo. A cor
l
I
t

I
0


*
*
*
*
*
14
desenvolvida numa reao de ons de Cu
2+
em meio alcalino com estas protenas
deve-se exclusivamente s ligaes peptdicas e a sua intensidade proporcional a
quantidade de tais ligaes. A absorbncia detectada no espectrofotmetro (figura
2).
Um outro mtodo para determinar a quantidade de protena baseado no fato
que certos aminocidos possuem anis aromticos o que os leva a absorver em
comprimentos de onda especficos na regio de UV. Bases purnicas e pirimidnicas
tambm possuem estas propriedades.

Figura 2 Modelo de um espectrofotmetro.
II. OBJ ETIVOS
1) Determinao da concentrao de uma protena em soluo aquosa por
fotometria.
2) Determinao do espectro de absoro de luz de aminocidos e bases purnicas e
pirimidnicas.

III. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
1) Determinao da concentrao de uma protena em soluo aquosa por
fotometria
1a) Determinao do
mx
do produto da reao de biureto


Adicionar no tubo 1:
- 1,0 mL de padro de albumina (8 mg/mL),
- 0,5 mL de gua,
- 2,5 mL de reagente de biureto.

Adicionar no tubo 2:
- 1,5 mL de gua,
- 2,5 mL de reagente de biureto.
Aps adio dos reagentes, agitar e incubar os tubos por 15 min a 37
o
C.
15
Transferir contedo dos tubos para cubetas do espectrofotmetro e ler as
absorbncias nos comprimentos de onda 400, 420, 450, 470, 500, 520, 550, 580, 600,
630, 650, 680 e 700 nm. Usar a soluo de biureto como branco (tubo 2).
Com isso, voc estar construindo a curva de absorbncia em funo do
comprimento de onda. Estabelecer qual o
mx
do produto da reao de biureto.


1b) Determinao da concentrao de protena
Preparar os tubos como descrito na tabela 1 utilizando uma soluo de 8 mg/mL de
albumina (protena padro) e a soluo de protena desconhecida. No tubo branco no
dever ser adicionada soluo de protena. A ordem de adio dos componentes da
reao deve ser:
- primeiro soluo de protena,
- gua,
- por ltimo o regente biureto.
Aps adio do reagente, agitar e incubar os tubos por 15 min a 37
o
C.
Transferir o contedo dos tubos para cubetas do espectrofotmetro e ler as
absorbncias a 540nm.
Utilizando a curva padro (tubos de 1 a 5) e o valor medido de absoro a 540nm da
amostra desconhecida, calcular a concentrao de protena nesta amostra.

Tabela 1 Dados para a construo da curva padro para determinao de concentrao de
protenas.
tubos
Padro de
albumina
(8mg/mL)
protena
desconhecida
gua
destilada
reagente
biureto
concentrao
(mg/mL)
absorbncia
(540 nm)
branco - - 1,5 mL 2,5 mL
1 0,1mL - 1,4 mL 2,5 mL
2 0,2mL - 1,3 mL 2,5 mL
3 0,4mL - 1,1 mL 2,5 mL
4 0,7mL - 0,8 mL 2,5 mL
5 1,0mL - 0,5 mL 2,5 mL
amostra
desconhecida
- 1,0 mL 0,5 mL 2,5 mL


2) Determinao do espectro de absoro de luz de aminocidos e bases purnicas e
pirimidnicas
2a) Determinao do
mx

Pipetar 1 mL de cada soluo em uma cubeta de quartzo de espectrofotmetro:
- Leucina (0,2 mg/mL)
- Triptofano (0,004 mg/mL)
- Tirosina (0,1 mg/mL)
- Adenina (0,004 mg/mL)
- Timina (0,01 mg/mL)

Determinar nas diferentes solues fornecidas:
16
a)
mx
,
b) absorbncia obtida em
mx
,
c) calcular c de cada substncia.

2b) Determinao da curva de absorbncia x concentrao
Para construo da curva de absorbncia em diferentes concentraes de triptofano,
pipetar os seguintes volumes e medir a absorbncia em
mx
. (tabela 2).

Tabela 2 Absorbncia em
mx
. em diferentes concentraes de triptofano.
tubos
Triptofano
(0,01 mg/mL)
gua destilada
concentrao
(mg/mL)
absorbncia
obtida
branco - 2,0 mL
1 0,1 mL 1,9 mL
2 0,2 mL 1,8 mL
3 0,4 mL 1,6 mL
4 0,7 mL 1,3 mL

Fazer curva de absorbncia x concentrao e verificar se a mesma obedece a lei de
Lambert-Beer.

LABORATRIO 2: TITULAO E FRACIONAMENTO DE AMINOCIDOS

I. FUNDAMENTOS
Cromatografia - Separao de aminocidos
Um dos problemas que continuamente desafiam os bioqumicos a separao e a
purificao de um ou mais compostos de uma mistura complexa. Uma grande
variedade de tcnicas modernas, tanto analticas quanto preparativas, denominada
de cromatografia. O que elas possuem em comum a propriedade de fracionar uma
mistura complexa de substncias usando diferentes caractersticas qumicas entre os
componentes da mistura, o que faz com que eles interajam diferencialmente com a
fase estacionria e com uma fase mvel.
Existem quatro tipos principais de cromatografia: cromatografia lquida,
cromatografia gasosa, cromatografia de camada fina e cromatografia em papel. A
seleo do tipo de cromatografia para realizar uma determinada etapa de separao
dependente do material a ser isolado. Freqentemente, diversos mtodos
cromatogrficos podem ser usados seqencialmente para que seja obtido um
composto na forma pura.
Um leito cromatogrfico pode ser construdo de vrias formas, mas ele sempre
consistir, basicamente, de duas fases: a fase estacionria e a fase mvel. A fase
estacionria pode ser slida, lquida ou pode consistir de uma mistura de um slido
com um lquido. A fase mvel, que pode ser lquida ou gasosa, preenche os
interstcios da fase estacionria e deve ser capaz de fluir atravs desta. As fases
mvel e estacionria devem ser escolhidas de forma que os compostos que sero
17
separados durante o processo cromatogrfico possuam um coeficiente de partio
definido entre as duas fases. Neste processo, vrios mecanismos de distribuio
podem ser empregados: a distribuio pode ser uma simples partio entre dois
lquidos imiscveis; um equilbrio de adsoro entre uma fase estacionria adsorvente
e uma fase lquida mvel; ou um equilbrio de troca inica entre uma fase estacionria
trocadora de on e uma fase mvel constituda por uma soluo de um eletrlito.

Cromatografia de aminocidos em papel
Neste protocolo emprega-se uma mistura de solventes que interagem com as fibras
de celulose no papel de formas diferentes. O deslocamento do soluto pode ser
explicado da seguinte forma: as fibras de celulose do papel possuem uma forte
afinidade pela gua presente na mistura de solvente, mas muito pouca afinidade pela
fase orgnica. O papel, assim, pode ser visto como um suporte inerte contendo uma
fase estacionria aquosa (polar). Na medida em que o solvente flui atravs de uma
seo do papel contendo o soluto, uma partio deste composto ocorre entre a fase
mvel orgnica (pouco polar) e a fase estacionria aquosa (polar). Desta forma, parte
do soluto deixa o papel e entra na fase mvel. Com o fluxo contnuo de solvente, o
efeito desta partio entre a fase mvel e a fase estacionria a transferncia do
soluto do seu ponto de aplicao ao papel para um outro ponto localizado a alguma
distncia do local de aplicao, no sentido do fluxo de solvente. Aps o equilbrio do
papel com o vapor de um solvente saturado com gua, o desenvolvimento do solvente
produz a separao (figura 2).


Figura 1 Cromatografia em papel ascendente.

Quanto mais apolar for o grupo R, maior a mobilidade do aminocido com a fase
mvel. Conseqentemente a relao (R
F
) entre a distncia percorrida pelo aminocido
no papel e a distncia percorrida pela fase mvel ser tambm maior. A Tabela I
apresenta valores de R
F
de alguns aminocidos nas condies descritas.

18
R
F
= distncia percorrida pelo aminocido no papel
distncia percorrida pela fase mvel

Atravs da cromatografia em papel identificaremos um aminocido desconhecido em
comparao com quatro outros conhecidos (denominados de aminocidos-padro).
Com ajuda da Tabela II e dos valores de pKa obtidos na titulao, confirmaremos a
identidade do aminocido.
A solubilidade relativa dos aminocidos nestas duas fases pode ser mudada por
alteraes na polaridade do solvente, ou no pH da soluo, o qual ir alterar o estado
inico dos aminocidos. Sob um conjunto adequado de condies, ento, cada
molcula de uma mistura ir se deslocar a uma diferente velocidade sobre a fase
estacionria e estar a uma distncia especfica de um do ponto de origem, quando
cessar o fluxo de solvente.
Devido ao fato dos aminocidos no absorverem luz no comprimento de onda
visvel, eles no podem ser vistos. Assim, algum mtodo deve ser usado aps a
cromatografia para localiz-
los. A reao de ninhidrina
usada para este propsito
por que reage com
grupamentos amino livres
produzindo um composto
colorido (usualmente
prpura) (figura 3). Diversos
aminocidos, contudo,
produzem diversas
tonalidades de cores com a
ninhidrina, o que pode
ajudar em sua identificao.
A reao da ninhidrina com prolina, por exemplo, gera um composto amarelo e a
reao da ninhidrina com a tirosina produz uma colorao azul metlica.

Figura 2 Reao da ninhidrina com aminocidos.


II. OBJ ETIVOS
1) Identificao de um aminocido atravs de seu R
F
, determinado pela tcnica de
cromatografia em papel.
2) a) Identificao de um aminocido atravs de seus pKas, determinados pela
tcnica de titulao.
b) Comparao da curva de titulao de um aminocido com a de um cido fraco
monoprtico.
19

III. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
1) Cromatografia em papel
Tomar uma folha (23 x 16 cm) de papel Whatman n 1 e fazer um trao a lpis ao
longo do comprimento maior a 2 cm da borda. Evitar tocar no papel durante toda a
operao. Deixar uma margem de 1,5cm de cada lado. Marcar seis pontos sobre essa
linha que distem 4 cm um do outro e numer-los a lpis de 1 a 6. As amostras devem
ser aplicadas nos pontos numerados (3 uL) de tal modo que a mancha formada sobre
o papel seja a menor possvel.
Nos nmeros de 1 a 4 aplicar os padres e no nmero 6, a mistura de padres. A
amostra desconhecida aplicada no nmero 5.
Enrolar o papel de modo a transform-lo em um cilindro e prender as extremidades
superiores com clips.
Colocar 25 mL de solvente de Partridge (n-butanol/cido actico glacial/gua 4:1:1),
em uma placa de Petri e mergulhar o cilindro de papel em seu interior de modo que
este fique perfeitamente na vertical. Evitar que o papel toque na parede da placa.
Cobrir o sistema com um bquer de 2 L e deixar o solvente migrar 10 cm.
Retirar o papel e marcar imediatamente a linha de frente do solvente.
Secar o papel na estufa.
Mergulhar em soluo 0,1% de ninhidrina em acetona e levar estufa (80C-100C) por
alguns minutos.
Delimitar com lpis as manchas que aparecem no papel.
Determinar o R
F
dos padres e do aminocido desconhecido e comparar com os
dados fornecidos na tabela 1, para sua identificao.

Tabela 1 - R
F
de aminocidos determinados nas seguintes condies: solvente de Partridge,
n-butanol / cido actico glacial / gua (4:1:1), papel Whatman n
o
1 e 20
o
C.

Aminocido R
F
Aminocido R
F

Cys 0,08 Ala 0,38
Lys 0,14 Pro 0,43
His 0,20 Tyr 0,45
Arg 0,20 Trp 0,50
Asp 0,24 Met 0,55
Gly 0,26 Val 0,60
Ser 0,27 Phe 0,68
Glu 0,30 Ile 0,72
Thr 0,35 Leu 0,80




20
2) Titulao
Colocar 50 mL da soluo do aminocido (0,10 M) em pH 1,0 em um bquer e titular
com soluo 0,5 M de KOH medindo o pH aps cada adio de 1 mL at atingir pH
11,0.
Colocar 50 mL de cido actico 0,15 M em outro bquer e titular com soluo 0,5 M de
KOH medindo o pH aps cada adio de 0,5 mL at pH 12,0.

Determinar os pKs do aminocido desconhecido e do cido actico e comparar
os pKs com os dados fornecidos na tabela 2, para sua identificao.

Tabela 2 - pK de aminocidos
Aminocido pKa Aminocido pKa
Glu 2,19 Thr 2,62
4,25 10,43
9,67 Asn 2,20
Lys 2,18 8,80
8,95 Ala 2,30
10,53 9,70
His 1,82 Leu 2,36
6,00 9,60
9,17 Pro 1,99
Cys 1,71 10,60
8,33 Gly 2,34
10,78 9,60


MDULO 3: PROTEINAS: ESTRUTURA PRIMARIA

1. A descrio da estrutura das protenas dividida em quatro nveis de organizao:
estrutura primria, secundria, terciria e quartenria.

2. A estrutura primria se refere seqncia de aminocidos que compem a
protena. Trata-se, portanto, da estrutura de ligaes covalentes. A principal ligao
covalente entre aminocios a ligao peptdica. Os aminocidos podem formar
polmeros atravs da ligao do grupo carboxila de um aminocido com o grupo amino
de outro. Esta ligao carbono-nitrognio chamada ligao peptdica, obtida por
excluso de uma molcula de gua. Quimicamente, a formao da ligao peptdica
pode ser representada pela seguinte equao:





21


Esta reao, como est escrita, jamais ocorre nos seres vivos. A unio dos
aminocidos por ligao peptdica no feita por reao direta entre eles, mas atravs
de um complexo aparato de sntese protica, que inclui ribossomos, cidos
ribonuclicos, vrias protenas e enzimas num processo chamado traduo. A
equao mostra apenas o resultado liquido do processo.

3. As propriedades da ligao peptdica impem restries ao dobramento do
polmero formado. A ligao peptdica apesar de ser representada por um nico trao
de ligao, tem caractersticas intermediarias entre uma ligao simples e uma dupla
ligao, devido s interaes entre duas formas de ressonncia.

A conseqncia desse carter parcial de dupla ligao que no h possibilidade de
rotao em torno da ligao peptdica. Assim sendo, os quatro tomos dos
grupamentos que participam da ligao peptdica ficam dispostos em um plano rgido,
constituindo o que se costuma chamar de grupo peptdico ou unidade peptdica (vide
retngulos) Notar tambm que os dois carbonos alpha (C
o
) vizinhos de cada ligao
peptdica tambm se encontram o plano.

22

Marzzocco & Torres, Bioqumica Bsica.

O polmero formado pode, portanto, ser visualizado como uma cadeia constituda por
unidades planares (unidades peptdicas), unidas entre si com uma articulao flexvel:
o carbono . Esta cadeia chama-se cadeia polipeptdica. As protenas podem ser
formadas por uma ou mais cadeias polipeptdicas.
4. Todavia, existem pontos de dobramento entre as unidades peptdicas rgidas,
graas a possibilidade de rotao em torno das ligaes com o carbono alfa (N-C e
C-C), que so ligaes efetivamente simples (vide figura acima). Estas ligaes so
chamadas phi (|) e psi () respectivamente.
5. A cadeia polipeptdica pode ser dividida entre a cadeia principal e as cadeias
laterais (grupos R) ligados aos carbonos alfa.


LABORATRIO 3: FRACIONAMENTO DE PROTENAS

I. FUNDAMENTOS
Mtodos de Purificao de Protenas
possvel purificar e isolar protenas utilizando-se princpios fsico-qumicos, que
levam em conta as propriedades caractersticas dessas biomolculas. Uma dessas
caractersticas est baseada na solubilidade das diferentes cadeias laterais dos
23
aminocidos, que dependem da concentrao de sais dissolvidos no solvente (fora
inica da soluo), da polaridade do solvente (constante dieltrica desse solvente), do
pH do meio (ponto isoeltrico da protena) e da temperatura.
Em uma soluo aquosa de baixa fora inica, a solubilidade de uma protena, em
geral, aumenta com a concentrao salina. Esse fenmeno conhecido como
salting in. Em solues com alta fora inica, entretanto, a solubilidade de uma
protena em geral decresce, fenmeno que resulta da competio entre os ons salinos
adicionados e o soluto (protena), diminuindo a capacidade de solvatao do solvente
aquoso. Esse fenmeno conhecido como salting out, constituindo uma das
tcnicas mais utilizadas para a purificao de protenas. Sulfato de Amnio
[(NH4)
2
SO
4
] o sal mais utilizado para salting out, uma vez que sua solubilidade
alta (3,9 M a 0C), permitindo gerar solues aquosas de alta fora inica.
Protenas em geral possuem uma grande variedade de aminocidos com
grupamentos ionizveis com diferentes pKs. A um pH caracterstico para cada
protena, as cargas positivas da molcula so balanceadas pelas cargas negativas,
conferindo protena carga total zero. Neste pH, denominado ponto isoeltrico (pI),
a molcula torna-se imvel em presena de um campo eltrico. Como pode ser visto
na Figura 1, a solubilidade da lactoglobulina pode variar com a concentrao salina
(NaCl). No entanto, em qualquer caso, ao se ajustar o pH para valores prximos ao pI
da protena, ocorre uma solubilizao mnima e a maior frao de protenas ficar
insolvel.
Em muitas situaes, pode-se utilizar os conceitos de salting out e de
precipitao no pI para purificar uma protena especfica.













Figura 1 Solubilidade da lactoglobulina
em funo do pH em diferentes
concentraes de NaCl.

Solubilidade
mg/mL
pH

24

Eletroforese e Separao de Protenas Totais (SDS-PAGE)
A separao de macromolculas (protenas, DNA e RNA) pode ser feita
aplicando-se um campo eltrico numa matriz slida, como um gel ou papel, que
contem a mistura de interesse. Esse mtodo, amplamente utilizado, denomina-se
eletroforese e baseia-se na migrao das molculas em relao a um campo eltrico,
devido sua carga.
Normalmente se utiliza um gel, devido a supresso das correntes de
conveno produzidas por pequenos gradientes de temperatura e tambm porque o
gel funciona como uma peneira molecular, permitindo a separao das
macromolculas por peso molecular.
O gel de eletroforese constitudo de um polmero de acrilamida cuja estrutura
est demonstrada na Figura 2. Esta polimerizao ocorre na presena de radicais
livres, os quais so gerados por persulfato de amnio e estabilizados por TEMED
(N,N,N,N-tetrametilenenodiamino). A polimerizao tambm depende da presena de
um agente, o NNmetileno-bis-acrilamida, que facilita a ligao das cadeiras entre si,
formando um gel cuja porosidade determinada pelo comprimento das cadeias e pelo
grau de interligao entre estas.


Figura 2 Esquerda: ao de peneiramento de um gel poroso de acrilamida. Direita: formao
de um gel de poliacrilamida. O tamanho do poro pode ser controlado pelo ajuste da
concentrao do monmero ativado (acrilamida, em azul) e do interligante (bis-acrilamida, em
vermelho).

25
A separao de protenas ocorre em condies desnaturantes. A mistura de
protenas e dissolvida em tampo de amostra. Este tampo de amostra contm SDS
(dodecil sulfato de sdio), que um detergente aninico que acaba rompendo as
ligaes no covalentes existentes na protena nativa resultando na sua desnaturao.
Neste tampo tambm temos |-mercaptoetanol que reduz as pontes de dissulfeto
existentes na protena.

II. OBJ ETIVOS
1) Precipitar as protenas totais de uma soluo de leite em p, utilizando os
conceitos de precipitao no pI.
2) Utilizar eletroforese em gel de poliacrilamida/SDS (SDS-PAGE) para separar as
protenas de diferentes amostras e estimar sua concentrao.

III. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
1) Precipitao no pI
- Preparar uma srie de tubos de ensaio de acordo com a tabela 1

Tabela 1 Preparao dos tubos em diferentes pHs.

Tubo 1 2 3 4 5
cido Actico 0,1 mM 1,0 mL
cido Actico 1,0 mM 1,0 mL
cido Actico 50 mM 1,0 mL
cido Actico 1,0 M 1,0 mL
cido Actico 2,0 M 1,0 mL
pH 6,7 5,7 4,7 3,7 2,7
Turvao (sim / no)
- Adicionar, a cada um dos tubos, uma alquota (5,0 mL) de soluo de leite em p
desnatado (5%, previamente centrifugado).
- Agitar os tubos e aguardar 5 minutos
- Separar alquotas de 1,0 mL, distribuir em tubos plsticos pequenos e centrifugar
(5000 rpm, 5 minutos, temperatura ambiente). Descartar a fase sobrenadante e
ressuspender o precipitado em NaOH 0,1M (1,0 mL) (Observao: utilizar o mesmo
procedimento mesmo para os tubos que aparentemente no apresentam precipitado)
- Aps a dissoluo total do precipitado, separar uma alquota da soluo obtida (10,0
L) para SDS-PAGE.

2) Eletroforese em gel de poliacrilamida/SDS (SDS-PAGE)
Para este experimento, sero utilizadas como amostras:
- alquotas de protenas purificadas anteriormente, a partir de uma soluo de
leite em p (5%) (amostras 1 a 5)
- a soluo contendo o extrato bruto de protenas totais de leite em p (5,0 L)
para comparao (amostra 6)
- Soro bovino diludo a 10% (10,0 L) para comparao (amostra 7)
26
- Albumina bovina a 4,0 mg/mL (5,0 L) (padro de peso molecular: 66,0 KDa)
Montar o aparato para eletroforese conforme figura 3 (o gel de eletroforese ser
preparado previamente de acordo com o apndice 1), adicionar na cuba o tampo de
corrida at cobrir os poos do gel para eletroforese.
Adicionar tampo de amostra (10 L) a cada uma das amostras, e aquecer (2
minutos, 100C) para desnaturar as protenas. Resfriar (gelo) e aplicar 15 L nos
poos do gel para eletroforese seguindo a ordem da tabela 2.

TABELA 2 ADIO DAS AMOSTRAS AO SDS-PAGE
poo n 1 2 3 4 5 6 7 8
Amostra padro amostra 1 amostra 2 amostra 3 amostra 4 amostra 5 amostra 6 amostra 7

Aplicar a tenso nos eletrodos do aparato de eletroforese (150 V) e aguardar (30
minutos) at que o corante marcador (Azul de Bromofenol) se aproxime da base do gel
Interromper a eletroforese e mergulhar o gel em uma soluo de colorao:
Coomassie Blue R (0,25g) em metanol : cido actico : gua (45% : 10% : 45%).
Aguardar (5-10 minutos)
Substituir a soluo de colorao pela soluo de descolorao: metanol : cido
actico : gua (45% : 10%: 45%) (15 minutos)
Verificar as protenas coradas, e estimar por comparao, a purificao da amostra.


V. APNDICE
Preparao do gel de acrilamida / SDS

Inicialmente montam-se as placas de vidro com os espaadores posicionados. Vedar
o espao entre as placas com agarose (1% aquecida em ebulio). Aguardar
resfriamento.
PRECAUES: Acrilamida neurotxica quando no polimerizada. Utilize sempre
luvas descartveis para manipular solues contendo acrilamida. Evite inalar TEMED
(mesmo diludo, pode ser txico) e butanol.

Preparar a soluo para o gel de resoluo (de corrida):
- gua destilada (3,7 mL)
- soluo A (1,8 mL)
- soluo B (1,9 mL)
- APS (Persulfato de Amnio) (0,12 mL) (soluo a 10%)
- TEMED (0,45 mL) (diludo 40 vezes)

OBS: Adicionar o TEMED por ltimo, pois ele o agente polimerizante deste gel.

Utilizar a soluo imediatamente aps o preparo (aplicando-a no espao entre as
placas de vidro com uma pipeta. Sero necessrios aproximadamente 4,0 mL de
27
soluo. Aguardar a polimerizao do gel (5 minutos). Ser necessrio deixar
aproximadamente 1,0 cm de espao para aplicar o gel de empilhamento
OBS: A soluo comea a polimerizar muito rapidamente, necessrio ateno e
rapidez para aplicar a soluo no aparato de eletroforese.


Preparar a soluo para o gel de empilhamento:
- gua destilada (1,66 mL)
- Soluo A (0,3 mL)
- Soluo C (0,75 mL)
- APS (Persulfato de Amnio) (0,05 mL) (soluo a 10%)
- TEMED (0,24 mL) (diludo 40 vezes)

OBS: Adicionar o TEMED por ltimo, pois ele o agente polimerizante deste gel.

Utilizar a soluo imediatamente aps o preparo, aplicando-a sobre o gel de
resoluo (deve preencher um espao de cerca de 1 cm de altura). Colocar um pente
plstico para formar os poos onde as amostras sero aplicadas (de acordo com a
demonstrao). Sero necessrios aproximadamente 1,60 mL de soluo. Aguardar a
polimerizao do gel (15 minutos)
OBS: A soluo comea a polimerizar muito rapidamente, necessrio ateno e
rapidez para aplicar a soluo no aparato de eletroforese.

Solues utilizadas

Soluo A: Acrilamida e bis-acrilamida
45 g acrilamida
1,2 g bis-acrilamida
gua destilada (at 100 mL)

Soluo B: Tris-HCl pH 8,8
18,17 g Tris (em 50 mL de gua destilada)
Ajustar o pH para 8,8 (com HCl)
Adicionar SDS (4,0 mL, soluo a 10%)
Completar o volume com gua destilada (at 100 mL)

Soluo C: Tris-HCl pH 6,8
6,06 g Tris (em 50 mL de gua destilada)
Ajustar o pH para 6,8 (com HCl)
Completar o volume com gua destilada (at 100 mL)

Tampo de corrida:
3,0 g de Tris, 14,4 g de Glicina e 10, 0mL de SDS (10%)
Ajustar o volume de gua destilada para 1000 mL
28

Tampo de amostra:
SDS 10% (5,0 mL), 2-mercaptoetanol (0,5 mL), Glicerol (2,0 mL), EDTA 0,1M
(0,1 mL), Azul de Bromofenol 1% (1,0 mL), Soluo C (2,5 mL) e gua
destilada (at 20,0 mL).






29



Figura 3 Esquema do aparato para eletroforese.








30
MDULO 4: INTRODUO CINTICA E TERMODINMICA QUIMICA

1. A variao de energia livre padro diretamente relacionada constante de
equilbrio:

AG
o
= -2.3RT log K
eq

2. A composio de um sistema de reao (uma mistura de reagentes e produtos)
tende a uma variao contnua at que o equilbrio alcanado. No equilbrio, as taxas
de reao para um lado e para outro so exatamente iguais. As concentraes de
reagentes e produtos no equilbrio definem a constante de equilbrio. Na reao:
A + B C + D, a constante de equilbrio dada por:
K
eq
= [C][D] / [A][B]

3. Quando um sistema no est em equilbrio, ele tende ao equilbrio, e a magnitude
desta tendncia pode ser medida como a variao de energia livre da reao, AG. A
energia livre de Gibbs (G), uma propriedade termodinmica, definida pela equao:
G = H TS, onde H, T e S so respectivamente entalpia, temperatura absoluta e
entropia, todas tambm propriedades termodinmicas.

4. Numa transio de estado a temperatura (T) e presso constantes (condies
comuns s reaes bioqumicas) a variao de G (AG) : AG = AH - TAS.
Se se trata de uma reao bioqumica, AH o calor de reao. Quando AH positivo
a reao endotrmica, se AH for negativo a reao exotrmica. Nestas condies,
a espontaneidade da reao definida pelo valor de AG: se AG negativo, a reao
espontnea, sendo denominada exergnica. Se, ao contrrio, AG for positivo, a reao
no ocorre espontaneamente e denominada endergnica. Portanto, a reao ocorre
no sentido em que a energia livre total diminui.

4. No equilbrio, AG = 0. Logo, possvel demonstrar a validade das seguintes
igualdades:
AG = AG + 2,3 RT logB/A B/A = K AG = - 2,3 RT logK

5. Em condies padro, 25C (298K), com concentraes de reagentes e produtos
iguais a 1M, pH = 0, a variao de energia livre considerada padro, ou AG.
Entretanto, a maioria das reaes bioqumicas ocorrem em pH 7,0, para as quais
utiliza-se AG.

6. A Figura 4 (p.35) mostra esquematicamente como varia G com o desenvolvimento
da reao, indicado no eixo das abcissas como coordenada de reao.
Para que a reao ocorra, necessariamente tem-se G
final
< G
inicial
, isto , AG negativo.
Um ponto importante a ser destacado que o valor de AG permite prever se a reao
pode ocorrer, mas no a velocidade com que a reao atinge o equilbrio. A
velocidade de reao depende da energia livre do Estado de Transio que maior
que do que o dos reagentes no Estado Inicial, isto , AG* positivo. Quanto maior o
valor de AG*, menor ser a velocidade de reao.
31

7. Na reao genrica A B a velocidade (v) proporcional a [A], isto , v
1
=k
1
[A]. A
velocidade da reao inversa ser, consequentemente, v
-1
=k
-1
[B]. k
1
e k
-1
so
constantes de velocidade e reaes como AB e BA so ditas de primeira ordem,
porque as suas respectivas velocidades dependem de concentrao molar de um
nico reagente elevado potncia 1. As constantes de velocidade k
1
e k
-1
so
diferentes da constante de equilbrio da reao, K=[B]/[A]. No estado de equilbrio, por
definio, v
1
=v
-1
e, portanto, formalmente, K=k
1
/k
-1
. As reaes representadas pelas
equaes seguintes: 2AB e A+BC so de segunda ordem, cujas velocidades so,
respectivamente, v=k
A
[A]
2
e v=k
AB
[A][B]. Notar que a ordem da reao no coincide
necessariamente com a estequiometria da equao qumica.

8.












Variao de energia livre (G) no decorrer de uma reao genrica.

9. As quinases formam uma classe muito importante e abundante de enzimas, que se
caracterizam por catalisar a transferncia de um grupo fosfato de alta energia para
uma outra substncia receptora.

10. So chamados compostos de alta energia substncias orgnicas com o grupo
fosfato em ligaes anidrido ou fosfoenol, cuja hidrlise libera fostato inorgnico (Pi)
com um AG
0
negativo e em valor absoluto superior a 8kcal/mol. Outros compostos
fosforilados com o fosfato em ligaes ester ou tioester tambm mostram um AG
0
de
hidrlise negativo, mas de valor absoluto da ordem de 3kcal/mol. Estas classes de
compostos esto ilustradas na Tabela 2. O principal composto fosforilado da clula o
ATP; cuja frmula estrutural est na Figura 5. O ATP possui fosfato em ligaes
anidrido e ester, aos quais correspondem AG
0
de hidrlise de, respectivamente, -
8kcal/mol e -3,5kcal/mol. Todas estas reaes so, portanto, muito voltadas para os
produtos de hidrlise, sendo praticamente irreversveis. No entanto, nenhuma destas
Energia
Livre
(G)
Coordenada de Reao
Estado Inicial (S)
Estado Final (P)
Estado de Transio
(T)
AG'
AG*
32
reaes ocorre na clula a velocidade significante se no houver catlise por uma
enzima especfica, da classe das fosfatases.

11. No metabolismo muito importante a transferncia de fosfatos de um composto
fosforilado de alta energia para outro. Uma das reaes chave deste tipo :

fosfoenolpiruvato + ADP ATP + piruvato AG
0
=-5kcal/mol

Como esta reao no ocorre sem catlise, seu controle pela clula feito atravs
de uma enzima quinase especfica.


Frmula estrutural do ATP.



12. Alm das quinases que catalisam a transferncia de grupo fosfato do ATP para
metablitos, existem as quinases que tem como substratos protenas, genericamente
referidas como quinases de protena ou, simplesmente, protena-quinases.
C
C
C C
C
H
H
H
H
H
H
N
N
N
N
H O O H
N H
2
O
-
O - P - O - P - O - P - O - C H
2
O O O
O
-
O
-
O
-
A d e n i n a
R i b o s e
A MP
A D P
A T P

ATP = Adenosina 5-trifosfato

Na clula: [ATP] + [ADP] + [AMP] = Constante

FIGURA 2
C
C
C C
C
H
H
H
H
H
H
N
N
N
N
H O O H
N H
2
O
-
O - P - O - P - O - P - O - C H
2
O O O
O
-
O
-
O
-
A d e n i n a
R i b o s e
A MP
A D P
A T P

ATP = Adenosina 5-trifosfato

Na clula: [ATP] + [ADP] + [AMP] = Constante

FIGURA 2
33
H alguns milhares de protena-quinases diferentes em um organismo, que catalisam
a transferncia de fosfato de ATP para o grupo OH da cadeia lateral de resduos
especficos de serina e treonina formando um ster de fosfato. As reaes deste tipo
so genericamente chamadas de fosforilaes e so modificaes covalentes que
causam mudana de conformao das protenas, alterando sua atividade biolgica.
Por exemplo, um grande nmero de enzimas so fosforiladas para sofrer uma
transio do estado inativo ao ativo ou vice-versa. Mais raramente as protenas so
fosforiladas no grupo enlico de resduos de tirosina.
34
Compostos fosforilados.
R
C
CH
2
Fosfoenol
+
H
2
O
O P
R
C
CH
3
O
+
P
i
AG
o
' = - 13.000 cal/mol
Anidrido fosfrico
cetona cido
R
C O P
O
+
H
2
O
R
C
O + P
i
cido
O
cido
G
o
' = - 8.000 cal/mol
O P R
+
H
2
O
+
P
i
cido
G
o
' = - 3.000 cal/mol
ster fosfrico
O
R
H
lcool
R S CoA
O
C
Tioster
+
H
2
O
+
cido
G
o
' = - 3.000 cal/mol
OH R
O
C
HS-CoA
tiolcool
ATP ADP
ADP
AMP
+
H
2
O
+
P
i
cido
G
o
' = - 8.000 cal/mol
cido
AMP +
H
2
O
+
P
i
cido
G
o
' = - 8.000 cal/mol
cido
A OH +
H
2
O
+ P
i
cido
G
o
' = - 3.500 cal/mol
lcool
Adenosina trifosfato
Adenosina difosfato
Adenosina monofosfato
(Adenosina)
P
i
= fosfato inorgnico = HPO
4
2-
= PO
3
2-
P
Na clula:
[ATP] + [ADP] + [AMP] =
constante
(pH=7,4)
H A
A
A
A
A
A




MDULO 5: PROTEINAS: ESTRUTURA 3D E CONFORMAO

1. A estrutura secundria definida pela conformao local do esqueleto de ligaes
peptdicas que compe o eixo da protena. Esta conformao local pode ser
35
explicitamente expressa atravs dos ngulos phi (|) e psi () (vide Mdulo 3). Em
geral, certas combinaes de ngulos phi (|) e psi () so permitidas enquanto outras
no so permitidas devido a impedimentos estricos entre tomos de grupos vizinhos.
Este princpio pode ser resumido numa diagrama de Ramachandran (Figura 1).
|
|
o o

Diagramas de Ramachandran. Esquerda: Estruturas secundrias
correpondentes s combinaes estericamente permitidas para angulos phi e
psi. Direta: ngulos observados para todas as ligaes em 12 protenas com
estruturas de alta resoluo determinadas por cristalografia.


2. H duas estruturas secundrias principais: o-hlice (Figura 2) e folha | pregueada
(Figura 3), que so estruturas organizacionais regulares e repetitivas. Estas duas
estruturas podem ser caracterizadas por combinaes de ngulos phi e psi (Figura 1)
adotadas pela cadeia principal. Alm de o-hlice e folha |, as protenas globulares
mostram tambm alas de formas definidas, mas irregulares e no repetitivas.
36


o-hlice. Folha | pregueada.

3. A estrutura terciria descreve o arranjo tridimensional da cadeia principal da
protena, incluindo a disposio espacial das cadeias laterais dos aminocidos. H
muitas possibilidades de arranjos tridimensionais para a estrutura terciria das
protenas.
a. As propriedades bioqumicas e biolgicas de uma protena so determinadas
pelo arranjo tridimensional de sua cadeia, isto , pela sua estrutura terciria. Logo, nas
condies fisiolgicas a protena adquire uma estrutura terciria bem definida e
necessria sua funo, que conhecida como estrutura nativa. O desarranjo da
estrutura terciria leva perda de funo da protena, processo que genericamente
chamado de desnaturao.
b. Em protenas pequenas da estrutura primria define a estrutura terciria nativa
da protena. Nestes casos os processos de desnaturao e renaturao da estrutura
da protena so reversveis. A estrutura nativa a conformao da protena de menor
nvel de energia livre (G) e alcanada espontaneamente (processo exergnico). O
exemplo clssico desse comportamento dado pela protena Rnase A, uma enzima
que no seu estado nativo catalisa a hidrlise de RNA. Para protenas grandes o
processo de desnaturao irreversvel e o fenmeno de alcance da conformao
nativa complexo e ainda mal entendido.
c. A estrutura tridimensional das protenas mantida por ligaes fracas como
pontes de H, ligaes inicas e interaes hidrofbicas. A exceo a ponte de
dissulfeto (-S-S-) que, apesar de covalente, importante na manuteno da
conformao nativa de protenas.
37
d. Protenas possuem muitos grupos ionizveis atravs de reao cido-base,
cujos pKs variam enormemente. O pI de uma protena definido como pH da soluo
na qual a carga lquida da molcula de protena nula.

4. Existem muitas maneiras diferentes para apresentar estruturas tridimensionais de
protenas.


Estrutura de mioglobina de baleia, uma protena globular tpica
Fita (azul = H|) modelo space-filling
Topografia
de superfcie


38
MDULO 6: CINTICA ENZIMTICA

1. Enzimas so catalisadores biolgicos cuja natureza qumica proteica. A natureza
proteica das enzimas lhes proporciona alto grau de especificidade.

2. A grande maioria das reaes biolgicas no ocorre, ou ocorrem a velocidades
baixssimas nas condies fisiolgicas de pH e temperatura. Logo, as reaes
biolgicas, em geral, necessitam de catlise para ocorrer, isto , necessitam de
enzimas. Para cada reao h uma enzima especfica.

3. Na reao genrica A B a direo espontnea da reao dada pela variao
de energia livre, .AG
0
, conforme esquematizado no grfico da Figura 5.
AG
0
uma constante que se relaciona com a constante de equilbrio da reao pela
expresso -AG
0
=2.3 RTlogK. Por outro lado, as velocidades das reaes AB e BA
ou, respectivamente, as constantes de velocidade k
1
e k
-1
no dependem do AG
0
da
reao, mas dos, respectivos, AG
1
0=
e AG
-1
0=,
que por sua vez s dependem da
energia livre (G) do estado de transio (energias de ativao). A enzima
(catalisador) no muda o AG
0
da reao, pois catalisadores no interferem com
os estados inicial e final das reaes, mas mudam o caminho da reao e, por
conseqncia diminuem a energia do Estado de Transio.















Variao de energia livre (G) na reao genrica A B.
4. Uria uma substncia muito estvel em gua, mas que pode ser rapidamente
decompostas por hidrlise se a reao for catalisada pela enzima urease:
H
2
N
UREASE

C=O + H
2
O CO
2
+ 2 NH
3

H
2
N

Energia
Livre (G)
Coordenada de Reao
Estado Inicial
(S)
(Reagentes)
Estado Final
(P)
(Produtos)
Estado de transio da
reao no catalisada
AG
0

AG
1
0#

AG
0#
-1

Estado de transio da
reao catalisada
AG
0#
-1cat

AG
0#
1cat

*
*
39
Trata-se de reao de primeira ordem, onde v=k
1
[uria], apesar de a equao
estequiomtrica indicar a existncia de 2 reagentes. Esta reao pode ser
acompanhada em tubo de ensaio no laboratrio.
As Tabelas 3 e 4 mostram resultados obtidos na prtica.

Cintica da enzima urease.
Tubo n
o
Tempo (minuto) NH
3
(moles)
1 0 0
2 2 0.084
3 4 0.168
4 6 0.252
5 8 0.336
6 10 0.420
Concentrao da uria: 5 mM; Concentrao da urease: 0,1 g/mL;
Volume de reao: 1 mL; Temperatura: 30
o
C.

Os dados da Tabela anterior mostram que a velocidade da reao constante ao
longo do tempo estudado. J os dados da Tabela seguinte mostram variaes
relativamente complexas da velocidade de reao em funo da concentrao da
uria para um perodo de 10 minutos de reao. Os dados da Tabela seguinte
permitem medir experimentalmente duas constantes importantes das reaes
enzimticas V
max
(velocidade mxima) e K
m
(constante de Michaelis) atravs da
equao v = V
max
[S] / (K
m
+ [S]).

Cintica da enzima urease.
Tubo n Uria (mM) Urease (g) NH
3
(moles)
1 2,5 0,1 0,21
2 5,0 0,1 0,42
3 10 0,1 0,59
4 15 0,1 0,67
5 25 0,1 0,73
6 50 0,1 0,78
7 100 0,1 0,79
8 200 0,1 0,78
9 200 - 0,00

Os significados de V
max
e K
m
so definidos no modelo de cintica enzimtica proposto
por Michaelis e Menten no incio do sculo passado onde ES um complexo enzima
substrato formado antes de converso do substrato em produtos.



E + S ES E + P
k
cat
k
1
k
-1
40
A derivao da equao Michaelis Menten: v = V
max
[S] / (K
m
+ [S]) = k
cat
[E
t
][S]
/ (K
m
+ [S]) apresentada a seguir.










Frao de E
tot
na forma de ES =
[S]/(K
diss
+ [S])
Velocidade
naquela [S]
Velocidade mxima
Concentrao
do substrato
K
diss
aparente do
Complexo enzima-substrato
41
5. Substncias que reduzem a atividade de uma enzima so chamadas inibidores.
Em termos gerais, inibidores podem atuar em vrias maneiras. Aqui vamos focalizar
em inibidores que ligam reversivelmente com a enzima com constantes de
dissociao K
I
. Estes tipos de inibidores podem atuar em duas maneiras diferentes:
a) Eles podem competir com o substrato para o mesmo stio de ligao na superfcie
da enzima livre. Neste caso so chamados inibidores competitivos ou b) Eles
podem ligar em outro stio na enzima livre (E) e/ou no complexo enzima-substrato
(ES). Estes inibidores so chamados inibidores mistos/no-competitivos se podem
ligar a E e ES e so chamados acompetitivos se ligam somente ao complexo ES.

6. A presena de um inibidor competitivo se manifesta em uma mudana no valor do
K
m
:
K
m obs
= K
m
(1+[I]/K
I
) = oK
m
onde o = (1+[I]/K
I
)

7. A presena de um inibidor misto/no-competitivo se manifesta em uma mudana
nos valores do K
m
e no valor do V
max
: K
m obs
= K
m
(1+[I]/K
I
)/(1+[I]/K
I
) = oK
m
/ o
V
max obs
= V
max
/ o

8. A presena de um inibidor acompetitivo se manifesta em uma mudana nos
valores do K
m
e no valor do V
max
:
K
m obs
= K
m
/ (1+[I]/K
I
) = K
m
/ o
V
max

obs
= V
max
/ o


LABORATRIO 4: CINTICA DA INVERTASE

I. FUNDAMENTOS
A Cintica Enzimtica estuda os mecanismos de reaes qumicas catalisadas por
enzimas. H na estrutura da enzima, uma determinada regio diretamente
responsvel pela ao cataltica. Essa regio denominada stio ativo e a sua
conformao correta fundamental para a atividade enzimtica. Ali se localizam
diversos resduos de aminocidos que podem desempenhar funes de orientao do
substrato e de direta interao com este, permitindo que a reao ocorra.
Em 1913, L. Michaelis e M. L. Menten, desenvolveram estudos considerando as
principais propriedades das enzimas e aplicando as teorias conhecidas de Cintica
Qumica para um modelo simplificado, o qual envolvia a enzima livre (E), o substrato
(S), o complexo enzima-substrato (ES) e o produto (P). Esse modelo pode ser
expresso pela equao qumica:
E + S ES E + P
k
1
k
-1
k
2

42
Michaelis e Menten, com essas consideraes, desenvolveram a expresso de
velocidade para uma reao catalisada enzimaticamente, onde V funo de [S] e
V
max
e K
m
so constantes:
v =
V
mx
. [S]
K
m
+ [S]

Na figura 1 est apresentada a curva de velocidade inicial de reao em funo da
concentrao de substrato para uma enzima que siga o modelo proposto por Michaelis
e Menten. Essa enzima dita de caractersticas michaelianas e obedece expresso
de velocidade apresentada acima.
Km
Vmx / 2
Vmx
V
e
l
.

I
n
i
c
i
a
l

R
e
a

o

(

m
o
l

/

m
i
n
.
l
)
Concentrao de Substrato (M)

Figura 1 Velocidade de reao em funo da concentrao de substrato para uma enzima
michaeliana.


Nesta curva pode-se facilmente identificar o efeito de saturao do substrato. Nestas
circunstncias, o sistema tende a adquirir velocidade de reao mxima (V
mx
),
grandeza que funo da concentrao inicial da enzima livre (E). Podemos tambm
definir uma concentrao de substrato na qual se obtm metade de V
mx
. Esse valor
de [S] numericamente igual ao K
m
, parmetro que dentro de certos limites mede a
afinidade da enzima pelo substrato.
O mtodo mais preciso para determinao grfica dessas grandezas num
experimento de Cintica Enzimtica atravs do grfico de duplo-recproco ou de
Lineweaver-Burk. Para tanto se deve plotar 1/V em funo de 1/[S].
A enzima escolhida para este estudo a invertase de levedura que catalisa a
hidrlise da sacarose para produzir glicose e frutose:
C
12
H
22
O
11
+ H
2
O C
6
H
12
O
6
+ C
6
H
12
O
6
Sacarose Glicose Frutose


A determinao da velocidade da reao (ou da atividade enzimtica) pode ser feita
atravs da dosagem dos acares redutores formados (frutose e glicose). A dosagem
baseia-se na reao entre o cido 3,5-dinitro-saliclico (DNS) e os acares redutores.
43
Estes monossacardeos reduzem o DNS fornecendo um produto de cor caracterstica,
cuja formao pode ser acompanhada a 540 nm.
Conhecendo-se por colorimetria a quantidade (mols) de acares redutores
formada, por um clculo estequiomtrico simples, pode-se determinar a quantidade
correspondente (mols) de sacarose hidrolisada. Nestas experincias as velocidades
da reao sero expressas em mols de sacarose hidrolisada por minuto.
Para estudos de velocidade, o tempo de reao deve ser medido com a maior
exatido possvel. Para isso, o grupo dever organizar-se de maneira a no permitir
que a reao se inicie em tempos diferentes nos vrios tubos. Para tal, importante
manter os tubos em gelo durante a adio dos reagentes. Esses devem ser
adicionados na ordem em que aparecem nos protocolos, com a enzima sendo
adicionada por ltimo. Levam-se ento os tubos, todos juntos, ao banho a 37C para
reagir. Transcorrido o tempo determinado, os tubos devem voltar, todos juntos e
simultaneamente, para o gelo. Neste ponto a reao pra.
A atividade enzimtica medida em unidade (U), sendo que 1 U a quantidade de
enzima necessria para a formao de 1 mol de produto por minuto.

II. OBJ ETIVOS
Estudar as influncias das concentraes de enzima e substrato nas velocidades de
uma reao enzimtica, examinar as curvas obtidas experimentalmente, calcular os
parmetros cinticos e discutir seus valores e importncia.

III. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
1) Construo da curva padro
Adicionar a seis tubos (180 X 20 mm) com volumes crescentes de soluo padro
redutora (glicose 6 mM + frutose 6 mM), conforme indicado na tabela 1. Complete o
volume em cada tubo para 2,0 mL com tampo. Adicionar em seguida 2 mL do
reagente DNS. As quantidades esto indicadas na tabela 1.







Tabela 1 Curva padro da soluo redutora.
tubos
soluo padro
redutora (mL)
soluo
tampo (mL)
reagente
DNS (mL)
absorbncia
(540 nm)
sacarose
hidrolisada(mols)
branco - 2,0 2,0 0,000 0,00
1 0,2 1,8 2,0
44
2 0,4 1,6 2,0
3 0,6 1,4 2,0
4 0,8 1,2 2,0
5 1,0 1,0 2,0

Anotar aqui a concentrao da soluo padro: ________

Aps a adio do DNS (cido 3,5-dinitro-saliclico), colocar os tubos em banho-maria
fervente por 10 min. Aps este tempo, esfriar em gua corrente e adicionar 16 mL de
gua destilada. Agitar com inverso da posio na vertical (3x). Ler as absorbncias a
540 nm contra o branco.
Construir o grfico absorbncia versus concentrao de sacarose hidrolisada. Este
grfico ser a curva padro.

2. Efeito da concentrao da enzima
Numerar sete tubos de ensaio (180 X 20 mm) e adicionar os reagentes conforme
tabela 2.
Manter todos os tubos no gelo.

Tabela 2 Estudo da concentrao de enzima x velocidade de reao.
tubos
sacarose 5%
em tampo
(mL)
tampo
pH 4,77
(mL)
soluo
enzima
(mL)
Concentrao
enzima (M)
Abs. 540
nm
sacarose
hidrolisada por
min. (mol/min)
branco 1,0 1,0 - 0,00 0,000 0,00
1 1,0 0,9 0,1
2 1,0 0,7 0,3
3 1,0 0,5 0,5
4 1,0 0,3 0,7
5 1,0 0,1 0,9
6 1,0 - 1,0

Aps a adio da enzima, agitar suavemente. Retirar os tubos do gelo e coloc-los
imediatamente (e simultaneamente) em banho-maria a 37C por 5 min. Transcorrido
este tempo, os tubos devem retornar imediatamente para o gelo. Assume-se que
nesse instante a reao para. Ainda no gelo, adicionar a cada tubo 2 mL de DNS. Na
presena de DNS, devido alcalinidade do reagente, a enzima para de funcionar.
Transferir os tubos para banho-maria fervente e esperar 10 min. Findo este tempo,
esfriar em gua corrente e adicionar 16 mL de gua destilada em cada tubo. Agitar
com inverso da posio na vertical (3x). Ler as absorbncias a 540 nm.
Fazer o grfico colocando a concentrao da enzima (M) nas abscissas e a
velocidade de hidrlise expressa em mols de sacarose hidrolisada por minuto nas
ordenadas. Durante a aula de laboratrio ser fornecido o valor da concentrao da
enzima na soluo estoque.
45

3. Efeito da concentrao de substrato
Numerar sete tubos de ensaio (180 X 20 mm) e adicionar os reagentes segundo a
tabela 3.
Manter todos os tubos no gelo.

Tabela 3 Estudo da concentrao de substrato x velocidade de reao.
tubos
sacarose
5% em
tampo
(mL)
tampo
pH 4,77
(mL)
soluo
enzima
(mL)
concentrao
sacarose (M)
Abs. 540
nm
sacarose
hidrolisada por
min. (mol/min)
branco 1,0 1,0 - 0,000 0,00
1 0,05 1,45 0,5
2 0,1 1,4 0,5
3 0,3 1,2 0,5
4 0,5 1,0 0,5
5 0,7 0,8 0,5
6 1,0 0,5 0,5

Proceder exatamente como no caso do estudo da concentrao da enzima (item
anterior).
Aps a adio da enzima, agitar suavemente. Retirar os tubos do gelo e coloc-los
imediatamente (e simultaneamente) em banho-maria a 37C por 5 min. Transcorrido
este tempo, os tubos devem retornar imediatamente para o gelo. Assume-se que
nesse instante a reao para. Ainda no gelo, adicionar a cada tubo 2 mL de DNS. Na
presena de DNS, devido alcalinidade do reagente, a enzima (valor elevado de pH)
pra de funcionar.
Transferir os tubos para banho-maria fervente e esperar 10 min. Findo este tempo,
esfriar em gua corrente e adicionar 16 mL de gua destilada em cada tubo. Agitar
com inverso da posio na vertical (3x). Ler as absorbncias a 540nm.

Fazer um grfico da velocidade versus concentrao inicial do substrato.
Estimar os valores de V
mx
e K
m
.
Fazer o grfico de Lineweaver-Burk e calcular os valores de V
mx
e K
m
.
Comparar o valor de K
m
com o encontrado na literatura cientfica.


LABORATRIO 5: REAO DE TRANSAMINAO

I. FUNDAMENTOS
Enzimas transaminases ou aminotransferases so importantes no metabolismo de
aminocidos, pois transferem o grupo oNH3
+
de um aminocido para um o
46
cetocido. Foram identificadas mais de 50 tipos de transaminases, presentes em todos
os tipos de clulas e sendo encontradas tanto no citossol como em mitocndrias de
clulas eucariticas. O grupo oNH
3
+
de todos os aminocidos (com exceo de Lys,
Arg e Thr) podem ser removidos por transaminases em diferentes organismos. As
transaminases possuem especificidade diferenciada: relativamente especfica para o
ocetocido aceptor do grupo NH
3
+
e, numa menor intensidade, para o aminocido
doador. A coenzima PLP (piridoxal-fosfato) essencial para as transaminaes e
vrias outras enzimas envolvidas no catabolismo de aminocidos (figura 1). PLP
derivada da vitamina B6, hidrossolvel, o piridoxal. A figura 2 mostra como os
processos catablicos dos diversos aminocidos colaboram com o eficiente
funcionamento do ciclo de Krebs pelo fornecimento de intermedirios desse ciclo.
O cido glutmico (Glu), produzido em diversas transaminaes, pode tanto sofrer
desaminao oxidativa, produzindo o o- cetoglutarato e o on NH4+, que ser utilizado
no ciclo da uria, como doar o grupo NH
3
+
para a biossntese de outros aminocidos.
O Glu o principal doador de grupos NH
3
+
nesta funo. A figura 3 ilustra esses
processos metablicos.


Figura 1 - Reao de transaminao, mostrando a dependncia pela coenzima PLP no
processo de transferncia dos grupos amino entre aminocidos e cetocidos.

C
NH
3
+
COO- R
H
C
COO-
R
O
AMINOCIDO
o -CETOCIDO
N
H
+
CH
2
O
C
H
HO
H
3
C
P
O
N
H
+
CH
2
O
CH
2
HO
H
3
C
P
NH3
Piridoxal-fosfato Piridoxamino-fosfato
-OOC CH
2
CH
2
C
NH
3
+
COO-
H
GLUTAMATO
C
COO-
O
-OOC CH
2
CH
2
o -CETOGLUTARATO

47
Figura 2 - Os processos catablicos dos diversos aminocidos colaboram com o
eficiente funcionamento do ciclo de Krebs pelo fornecimento de intermedirios desse
ciclo.
Figura 3 Formao de o-cetoglutarato e uria a partir de glutamato.

II. OBJ ETIVOS
Estudar as reaes de transaminases e identificar os produtos e reagentes atravs da
cromatografia em papel.

III. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
1) Preparao do homogeneizado de fgado
Essa etapa ser realizada previamente. Fgados de camundongos (5 a 7 animais) ou
de galinha foram extrados e lavados com PBS (tampo fosfato: 0,05M, pH 7,4),
picados e macerados para homogeneizao com PBS (at 10,0 mL de volume final).
O homogeneizado foi centrifugado (800 g, 15 minutos) para eliminar clulas
remanescentes, ncleos e debris celulares. O sobrenadante foi aliquotado para
utilizao em sala de aula, mantido em gelo e em seguida mantido congelado (-20C)
at sua utilizao.




48
2) Preparao da mistura reacional
O sistema completo da reao composto por um aminocido, um cetocido, o
preparado enzimtico, arsenito de sdio e o tampo. O arsenito de sdio empregado
com a finalidade de evitar a oxidao dos cetocidos pelo sistema enzimtico.
Montar a seguinte reao:
- 0,3 mL de soluo de ocetoglutarato 0,2M pH 7,4
- 0,3 mL de soluo de Alanina a 0,2M pH 7,4
- 0,3 mL de preparao enzimtica
- 0,5 mL de tampo fosfato 0,05M pH7,4
- 0,4 mL de soluo de arsenito de sdio 0,2M
E tambm um controle negativo (branco) contendo todos os componentes exceto a
preparao enzimtica, que substituda por tampo:
- 0,3 mL de soluo de ocetoglutarato 0,2M pH 7,4
- 0,3 mL de soluo de Alanina a 0,2M pH 7,4
- 0,8 mL de tampo fosfato 0,05M pH7,4
- 0,4 mL de soluo de arsenito de sdio 0,2M
Incubar os dois tubos (reao e controle negativo) a 37C por 30 minutos. Em
seguida, inativar a reao em banho-maria fervente por 3 minutos. Centrifugar a 5000
rpm, 10 minutos (centrfuga Eppendorf). Decantar o sobrenadante transferindo para
um segundo tubo Eppendorf e fazer a cromatografia com os padres adequados.
3. Cromatografia
Em um papel de filtro Whatman nmero 1 (10 cm X 20 cm) traar com um lpis uma
linha horizontal de 2,5 cm de altura a partir da origem (ponto de contato do papel com
a soluo na cuba de cromatografia). Marcar 7 pontos com 2,5 cm de distncia entre
si.
Aplicar, com um capilar de vidro fino, sobre os pontos marcados, uma pequena
alquota dos padres de alanina, glutamato, piruvato, e o-cetoglutarato, a mistura de
reao, o branco (controle negativo) e 2,4-dinitrofenil-hidrazina. Sobre os pontos onde
foram aplicados os padres e as amostras, adicionar 3 uL de 2,4-dinitrofenil-hidrazina.
O solvente utilizado para a cromatografia ser uma mistura de butanol/etanol/NH
4
OH
0,5 M na proporo 70:20:30 (v/v).
Aps o solvente alcanar 1 cm do final do papel, secar o papel a 80C em estufa e
marcar os produtos coloridos formados. Revelar os aminocidos do cromatograma
com a soluo de ninhidrina, secando em seguida o papel. Marcar a posio das
manchas que aparecerem.

MDULO 7: ACARES; ESTRUTURA E FUNO


1. Os carboidratos so compostos que apresentam a frmula emprica (CH
2
O)
n

(n> ou = 3), sendo funcionalmente poliidroxialdedos ou poliidroxicetonas. Os
carboidratos mais simples so os monossacardeos, que se apresentam na formas de
aldoses ou cetoses, conforme o grupo funcional carbonlico que possuem, isto ,
49
respectivamente, aldedo ou cetona. H duas trioses: o gliceraldedo, uma aldotriose, e
a diidroxiacetona, uma cetotriose (Figura 8). O gliceraldedo apresenta um carbono
(C2) assimtrico, dando origem a dois ismeros opticos, as formas D e L (Figura 9). J
a diidroxiacetona no possui C assimtrico e, por isso, no mostra esse tipo de
isomeria. Os outros monossacardeos podem ser derivados pelo crescimento da
cadeia destas duas trioses. A Figura 10 mostra a famlia D derivada do D-
gliceraldeido, cujas frmulas estruturais planares obedecem as regras de Fisher.




Gliceraldedo e diidroxiacetona. Carbono quiral ou carbono assimtrico.
50
Famlia D derivada do D-gliceraldedo





.












Ciclizao da D-glicose
51
O aumento da cadeia do monossacardeo leva ao aparecimento de novos Cs
assimtricos e, portanto mais ismeros estruturais, tambm chamados
estereoismeros. O nmero de ismeros dado pela expresso 2
n
onde n o nmero
de carbonos assimtricos. Por exemplo, em aldoexoses h 4 Cs assimtricos, logo o
nmero de ismeros 2
4
=16, sendo 8 da forma D e 8 da forma L. Mas, as estruturas
lineares como representadas na Figura 10 tanto para pentoses como para hexoses
so poucos estveis em soluo, formando estruturas cclicas segundo a reao
mostrada na Figura 11. Esta uma reao bem conhecida da qumica orgnica, pela
qual um lcool (OH) faz uma adio nucleoflica a carbonila de um aldedo, formando
um composto de condensao da conhecido como semiacetal. No caso do exemplo
da Figura 11 a hexose a D-glicose e, como a figura mostra, a ciclizao leva ao
aparecimento de uma outra isomeria estrutural devido s duas posies possveis do
OH do C1 em relao ao plano do anel, gerando os ismeros o e |. importante
enfatizar que o OH do C1 no quimicamente equivalente aos demais OHs que so
alcolicos, sendo por isso chamado de OH glicosdico. A existncia do OH glicosdico
permite que todos os monossardeos sejam oxidados em condies brandas pelo
reagente de Fehling, uma reao de oxido-reao na qual os OHs alcolicos no
participam.



Nomenclatura para estereoismeros.

52
2. Conforme exemplificado na Figura 12 h uma nomenclatura especificamente
designada para distinguir pares de estereoismeros. Enantimeros possuem
estruturas isomricas que so uma imagem especular da outra, por exemplo, cada
membro da famlia D de hexoses mostrada na Figura 10 tem um, e, somente um,
enantimero na famlia L. So epmeros pares de estereoismeros que diferem
apenas pela configurao de um C assimtrico. So anmeros os dois ismeros
resultantes da posio do OH glicosdico do C1 na estrutura cclica da hexose. E,
finalmente, so denominados diastereoismeros pares de ismeros que no caem em
nenhuma das categorias anteriores.

3. Ligao glicosdica: os monossacardeos podem se apresentar na forma de
oligo ou polissacardeos, onde os monmeros so ligados atravs de ligaes
glicosdicas. Oligossacardeos so formados por um pequeno nmero de
monossacardeos, resultantes da condensao de um OH glicosdico com um OH
alcolico, como exemplificado abaixo pela dimerizao de duas molculas de -glicose
por ligao 1-4, originando o dissacardeo maltose:

Caso a ligao glicosdica envolva a condensao dos dois OHs glicosdicos como
o caso da trealose, uma 1-1-diglicose, o dissacardeo no pode ser oxidado pelo
reagente de Fehling (dissacardeo no redutor). J a maltose, que possue um OH
glicosdico livre um dissacardeo redutor, sendo oxidado pelo reagente de Fehling.

4. Polissacardeos so polmeros constitudos de centenas ou milhares de
resduos de monossacardeos, geralmente glicose, formando cadeias lineares, como a
celulose (1-4-poliglicose), ou cadeias ramificadas, como o glicognio e o amido.
O glicognio altamente ramificado, as suas cadeias lineares so formadas por
ligaes 1-4-glicosdicas e suas ramificaes decorrem de ligaes 1-6-glicosdicas
(Figura 13). O glicognio apresenta uma nica extremidade redutora livre (C1 no
resduo final na ltima molcula de glicose da cadeia) e inmeras extremidades no
redutoras. A partir das extremidades no redutoras h acrscimo ou retirada de
resduos do polmero. Portanto, as molculas de glicognio no tm tamanhos
definidos.
53

Glicognio Poli (1-4) (1-6) glicose.


MDULO 8: GLICLISE

1. A gliclise a principal via catablica da glicose compreendendo as 10 reaes
enzimaticamente catalisadas que so mostradas na figura abaixo e cuja
estequiometria total pode ser observada na equao qumica seguinte:
Glicose + 2 NAD
+
+ 2 ADP + 2 P
i
2 Piruvato + 2 NADH + 2 ATP + 2 H
2
O + 2 H
+
A gliclise, como todas as vias catablicas, exergnica e a equao acima
corresponde a AG
o
= -43,4 kJ/mol. Mas o dado da variao de energia livre mais
interessante em termos de AG, cujo valor exato depende de cada clula especfica,
por exemplo, em msculo cardaco estima-se que seja igual a 74,0 kJ/mol.

2. A finalidade da gliclise obteno de energia, como a equao estequiomtrica
indica, cada molcula de glicose degradada a duas de piruvato e parte da energia
livre liberada nesta degradao retida nos produtos na forma de 2 NADH e 2 ATP.

3. A reao que permite a obteno de NADH a nica de oxido-reduo da gliclise,
pela qual gliceraldedo-3-P oxidado a glicerato-1,3-bisP, atravs da ao oxidante de
NAD
+
catalisada pela enzima gliceraldedo desidrogenase. A manuteno da
capacidade oxidante da gliclise exige que NADH seja re-oxidada a NAD
+
, uma
alternativa para isso apresentada na figura, atravs da reao pela qual NADH reduz
piruvato a lactato, recuperando NAD
+
. Esta alternativa ocorre no msculo esqueltico
com baixos nveis de O
2.


4. J ATP produzido em duas reaes distintas pelas quais um radical fosforil
transferido de, respectivamente, glicerato-1,3-P e P-enolpiruvato para ADP, em
transferncias catalisadas por glicerato-1,3-P-quinase e P-enolpiruvato-quinase. Esta
maneira de fosforilao de ADP conhecida como fosforilao a nvel do substrato,
para distingui-la da fosforilao oxidativa da mitocndria que ser vista mais adiante.




54
5. Na gliclise, h 3 reaes de fosforilao irreversveis catalisadas, respectivamente,
pela hexoquinase, fosfofrutoquinase e piruvato-quinase, que funcionam como marca-
passos da via, cuja regulao se d por um elaborado sistema de controle alostrico
das enzimas.

6. Diversas outras hexoses, como frutose, galactose e manose, tambm so
metabolisadas pela via glicoltica.

7. A gliclise em condies anaerbicas tem energtica e funes variadas, conforme o
organismo. Cabe fazer dois destaques importantes.

8. Em vertebrados, encontram-se msculos esquelticos muito pobres em mitocndria,
que so especializados para produzir ATP a partir de gliclise anaerbica, cuja
energtica obedece a seguinte reao geral: Glicose 2Lactato + 2H
+
; G
o
= -
196kJ/mol. Mas, parte dessa energia livre liberada que seria dissipada (61kJ/mol)
retida na forma de 2ATP produzidos por mol de glicose degradada. Deve-se ainda
enfatizar que o lactato no descartado, pois vai ser aproveitado no fgado, aonde
reoxidado a piruvato, alternativa metablica importante a ser examinada mais frente.

9. Leveduras mostram um exemplo de gliclise anaerbica na forma da fermentao
alcolica, segundo a reao geral: Glicose 2Etanol + CO
2
; G
o
= -235kJ/mol. Aqui
tambm parte da energia livre, +61kJ/mol, mantida com a produo de 2ATP. A
parte final da fermentao alcolica compreende duas reaes: a primeira envolve a
descarboxilao de piruvato e liberao de acetaldedo, catalisada pela enzima
piruvato-carboxilase, que no existe em animais. Na segunda reao a desidrogenase
alcolica catalisa a reduo do acetaldedo por NADH.

55


O
OH
OH
OH
HO
ATP
ADP
O
OH
OH
OH
HO
ATP
ADP
O
P -O-CH
2
CH
2
O- P
OH
HO
H
2
C-O- P
C=O
H
2
C-OH
HC=O
HC-OH
H
2
C-O- P
HOCH
2
P -OCH
2
O=C-O- P
HC-OH
H
2
C-O- P
NAD
+
NADH
P
i
O=C-O
-
HC-OH
H
2
C-O- P
COO
-
HC-O- P
H
2
C-OH
H
2
O
COO
-
C-O- P
CH
2
ATP
ADP
COO
-
C=O
CH
3
COO
-
HC-OH
CH
3
NAD
+
NADH
O
P -O-CH
2
CH
2
OH
OH
HO
HO
ATP
ADP
NAD
+
NADH
P
i
ATP
ADP
Glicose
Glicose 6-fosfato
Frutose 6-fosfato
ATP
ADP
Frutose 1,6 bisfosfato
Diidroxiacetona
fosfato
Gliceraldedo
3-fosfato
1,3 Bisfosfoglicerato
3-Fosfoglicerato
2-Fosfoglicerato
Fosfoenolpiruvato
Piruvato Lactato
GLICLISE
HO
NAD
+
NADH
ADP
ATP
ADP
ATP

56

MDULO 9: ACETIL-COA E CICLO DE KREBS

1. Em condies aerbicas, o destino do piruvato produzido na gliclise sofrer uma
descarboxilao oxidativa catalisada pela piruvato desidrogenase, que um complexo
multienzimtico existente no interior da mitocndria de eucariotos. Portanto, o piruvato
precisa entrar na mitocndria para ser degradado por essa via. A reao geral a
seguinte:
Piruvato + CoA + NAD
+
Acetil-CoA + NADH + CO
2

2. O acetilCoA resultante da metabolizao do piruvato totalmente oxidado no ciclo
do cido ctrico, tambm chamado ciclo de Krebs, conforme a seguinte reao geral:
Acetil-CoA + 3 NAD
+
+ FAD + GDP + P
i
+ 2 H
2
O 2 CO
2
+ 3 NADH + FADH
2
+ GTP
+ CoA + 2 H
+


3. O ciclo de Krebs, esquematizado na figura, compreende 8 reaes, envolvendo 8
enzimas e 8 cidos carboxlicos, di e tri-cidos, todos dispersos na matriz da
mitocondria. Portanto, comeando no piruvato e passando pelo acetilCoA, ocorre
oxidao completa desses metabolitos liberando 3CO
2
sem participao de O
2

molecular. Os agentes oxidantes em todas as reaes so NAD
+
ou FAD e as formas
reduzidas destas co-enzimas (NADH + FADH
2
), resultantes do processo, s so
reoxidadas na cadeia respiratria, uma via especializada que se localiza na membrana
mitocondrial interna e ser considerada mais adiante.

4. O ciclo de Krebs, conforme sua reao geral indica, essencialmente catablico,
pois promove a oxidao do radical acetil a 2CO
2
e retm parte da energia livre desta
reao na forma de coenzimas reduzidos que, posteriormente, serviro produo de
ATP atravs da fosforilao oxidativa. Para cumprir esta funo basta que os 8
intermedirios do ciclo ocorram em concentraes catalticas. Mas, o ciclo possui outra
funo, alm da catablica, diversos de seus intermedirios alimentam as vias de
sntese de aminocidos, lipdeos e glicose, isto , o ciclo tem tambm funo
anablica e, portanto, deve ser classificado como anfiblico. Para que o ciclo
desempenhe concomitantemente ambas as funes, catablica e anablica, as
concentraes dos intermedirios so mantidas e controladas atravs de um complexo
sistema de reaes auxiliares, conhecidas como reaes anaplerticas. Um exemplo
de reao anaplertica a carboxilao de piruvato para obter oxalacetato, catalisada
pela enzima piruvato carboxilase.

5. A transformao de piruvato em acetil-CoA, uma reao para a qual convergem
diversas vias catablicas e anablicas, alm da gliclise. Por esse motivo a piruvato
desidrogenase est sujeita a um controle altamente elaborado, compreendendo dois
nveis de regulao: a) controle alostrico atravs da inibio pelo produto, exercido
por NADH e acetil-CoA; b) modificao covalente reversvel da subunidade E
1
da
enzima, por fosforilao/desfosforilao.

57
6. As enzimas citrato sintase, isocitrato desidrogenase e o-cetoglutarato
desidrogenase so as reguladoras do fluxo metablico atravs do ciclo de Krebs e
esto sujeitas a controle alostrico, envolvendo NADH como inibidor e Ca
+
e ADP
como ativadores.

Citrato
cis-Aconitato
Isocitrato
Oxalosuccinato
a-Cetoglutarato
Succinil-CoA
Succinato
Fumarato
L-Malato
Oxaloacetato
Acetil-CoA
Piruvato
CoASH + NAD+
CO2 + NADH
H2O
CoASH
H2O
H2O
NAD+
NADH + H+
CO2
NAD+
NADH
+ H+
CoASH CO2
GDP + Pi
GTP
FAD
FADH2
H2O
NAD+
NADH + H+
Ciclo de Krebs





MDULO 10: CADEIA RESPIRATRIA E FOSFORILAO OXIDATIVA

1. Fosforilao oxidativa o processo bioqumico pelo qual a oxidao de NADH e
FADH
2 ,
produzidos na gliclise e ciclo de Krebs, ocorre acoplada produo de ATP,
a partir de ADP + Pi. Este processo se d na cadeia respiratria ou cadeia de
transporte de eltrons, que compreende um conjunto ordenado de enzimas e
transportadores de eltrons inseridos na membrana interna da mitocndria.

2. A cadeia respiratria contem 4 complexos, I,II, III e IV, ordenados por ordem
crescente de potencial redox, indo do potencial padro de NAD
+
/NADH (E
0
= -0,315V)
ao do O
2
/H
2
O (E
0
= +0,815V). Os eltrons so transferidos do complexo I ou II para o
complexo III pela coenzima Q (ou ubiquinona), e do complexo III para o complexo
IV pelo citocromo C para chegar ao O
2
. NADH e FADH
2 ,
cedem eltrons,
respectivamente, aos complexo I e II. A transferncia exergnica de eltrons do nvel
redox de NADH para o de O
2
(E
0
= 1,130V) envolve uma diferena de energia livre
58
liberada (G
0
= -218kJ/mol) que em parte retida pelo transporte de H
+
do lado
interno para o externo da membrana, criando o gradiente eletroqumico de prtons que
permitir empurrar o processo endergnico de fosforilao de ADP por Pi para gerar
ATP, atravs da bomba de prtons que constitui a ATP sintase (tambm conhecida
com F
1
F
0
- ATPase).
Complexo I
Complexo III
Complexo IV
Espao
Intermembranar
Matrix
Mitocondrial
NADH + H+
2 H+
NAD+
Q
4 H+
Cit C
2 H+
1/2 O2 + 2H+
H2O
Complexo II
FADH2


3. A ATP sintase distinta e fisicamente separada da cadeia de transporte de
eltrons. A transferncia de 2e de NADH at O
2
envolve um G
0
= -218kJ/mol, que
gera um incremento no gradiente de prtons suficiente para mover a ATP sintase,
permitindo a produo de 3 moles de ATP (G
0
= +30,5kJ/mol). Nestas condies, a
ATP sintase trabalha com uma eficincia termodinmica igual a 42%. , no entanto,
necessrio destacar que quando os 2e saem do nvel redox de FADH
2 ,
formam-se
apenas 2ATP. Naturalmente, para uma melhor medida da real eficincia
termodinmica da fosforilao oxidativa seria preciso estimar o G da transferncia de
eltrons em vez do G
0
.

4. A grande quantidade de energia livre que seria dissipada na oxidao completa da
glicose a CO
2
e H
2
O [C
6
H
12
O
6
+ 6 O
2
6 CO
2
+ 6 H
2
O; AG
0
= -2823 kJ/mol]
aproveitada para produo de ATP, graas quase exclusivamente ao processo de
fosforilao oxidativa, rendendo 38ATP por mol de glicose (incluindo neste total 2ATP
da gliclise e 2 do ciclo de Krebs).

5. Vrios mecanismos da cadeia de transporte de eltrons e de seu acoplamento
sntese de ATP foram elucidados atravs da utilizao de inibidores e desacopladores,
entre os quais esto: rotenona, amital, antimicina A, cianeto e DNP.
Rotenona e amital inibem a reduo dos complexo I e III por NADH.
Antimicina A inibe o transporte de eltrons no complexo II.
Cianeto inibe o transporte no complexo IV.
59
DNP desacoplador, pois promove o vazamento de H
+
,levando dissipao do
gradiente de prtons e contnuo transporte de eltrons, desacoplado da sntese de
ATP.
6. A sntese de ATP a partir de ADP e P
i
na mitocndria, que catalisada pela ATP
sintase, dirigida pelo processo de transporte de eltrons. Mas como a ATP sintase
fisicamente separada das protenas do transporte de eltrons, a energia livre liberada
no transporte de eltrons deve ser conservada em uma forma que possa ser utilizada
pela ATP sintase. A energia livre do transporte de eltrons conservada pelo
bombeamento de H
+
da matriz mitocondrial para o espao intermembranar, criando
um gradiente de H
+
. A volta dos prtons ao interior da mitocndria
termodinamicamente favorvel. A membrana interna da mitocndria impermevel a
prtons em toda sua extenso, exceto na ATP sintase; e ento por este canal que os
prtons atravessam a membrana, de volta matriz mitocondrial. A variao de energia
livre associada ao transporte de um prton atravs da membrana interna da
mitocndria pode ser determinada atravs de medidas da diferena de pH e do
potencial de membrana estabelecidos em mitocndrias consumindo oxignio.


MDULO 11: GLICONEOGNESE

1. O fgado humano precisa manter nveis mnimos da glicose circulante, porque
crebro e hemcias dependem quase exclusivamente de glicose para produo de
energia. No entanto, a reserva de glicognio heptico no suficiente para essa
finalidade. Por isso, o fgado sintetiza glicose de novo a partir de lactato, piruvato,
glicerol, intermedirios do ciclo de Krebs e aminocidos, atravs de uma via anablica
chamada de gliconeognese. No jejum, mesmo o jejum de poucas horas, a
gliconeognese a principal fonte da glicose liberada pelo fgado na circulao.

2. A gliclise, como j foi visto, um a via catablica com a finalidade de produzir
energia na forma de 2 NADH + 2 ATP a partir da degradao de glicose a piruvato de
acordo com a equao qumica seguinte:
Glicose + 2 NAD
+
+ 2 ADP + 2 Pi 2 Piruvato + 2 NADH + 2 ATP + 2 H
2
O + 2 H
+

A gliconeognese tem a finalidade de sintetizar glicose a partir de piruvato, isto , faz
o caminho metablico inverso ao da gliclise. Mas, a gliconeognese, contrariamente
gliclise, muito endergnica. Para produzir glicose a partir de piruvato necessitam-
se 2 NADH + 4 ATP +2 GTP, conforme a estequiometria indicada na equao abaixo:

2 Piruvato + 2 NADH + 4 ATP + 2 GTP + 2 H
2
O Glicose + 2 NAD
+
+ 4 ADP + 2 GDP + 6 P
i
+ 2 H
+


3. A gliconeognese utiliza enzimas glicolticas reversivelmente, mas trs dessas
enzimas, a hexoquinase, a fosfofrutoquinase e a piruvato quinase, catalisam reaes
com AG
-
muito negativo, sendo essencialmente irreversveis. Estas reaes so
substitudas na gliconeognese por reaes exergnicas, tornando
60
termodinamicamente favorvel a sntese de glicose a partir de piruvato. Destas
reaes, as duas primeiras correspondentes s enzimas hexoquinase e
fosfofrutoquinase, so substitudas por reaes simples de hidrlise de ligao fosfo-
ester, catalisadas, respectivamente, pelas enzimas glicose-6-P-fosfatase e frutose-1,6-
bis-fosfatase. J a terceira reao, que permite a volta de piruvato para P-enolpiruvato
mais complexa e se d em duas etapas catalisadas, respectivamente, por piruvato-
carboxilase e P-enolpiruvato-carboxiquinase.

4. O balanceamento entre gliclise e gliconeognese coordenadamente controlado
por um complexo sistema de regulao enzimtica, envolvendo interaes alostricas
e modificaes covalentes. Todo esse controle est concentrado nas 3 reaes nas
quais gliclise e gliconeognese seguem reaes independentes, irreversveis e
opostas, que so: 1) glicose / glicose-6-P; 2) frutose-6-P / frutose-1,6-bisP; 3) P-
enolpiruvato / piruvato.


MDULO 12. CIDOS GRAXOS: ESTRUTURA, FUNO E METABOLISMO

1. Lpides ou lipdeos so substncias biolgicas solveis em solventes orgnicos,
como clorofrmio e metanol e, praticamente, insolveis em gua. Os lpides
compreendem: a) cidos graxos, em geral na forma de triacilglicerois; b)
glicerofosfolpides; c) esfingolpides; d) colesterol e derivados. Este mdulo se
restringe a cidos graxos e triacilglicerois.

2. cidos graxos so cidos carboxlicos com longas cadeias hidrocarbonadas,
encontrados na forma de tri-esteres de glicerol. A maioria possui um nmero par de C,
predominando os de 16 C (cido palmtico) e os de 18 C (cido olico). Grande parte
apresenta dupla ligao (insaturado) e muitos so poli-insaturados.

3. As propriedades fsicas dos cidos graxos dependem do grau de insaturao da
cadeia hidrocarbonada. As molculas dos cidos graxos saturados so muito flexveis,
facilitando a atrao e coeso entre si. Duplas ligaes entre C impe rigidez cadeia,
tornando-a menos flexvel e limitando a coesividade entre as molculas do cido
graxo. Em conseqncia disso, a temperatura de fuso (transio de fase
slido/lquido) diminui com o grau de insaturao dos cidos graxos.

4. Os triacilglicerdeos desempenham um papel de reserva de energia metablica.
Algumas de suas propriedades fsico-quimicas so ideais para essa funo: a) elevado
grau de reduo de seus C, maximizando a quantidade de energia livre liberada na
oxidao e b) alta hidrofobicidade, permitindo estocagem livre de gua (estoques
anidros). No por acaso que os triglicerdeos compe cerca de 90% da reserva de
energia metablica e tambm da dieta lipdica dos humanos.

5. A reserva de triacilglicerdeos do tecido adiposo mobilizada atravs da hidrlise a
glicerol e cidos graxos livres, catalisada por lpase especfica. Os cidos graxos livres
61
so carregados pela corrente sangunea na forma de complexos com albumina, que
representa 50% da protena do plasma. cidos graxos livres so muito insolveis, a
~1microM formam micelas, que so altamente txicas.

6. A via catablica de degradao de cidos graxos para produo de ATP ocorre na
matriz mitocondrial e se chama beta-oxidao. Esta via leva clivagem sequencial da
cadeia do cido graxo em pares de C, liberando a cada ciclo: 1 acetilCoA, 1 NADH e 1
FADH
2
(ver reaes abaixo), que alimentaro, respectivamente, o ciclo de Krebs e a
cadeia respiratria. Mas, a beta-oxidao exige previamente uma ativao inicial que
consome 1 ATP e libera o cido graxo na forma de acilCoA. Esta etapa preliminar de
ativao se d associada membrana externa da mitocndria e, a transferncia da
acilCoa para dentro da mitocndria, mediada pela carnitina.

7. A oxidao completa de uma molcula de palmitato (16 C) a CO
2
e H
2
O, atravs da
beta-oxidao, ciclo de Krebs e cadeia respiratria, rende 129 ATP. importante
destacar que este rendimento, medido em ATP/mol-oxidado, muito superior ao da
oxidao completa de aucares e protenas, pois a oxidao de um cido graxo leva
liberao de 37,6 kJ/g de energia livre, enquanto oxidao de aucares ou protenas
libera apenas 16,7 kJ/g.

8. Os cidos graxos so sintetizados no citosol por via anablica prpria que adiciona
seqencialmente unidades de 2 C cadeia em crescimento. Esta via alimentada por
acetilCoA, mas s a primeira unidade de 2 C entra como acetilCoA, as subseqentes
so na forma de malonilCoA. Portanto, o acetilCoA precisa ser previamente ativado a
malonilCoA, por carboxilao e consumo de 1 ATP, para permitir a reao de
condensao, levando ao crescimento da cadeia do cido graxo de uma unidade de 2
C, por ciclo de sntese. A ativao de acetilCoA catalisada pela acetilCoA-
carboxilase, uma enzima sujeita a controle complexo, envolvendo regulao alostrica
e ativao / desativao por modificao covalente (fosforilao / desfosforilao).

9. A sntese de palmitato (16 C) altamente endergnica, obedecendo a sequinte
estequiometria:

AcetilCoA + 7 malonilCoA + 14 NADPH + 7H
+
palmitato + 7 CO
2
+ 14 NADP
+
+ 8
CoA + 6H
2
O

A elongao da cadeia alm de 16 C e a insero de duplas ligaes feita por outros
sistemas enzimticos especializados, que se localizam na membrana do retculo
endoplasmtico. Mas, mamferos no possuem enzimas para introduzir duplas
ligaes em cadeias de cidos graxos acima do C9. Por isso, linoleato (18:2) e
linolenato (18:3), so cidos graxos essenciais que precisam ser adquiridos pela dieta.




62
Reaes de um ciclo de beta-oxidao:
O
R CH
2
CH
2
CH
2
C S-CoA (acil-CoA)
| o
oxidao FAD
FADH
2
H O
R CH
2
C = C C S-CoA (enoil-CoA)
H
hidratao H
2
O

HO H O
R CH
2
C C C S-CoA (L-hidroxiacil-CoA)
H H
oxidao NAD
+

NADH
O O
R CH
2
C CH
2
C S-CoA (ceto acil-CoA)

tilise CoA

O O
R CH
2
C S-CoA + H
3
C C S-CoA (acetil-CoA)


10. importante destacar que animais degradam eficientemente glicose at acetilCoA
pela gliclise e assim podem converter C de acar em cadeias de lipdeo de reserva.
Mas, estes organismos no podem fazer o caminho de volta de cadeias de cido
graxo para glicose, pois no possuem reaes que convertam acetilCoA em piruvato
ou oxalacetato.


MDULO 13: LPIDEOS, MEMBRANA & TRANSPORTE

1. Molculas anfiflicas, como lipdeos com uma nica cauda hidrofbica, cidos
graxos livres e detergentes, quando em soluo aquosa e acima de um limiar de
concentrao (concentrao micelar crtica ou cmc) formam agregados globulares
chamados micelas.

63
2. Por outro lado, lipdeos com duas caudas hidrofbicas, como glicerofosfolipdeos e
esfingolipdeos, tendem a formar bicamadas lipdicas, que so a base estrutural das
membranas biolgicas.

Micela
Bicamada


3. As membranas biolgicas so compostas por protenas associadas a uma matriz de
bicamada lipdica. As protenas que compe as membranas pertencem a duas
categorias: a) integrais ou intrnsecas e b) perifricas ou extrnsecas. Este arranjo
estrutural foi originalmente proposto em 1972 por Singer e Nicholson como o modelo
de mosaico fludo para as membranas biolgicas, que foi plenamente confirmado por
resultados experimentais estruturais e funcionais.
Modelo de mosaico fludo para membranas biolgicas
64


4. As membranas so barreiras hidrofbicas que oferecem grande resistncia
passagem de solutos hidroflicos, cuja permeao exige protenas transportadoras
especficas, conforme esquematizado na figura abaixo. Desta maneira a membrana,
atravs de transportadores especficos, regula o transporte de metabolitos entre
compartimentos celulares.


5. Um exemplo clssico de transporte a tomada de glicose pela hemcia mediada
por um transportador especfico, cuja velocidade depende da concentrao externa de
65
glicose e obedece a uma curva hiperblica de saturao j bem conhecida da cintica
enzimtica, sendo K
t
anlogo a K
m
: Esta forma de transporte conhecida como
transporte passivamente mediado ou difuso facilitada. Trata-se de um processo
exergnico, pelo qual o soluto, no caso a glicose, atravessa espontaneamente a
membrana indo do compartimento de maior para o de menor concentrao.

6. Existem 5 transportadores conhecidos que mediam a difuso facilitada de glicose
em humanos: GLUT1 a 5, cujos K
t
s so diferentes para atender as necessidades
funcionais dos tecidos nos quais so expressos. GLUT1 o transportador em
hemcias, j GLUT2 expresso no fgado e clulas beta do pncreas, enquanto
GLUT4 aparece no msculo esqueltico, tecido adiposo etc.

7. Mas, no epitlio do intestino a glicose obtida da dieta transportada para dentro da
clula contra o gradiente de concentrao, portanto atravs de um processo
endergnico que exige consumo de energia metablica para ocorrer e referido como
transporte ativo. Neste caso o transportador chamado simport, pelo qual a glicose
transportada junto com Na
+
e termodinamicamente possvel porque existe um
gradiente eletroqumico de Na
+
de fora para dentro da clula. H mltiplas formas de
transporte ativo, das quais este exemplo da glicose apenas uma delas. Grande parte
da energia metablica consumida pelas clulas se deve manuteno da enorme
diversidade de transportadores que promovem a transferncia de metabolitos e ons
contra gradientes de concentrao.

MDULO 14: CICLO DAS PENTOSES

1. Muitas funes celulares que envolvem reaes endergnicas so efetuadas
graas hidrlise exergnica de ATP. Outras reaes endergnicas, como a sntese
de cidos graxos e colesterol e a fotossntese, requerem NADPH, que tem um grande
poder redutor.

2. O grupo fosforila no carbono 2 de uma das unidades de ribose do NADPH o
diferencia de NADH. NADH oxidado pela cadeia respiratria para gerar ATP,
enquanto que NADPH serve como um doador de eltrons em reaes biossintticas
redutoras.

3. Na via das pentoses, NADPH gerado quando a glicose-6-fosfato oxidada a
ribose-5-fosfato, que um acar de 5 carbonos, componente de vrios compostos
importantes, como ATP, CoA, NAD
+
, FAD, RNA e DNA.

4. A via das pentoses tambm catalisa a interconverso de acares de 3, 4, 5, 6 e 7
carbonos, em uma srie de reaes no oxidativas que ocorrem no citosol.

5. As reaes da via das pentoses so as seguintes:
glicose-6-fosfato desidrogenado e convertido a ribulose-5-fosfato, em trs
reaes, produzindo 2 NADPH + H
+
.
ribulose-5-fosfato isomerizada a ribose-5-fosfato.
66
Nestas reaes, 2 NADPH + H
+
e uma ribose-5-fosfato so gerados para cada glicose-
6-fosfato oxidada.
ribose-5-fosfato convertida a gliceraldedo-3-fosfato e frutose-6-fosfato pela
transcetolase e transaldolase. A transcetolase catalisa a transferncia de unidades de
C2 de uma cetose para uma aldose. A transaldolase transfere unidades de C3 de uma
aldose para uma cetose.
As reaes de transcetolase e transaldolase criam uma ligao reversvel entre a via
das pentoses e a via glicoltica. O resultado dessas reaes a formao de 2
hexoses e 1 triose a partir de 3 pentoses:
C
5
+ C
5
C
3
+ C
7
Transcetolase
C
7
+ C
3
C
4
+ C
6
Transaldolase
C
5
+ C
4
C
3
+ C
6
Transcetolase

6. O excesso de ribose-5-fosfato formado pela vias das pentoses pode ser
completamente convertido em intermedirios da via glicoltica.

7. A primeira reao da via das pentoses, a desidrogenao da glicose-6-fosfato,
praticamente irreversvel. E essa a reao em que a via das pentoses controlada.
O fator regulatrio mais importante o nvel de NADP
+
, o receptor de eltrons na
oxidao da glicose-6-fosfato a 6-fosfogluconolactona. Alm disso, NADPH compete
com NADP
+
pela ligao enzima. A parte no oxidativa da via das pentoses
controlada principalmente pela disponibilidade de substratos.

8. A via percorrida pela glicose-6-fosfato depende da necessidade celular de NADPH
+ H
+
, ribose-5-fosfato e ATP:
Quando muito mais ribose-5-fosfato requerida que NADPH + H
+
, a maior parte de
glicose-6-fosfato convertida a frutose-6-fostato e gliceraldedo-3-fosfato pela via
glicoltica, a transaldolase e a transcetolase convertem esses em ribose-3-fosfato.
Quando a necessidade de NADPH + H
+
e ribose-5-fosfato esto balanceadas, a
reao predominante a formao de 2 NADPH e uma ribose-5-fosfato de glicose-6-
fosfato pela fase oxidativa da via das pentoses.
Quando muito mais NADPH + H
+
requerido que ribose-5-fosfato, a glicose-6-
fosfato completamente oxidada a CO
2
, ou convertida a piruvato.


MDULO 15. FOTOSSNTESE

1. A fotossntese o processo pelo qual a energia luminosa transformada em
energia qumica e poder redutor, armazenada nas molculas de ATP e NADH +H
+
.
Num segundo passo fase escura (na verdade, fase independente de luz) a energia
armazenada utilizada para sntese de glicose a partir de CO
2
+H
2
O. A fotossntese
ocorre nos cloroplastos, uma organela que, como a mitocndria, possui uma
membrana externa altamente permevel e uma membrana interna praticamente
impermevel, separadas por um espao intermembranar.
67
A equao geral da fotossntese :

6 CO
2
+ 6 H
2
O C
6
H
12
O
6
+ 6 O
2
AG
o
= +2.870 KJ x mol
-1

2. As reaes dependentes de luz ocorrem na membrana tilacide e envolvem
processos semelhantes ao transporte de eltrons e fosforilao oxidativa da
mitocndria. As reaes independentes de luz ocorrem no estroma.

3. Os primeiros estudos de fotossntese realizados levaram concluso de que CO
2

era a fonte do O
2
gerado na fotossntese. Em 1931, entretanto, demonstrou-se que
bactrias fotossintetizantes anaerbicas, sintetizam glicose a partir de CO
2
, sem gerar
O
2
:
CO
2
+ 2 H
2
S
luz
(CH
2
O) + 2 S + H
2
O

4. A reao geral da fotossntese pode ser demonstrada como segue:
CO
2
+ 2 H
2
A
luz
(CH
2
O) + 2 A + H
2
O
Em cianobactrias, H
2
A H
2
S, e em plantas, H
2
O. Isso sugere que a fotossntese seja
um processo de duas fases, nos quais a energia solar utilizada para oxidar H
2
A (fase
clara):
2 H
2
A
luz
2 A + 4[H]
e o agente redutor resultante [H] subsequentemente reduz CO
2
(fase escura):
4[H] + CO
2

luz
(CH
2
O) + H
2
O

5. O principal fotorreceptor na fotossntese a clorofila. A luz absorvida pelas clorofilas
antena e pigmentos acessrios transferida para centros de reao fotossintticos,
onde ocorrem as principais reaes da fotossntese.

6. Plantas e cianobactrias utilizam o poder redutor gerado pela oxidao de H
2
O
dirigida pela luz para produzir NADPH.

7. A produo de O
2
na fotossntese requer 2 fotossistemas: Fotossistema I (P700)
gera um forte agente redutor, capaz de reduzir NADP
+
, e concomitantemente, um
oxidante fraco; Fotossistema II (P680) gera um forte agente oxidante, capaz de oxidar
H
2
O, e concomitantemente, um redutor fraco. O redutor fraco reduz o oxidante fraco.
Assim, fotossistemas I e II precisam funcionar em srie para acoplar a oxidao da
H
2
O com a reduo de NADP+ (transferncia de eltrons de H
2
O para NADP
+
,
formando O
2
e NADPH + H
+
).

8. Quando iluminado, o FS II passa para uma forma excitada e perde eltrons, os
quais so transportados por reaes de xido-reduo para o fotossistema I. O PS I
iluminado fornece eltrons para a reduo de NADP+. Como resultado temos a
oxidao do FS II e a reduo do FS I. A reposio de eltrons em PS II feita por
eltrons provenientes da oxidao de gua e, em PSI, por eltrons emitidos por PSII.

9. Os componentes envolvidos no transporte de eltrons de H
2
O para NADP+ com
produo de NAPDPH + H+ esto organizados em trs partculas, que esto ligadas a
membrana tilacide: (1) fotossistema II; (2) complexo do citocromo b
6
f; (3)
fotossistema I (fotofosforilao no-ciclica).
68
10. Os cloroplastos geram ATP de maneira muito semelhante da mitocndria, ou
seja, atravs do acoplamento da dissipao de um gradiente de prtons sntese de
ATP.

11. Na fotofosforilao cclica, os eltrons emitidos por P700 (PSI) so transferidos ao
complexo citocromo b
6
f, retornando finalmente a P700. No h sntese de NADPH +
H
+
, nem liberao de oxignio.

12. Na fase clara da fotossntese, ATP e NADPH + H
+
so sintetizados, e esses so
utilizados na fase escura para a sntese de carboidratos. A via pela qual as plantas
incorporam CO
2
em carboidratos denominada de Ciclo de Calvin.

13. O ciclo de Calvin engloba duas fases: (1) a fase de produo, na qual 3 molculas
de ribulose-5-fosfato reagem com 3 molculas de CO
2
, gerando 6 molculas de
gliceraldedo-3-fosfato, com o gasto de 9 ATPs e 6 NADPH + H
+
; (2) a fase de
recuperao, na qual os tomos de carbono de 5 gliceraldedo-3-fosfato entram em
uma srie de reaes para dar origem a 3 ribulose-5-fosfato, com as quais o ciclo
recomea.


MDULO 16: METABOLISMO DO GLICOGNIO E CONTROLE HORMONAL

1. O glicognio um polissacardeo que funciona como forma de reserva de energia
em animais e microrganismos. Em animais, o glicognio est depositado no fgado,
um rgo central de reserva de energia, e, tambm, nos msculos, onde degradado
localmente. O glicognio heptico exportado para manter a glicemia.

2. A natureza polimrica e semi-solvel do glicognio constitui-se numa maneira
perfeita de armazenar energia na forma de glicose. O estoque de glicognio do fgado
na forma de glicose causaria tamanha presso osmtica, que a viabilidade do
hepatcito seria impossvel.

3. O glicognio um polmero de o-D-glico-piranose altamente ramificado. Na cadeia
os monmeros so interligados por ligaes glicosdicas o (14); nos pontos de
ramificao a ligao tambm glicosdica, mas o (16).

4. A glicose, na forma de glicose-1-P, liberada da reserva de glicognio pela
fosforlise da ligao o (14) da extremidade no redutora do polmero. Esta reao
catalisada pela glicognio fosforilase.

5. A glicognio fosforilase degrada at restarem 4 resduos antes de uma ramificao
at que a enzima desramificadora transfere 3 dos 4 resduos para outra extremidade
da cadeia de glicognio formando uma nova ligao o (14). O resduo restante est
ligado a cadeia pela ligao o (16) que hidrolisada pela enzima desramificadora
atravs de sua atividade o (16) glicosidase.

69
6. Glicose-1-fosfato convertida a glicose-6-fosfato pela fosfoglicomutase, esta pode
ser liberada pela circulao no fgado pela ao da glicose-6-fosfatase ou degradada
pelo msculo.

7. A sntese do glicognio se d atravs de via uma diferente da de degradao. A
glicose-1-P primeiro ativada uridinadifosfato-glicose, ou simplesmente UDP-G.
UDP-G o substrato da glicognio sintase que catalisa a adio de um resduo de
glicose ao carbono 4 da glicose de uma extremidade no redutora do glicognio,
liberando ainda como produto UDP. Esta reao necessita de cadeias glicognicas
pr-existentes que funcionam como PRIMER da reao, oferecendo extremidades no
redutoras para reagir com UDP-G.
Gli 6-P Gli 1-P
Gli 1-P + UTP UDP-Gli + PP
I
(1-fosfato uridil transferase)
UDP-Gli + glicognio
(n)
UDP + glicognio
(n + 1)


O UDP convertido a a UTP as custas da utilizao de ATP:

PP
I
+ H
2
O 2 P
I
(pirofosfatase)
UDP + ATP UTP + ATP (nucleosdeo difosfato quinase)

8. A glicognio fosforilase e glicognio sintase formam um ciclo que,
respectivamente, libera e deposita glicose-1-P no estoque da glicognio:

UTP + H
2
O 2 P
i

Glicose-1P UDPG
Glicognio
n

Fosforilase SintaseI

P
i
Glicognio
n+1
UDP

fcil notar que se estas enzimas funcionarem concomitantemente o ciclo ser
FTIL, cujo nico resultado lquido ser dissipao de energia atravs da reao:
UTP + H
2
O UDP + P
i

Conclui-se que, necessariamente, no hepatcito estas enzimas so coordenadamente
reguladas, isto , quando a fosforilase ativada para mobilizar glicose-1-P, a sintase
desativada, e vice-versa, conforme a necessidade celular.

9. Ambas fosforilase e sintase so reguladas por fosforilao (modificao covalente)
em resduos especficos de serina, reaes catalisadas pela mesma protena-quinase
que possui dupla especificidade, sendo por isso chamada de sintase-fosforilase
quinase. A fosforilase e a sintase so espcies fosforiladas, portanto a fosforilao,
catalisada pela sintase-fosforilase quinase, causa ativao da fosforilase e inativao
da sintase.

70
10. A fosforilase a e a sintase I (formas ativas), por um lado, e a fosforilase b e a
sintase D (formas no ativas), por outro, so, respectivamente interconversveis. Para
tanto necessrio que fosforilase a e a sintase I sejam desfosforiladas, atravs de
uma reao que requer catlise. A principal enzima, catalisadora comum destas
desfosforilaes, a fosfoprotena fosfatase 1.

11. A integrao metablica requerida pelo bom funcionamento do organismo faz com
que as interconverses coordenadas da fosforilase e sintase do glicognio no fgado,
por fosforilao, sejam controladas extracelularmente por hormnios especficos,
principalmente: adrenalina, glucagon e insulina.

12. As formas inativas fosforilase b e sintase D so intracelularmente estimuladas por
fatores alostricos positivos, por razes de economia interna do metabolismo celular,
independentemente de controle hormonal. So estimuladores alostricos da fosforilase
b e sintase D, respectivamente, 5-AMP e glicose-6P.

13. A regulao metablica feita de interferncia direta de determinadas reaes
qumicas que compem o metabolismo, aumentando ou reduzindo sua velocidade. O
resultado direto deste processo a maior oferta de substratos ou acmulo de
metablitos que acabar por influenciar outras vidas dependentes destes compostos e
a forma mais eficiente de regulao desta rede aumentar a concentrao ou alterar a
eficincia da enzima.

14. Pode se controlar a sntese ou degradao enzimtica; tambm se pode modular a
atividade enzimtica atravs de mudanas conformacionais da prpria enzima
provocada atravs da ligao de compostos ou grupos na cadeia peptdica: regulao
alostrica e regulao por modificao covalente. A concentrao enzimtica tambm
pode variar conforme a oferta do substrato; alterao mediada atravs de hormnios.

15. Hormnios so sinais qumicos que permitem a comunicao entre clulas. So
sintetizados em clulas glandulares para atingir clulas alvo atravs da circulao
sangunea. As clulas alvo respondem a hormnios especficos por possurem os
respectivos receptores hormonais. A ligao do hormnio ao receptor segue uma
reao de equilbrio semelhante interao enzima-substrato: H + R [RH]: a
constante de dissociao de RH (K
D
), correspondente reao inversa muito baixa -
(10
-12
a 10
-9
M) - devido alta afinidade entre hormnio e receptor.

16. Uma parte importante dos receptores hormonais so protenas integrais de
membrana, muitas da quais tem, atualmente, sua estrutura primria conhecida e sua
estrutura tridimensional modelada, em conseqncia da clonagem e seqenciamento
dos seus respectivos genes. Por exemplo, o receptor |-adrenrgico do hormnio
adrenalina, encontrado em hepatcito e outros tipos celulares, possui um peso
molecular de 64 kD, compreendendo uma nica cadeia peptdica que, de maneira
serpentiforme, atravessa a membrana 7 vezes, deixando do lado extracelular, a
extremidade N-terminal e 3 alas, e do lado intracelular, outras 3 alas mais a
71
extremidade C-terminal. A poro extracelular do receptor contm o stio de ligao da
adrenalina, enquanto a poro intracelular se associa a um trmero de protenas
conhecidas como protena-G, por ter um stio especfico para ligao do nucleotdeo
GTP. So hoje conhecidos mais de 1000 receptores, de mltiplos hormnios, com esta
estrutura bsica formando a superfamlia chamada dos receptores associados a
protena-G. A funo deste receptor transduzir o sinal adrenalina de fora para
dentro da clula, processo que mediado pelas protenas-G. H tambm receptores
presentes no citoplasma nuclear e citoplasmtico e neste caso, o hormnio precisa ter
alta solubilidade a lipdeos, atravessando a membrana plasmtica como os hormnios
esterides para encontrar o seu receptor dentro da clula.

17. Os hormnios esto envolvidos no metabolismo em dois nveis: induo ou
represso gnica de determinadas enzimas ou atravs da modificao covalente: A
fosforilao mediada pelas protenas quinases que transferem o grupo fosfato do
ATP para resduos especficos de serina, treonina e tirosina, formando uma ligao
ster fosfrico ou a retirada do grupo fosfato catalisada pela ao de fosfoprotenas
fosfatases atravs da hidrlise.

18. ligao de adrenalina ao receptor |-adrenrgico acoplado a protena G ativa a
enzima adenilato ciclase atravs da ativao da subunidade o (por ligao de GTP),
presente na face interna da membrana citoplasmtica, qual ativa a adenilato ciclase,
catalisando a formao de cAMP a partir de ATP e desencadeando a transduo de
sinal. A descoberta de cAMP, por Sutherland e colaboradores h cerca de 40 anos,
levou criao do conceito do segundo mensageiro da ao hormonal, sendo cAMP o
primeiro a ser descrito, e permitiu dar incio progressiva compreenso dos
mecanismos de ao do receptor de adrenalina. Devemos lembrar que os primeiros
mensageiros qumicos extracelulares so os hormnios. cAMP tem efeito transiente e
hidrolisada pela ao da fosfodiesterase. Na clula, o balano entre as reaes de
sntese (a) e degradao (b) regula a concentrao intracelular do cAMP.
a) ATP + H
2
O cAMP + 2 P
i
; catalisada pela adenilato ciclase
b) cAMP + H
2
O AMP; catalisada pela fosfodiesterase.

19. A base da ao metablica do cAMP a ativao alostrica de uma quinase cujos
substratos so protenas, sendo conhecida como protena quinase dependente de
cAMP, ou simplesmente PKA (Protein Kinase dependent on cAMP). A PKA, uma vez
ativada, catalisa a fosforilao ativadora (modificao covalente) de uma cascata de
protenas quinases que terminam na fosforilao da fosforilase a e da sintase do
glicognio, causando, respectivamente, a ativao e a inativao dessas enzimas. O
resultado final dessa seqncia de ativaes enzimticas, com alternncia de
regulao alostrica e modificao covalente, a fosforlise do glicognio liberando
glicose-1P, comandada por sinais hormonais extracelulares.

20. Os efeitos de ativao ou no da via dependem do receptor ativado, no caso dos
receptores o adrenrgicos, os efeitos de o1 so mediados atravs dos ons clcio e e
72
a ativao de o2 leva a inibio da via de adenilato ciclase. H casos aonde a protena
G do tipo G
s
sendo ativadora de adenilato ciclase e do tipo G
R
inibindo a adenilato
ciclase. Algumas toxinas podem ativar ou bloquear a via de transduo de sinal: toxina
da clera e a toxina da coqueluche.

21. Dois hormnios so os principais responsveis pelo equilbrio da concentrao da
glicose circulante: glucagon e insulina.

22. O glucagon um hormnio que tem efeitos equivalentes aos da adrenalina no
controle do metabolismo do glicognio: possui um receptor da famlia dos receptores
acoplados a protena-G e ativa a cascata que se inicia com cAMP/PKA. Este
liberado em condies de hipoglicemia ativando processos degradativos para
manuteno da glicemia sangunea. A PKA (protena quinase ativada por cAMP)
fosforila a fosforilase quinase tornando-a ativa. A fosforilase quinase fosforila agora
glicognio fosforilase. A glicognio fosforilase ativada (quando fosforilada, glicognio
fosforilase b a) catalisa a hidrlise de resduos de glicose do glicognio liberando
grupos de glicose-1-fosfato. No mesmo tempo, a fosforilase quinase, ativada pela
cascata do receptor de glucagon-protena-G, cAMP/PKA, fosforila a glicognio
sintase, a qual se torna inativa quando fosforilada (sntase I sintase D).

23. A insulina tem efeito oposto, promove a absoro de glicose pelo fgado e
msculos e usa deposio nas reservas de glicognio. Mas importante notar que a
insulina tem mecanismos de ao totalmente diferentes da adrenalina e do glucagon.
Os receptores de insulina no pertencem famlia dos receptores acoplados a
protena-G e no tm ao sobre a adenilato ciclase. Seus receptores so do grupo de
receptores cujo domnio intracelular apresenta atividade intrnseca de protena-quinase
de tirosina. A insulina estimula fosfoprotenas fosfatases. Para reverter a ao do
glucagon, a insulina promove a ativao da fosfoprotena fosfatase que catalisa a
desfosforilao da glicognio fosforilase e da glicognio sintase, levando a inativao
da primeira (fosforilase a b) e ativao da segunda (sntase D sintase I). Desta
forma o fluxo glicoseglicognio favorecido. O transporte da glicose no interior das
clulas com a atuao da insulina um processo passivo mediado por uma famlia de
permeases denominadas GLUT (glucose transporter).

24. Respostas celulares rpidas desencadeadas por hormnios s podem ser obtidas
atravs da ativao, ou da inibio, de enzimas pr-existentes. Hormnios esterides
(por exemplo cortisol) quando secretados difundem-se pela membrana citoplasmtica
e ligam-se ao seus receptores intracelulares os quais, quando ativados, promovem no
ncleo a regulao do metabolismo pela induo da transcrio de genes que
codificam enzimas especficas, levando sntese de novo das protenas
correspondentes, fenmeno conhecido como induo enzimtica. Mas o mecanismo
de induo enzimtica desencadeado por hormnios resulta necessariamente numa
resposta celular lenta, uma vez que os RNAs mensageiros (mRNAs) precisam ser
transcritos, processados, transportados para o citoplasma e finalmente traduzidos
para produzir as protenas enzimticas exigidas.
73

25. A adrenalina estimula uma resposta local no msculo. A liberao de adrenalina
induzida por estmulo nervoso autnomo em situaes de perigo, exerccio fsico, e
hipoglicemia e induz a degradao do glicognio com os fins de fornecer glicose-1-
fosfato como fonte de energia para atividades musculares que permitem ao animal
reagir a estas situaes.

26. Regulao da gliclise e gliconeognese. A gliclise uma das vias metablicas
principais para o fornecimento de energia. No fgado, encontra-se tambm a
gliconeognese, a qual , de forma geral, uma via antagnica da gliclise. A regulao
das duas vias feita de forma reciproca, isto , quando uma delas est ativa, a outra
est inibida. H trs vias sob controle metablico: as converses reversveis de: (i)
glicose para glicose-6-fosfato (hexoquinase e glicose-6-fosfatase); (ii) frutose-6-fosfato
e frutose-1,6-bisfosfato (fosfofrutoquinase e frutose-1,6-bisfosfatase; e (iii)
fosfoenolpiruvato e piruvato (piruvato quinase e fosfoenolpiruvato carboxiquinase,
piruvato carboxilase). A fosfofrutoquinase o principal ponto de regulao da gliclise.
AMP e frutose-2,6-bisfosfato agem como efetuadores alostricos positivos. A formao
de frutose-2,6-bisfosfato est sob controle hormonal. Em condies de hipoglicemia, o
glucagon estimula a produo de cAMP no fgado. Isso ativa a PKA a fosforilar e
inativar a fosfofrutoquinase e ativar a frutose-bisfosfatase-2, diminuindo a
concentrao de frutose-2,6-bisfosfatase. Como resultado, o equilbrio entre as
reaes de fosfofrutoquinase alterado, em favor da sntese de frutose-6-fosfato,
aumentado o fluxo gliconeognico e a sntese de glicose-6-fosfato. Ao contrrio, em
condies de hiperglicemia, as concentraes de cAMP diminuram, e o conseqente
aumento de frutose-2,6-bisfosfato ativa a fosfofrutoquinase e promove a gliclise.


MDULO 17: METABOLISMO DE AMINOCIDOS

1. Em animais, o N do grupo amino dos aminocidos so eficientemente obtidos a
partir de NH
4
+
pelas reaes catalisadas pelas enzimas desidrogenase glutmica e
glutamina sintetase, fornecendo, respectivamente, glutamato e glutamina.

2. Ainda em animais de forma geral, os aminocidos alanina e aspartato podem ser
obtidos a partir de, respectivamente, piruvato e oxalacetato, atravs da reao de
transaminao tendo glutamato como doador de grupo amino. Outros aminocidos
exigem reaes adicionais, alm da transaminao para sua sntese final. Mas, como
regra, os esqueletos de C dos aminocidos so obtidos a partir dos intermedirios da
gliclise, do ciclo de Krebs e do ciclo das pentoses.

3. H, no entanto, aminocidos que no podem ser sintetizados por animais devido a
falta do precursor que fornece o esqueleto de C. Estes so ditos aminocidos
essenciais e tem que ser obtidos na dieta. Por exemplo, humanos tem que conseguir
da dieta 9 aminocidos essenciais.

74
4. Triglicerdeos e glicognio so compostos de reserva, mobilizados quando h
necessidade de energia. Em animais, no existem espcies de protena com funes
de reserva energtica, mas no jejum prolongado protenas so hidrolisadas para
liberar aminocidos que sero catabolisados para produo de energia. O fgado o
centro de catabolisao de aminocidos.

5. O catabolismo de aminocidos envolve a eliminao de N na forma de NH
4
+
e a
transformao dos esqueletos de C em intermedirios da gliclise e do ciclo de Krebs.

6. Duas reaes principais permitem a eliminao do amino grupo. Diversos
aminocidos podem transferir o grupo amino para o alfa-cetoglutarato numa reao
catalisada por transaminases:

aspartato + alfa-cetoglutarato oxalacetato + glutamato

Por outro lado, glutamina e glutamato podem ser desaminados em reaes
catalisadas pela glutaminase e desidrogenase glutmica, respectivamente:

glutamina + H
2
O glutamato + NH
4
+

glutamato + NAD
+
(ou NADP
+
) + H
2
O NH
4
+
+ alfa-cetoglutarato + NADH (ou
NADPH) + H
+

O ction amnio txico, sendo utilizado para a sntese de glutamina ou convertido
em uria no ciclo correspondente, para fins de excreo.

7. Aminocidos como alanina, aspartato e glutamato so ditos glicognicos porque
podem ser convertidos em, respectivamente, piruvato, oxalacetato e alfa-cetoglutarato,
que, por sua vez, podem ser transformados em fosfoenolpiruvato para sntese de
glicose. J os aminocidos leucina e lisina so chamados cetognicos por produzirem
exclusivamente acetilCoA como produto de degradao, portanto servindo sntese
de corpos cetnicos, mas no de glicose.


MDULO 18: CICLO DO NITROGNIO

1. Os gases mais abundantes no ar atmosfrico, O
2
e N
2
, so essenciais para a
existncia da vida biolgica no planeta Terra, mas divergem quanto reatividade
qumica. O O
2
tem propriedades de radical livre reagindo com relativa facilidade, da
servir muito bem como oxidante final na respirao de todos os organismos. J o N
2

possui uma tripla ligao altamente estvel que lhe confere baixssima reatividade
qumica. Apesar disso, o N
2
gasoso da atmosfera a fonte do elemento N que garante
a vida na Terra. Por essas razes fsico-qumicas a reduo do N
2
atmosfrico pelos
sistemas biolgicos tem caractersticas muito peculiares.

2. A reduo qumica do N
2
a NH
3
exige condies drsticas, 500 graus Celsius de
temperatura e 300 atm de presso, certamente incompatveis com a vida biolgica.
Mas bactrias especializadas do gnero Rhyzobium, que so simbiontes de plantas
75
leguminosas, reduzem eficientemente N
2
a NH
4
+
, uma espcie qumica totalmente
compatvel com o metabolismo de todos os organismos. Portanto, o N
2
fixado por essa
simbiose entre planta e bactria garante a disponibilidade do elemento N para todas
as formas de vida terrestre. As bactrias fixadoras de N
2
possuem um complexo
enzimtico singular, a nitrogenase. A reao de reduo do N
2
a NH
4
+
(fixao de
nitrognio), qual envolve um redutor poderoso a grande investimento de energia na
forma de ATP, catalisado pela nitrogenase, qual usa NADPH + H
+
como doador de
eltrons:

N
2
+ 8 H
+
+ 8 e- + 16 ATP + 16 H
2
O 2 NH
3
+ H
2
+ 16 ADP +16 P
i

3.A volatilidade do NH
4
+
(NH
3
+ H
+
) no favorece sua permanncia no solo, mas
existem bactrias autotrficas de vida livre, muito abundantes e largamente
disseminadas, que so especializadas na oxidao do ction amnio a nitrito e nitrato
para fins de obteno de energia metablica. Desta maneira o elemento N
estavelmente depositado no solo na forma de espcies qumicas, sais de nitrito e
nitrato, que so eficientemente absorvidas pelas razes das plantas e prontamente
reduzidas a NH
4
+
no interior da clula vegetal.
As etapas sumariamente mencionadas compreendem o ciclo do nitrognio na
natureza: a) reduo do N
2
a NH
4
+
; b) oxidao de NH
4
+
a nitrito e nitrato; c) reduo
de nitrito e nitrato a NH
4
+
e d) transformao do elemento N de inorgnico para
orgnico com a sntese de aminocidos a partir de NH
4
+
, reao possvel em todas a
formas de organismos biolgicos.