I Curso de Seqenciamento

Noes de Biossegurana
e e
Regulamentao da CTNbio
MSc. Michely C.Diniz
Fortaleza Fevereiro-2008
Biossegurana Biossegurana
1970 A il / C lif i 1970:Asilomar /Califrnia
1993: WHO definiu como: 1993:WHOdefiniucomo:
"prticaspreventivasparaotrabalhocom
agentespatognicosparaohomem". g p g p
ABiossegurana oconjuntodeaesvoltadas
para a preveno minimizao ou eliminao de paraapreveno,minimizaooueliminaode
riscosinerentessatividadesdepesquisa,
produo,ensino,desenvolvimentotecnolgicoe
prestaodeservios,visandosadedo
homem,dosanimais,apreservaodomeio
bi t lid d d lt d " ambienteeaqualidadedosresultados"
(TEIXEIRAeVALLE,1996)
Risco biolgico Risco biolgico
Microorganismos e
Grupos de risco
Grupo 1 (NB1): Microrganismos que, at o p ( ) g q ,
momento, no causam doenas para o
homem (baixo risco individual e coletivo) e
que no representam riscos para o ambiente
(Lactobacillus, Lactococcus, Saccharomyces,
Bacillus polymyxa cepas no patognicas de Bacillus polymyxa, cepas no patognicas de
E. coli, dentre outros);
Microorganismos e
Grupos de risco
Grupo 2 (NB2): Microrganismos que podem
causar doenas no homem, mas a exposio
laboratorial raramente produz doena. Mesmo
i d i t did assim, para essas doenas existem medidas
profilticas e teraputicas eficientes (Espcies de
Salmonella (exceto S. typhi), E. coli patognicas, Salmonella (exceto S. typhi), E. coli patognicas,
Proteus, Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria,
Listeria, dentre outros);
Microorganismos e
Grupos de risco
Grupo 3 (NB3): Microrganismos que podem
causar doenas graves no homem e apresentam
risco elevado para os laboratoristas. Eles podem
apresentar riscos de serem disseminados para a apresentar riscos de serem disseminados para a
populao, mas para as doenas causadas
existem medidas profilticas e teraputicas p p
eficazes (Mycobacterium tuberculosis, Coxiella
burnetti);
Microorganismos e
Grupos de risco
Grupo 4 (NB4): Microrganismos que causam
doenas humanas severas e apresentam risco
elevado para os laboratoristas e para a populao
l El t lt t i f i em geral. Eles so agentes altamente infecciosos
que se propagam facilmente, podendo causar a
morte das pessoas infectadas, pois no existem morte das pessoas infectadas, pois no existem
atualmente medidas profilticas ou tratamentos
efetivos (Vrus Ebla).
Risco qumico Risco qumico
Rotas de entrada Rotas de entrada
INALAO
INGESTO
OCULAR
ABSORO
INJEO INJEO
Risco fsico Risco fsico
Boas prticas de
laboratrio laboratrio
Observncia de prticas e tcnicas Observnciadeprticasetcnicas
microbiolgicaspadronizadas.
Conhecimentoprviodosriscos.
Treinamentodeseguranaapropriado. g p p
Manual de biossegurana/POP Manualdebiossegurana/POP
(identificaodosriscos,especificaodas
prticas procedimentos para eliminao de prticas,procedimentosparaeliminaode
riscos).
Prevenindo Acidentes
em laboratrio
CONDUTAS:
Prevenindo Acidentes
em laboratrio
EQUIPAMENTOS(EPIs):
Prevenindo Acidentes
em laboratrio
EQUIPAMENTOSDEPROTEO
COLETIVA(EPC): ( )
Medidas de controle em
ambiente e equipamentos
CONCEITOS:
Assepsia: o conjunto de medidas adotadas para
impedir que determinado meio seja contaminado.
Antisepsia: a eliminao das formas vegetativas
de bactrias patognicas de um tecido vivo de bactrias patognicas de um tecido vivo.
Limpeza: a remoo da sujidade de qualquer p j q q
superfcie, reduzindo o nmero de microrganismos
presentes. Esse procedimento deve obrigatoriamente
li d d d i f / ili ser realizado antes da desinfeco e/ou esterilizao.
Medidas de controle em
ambiente e equipamentos
BicodeBunsen/Flambagem
Medidas de controle em
ambiente e equipamentos
Desinfeco: um processo que elimina
microrganismos patognicos de seres
inanimados, sem atingir necessariamente os
esporos esporos.
Esterilizao: um processo que elimina todos Esterilizao: um processo que elimina todos
os microrganismos: esporos, bactrias, fungos e
protozorios. Os meios de esterilizao podem
ser fsicos ou qumicos.
Mtodos de
esterilizao
Calor mido (Autoclave): vapor sob presso (1 2 ( ) p p (
atmosferas). Tempo de 15 30 minutos. Temperatura
de 121 132 C.
Calor Seco (Estufa): tempo de 1 hora 170C ou 2
horas 160C sem a abertura da mesma durante o horas 160 C, sem a abertura da mesma durante o
processo.
=> Processos Qumicos: xido de etileno por 4 horas;
glutaraldedo 2% por 10 horas e soluo de
f ld d 38% 18 h formaldedo 38% por 18 horas.
Como tratar ?
VIDRARIAS
Como tratar ?
VIDRARIAS
Lavagemcomguaesabo
Enxgecomguadestilada
Secagememestufa
Como tratar ? Como tratar ?
MATERIAL PLSTICO MATERIALPLSTICO
Ponteiras e tubos sem fenol/clorofrmio:
Lavagem com hipoclorito de sdio , gua
corrente e gua destilada
Ponteiras e tubos com fenol/clorofrmio:
Descarte em recipiente separado
Tubos de PCR
Como tratar ?
Outros materiais
Como tratar ?
- Instrumentos cortantes
- Culturas de bactrias Culturas de bactrias
- Resduos de Fenol/Clorofrmio
- Resduos de gis agarose/poliacrilamida - Resduos de gis agarose/poliacrilamida
- Resduos de AgNO
3
Como tratar ?
EQUIPAMENTOS BANCADAS E PIAS
Como tratar ?
EQUIPAMENTOS,BANCADASEPIAS
Observar manual de cada equipamento Observarmanualdecadaequipamento
Dependendodoprocedimentosisolar p p
bancadas
lcool70% 90%
Principais smbolos
Reagentes que merecem
destaque em lbm ...
ACRILAMIDA
(2propenamide;ethylene carboxamide;acrylic amide;vinyl
amide; acrylamide) amide;acrylamide)
Produzidadesde1950
Obtida da hidratao da acrilonitrila Obtidadahidrataodaacrilonitrila
Reagentes que merecem
destaque em lbm ...
USO ACRILAMIDA
Geldeeletroforese
USOACRILAMIDA
Tratamentodeesgotoseefluentes
Agenteselanteemconstruescivis
Indstriadepapel
Cosmticoseartigosdehigiene
Reagentes que merecem
destaque em lbm ...
DesastreambientalnaEscandinvia,Sucia(1997) , ( )
Mortandadedepeixes,paralisiadogado
Trabalhadorescomdormnciaeformigamento
FormaodeACMemalimentos,derivadosde
coco,eemqueimadecigarros q g
Nofoiconfirmadosercancergenoahumanosa
i d li partirdealimentos
Neurotoxidade em camudongos e em humanos Neurotoxidadeemcamudongoseemhumanos
expostosnotrabalho(SFC,2002)
Reagentes que merecem
destaque em lbm ...
Acrilamidasuspeitadesercarcinognica,
severamente neurotxica causar irritao severamenteneurotxica,causarirritao
dosolhos,pele(imediatamenteabsorvida)
etratorespiratrio. e trato respiratrio.
- Cuidado ao pesar acrilamida e bis-acrilamida
Poliacrilamida teoricamente no prejudicial - Poliacrilamida teoricamente no prejudicial
-Descarte em recipiente apropriado
Reagentes que merecem
destaque em lbm ...
BROMETODEETDEO
(homidium bromide;dromilac;3,8diamino5ethyl6phenyl
phenanthridinium bromide; ethidium bromide) phenanthridinium bromide;ethidium bromide)
Reagentes que merecem
destaque em lbm ...
EtB EtBr
reconhecido que os etdeos e seus anlogos no so q g
aptos para colorao de cidos nuclicos em clulas vivas nos
quais a membrana est intacta, exceto para clulas
permeabilizadas ou com grandes concentraes de corante permeabilizadas ou com grandes concentraes de corante.
Conseqentemente o EtBr ((Tanke, et al., J. IMMUNOL. METH.
52, 91 (1982)) , o idodeto de propdeo ((U.S. Pat. No.
5 057 413 to Terstappen et al Oct 15 1991 U S Pat No 5,057,413 to Terstappen et al. Oct. 15, 1991 U.S. Pat. No.
5,314,805)) e seus homodmeros de etdeo (Live/Dead.RTM.
kit, U.S. Ser. No. 07/783,182 to Haugland, et al., filed Oct. 26,
1991) U S P N 5 314 805 id d 1991) U.S. Pat. No. 5,314,805, tm sido usados
extensivamente para detectar e quantificar clulas
comprometidas ou mortas Phenanthridium dye staining of
nucleic acids in living cells US Patent Issued on August 1, 1995.
Reagentes que merecem
destaque em lbm ...
EtB
Dynamical Change of Mitochondrial DNA Induced in
EtBr
the Living Cell by Perturbing the Electrochemical
Gradient Biophysical Journal Volume 71 November 1996
Ethidiumbromidewasshowntoenterinto
li i ll d i l bl i livingcellsandtointercalatestablyinto
mitochondrialDNA(mtDNA),givingriseto
high fluorescence highfluorescence .
CUIDADOAOMANIPULAROBROMETO
DE ETDEO!!!!! PROVVEL AO DEETDEO!!!!!PROVVELAO
CANCRGENA!!!!
Reagentes que merecem
destaque em lbm ...
Descontaminao EtBr DescontaminaoEtBr
1.Descontaminaoparasoluescontendo>0,5mg/ml
Baseado no mtodo descrito por Lunn e Sansone (1987) reduo
em 200 vezes a atividade mutagnica confirmada em ensaio de em 200 vezes a atividade mutagnica confirmada em ensaio de
microssomo com Salmonella cido hipofosforoso e nitrito de sdio
Quillardet e Hofnung (1987) reduo em 3000 vezes a atividade QuillardeteHofnung(1987) reduoem3000vezesaatividade
mutagnica KMnO
4
Reagentes que merecem
destaque em lbm ...
Descontaminao EtBr DescontaminaoEtBr
2.Descontaminaodesoluesdiludas(tampodogel
contendo 0 5 g/ml) contendo0,5g/ml)
BaseadonomtododescritoporLunneSansone(1987):resina
amberliteXAD16 (absorventepolimriconoinico)
BaseadonomtododescritoporBensaude (1988):carvoativado
Alternativa:SYBERGREEN
Espao Fsico ideal para
laboratrio de biologia laboratrio de biologia
molecular
1)Preparaodasamostras(extraoRNAeDNA)
2)SaladeprPCR(preparaodomixdareao)
3)SaladePCR
4)Ps PCR(eletroforeseefotodocumentao)
Evitando contaminaes das
amostras
Sempre usar luvas trocando as freqentemente Sempreusarluvas,trocandoasfreqentemente.
MateriallivredeDNaseseRNases(microtubos,ponteiras). ( , p )
DNA:Usarponteirascombarreiras.
Minimizarageraodeaerossispelarpida
centrifugao dos microtubos antes de abri los (spin) centrifugaodosmicrotubosantesdeabrilos(spin).
Reagentesebuffers usarsempreumaalquotanova g ff p q
(fracionarosreagentes).
Especialatenocomaguautilizada(ultrapura)
Evitando contaminaes das
RNA
Evitando contaminaes das
amostras
RNA
Trabalhos com RNA devem ser realizados em rea Trabalhos com RNA devem ser realizados em rea
isolada no laboratrio (micropipetadores,
ponteiras, microtubos, soluo tampo e demais
reagentes).
RNA Vid i i h f 180C d t RNA: Vidraria: cozinhar em forno a 180C durante
vrias horas ou lavar com DEPC a 0,1% (em gua ou
em etanol) por 1 hora em etanol) por 1 hora.
http://www.ctnbio.gov.br/
Lei N11.105, DE 24 DE MARO DE 2005.
LEI DE BIOSSEGURANA
Art. 1o Esta Lei estabelece normas de segurana e
mecanismos de fiscalizao sobre a construo, o cultivo, a
produo, a manipulao, o transporte, a transferncia, a
importao, a exportao, o armazenamento, a pesquisa, a
i li lib i bi t comercializao, o consumo, a liberao no meio ambiente e
o descarte de organismos geneticamente modificados
OGM e seus derivados, tendo como diretrizes o estmulo ao
avano cientfico na rea de biossegurana e biotecnologia avano cientfico na rea de biossegurana e biotecnologia,
a proteo vida e sade humana, animal e vegetal, e a
observncia do princpio da precauo para a proteo do
meio ambiente meio ambiente.
Art. 8o Fica criado o Conselho Nacional de Biossegurana CNBS,
vinculado Presidncia da Repblica, rgo de assessoramento superior
do Presidente da Repblica para a formulao e implementao da do Presidente da Repblica para a formulao e implementao da
Poltica Nacional de Biossegurana PNB.
1o Compete ao CNBS:
I fixar princpios e diretrizes para a ao administrativa dos rgos e I fixar princpios e diretrizes para a ao administrativa dos rgos e
entidades federais com competncias sobre a matria;
II analisar, a pedido da CTNBio, quanto aos aspectos da convenincia e
oportunidade socioeconmicas e do interesse nacional os pedidos de oportunidade socioeconmicas e do interesse nacional, os pedidos de
liberao para uso comercial de OGM e seus derivados;
III avocar e decidir, em ltima e definitiva instncia, com base em
manifestao da CTNBio e, quando julgar necessrio, dos rgos e , q j g , g
entidades referidos no art. 16 desta Lei, no mbito de suas
competncias, sobre os processos relativos a atividades que envolvam o
uso comercial de OGM e seus derivados;
Art 11 A CTNBio composta de membros Art. 11. A CTNBio, composta de membros
titulares e suplentes, designados pelo Ministro de
Estado da Cincia e Tecnologia, ser constituda g ,
por 27 (vinte e sete) cidados brasileiros de
reconhecida competncia tcnica, de notria
atuao e saber cientficos, com grau acadmico
de doutor e com destacada atividade profissional
nas reas de biossegurana biotecnologia nas reas de biossegurana, biotecnologia,
biologia, sade humana e animal ou meio
ambiente; ;
Art. 3o Para os efeitos desta Lei, considerase:
I organismo: toda entidade biolgica capaz de reproduzir ou
transferir material gentico, inclusive vrus e outras classes
que venham a ser conhecidas;
V organismo geneticamente modificado OGM: organismo
cujo material gentico ADN/ARN tenha sido modificado por j g / p
qualquer tcnica de engenharia gentica;
VI derivado de OGM: produto obtido de OGM e que no VI derivado de OGM: produto obtido de OGM e que no
possua capacidade autnoma de replicao ou que no
contenha forma vivel de OGM;
MMesma
espcie
Espcie
diferente
TodotransgnicoumOGM,mas
nemtodoOGMtransgnico! g
C ti L i d Bi CrticasaLeideBiossegurana
Contaminao por agroqumicos Contaminaoporagroqumicos
Definiesobscuras:Protenaheterloga
2oNoseincluinacategoriadederivadodeOGMa
substnciapura,quimicamentedefinida,obtidapormeiode
processos biolgicos e que no contenha OGM protena processosbiolgicosequenocontenhaOGM,protena
heterloga ouADNrecombinante.
VI derivado de OGM: produto obtido de OGM e que no VI derivadodeOGM:produtoobtidodeOGMequeno
possuacapacidadeautnomadereplicaoouqueno
contenhaformaviveldeOGM;
Caso da Insulina
f l Nofazmenostecnologiasconvergentes
- Nanotecnologia
-Tecnologia da informao
- Tecnologia das cincias cognitivas
"Situao Global de Comercializao de
l d f d " lavouras geneticamente modificadas: 2007",
elaborado pelo Servio Internacional para
i i d li bi l i Aquisio de Aplicaes em Agrobiotecnologia
(ISAAA, na sigla em ingls)
OBrasilfoiopasquemaisavanounomundoem
reaplantadacomtransgnicosem2007.Foram
3,5milhesdehectaresacimadoanoanterior,
s perando o crescimento na ndia na China e nos superandoocrescimentonandia,naChinaenos
EstadosUnidos.
"OBrasilfoioquemaiscresceueserumlder
mundialdetransgnicos",dizCliveJames,
presidente do conselho diretor do ISAAA presidentedoconselhodiretordoISAAA
SojaeAlgodo
GLOBAL AREA OF BIOTECH CROPS
Million Hectares (1996 to 2007)
23 Biotech Crop Countries
140
Total
Industrial
120
140 Industrial
Developing
80
100
40
60
20
40
0
1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007
Increase of 12%, 12.3 million hectares (30 million acres), between 2006 and 2007.
Source: Clive J ames, 2007.