Tcnica de separao e anlise de misturas por interao dos seus componentes entre uma Fase Estacionria e uma Fase Mvel. Classificao dos mtodos cromatogrficos: TIPO FASE MVEL FASE ESTACIONRIA MECANISMO DE SEPARAO Gasosa Gasosa Lquida Partio Slida Adsoro Lquida Lquida Lquida Partio Slida Adsoro Troca Inica Excluso Molecular Processo Cromatogrfico Ocorre partio dos componentes de uma mistura entre a fase mvel (lquida) e a fase estacionria (slida). As foras elementares que agem sobre as molculas so de cinco tipos: 1) Foras de disperso de London ou foras de Van der Waals; 2) Interaes de dipolo induzido; 3) Pontes de hidrognio; 4) Interaes dieltricas; 5) Interaes eletrostticas e coulombianas As foras fsicas e qumicas atuam entre os solutos (presentes na amostra injetada junto com a fase mvel) e as duas fases (mvel e estacionria). As interaes surgidas sero responsveis pela reteno dos solutos sobre a coluna cromatogrfica. A diferena na magnitude dessas foras que determina a resoluo e, portanto, a separao dos solutos individuais. FASE MVEL E FASE ESTACIONRIA Existem diferentes tipos de cromatografia lquida, sendo os mais importantes o de coluna e empapel. A Fase estacionria pode ser um slido ou um lquido. A Fase mvel um lquido, chamado, eluente. Cromatografia de Camada Delgada Thin Layer Chromatography (TLC) Placa de Camada Delgada (Estacionria) Solvente (Mvel) Vapor Saturado do Solvente Placa de Petri Solvente (Mvel) Placa Resultado em TLC Distncia Mxima percorrida pelo solvente Eluente Ponto indicando a distncia percorrida pelo soluto antes de ser adsorvido pela placa Vapor Saturado do Solvente no interior da cmara impede que ocorra evaporao do eluente da superfcie da placa e auxilia no mecanismo de reteno pela placa. Os solventes so adsorvidos pela placa e ocorrer a interao entre o soluto (amostra) e a placa de slica. Clculo do Rf: Mecanismo de Separao em TLC A placa delgada a fase estacionria deste processo cromatogrfico e constituda de slica gel ou alumina que, por sua vez, apresentam alta polaridade. O solvente comea a ser absorvido pela placa, dissolvendo os solutos na linha de base. Os compostos presentes, ento, tendem a ser arrastados para o alto da placa juntamente como solvente . De acordo com a interao estabelecida entre o soluto e a placa o tempo de reteno aumentar devido a forte adsoro que ocorrer desta molcula de soluto na placa. Exemplo de Cromatograma TLC Separao dos componentes do leo de laranja doce Fonte: Micronal S/A. Reich, E.; Blatter, A.; Meier, B.; Milano, S. TLC PARA ANLISE DE DROGAS HERBCEAS. REVISO CRTICA DO STATUS E PROPOSTA PARA O APERFEIOAMENTO DAS MONOGRAFIAS. Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) Tipo de cromatografia lquida que emprega pequenas colunas, recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase mvel que eluda sobre altas presses. Constitui-se, portanto: -Fase Mvel: lquido -Fase Estacionria: material slido Coluna Empacotamento Cromatgrafo (HPLC) A composio bsica de um cromatgrafo lquido (CLAE ou HPLC) : Bomba Injetor Forno de coluna Detector (UV, Fluorescncia) Processador (Software) Fonte: Shimadzu Co., Japan Importncia Realizao de separaes e anlises quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes em vrios tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos, com alta resoluo, eficincia e sensibilidade Pode ser acoplada a outros mtodos instrumentais como o espectrmetro de massa para aumentar a sensibilidade do resultado. Vantagens e Desvantagens Vantagens Desvantagens Tempo de anlise Custo de Implantao Alta resoluo Custo de operao Sensibilidade (ppb ppm) Treinamento Versatilidade (tamanho, orgnico, inorgnico Detectores gua (grau HPLC) R$ 50,00 / litro Acetonitrila (grau HPLC) R$ 250,00 / litro Hexano (grau HPLC) R$ 212,00 / litro Coluna C18 R$ 2230,00 Grau HPLC acima de 99% de pureza Aplicaes Tcnica verstil que permite a deteco de: Vitaminas Lipdios Aminocidos / Protenas Pesticidas Antioxidantes Drogas (antidoping) Frmacos Bactericidas Surfactantes cidos Graxos Escalas Cromatogrficas Existem duas escalas de operao de uma anlise cromatogrfica e sero estabelecidas de acordo com a necessidade ou no de emprego posterior do material separado pela coluna cromatogrfica: preparativa e analtica Escala Preparativa: O interesse , alm da separao e quantificao das molculas, que sejam coletadas fraes de cada molcula para posterior uso. Emprego: -Confirmao da identidade de um compostos -Determinao da atividade biolgica de um ou mais constituintes da frao - Verificao da utilizao de uma frao isolada (por exemplo, como catalisador). -Purificao de um frmaco atravs do isolamento das impurezas (ex. insulina) e outras. Execuo: Colunas de comprimento e dimetro interno maiores que a analtica, uma vez que o objetivo usualmente isolar grandes quantidades do(s) composto(s) de interesse. Estas colunas podem chegar a vrios metros de comprimento e valores superiores a um metro para o dimetro interno. O dimetro interno das colunas preparativas usualmente possui valores superiores a 10 cm, enquanto que as colunas analticas possuem dimetro interno de no mximo 4,6mm. Portanto, existe uma pequena faixa na qual o dimetro interno da coluna superior das analticas e inferior das preparativas. Esta faixa intermediria usualmente denominada de coluna semi-preparativa, e sua maior utilizao tem sido para o desenvolvimento e otimizao de separaes as quais so posteriormente transferidas para a escala preparativa. Fluxo da Fase Mvel Todos os analitos sero arrastados pela fase mvel no interior da coluna (fase estacionria) De acordo com a fora das interaes entre a fase mvel, fase estacionria e o analito ocorrer um espalhamento das molculas no interior da coluna fazendo que ocorra uma separao por afinidade qumica. A velocidade de escoamento pela coluna variar. - menor interao, maior velocidade (primeiro pico cromatogrfico) - maior interao, menor velocidade (ltimo pico cromatogrfico) - Mecanismo de Separao Mecanismo de Separao A interao (afinidade) entre a substncia analisada e as fases mvel e estacionria far com que de acordo com sua polaridade, ou caracterstica qumica, a substncia sofra um perodo de reteno no interior da coluna. Fase Estacionria A fase estacionria pode conter diferentes recheios: a) Slidos rgidos, semi-rgidos ou no rgidos; b) Partculas porosas ou peliculares; c) Partculas esfricas ou irregulares; d) Partculas com diferentes dimetros. Caractersticas da Fase Estacionria - Slidos rgidos a base de slica so os recheios mais usados atualmente pois so mais resistentes a presso. -Slidos semi-rgidos so geralmente constitudos de partculas porosas de poliestireno cruzadas com divinilbenzeno. O semi-rgido tem sido usado para presses at 350 bars. - Slidos no-rgidos (dextrose ou agarose) tem sido usados para excluso de molculas grandes. -Pelicular ou Poroso: pode ser tratado quimicamente para que tenham capacidade adsorvente (troca inica). Importante: Eficincia garantida ao manter-se o mesmo dimetro para todo o recheio. Tamanho da Partcula Em geral, menor que 30 mm (exceto em colunas de troca inica). Garante a difuso das molculas (amostra) ao penetrar e ao sair dos poros das partculas. Menor Partcula = Menor tempo para ocorrer a difuso Anlise mais rpida Partcula - Coluna Fonte: Sigma-Aldrich Ltd., Germany Fase Mvel Duas Formas de Eluio dos Solventes: Isocrtico: a proporo empregada de cada solvente utilizado na fase mvel (eluente) mantida constante. Gradiente: a proporo de cada solvente sofre alterao durante o tempo de anlise. Por qu? Muitas vezes, devido a uma forte adsoro ou reteno de alguns componentes da amostra no slido ativo, necessrio aumentar a polaridade da fase mvel de uma maneira constante e uniforme, com o qual se consegue um incremento de solubilidade dos componentes da amostra na fase mvel. [Solvente] Tempo [Solvente] Tempo Mantm constante a composio da fase mvel atravs da manuteno da proporo de cada solvente empregado. Varia a composio da fase mvel atravs da variao da proporo de cada solvente empregado. Mtodo Isocrtico Mtodo Gradiente Equipamento Exemplo de HPLC (Shimadzu, Japan) Solventes Fase Mvel Bomba e Desgaseificador Injetor e Forno de Coluna Detector Solventes Fase Mvel Desgaseificador Remover as bolhas de ar e outros gases que podem estar presentes no solvente e que podem interferir na resoluo do cromatograma alm de, emsituaes extremas desempacotar a coluna. Bombas Pistonadas Vlvula de Purga Dois Pistes em Paralelo Promover o deslocamento da fase mvel mantendo a proporo de solventes e vazo programadas. Injetor Loop utilizando micro seringa. Volume de Injeo pequeno para evitar sobrecarga da coluna.Evitar bolhas de entrar durante injeo Fonte: Plasmatronics LTDA Em geral de ao inoxidvel. Existem dois tipos: Pr-colunas: Introduzidas antes da coluna de separao. Utilizada para promover aumento da vida til devido a remoo de material particulado e contaminantes. Coluna de Separao: 10 a 30 cm de comprimento. De 3 a 10 mm de dimetro. Contm partculas de 3, 5 ou 10 mm. Coluna Forno de Coluna Manter temperatura da coluna constante. Diversas anlises so feitas sob controle rgido de temperatura. Absorbncia: UV/Vis (l fixo) Infravermelho Fotodiodo (todo o espectro) Fluorescncia Substncias sensveis emisso de radiao (fluorescncia). ndice de Refrao. Espectrmetro de Massa: Substncia ionizada. ons so separados. O feixe de ons atinge o detector. O detector converte o feixe de ons em sinal eltrico. Detectores Absorbncia Detector UV Detector Cromatograma Exemplo de Cromatograma Coluna C18 RP. Gradiente de Acetonitrila:gua. Vazo: 1,0 mL/min. Tipos de Cromatografia Lquida Interao Hidrofbica ou Adsoro Princpio: Adsorvente Soluto Solvente Baseia-se na competio que existe entre molculas da amostra e as da fase mvel em ocupar os stios ativos na superfcie de um slido (fase estacionria). Para que uma molcula de soluto seja adsorvida pela fase estacionria necessrio que uma molcula do solvente seja deslocada. Distribuio de equilbrio ser afetada por: -Composio da fase mvel -Composio da fase estacionria -Temperatura de separao -Vazo de Eluio Tempo Exemplo Adsorvente Polar e soluto apolar: A pouca afinidade entre o soluto e o adsorvente (partcula na coluna) far com que no ocorra deslocamento do solvente (fase mvel). FASE NORMAL: fase estacionria polar; fase mvel apolar (n-alcanos,clorofrmio, acetato de etila); solutos neutros; polaridade soluto t. reteno; mecanismo reteno: adsoro FASE REVERSA: (inverso) fase estacionria apolar (C18); fase mvel polar (tampes, gua, metanol, acetonitrila, THF); solutos apolares, no-inicos; polaridade fase mvel tempo de reteno; mecanismo reteno: partio POLARIDADE RELATIVA DAS FASES: Fase Normal Tipos de Fase Estacionria Principais Partculas empregadas em CLAE por adsoro Em Cromatografia de Fase Normal: O componente menos polar eluir primeiro (maior solubilidade na fase mvel). Quanto maior a polaridade da fase mvel, menor o tempo de reteno (picos saem em menos tempo e mais prximos entre si). Interao por pontes de hidrognio (F, O, N). Em Cromatografia de Fase Reversa: O componente mais polar eluir primeiro (menor solubilidade na fase mvel) Quanto maior a polaridade da fase mvel, maior o tempo de reteno (picos saem em maior tempo e mais distantes entre si). Relao entre Eluio e Polaridade Polaridade de Solventes (Fase Mvel) Polaridade de Solventes (Fase Mvel) Fase Normal Fase Reversa A afinidade maior em cromatografia de fase normal quanto menos impedido for o grupo polar da molcula. Interao em Fase Normal (Ponte de Hidrognio) Interao em Fase Reversa Influncia do Solvente (Fase Mvel) Influncia da Coluna (Fase Estacionria) Ocorre atrao eletrosttica. Interaes por Troca Inica Aplicao: Aminocidos Nucleotdeos Carbohidratos protenas Fase Estacionria: Aninica / Catinica. Fase Mvel: Solues Salinas (Tamponada). Interaes por Excluso Fase Estacionria: Polmeros Porosos. Fase Mvel: Solues Aquosas ou Solventes. Aplicao: Polmeros Protenas cidos Nucleicos Mecanismo de Reteno: Capacidade das molculas penetrarem nos poros da fase estacionria. Molculas menores penetram nos condutos da fase estacionria e, com isso, diminuem sua velocidade de eluio pela coluna. Em paralelo, as molculas maiores conseguem eluir com maior liberdade.