Optimizacin de la viabilidad del Lactobacillus plantarum encapsulado por secado de aspersin empleando redes neuronales
Protocolo
PRESENTA: IBQ. Gerardo Alfredo Culej Vzquez
DIRECTOR DE TESIS: Dr. Miguel Abud Archila
Tuxtla Gutirrez, Chiapas Noviembre de 2013
2
ndice Resumen ............................................................................................................................... 4 1.0 Introduccin ................................................................................................................... 5 2.0 antecedentes ................................................................................................................... 6 2.1 probiticos .................................................................................................................. 6 2.2.Tipos de estrs a los que son sometidos los probiticos .......................................... 6 2.3 Factores que afectan el crecimiento de los probiticos ............................................ 7 2.4.Factores que afectan la supervivencia de los probiticos ........................................ 8 2.5.Estabilizacin de los probiticos mediante el encapsulamiento ................................. 9 2.5.1 Encapsulamiento por liofilizacin .......................................................................... 9 2.5.2 Encapsulamiento por secado de aspersin ............................................................ 9 2.5.3 Encapsulamiento por emulsin y extrusin ......................................................... 10 2.6 Microencapsulacion de microorganismos por secado de aspersin ........................ 10 2.7 Parmetros que afectan la viabilidad de los probiticos en la encapsulacin por secado de aspersin ............................................................................................................. 11 2.7.1 Agentes encapsulantes ........................................................................................... 11 2.7.2 Temperatura del aire entrante .............................................................................. 12 2.7.3 Flujo de atomizacin y alimentacin .................................................................... 12 2.8 Modelacin y optimizacin del secado por aspersin ......................................... 13 2.8.1 Modelos empricos ................................................................................................. 13 2.8.2 Mtodo de superficie y respuesta .......................................................................... 15 2.8.3 Redes neuronales artificiales ................................................................................ 16 2.8.3.1 Estructura de un sistema neuronal artificial .................................................... 17 2.8.3.2 Aplicacin de las redes neuronales en el secado por aspersin ....................... 17 2.8.3.3 Modelo neuronal de multica-Perceptron con algoritmos de retropropagacin ........................................................................................................................................... 18 3. Planteamiento del problema .......................................................................................... 20 4. Justificacin ..................................................................................................................... 21 5.0bjetivos ........................................................................................................................ 22 5.1 Objetivo general .................................................................................................... 22 5.2 Objetivo especifico ................................................................................................. 22 3
6.0 Materiales y mtodos .............................................................................................. 23 6.1 Reactivacin de la cepa Lactobacillus plantarum................................................... 23 6.2 Microencapsulacion por secado de aspersin ........................................................ 23 6.3 Determinacin de la supervivencia de Lactobacillus plantarum despus del proceso de secado por aspersin .................................................................................... 23 6.4 Determinacin del rendimiento del proceso ......................................................... 24 6.5 Determinacin de la actividad de agua (aw) .......................................................... 24 6.6 Determinacin del color de la partcula .................................................................. 24 6.7 Condiciones de almacenamiento ............................................................................. 24 7.0 Diseo experimental .................................................................................................... 25 7.1 Superficie y respuesta ............................................................................................... 25 7.2 Diseo de red neuronal artificial .............................................................................. 26 7.3 Validacin de la red neuronal con datos experimentales ...................................... 27 8.0 Cronograma de actividades ........................................................................................ 28 9. Bibliografa ................................................................................................................................ 29
4
Resumen La aplicacin de redes neuronales en las ltimas dcadas como una herramienta ms para la optimizacin del proceso de secado por aspersin ha tomado un inters por su capacidad de generalizacin de datos no-lineales. Investigaciones sobre la aplicacin de las redes se encuentra en la protemica, genmica y proceso biologios (fermentaciones) y en el rea de medicina. Dentro de las aplicaciones de las redes neuronales en secado por aspersin se encuentran en la prediccin de las propiedades fisicoqumicas en ciertos alimentos (frutas y verduras) despus del secado, sin embargo no existe reportes sobre la modelacin de redes neuronales en la optimizacin del proceso en la microencapsulacion del probiticos. Por lo tanto este trabajo tiene la finalidad de aplicar las redes neuronales artificiales para la optimizacin del proceso de secado por aspersin, empleando variables de entrada: 100 y 180C, flujo de alimentacin, 3 y 12 mL/min, y como variables de respuesta: viabilidad celular (% de supervivencia), color de la muestra, rendimiento y aw. Se empleara un diseo factorial 3 2 con tres replicas en el punto central, generando un total de 12 experimentos completamente al azar. Todos los resultados sern analizados mediante un anlisis de varianza con un P<igual 0.05. Para la optimizacin del secado por aspersin con la red neuronal artificial se emplear la red neuronal artificial multicapa perceptrn de retroalimentacin (feed-forward-MLP), con el algoritmo de retropropagacin (BP) para desarrollar el modelo de prediccin. Los resultados esperados por la simulacin de la red sern entre un rango de aproximacin (70-100% de supervivencia y 50-100% de rendimiento) con una R=0.9-1, para concluir que ser posible aplicar este tipo de sistemas a los proceso de secado por aspersin.
5
1. Introduccin Durante las ltimas dcadas, se ha considerado laencapsulacin de microorganismos por secado de aspersin, como un proceso en el cual las clulas son encapsuladas dentro de una membrana (polisacridos) con la finalidad de reducir daos celulares durante el almacenamiento (temperatura, humedad) y digestin (pH, sales biliares y proteasas). Las principales ventajas del secado de aspersin incluyen alta velocidad del secado, fcil operacin, sin embargo dicho proceso para su optimizacin en la microencapsulacin de probiticos se hace muy complejo debido a que deben controlarse las variables de entrada (temperatura, flujo de alimentacin, flujo del atomizador) para interactuar entre ellos para generar una variable de respuesta (rendimiento, tamao de partcula, aw y % de supervivencia) la interaccin de las variables de entrada y salida son relaciones no-lineales que hacen difcil para su modelado y optimizacin. El mtodo de optimizacin en los procesos no-lineales se encuentra el mtodo estadstico de Superficie y Respuesta, esta tiene la capacidad de relacionar las variables de entrada con la salida para generar un modelo matemtico, siendo uno de los mtodos ms aplicables. Sin embargo una herramienta aplicable a sistemas altamente no-lineales en el secado por aspersin son las redes neuronales artificiales, por su naturaleza estructural tienen la capacidad de relacionar ms de una variable de entrada para generar los valores de salida y estn aprenden con el entrenamiento prcticamente simulan la capacidad de un cerebro en su anlisis de datos, estos modelos no generan modelos matemticos.
6
2. Antecedentes 2.1.Probiticos Los probiticos son microorganismos vivos, que al ser administrados en dosis adecuadas, confieren un beneficio de salud en el husped (FAO/OMS, 2002). Durante las dos ltimas dcadas los consumidores son ms conscientes y preocupados por su estilo de vida y esto ha aumentado la demanda de alimentos que promueven la salud y el bienestar, tales como los productos funcionales que contienen microorganismos probiticos, los cuales tienen un efecto benfico sobre el equilibrio de la microbiota intestinal. Dentro de los beneficios que tienen los probiticos se encuentran la reduccin y la prevencin de la diarrea, la mejora del equilibrio microbiano intestinal debido a la actividad antimicrobiana, la prevencin de alergias a los alimentos y el aumento del potencial inmune (Aureli et al,2011). Entre los microorganismos probiticos ms comnmente utilizados por la industria alimentaria corresponden a aquellos del genero Lactobacillus. Sin embargo a travs de los aos, muchas especies de microorganismos han sido utilizadas como probiticos y no slo consisten en bacterias cido lcticas (Lactobacilos, Streptococos, Enterococos, Lactococos, Bifidobacterias), sino tambin se han incluido los Bacillus y algunos hongos, tales como Saccharomyces y Aspergillus. Cada uno de estos gneros de probiticos posee mecanismos de accin diferente sobre la salud, uno de los factores ms importantes de los probiticos es que deben ser ingeridas a concentraciones 10 6 y 10 7 UFC/g. (Gonzales, 2013; Furtado et al, 2013). 2.2.Tipos de estrs a los que son sometidos los probiticos Los probiticos son aislados de muchas fuentes naturales, la flora microbiana de humanos (boca, tracto intestinal y aparato reproductor femenino), leches fermentadas, quesos, mantequillas, pulque, entre otras fuentes (Soda et al, 2003; Gonzales, 2013). El cambio de su fuente natural en su reproduccin en el laboratorio en medios sintticos y las condiciones de cultivo (T, pH, concentracin de sales), provoca un estrs celular. Cuando se cultiva en un fermentador por lote, el crecimiento de las bacterias se produce durante cuatro fases: fase-lag, fase-log, estacionaria y la muerte, las respuestas de estrs de cultivos varan en funcin de la fase de crecimiento. Las bacterias en la fase-log, debido a la privacin de carbono y el agotamiento de las fuentes de alimentos disponibles se activan respuestas al estrs para permitir la supervivencia de la poblacin celular. Las bacterias que entran en la fase estacionaria desarrollan una resistencia general al estrs y son por lo tanto ms resistentes a diversos tipos de estreses. Por lo tanto, la fase de crecimiento ptima para la supervivencia en la deshidratacin es la fase estacionaria. Las bacterias probioticas crecen en un rango de temperatura de 2-53 C, sin embargo la temperatura ptima vara entre 28-44 C. Estos son microorganismos acidricos, por lo que crecen ptimamente un pH entre 4.2 y 6.4 y toleran un rango de 4 a 6.5 % de NaCl (Estela 7
et al, 2007). En cultivos por lote, al realizar cambios en la temperatura o el pH, se induce un estrs celular. Sin embargo estos cambios propicios no son letales cuando son sometidos a cambios muy bajos, tales como los pretratamientos trmicos suaves pueden conducir a una adaptacin de la membrana celular mediante el aumento de la saturacin y la longitud de los cidos grasos con el fin de mantener la fluidez ptima de la membrana y la actividad de las protenas intrnsecas. Por lo tanto, el efecto benfico de estrs por calor puede ser por la produccin de protenas de choque trmico (HSPs) que promueven el correcto plegamiento de los polipptidos, ensamblaje de complejos protenas, la degradacin y la translocacin de las protenas. Los dos grupos de protenas principales involucrados en la correccin son las chaperonas de la familia DnaK 70-kDa y la familia GroEL 60-kDa (Gobbetti et al, 2004). Desmond et al (2004), reportaron que la protena chaperona GroEL fue una de las protenas ms fuertemente expresado en la clula en condiciones de adaptacin al calor. El cambio de pH propicia estrs celular, este fenmeno puede alterar el estado fisiolgico de las clulas bacterianas que conducen a una mayor sntesis de protenas de choque trmico (Meng et al, 2006). El cultivo de L. delbrueckii bajo pH no controlado aumenta la produccin de protenas de choque trmico (Silva et al, 2005). Una viabilidad de 80% de supervivencia fue obtenido por liofilizacin cuando L. reuteri fue cultivado a un pH 5.0 con 2 horas de mantenimiento en la fase estacionaria (Meng et al,2008). Por lo tanto Las bacterias responden a los cambios en su entorno por una reprogramacin metablica que conduce a un estado celular de mayor resistencia (Pichereau et al, 2000). 2.3.Factores que afectan el crecimiento de los probiticos La composicin del medio de cultivo es un factor que contribuye a la tasa de crecimiento de los cultivos probiticos durante el secado, y en este sentido, se ha demostrado la importancia de la presencia de hidratos de carbono. El crecimiento de L. delbrueckii. y L. bulgaricus en presencia de azcares, tales como lactosa, sacarosa y trehalosa, o crioprotectores qumicos, tales como, glicerol, muestra que las clulas pueden adaptarse a la congelacin y la descongelacin por un estrs osmtico. La supervivencia de L. sakei al ser sometido por secado de aspersin se mejor cuando las clulas fueron cultivadas en la presencia de sacarosa. Otros azcares, tales como fructosa y el sorbitol tambin proporcionan un mejor crecimiento a los probiticos que la glucosa. El mecanismo para la proteccin de los azcares en el medio de cultivo radica probablemente a que el crecimiento en presencia de diversos sustratos de azcar produzca clulas con distintas caractersticas morfolgicas y fisiolgicas, lo que refleja la resistencia a diferentes tratamientos de estrs. Otros factores, incluyendo la presencia sales como de cloruro de sodio en el medio de crecimiento tiene efectos sobre la supervivencia de los probiticos cultivadas despus de la deshidratacin (Meng et al, 2008).
8
2.4.Factores que afectan la supervivencia de los probiticos Las condiciones de almacenamiento, tales como la temperatura de almacenamiento, el contenido de humedad del polvo, la humedad relativa, la composicin del polvo, contenido de oxgeno, la exposicin a la luz y los materiales de almacenamiento, tienen una influencia significativa en la supervivencia de los probiticos en los polvos secos, establecer las condiciones correctas son esenciales para mantener la viabilidad de las bacterias probiticas secadas por aspersin. La viabilidad de las bacterias probiticas durante el almacenamiento de polvo est inversamente relacionada con la temperatura de almacenamiento. La viabilidad de un nmero de especies de Bifidobacterias disminuye cuando se seca por aspersin en un vehculo a base de leche desnatada y se almacena a 15 C y 25 C disminuye su viabilidad (Simpson et al, 2005). El contenido de humedad de los polvos de probiticos es un factor crtico que influye la estabilidad de la vida til de las bacterias vivas. El contenido de humedad ptimo para el almacenamiento L. salivarius despus del proceso de liofilizado est en un rango de 2.8% a 5.6%. La viabilidad de probiticos liofilizados en la leche descremada es inversamente proporcional a presin relativa de vapor (PRV), con 11,4% PRV produciendo ms alta viabilidad durante el almacenamiento a temperatura ambiente (Meng et al. 2008). Algunos estudios han demostrado que la presencia de polisacridos (sacarosa, maltodextrina) puede estabilizar la membrana celular de los probiticos durante la congelacin y almacenamiento, por ejemplo, se ha propuesto que el sorbitol previene el dao de la membrana por la interaccin con la membrana y estabiliza la estructura y funcionalidad de la protena (Meng et al. 2008). Otro factor deterioro de la viabilidad durante el almacenamiento est relacionada con la oxidacin de los lpidos de la membrana. Lpidos acilo insaturados tales como el cido oleico, que no pueden ser considerados como constituyentes de los alimentos estables durante el almacenamiento de alimentos, como la presencia de uno o ms grupos alilo dentro de la molcula de cido graso se oxidan fcilmente a hidroperxidos, por lo tanto los productos de la peroxidacin lipdica induce a un dao en el ADN provocando la muerte celular (Meng et al. 2008). La rehidratacin de polvos probiticos es el paso crtico final para la reactivacin de las clulas despus de la deshidratacin. El proceso de reconstitucin en agua se puede dividir en cuatro pasos: humectacin, inmersin, dispersin y disolucin. La solucin de rehidratacin en s (en trminos de la osmolaridad, pH y la fuente de energa nutricional), as como las condiciones de rehidratacin (en trminos de temperatura de rehidratacin y volumen) pueden afectar significativamente la tasa de recuperacin al estado viable, y por lo tanto influir en el porcentaje de supervivencia (Carvalho et al, 2004). Para obtener resultados ptimos, se recomienda secar las clulas en la fase estacionaria de crecimiento y 9
de utilizar procedimientos de rehidratacin lentos. Algunos autores indican que se debe rehidratar con la misma solucin con la que fue crioconservada (microencapsulada). La razn de esto es que tal solucin proporciona un entorno de alta presin osmtica que podran controlar la velocidad de hidratacin, y por lo tanto evitar el choque osmtico. La temperatura de rehidratacin de los probiticos liofilizados o por secado de aspersin tambin influye en la recuperacin de clulas. La rehidratacin a 15-25 C produce el mayor nmero de clulas de Salmonella anatum recuperados, en comparacin con la temperatura de 35 C y 45 C, donde la recuperacin celular fue menor (Meng et al. 2008).
2.5. Estabilizacin de los probiticos mediante el encapsulamiento Aunque el contenido de agua es un componente esencial para el funcionamiento de la clula, la retencin de la viabilidad durante el almacenamiento es a menudo mayor cuando la cantidad de contenido de agua es baja. Por lo tanto, la deshidratacin se utiliza comnmente como una tcnica para estabilizar los probiticos para facilitar su almacenamiento, manipulacin, transporte, y su aplicacin en alimentos funcionales. La liofilizacin es la tcnica ms extendida para la deshidratacin de cultivos probiticos y los productos lcteos, mientras que el secado por aspersin se ha aplicado a la deshidratacin de un nmero limitado de cultivos probiticos (Meng et al, 2008). 2.5.1 Encapsulamiento por liofilizacin El encapsulado por liofilizacin se ha usado para la fabricacin de polvos con probiticos durante dcadas y se basa en la sublimacin, que ocurre en tres fases; las clulas son sometidas a una congelacin de temperatura de -196 C y posteriormente se introduce a una cmara de vaco para realizar la separacin del agua por sublimacin. Sin embargo las clulas sufren una inactivacin que se produce sobre la etapa de congelacin, el 60-70% de las clulas que sobrevivieron a la etapa de congelacin pueden sobrevivir al momento de la hidratacin. Durante la congelacin, la formacin de hielo extracelular provoca un aumento en la osmolalidad extra-celular, tan pronto como se forma hielo fuera de la clula en solucin, la clula comienza a deshidratarse. La eliminacin del agua ligada de las clulas bacterianas durante el proceso de secado conduce al dao de protenas de la superficie, pared celular y la membrana celular. El agua ligada juega un papel importante en la estabilizacin estructural y funcional de la clula. En consecuencia, la eliminacin del agua durante la desecacin puede conducir a la desestabilizacin de la integridad estructural, por lo que resulta la prdida o muerte celular de la bacteria (Meng et al, 2008). 2.5.2 Encapsulamiento por secado de aspersin El secado por aspersin es una unidad operacional, en la que una alimentacin liquida se pone en contacto con una corriente de gas (aire) caliente para obtener un producto seco 10
instantneamente. El producto seco puede obtenerse como un polvo granulado o aglomerado, lo cual depende de la naturaleza de la materia y las condiciones del secado por aspersin. El secado por aspersin es usado en la industria alimentaria para asegurar la estabilidad microbiolgica de los productos. El secado por pulverizacin produce un polvo muy fino (10-50 m) o partculas de gran tamao (2-3 mm) dependiendo del material de alimentacin y las condiciones de funcionamiento. El proceso de secado su principal funcin es eliminar el contenido de agua de la muestra (Gharsallaoui et al, 2007). 2.5.3 Encapsulamiento por emulsin y extrusin La tcnica de emulsin consiste en atrapar a bacterias en una solucin de agua / sistema de aceite. El material encapsulado, por ejemplo, alginato de sodio, se mezcla primero con las clulas bacterianas y la mezcla se suspende en un bao de aceite que contiene tween 80 como emulsificante. La emulsin se rompe mediante la adicin de CaCl2, y las microcpsulas formadas son recogidas por centrifugacin. Otros materiales, tales como la carragenina con KCl como interruptor de la emulsin, se pueden utilizar para encapsular los probiticos mediante la tcnica de emulsin. El tiempo de reaccin afecta a la formacin de microcpsulas y, por otro lado, la supervivencia de los microorganismos. El tamao de las cpsulas de alginato de calcio se ha observado que disminuye a medida que la concentracin de lauril sulfato sdico y Tween 80 incrementan. Tambin es posible controlar el tamao de las microcpsulas mediante el uso de una membrana de vidrio microporosa en el mtodo de emulsin (Rustran, 2012). En la tcnica de extrusin, una solucin hidrocoloide es preparada como primer paso, un inculo de microorganismos es adicionado y la solucin es dosificada a travs de una aguja de la jeringa o la boquilla. Las gotitas pueden caer en una solucin de endurecimiento. En esta tcnica se han utilizado alginato, carragenina, goma xantana con almidn de maz y protenas de suero de leche, como materiales de microencapsulacin para lactobacilos y Bifidobacterias. El tamao de las microcpsulas es afectado por el tamao de la boquilla de la geringa. Tambin el dimetro de las cpsulas de alginato se incrementan cuando la concentracin del alginato de sodio. 2.6. Microencapsulacion de microorganismos por secado de aspersin Investigaciones recientes consideran la encapsulacin de microorganismos como un proceso en el cual las clulas se mantienen dentro de una membrana de encapsulado para reducir daos celulares y ha sido ampliamente utilizado para proteger a los microorganismos como probiticos (Rustran, 2012). Las principales ventajas de la microencapsulacin por secado de aspersin incluyen alta velocidad de secado, baja temperatura de alimentacin, y mayor solubilidad de los productos, fcil operacin y control. Tal tcnica muestra una gran perspectiva en aplicacin industrial, especialmente para materiales sensibles al calor (Yu et al, 2008). Sin embargo el secado por aspersin 11
hablando estrictamente de los probiticos plantea, un gran obstculo, en la preservacin de la viabilidad durante y despus del secado. Los probiticos son sensibles al calor ya que la mortalidad se incrementa con la temperatura de secado y acenta tpicamente por encima de 51 C (Chvez et al, 2007). Sin embargo la exposicin de las partculas al calor es del orden de unos pocos segundos y la rpida evaporacin del agua de la superficie durante su solidificacin mantiene la temperatura del ncleo por debajo de 100C a pesar de las temperaturas elevadas durante el proceso de desecacin. Esto le confiere la principal ventaja del mtodo del secado por aspersin para su aplicacin a muchos productos termolbiles (enzimas, microorganismos, antioxidantes) (Gharsallaoui et al. 2007; Rusian, 2012). En la microencapsulacion de probiticos la cantidad de humedad al final del proceso de secado, debe contener una humedad por debajo de 4% que se requiere para la estabilidad de almacenamiento (Chavez et al, 2007).
2.7. Parmetros que afectan la viabilidad de los probiticos en la encapsulacin por secado de aspersin 2.7.1 Agentes encapsulantes La eleccin de un agente de encapsulacin es muy importante para la eficiencia de la encapsulacin y la estabilidad de las microcpsulas. Los criterios para la seleccin de un material de pared se basan en las propiedades fisicoqumicas de la sustancia a encapsular (porosidad, solubilidad) y del agente de encapsulacin (viscosidad, propiedades mecnicas), la compatibilidad entre los dos (el material de la pared debe ser insoluble y no debe reaccionar con el ncleo). Otro criterio a considerar es el tamao deseado de las microcpsulas, debido a que un agente de encapsulacin por s sola no puede tener todas las caractersticas requeridas, una combinacin de agentes de encapsulacin puede ser utilizada. La microencapsulacin de los ingredientes alimentarios se consigue a menudo con biopolmeros de diferentes fuentes. Algunos hidratos de carbono (por ejemplo, almidn, maltodextrinas, dextrosa), gomas (por ejemplo, goma rabe, goma de acacia, alginatos, carragenanos), protenas (por ejemplo, leche o suero de leche protenas, gelatina) (Meng et al. 2008; Nogueiro et al. 2013). El uso de goma de acacia en el medio de cultivo leche desnatada reconstituida (LDR) en el secado por pulverizacin a una temperatura de salida de aire de 100-105 C, dio lugar a una mayor supervivencia del probitico de L. paracasei NFBC 338, comparadas con el control que fueron cultivadas con 20% (p/v) de leche desnatada (LD), mostrando as 10 veces mayor supervivencia. El medio LDR parece ser un medio muy eficaz adecuado para el secado por pulverizacin de los cultivos probiticos. Solutos compatibles tambin han demostrado ser beneficos en la proteccin de la viabilidad de los probiticos en ambientes cidos. Por ejemplo, la presencia de 19,4 mM de glucosa result con una supervivencia hasta 6-log10 Lactobacillus rhamnosus GG, despus de 90 minutos de exposicin al jugo gstrico simulado a pH 2,0 en comparacin 12
con el control simple medio de leche desnatada. Estos aumentos de la supervivencia se debe a la unin de ciertos enlaces de los agentes encapsulantes en la membrana celular provocando rigidez celular y mayor resistencia a los sistemas adversos (Meng et al, 2008). Otro factor importante es la proporcin de agente ya que al aumentar la cantidad de los agentes encapsulantes (slidos totales en la mezcla) la eficiencia de microencapsulacion aumenta. Trabajos recientes reportan que la encapsulacin en microcpsulas de alginato- gelatina mejor exitosamente la sobrevivencia de L. casei ATTCC 393 y esta propuesta puede ser til en cultivos probiticos Por otra parte, los distintos materiales encapsulantes, como goma xantana y goma carragenato en particular, parecen ser tan eficaces como el alginato en la proteccin de las clulas probiticas durante el almacenamiento en condiciones ambientales (Rustran, 2012) 2.7.2 Temperatura del aire entrante El proceso de secado por pulverizacin consiste en la inyeccin de un gas (aire) caliente con una alta velocidad a temperaturas de hasta 200 C. En consecuencia, este proceso da como resultado la exposicin del medio de secado a altas temperaturas durante un corto perodo de tiempo, que pueden ser perjudiciales para la integridad de las clulas bacterianas vivas. El proceso de secado por aspersin tiene un efecto sobre la membrana celular ya que puede conducir a un aumento de la permeabilidad celular que puede resultar en la prdida de componentes intracelulares de la clula en el medio ambiente circundante. La membrana citoplasmtica se encuentra entre los sitios ms sensibles en las clulas bacterianas a las tensiones asociadas con el secado por aspersin, el ADN y ARN tambin son afectadas, lo que lleva a la prdida de la actividad metablica (Meng, et al, 2008). Varios estudios han informado sobre el rendimiento de una variedad de probiticos durante el secado por pulverizacin, y, en general, la tasa de supervivencia de cultivos probiticos depende de factores tales como la cepa utilizada, las condiciones de operacin del secado, la temperatura de entrada y salida, y el medio de encapsulamiento. Para encapsular L. paracasei NFBC 338, ha demostrado que la tasa de supervivencia fue > 80% durante el secado de aspersin usando leche descremada reconstituida con polisacridos, con una temperaturas de salida de 85-90 C (Gardiner et al., 2002), mientras que bajo condiciones similares (temperatura de salida de 80 C), Ananta y Knorr (2003) reportaron una tasa de supervivencia mayor a 60% para L. rhamnosus GG. Por lo tanto las diferentes especies bacterianas varan con respecto a la tolerancia al secado por aspersin.
2.7.3 Flujo de atomizacin y alimentacin Dentro de los objetivos de atomizacin es la creacin de una superficie mxima de transferencia de calor entre el aire seco y el lquido con el fin de optimizar las transferencias de calor y masa. Los parmetros atomizadores ejercen un efecto significativo 13
sobre la distribucin del tamao de partcula de los polvos resultantes. Con frecuencia es conveniente producir grandes partculas para favorecer la dispersin durante la reconstitucin. Las partculas pequeas suelen ser de difcil dispersin puesto que tienden a flotar sobre las superficies lquidas. El aumento del flujo de atomizacin es la que propicia el tiempo de exposicin entre la temperatura y la muestra, cuanto mayor es el flujo de atomizacin, la exposicin de las partculas al calor es del orden de unos pocos segundos por lo tanto el dao por temperatura puede ser disminuido (Golowczyc et al, 201l). 2.8. Modelacin y optimizacin del secado por aspersin La modelacin matemtica y optimizacin de un proceso permite aumentar la eficiencia del proceso, esta etapa es considerada como una de las etapas ms importantes en un proceso bioqumico (Bas et al.2007). El enfoque clsico para la optimizacin es la tcnica de un factor-un-tiempo, lo que consume mucho tiempo, por otra parte, esta tcnica no describe los efectos completos de los parmetros en el proceso. Debido a estos inconvenientes, los investigadores han buscado mtodos alternativos. Uno de los mtodos ms populares utilizados en las dos ltimas dcadas es la metodologa de superficie y respuesta (MSR) y las redes neuronales artificiales (RNA) (Bas et al.2007; Zhang et al. 2010). 2.8.1 Modelos empricos En la operacin de secado, la transferencia de calor y masa dentro de la pulverizacin participan simultneamente, aunque la transferencia de calor es el mecanismo que controla el proceso. Los secadores de aspersin y otros equipos el coeficiente de transferencia de calor, es la principal causa que refleja la cintica del proceso de secado. La importancia del coeficiente de transferencia de calor se debe: (a) es una cantidad fundamental para la evaluacin de los efectos hidrodinmicos asociados con una cierta configuracin de flujo y su influencia en la transferencia de calor; (b) que se utiliza para evaluar la capacidad de un dispositivo de secado o para la comparacin entre diferentes tipos de equipos. El coeficiente de transferencia de calor se puede estimar usando correlaciones experimentales (Riveros et al, 2009). Para un secador por aspersin, Kessler propone la siguiente correlacin para el nmero de Nusselt ecuacin 1: ( 1)
Donde el nmero de Reynolds (Rep) utiliza la velocidad de sedimentacin y el dimetro de la gota atomizada. La entrada y la salida de la humedad, el flujo de alimentacin, y el tiempo de permanencia de la partcula en el secador se pueden medir experimentalmente. Adems, el dimetro de partcula se puede calcular a partir de correlaciones para el tipo de 14
boquilla de pulverizacin. De acuerdo con Coulson y Richardson una correlacin, para estimar el dimetro de una gota de una boquilla de pulverizacin ecuacin 2 (Riveros et al, 2009):
Donde el nmero de flujo (FN) es una constante adimensional definida por la ecuacin 3:
Basndose en los resultados experimentales, la velocidad de secado (en un periodo de velocidad de secado constante) y la transferencia de calor se calculan con la ecuacin 4 y 5:
El flujo de conveccin de calor tambin se puede calcular como el producto entre el coeficiente de transferencia de calor global (determinado por el rgimen de dinmica de fluidos de la partcula) y la diferencia entre el calor de bulbo seco del aire y temperaturas de bulbo hmedo. Sin embargo, la transferencia de calor es debido a la conduccin y la radiacin: la conduccin puede ocurrir debido a la colisin de las partculas con la pared de la secadora, mientras que la radiacin es pequea en aquellos sistemas que operan a bajas temperaturas y por lo tanto es pequea. Siguiendo esta lgica, los diferentes mecanismos pueden agruparse en un coeficiente global de transmisin de calor ecuacin 6 (Riveros et al, 2009):
2 3 (4) (5) (6) 15
Donde es la media logartmica de la diferencia de temperatura entre el aire caliente- partculas hmedas y est dado por ecuacin 7 (Riveros et al, 2009):
Es importante tener en cuenta que al utilizar estas ecuaciones, el coeficiente de transferencia de calor slo puede ser aproximado, ya que es un fenmeno complejo y la cuantificacin de la zona real de evaporacin de la gota durante el secado no es simple. El coeficiente de transferencia de calor (U) no est relacionado con el volumen del secador por aspersin, ya que, en los sistemas el volumen de las partculas es del orden de 1% del volumen de la secadora en funcionamiento continuo. La transferencia de calor (U) con la expresin de coeficiente volumtrico es definida por Tamir ecuacin 8 (Riveros et al, 2009):
Esta expresin del coeficiente compara la capacidad del equipo en funcin de su tamao, utilizando esta relacin para predecir la capacidad de evaporacin de un prototipo de tamao ms grande (Riveros et al, 2009).
2.8.2 Mtodo de superficie y respuesta El mtodo de superficie y respuesta es un conjunto de tcnicas estadsticas y matemticas tiles para el desarrollo y mejora de un proceso especifico, en los que una respuesta de inters est influenciada por diversas variables que describen la relacin entre las entradas y la salida. El efecto entre las variables que interviene sobre el parmetro del valor ptimo lo representa en una grfica tridimensional. Esta metodologa experimental genera un modelo matemtico, que describe el proceso (Bas et al.2007; Meena et al. 2011). Sin embargo, los modelos basados en la metodologa de superficie y respuesta, son limitados por el nmero de relaciones entre un nmero de parmetros de entrada y de salida. Esto plantea una limitacin en el uso de los modelos para procesos altamente no lineales. Estas restricciones han provocado el desarrollo de modelos basados en redes neuronales artificiales (Youssefi et al. 2009). Un modelo en particular fue obtenido con un diseo experimental para la encapsulacin de Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495 y Lactobacillus rhamnosus (7) (8) 16
NRRL B-442 tomando como parmetros de entrada: Temperatura 100, 115 y 130 C. Con flujos de alimentacin: 10, 15, 20 mL/min y slidos totales: relacin malto dextrina 1:1, 1:1.5 y 1:2. (Anekella et al. 2013).
Donde RMD= la relacin malto dextrina F= flujo de alimentacin
Donde Te= temperatura de entrada RMD= relacin malto dextrina F= flujo de alimentacin
2.8.3 Redes neuronales artificiales El estudio de las redes neuronales puede orientarse en dos direcciones, bien como modelos del sistema nervioso y fenmenos cognitivos, o bien como herramientas para la resolucin de problemas prcticos (Martin et al, 2007). Por lo tanto considerando el segundo punto de nuestro inters, una red neuronal artificial (RNA), fue definida por Lin y Lee en 1996, como un sistema de computacin constituidos por un nmero de seales simples pero altamente interconectadas, como unidades de procesamiento de informacin denominadas neuronas artificiales, que intenta simular la capacidad de procesamiento neurolgico del cerebro humano (Taylan, 2006; Youssefi et al.2009). El fundamento del procesamiento de la red neuronal artificial es idntica a una neurona biolgica (figura. 1a) que recibe datos de entradas del exterior, procedentes de otras fuentes, las combina, analiza y genera una operacin no lineal en el resultado de salida figura. 1 (b), donde las entradas estn representadas por smbolo X(n). Cada una de estas entradas se multiplican por un peso de conexin y estos pesos estn representados por w. (Bas et al, 2007). Por lo tanto las neuronas artificiales son capaces de predecir por medio de aprendizajes utilizando la experiencia a partir de las seales o datos provenientes del exterior (Meena, 2011).
17
a) Neurona biolgica b) Neurona artificial. Figura1. Estructura de una neurona biolgica comparada con una red neuronal artificial. (a) Neurona biolgica y b) Neuronal artificial.
Estructura de un sistema neuronal artificial 2.8.3.1 Los sistemas de redes neuronales artificiales imitan la estructura de una neurona biolgica, con la intencin de construir sistemas de procesamiento sobre la informacin en forma paralela, distribuida y generativa, por tal razn le confiere la capacidad de simular. El elemento de partida ser una neurona, donde se organizara en capas; como resultado de las capas se crea una red neuronal artificial, junto con las interfaces de entrada y salida, constituirn el sistema global del proceso figura 2.
Figura 2. Estructura jerrquica del sistema de redes neuronales artificiales
Aplicacin de las redes neuronales en el secado por aspersin 2.8.3.2 La seleccin de la estructura de la red neuronal artificial ptima incluye la determinacin del nmero de capas ocultas, nmero de neuronas en cada capa, el nmero de enlaces entre las neuronas, esta es definida como la inmensidad de la red. Dentro de los mtodos de optimizacin de la estructura RNA se pueden dividir en los siguientes grupos: algoritmos de construccin, los algoritmos de destruccin, mtodos empricos, los mtodos combinados, algoritmos genticos, etc. Una red neural artificial RNA ptima por lo general contiene un menor nmero de neuronas y conexiones que permiten su uso en aplicaciones a en tiempo real (Krsi et al, 2013). 18
Las redes neuronales artificiales, tienen la capacidad de manejar mltiples variables independientes X y dependientes Y, al mismo tiempo. Por ello los conocimientos previos sobre la relacin funcional del proceso no necesitan ser conocidos. Pudiendo as modelar fcilmente relaciones no lineales entre las variables. Por lo tanto la RNA difiere de los mtodos computacionales tradicionales, por el estilo de procesamiento de datos, ya que procesan la informacin paralelamente. Por otro lado, los mtodos tradicionales son secuenciales y lgicos. De hecho, los mtodos tradicionales pueden aprender las reglas, pero la RNA aprende con el ejemplo (Bas et al, 2007; Mihajlovic et al, 2011; Krsi et al, 2013). Otra de las caractersticas de las RNA es que no generan una ecuacin modelo similar al MSR, pero su funcin como el cerebro humano le permite estimar la respuesta sobre la base de los datos entrenados en el intervalo investigado (Gimeno et al. 2002). Modelo neuronal de multica-Perceptron con algoritmos de retropropagacin 2.8.3.3 Las rede neuronal artificial se denomina procesador elemental como un dispositivo simple de caculo que, a partir de un vector de entrada procedente del exterior o de otras neuronas, proporciona una nica respuesta o salida. Los elementos que lo constituyen son los siguientes (figura 3).
Los conjuntos de entradas x j (t) y w ij , representan la intensidad de interaccin entre cada neurona. La regla de retropropagacin permite obtener, a partir de las entradas y los pesos, el valor del potencial postsinptico h i de la neurona ecuacin 9. () ( ()) La funcin ms habitual es de tipo lineal, y se basa en la suma ponderada de las entradas con los pesos sinpticos ecuacin 10. () La funcin de activacin proporciona el estado de activacin actual a i (t) a partir del potencial postsinptico h i (t)y del propio estado de activacin anterior a i (t-1) ecuacin 11. Figura 3. Modelo genrico de una neurona artificial (9) (10) 19
() (( ) ())
Funcin de salida, esta proporciona la salida global de la neurona y i (t) en funcin de su estado de activacin actual a i (t) ecuacin 12. y i (t)=F i (a i (t)) El modelo ms habitual para ejecutar las redes neuronales consiste en simular en un ordenador convencional, como un PC, haciendo uso de escritos en lenguajes de alto nivel Matlab,etc. ( Rajesh et al, 2006; Martin et al, 2007).
(11) (12) 20
3. Planteamiento del problema El secado por atomizacin aunque se considera un proceso tecnolgico complejo, es una tcnica que tiene una amplia gama de aplicaciones en la industria alimentaria y farmacutica. La comprensin del cambio de los parmetros que afectan a las propiedades fsico-qumicas del producto, es especialmente importante para la produccin. El secado por pulverizacin permite el ajuste de muchos parmetros del proceso, como consecuencia mejora los rendimientos del proceso y las caractersticas ptimas de partculas. La aplicacin de diseo de experimentos (DE) y la red neuronal artificial (RNA) es un nuevo enfoque en el estudio de los sistemas de secado, con importantes ventajas como la modelizacin y optimizacin. Una RNA homogeniza los valores de los parmetros utilizando la correlacin entre los parmetros medidos y los parmetros de destino. Los modelos de RNA han sido utilizados con xito en la prediccin de los problemas en bio- procesamiento y la ingeniera qumica. En el campo de secado, una RNA es una mejor alternativa a modelos empricos y semi-empricos convencionales basado en regresiones polinmicas y lineales, especialmente para los problemas que afectan a muchos parmetros, como el secado por aspersin. Varios modelos de RNA se han desarrollado y probado para el secado de atomizacin de materiales diversos, desarrollando un modelo que consiste en un RNA hbrido que incluye un modelo de regresin polinmica y una RNA estndar para la prediccin de la porosidad de 11 tipos de frutas y verduras. Otros investigadores han desarrollado modelos de RNA para el modelado de secado de rodajas de patata, zanahorias, tomate, Echinacea angustifolia, y la manzana (liofilizacin) (Hussain et al. 2005). Los probiticos son microorganismos no patgenos que, cuando se ingiere en cantidades adecuadas, ejercen una influencia positiva en la salud de su anfitrin (FAO / OMS, 2006). Lactobacillus plantarum pertenece al gnero de Lactobacillus. Es una especie heterognea y verstil que se encuentra en una variedad de nichos ambientales, incluyendo productos lcteos, carne, pescado y muchos vegetales. Si bien existen modelos de RNA para propiedades fsico qumicas de algunos alimentos, no existen modelos matemticos que simulen la supervivencia de microorganismos de inters como probiticos mediante RNA.
21
4. Justificacin Los probiticos, debido a sus beneficios para la salud, han sido incorporados a una gran variedad de productos lcteos, como yogures, quesos, helados, leche en polvo y postres lcteos congelados. Sin embargo, todava existen varios problemas con respecto a la disminucin de la viabilidad de las bacterias probiticas durante el secado, durante el almacenamiento y durante la vida de anaquel de los productos. La microencapsulacin de bacterias probiticas por secado de atomizacin puede ser utilizada para mejorar la viabilidad durante el procesamiento (Anil et al. 2007). Por lo tanto, es importante identificar los parmetros ptimos y las condiciones de procesamiento para asegurar la conservacin o mejora de la calidad del producto. La aplicacin de RNA es un nuevo enfoque en el estudio de los sistemas de secado de atomizacin para la optimizacin (Tijana et al. 2011). En la modelacin matemtica de la viabilidad del probitico por secado de aspersin mediante RNA no hay trabajos reportados, por lo tanto la novedad del presente trabajo es la aplicacin de una RNA para la prediccin de la viabilidad microbiana que con lleva a la optimizacin de las variables del proceso de secado.
22
5. 0bjetivos 5.1 Objetivo general Simular la viabilidad de Lactobacillus plantarum despus del secado de aspersin empleando una red neuronal de retropropagacin. 5.2 Objetivos especficos Evaluar el efecto de las variables de proceso sobre el rendimiento y viabilidad de Lactobacillus plantarum despus del secado por aspersin.
Disear la estructura arquitectnica de la red neuronal artificial multica Perceptron con el algoritmo retropropagacin.
Validar la simulacin de la red neuronal con nuevos datos experimentales.
23
6. Materiales y mtodos 6.1 Reactivacin de la cepa Lactobacillus plantarum La cepa Lactobacillus plantarum previamente aislada de la taberna ser donado por el Instituto Tecnolgico de Tuxtla Gutirrez del laboratorio de investigacin que fue aislada de la taberna. Los cultivos stock se encuentran conservados en 40%(v/v) de glicerol a - 18C. La cepa se reactivar en un medio de cultivo MRS (DIBICO). Se prepararn 250 mL de medio de cultivo MRS para transferir dos tubos de stock que contiene la cepa, incubar por 12 h a 35C. Transferir 10%(v/v) de inculo a un matraz de 25 mL, se incubara 35C, agitacin de 80 rpm por 24 h. El medio de cultivo se centrifugar a 8000 rpm a 25C durante 10 min. para separar la biomasa y se lavarn con agua estril (Golowczyc et al, 2009; Riveros et al, 2009; Gonzales, 2012). Se tomara 1 mL del cultivo, para realizar diluciones seriadas del orden de 10 -6 , tomar 0.1 mL de la dilucin de 10 -4 y 10 - 6 , y se sembrarn por la tcnica de vaciado en placa en medio de cultivo agar MRS utilizando perlas de ebullicin, incubar a 35C por 48 h. La cuantificacin del crecimiento se llevar a cabo mediante las unidades formadoras de colonias por mililitro (Gonzales, 2012). 6.2 Microencapsulacion por secado de aspersin Se preparar la mezcla de emulsin Lactobacillus plantarum/ agente encapsulante, los agentes encapsulantes sern maltodextrina (MD) 30% (p/v) y alginato de sodio (AL) 3%(p/v), cada agente se rehidratar con agua esterilizada a 40C, se mezclarn ambas soluciones en una relacin de 60- 40% (v/v), y se esterilizar la mezcla de solucin a 121C por 15 min. El pellet se mezclar con el agente encapsulante en una relacin de 1:1 en un matraz de 250 mL, a 7200 rpm por 2 minutos. Se emplear el equipo de secado por aspersin BUCHI en el laboratorio de investigacin del Instituto Tecnolgico de Tuxtla Gutirrez. El secado de la solucin se realizar utilizando una temperatura del aire entre 100 y 160C y flujo de alimentacin de 3 y 12 mL/min. El polvo obtenido despus del secado se almacenar en bolsas selladas al vaco (Su et al. 2007; Ding et al. 2009; Rustran, 2012) en condiciones de refrigeracin y congelacin. 6.3 Determinacion de la supervivencia de Lactobacillus plantarum despus del proceso de secado por aspersin Con base a la tcnica reportada por Riveros et al (2009) y Rustran (2012), se rehidratar el polvo obtenido despus del proceso de secado con 9 mL de una solucin Ringer estril. Se realizarn diluciones seriadas en tubos de ensaye con agua peptonada estril, hasta el orden 10 -6 . 0.1 mL de las diluciones sern sembradas en cajas de petri conteniendo agar MRS y se incubarn por 72 h a 37C. Se calcular el porcentaje de supervivencia de Lactobacillus plantarum despus del proceso de secado mediante la ecuacin 1. 24
Donde N (UFC/mL) es el nmero de microorganismos determinados al final del proceso y Ni (UFC/mL) nmero de microorganismos determinados antes del proceso. 6.4 Determinacin del rendimiento del proceso Para determinar la eficiencia de microencapsulacin se utilizar la ecuacin 2, reportado por Su et al. 2007.
6.5 Determinacin de la actividad de agua (aw) Para la determinacin de aw se utilizar el equipo medidor de actividad de agua HigroPalm Rotronic 6.6 Determinacin del color de la particula Para la determinacin del color de la muestra se emplear el equipo ColorTec PCM/PSM. El ndice de blancura (IB) puede ser calculado por la siguiente ecuacin (3).
Donde L es la luminosidad que va de 0 (negro) a 100 (blanco). El valor de a (rojo-verde) donde los valores positivos son rojos y los valores negativos son verdes y 0 es neutral. El valor colorimtrico b (amarillo-azul) donde los valores positivos son amarillos, los valores negativos es azul y 0 es neutral (Su et al. 2007; Anekella et al, 2013).
6.7 Condiciones de almacenamiento La cepa Lactobacillus plantarum despus del proceso de secado sern almacenados en condiciones de refrigeracin entre 4-8 o C y en congelacin a -18 o C y se determinar la (1) (2) (3) 25
viabilidad cada mes mediante el conteo de unidades formadoras de colonias con diluciones seriadas en agua peptonada (apartado 3.0).
7. Diseo experimental 7.1 Superficie y respuesta Se emplear un diseo factorial 3 2 con tres replicas en el punto central, generando un total de 12 experimentos completamente al azar (Tabla 1). Todos los resultados sern analizados mediante un anlisis de varianza con un P . Se emplear la metodologa de superficie de respuesta para optimizar el proceso de secado que permitir generar un modelo polinomial. FT F T F T Yk k k k k k k
2 2
Donde k son los coeficientes a identificar, T la temperatura (C); F flujo de alimentacin (mL/min). Tabla 3. Diseo factorial 3 2 con tres replicas en el punto central 7.1 Tratamiento Temperatura (C) Flujo (ml/min) 1 100 3 2 130 12 3 130 3 4 160 3 5 100 7.5 6 160 7.5 7 100 12 8 130 7.5 9 160 12 10 130* 7.5* 11 130* 7.5* 12 130* 7.5* * Punto central
(4) 26
7.2 Diseo de red neuronal artificial Se emplear la red neuronal artificial perceptrn de retroalimentacin (feed-forward- MLP), con el algoritmo de retropropagacin (BP) para desarrollar el modelo de prediccin. Ya que su capacidad est documentada para modelar cualquier funcin (Hornik, Stinchocombe, & White, 1989; Heinzow y Tol, 2003). Consistir en dos capas de entradas, la temperatura y el flujo de alimentacin, las variables de respuesta sern, % de supervivencia, aw, rendimiento y color de la mezcla generando asi 4 capas de salida. Por lo tanto se tiene dos capas de entrada y 4 capas de salida (figura 4).
Para determinar el nmero de capas ocultas se seguir la metodologa Chegini, et al (2008), el ajuste de los parmetros de ANN incluido el nmero de capas y las neuronas ocultas, el tipo de funcin de transferencia, tasa de aprendizaje, el impulso, y el nmero de patrones. El primer paso ser trabajar con modelos de redes de BP. Se seleccionarn el mejor modelo basado en la precisin de la prediccin. El segundo ser trabajar con el modelo para encontrar el nmero ptimo de las pocas y la funcin de activacin. El tercer paso ser encontrar el valor de aprendizaje ptimo y los valores de impulso. Para calcular la exactitud del modelo neuronal se evaluara mediante el clculo de error absoluto medio (MAE) para cada valor de salida ecuacin 5.
Donde n es el nmero de datos, X M y X P son los valores de medicin, prediccin del proceso y los parmetros del producto, respectivamente.
Figura 4.0. Nmero de capas en la entra y salida (5) Supervivencia 27
7.3 Validacin de la red neuronal con datos experimentales En la validacin se empleara los datos de la red neuronal con las mejores predicciones que se encuentren dentro del rango de 70-100% de supervivencia de los probiticos, y el rendimiento, se comprobara con los datos experimentales que se obtendr con la parte experimental en el secado por aspersin tal como en el aparatado 2.0, se realizara por triplicado. Se comprobaran las medias mediante un anlisis de varianza con un valor de P 0.05.
28
8. Cronograma de actividades
2013 2014 2015 Actividades Ago Sep Oct Nov Dic Ene Feb Mar Abr May Jun Jul Ago Sep Oct Nov Dic Ene Feb Mar Abr May Jun Jul Ago Revisin bibliogrfica Reactivacin de la cepa Preparacin del inculo Desarrollo del experimento Diseo y evaluacin de la red neuronal Validacin de la red neuronal Anlisis de resultados Redaccin de tesis Redaccin de articulo Obtencin de grado
Actividades concluidas Actividades por realizar
29
9. Bibliografa Amiri, Z et al., 2010. Development of acidophilus milk via selected probiotics & prebiotics using artificial neural network. Advances in Bioscience and Biotechnology, 1(3), 224-231.
Ba, D et al., 2007. Modeling and optimization II: Comparison of estimation capabilities of response surface methodology with artificial neural networks in a biochemical reaction. Journal of Food Engineering, 78(3), 846-854.
Chvez, B et al., 2007. Drying of probiotics: optimization of formulation and process to enhance storage survival. Drying Technology, 25(7-8), 1193-1201.
Chegini, G., et al 2008. Prediction of process and product parameters in an orange juice spray dryer using artificial neural networks. Journal of food Engineering, 84(4), 534-543.
Desai, K et al., 2006. Optimization of fermentation media for exopolysaccharide production from Lactobacillus plantarum using artificial intelligence-based techniques. Process Biochemistry, 41(8), 1842-1848.
Desai, K et al., 2008. "Comparison of artificial neural network (ANN) and response surface methodology (RSM) in fermentation media optimization: case study of fermentative production of scleroglucan." Biochemical Engineering Journal 41.3 (2008): 266-273.
Garcia, Gimeno et al., 2002. Improving artificial neural networks with a pruning methodology and genetic algorithms for their application in microbial growth prediction in food. International journal of food microbiology, 72(1-2), 19-30.
Geethalakshmi, S et al., 2010. Artificial neural network based soft sensor for fermentation of recombinant Pichia Pastoris. In Advances in computer engineering (ACE), 2010 International Conference on (pp. 148-152). IEEE.
Ghandi, A et al., 2012. Effect of shear rate and oxygen stresses on the survival of Lactococcus lactis during the atomization and drying stages of spray drying: A laboratory and pilot scale study. Journal of Food Engineering, 113(2), 194-200.
Golowczyc, M et al., 2010. Preservation of probiotic strains isolated from kefir by spray drying. Letters in applied microbiology, 50(1), 7-12. 30
Kailasapathy, K. 2002. Microencapsulation of probiotic bacteria: technology and potential applications. Current issues in intestinal microbiology, 3(2), 39-48. Lian, W et la., 2002. Survival of bifidobacteria after spray-drying. International Journal of Food Microbiology, 74(1), 79-86.
Martin Bonifacio., 2007. Redes neuronales y sistemas borrosos, captulo 1-2. Ed. Alfaomega. pp. 10-40.
Meena, G et al., 2011. Growth characteristics modeling of Bifidobacterium bifidum using RSM and ANN. Brazilian Archives of Biology and Technology, 54(6), 1357-1366.
Meng, X et al., 2008. Anhydrobiotics: The challenges of drying probiotic cultures. Food Chemistry, 106(4), 1406-1416.
Mihajlovic, T et al., 2011. Application of design of experiments and multilayer perceptron neural network in optimization of the spray-drying process. Drying Technology, 29(14), 1638-1647.
Neshat, N et al., 2011. An enhanced neural network model for predictive control of granule quality characteristics. Scientia Iranica, 18(3), 722-730.
Paz, R et al., 2012. Effect of heat treatment and spray drying on lactobacilli viability and resistance to simulated gastrointestinal digestion. Food Research International. 48, 748 754
Rajesh, K., 2006. Artificial neural network for solving paper industry problems: A review. Journal of scientific & industrial research, 65, 565-573.
Riveros, B et al., 2009. Spray drying of a vaginal probiotic strain of Lactobacillus acidophilus. Drying Technology, 27(1), 123-132.
Rustrin Irene. 2012. Microencapsulacin del consorcio microbiano de la taberna utilizando secado por aspersin. Tesis de maestra en ciencias bioqumicas del Instituto Tecnologico de Tuxtla Gutierrez. pp. 26,31.
Salar-Behzadi, S et al., 2013. Impact of heat treatment and spray drying on cellular properties and culturability of Bifidobacterium bifidum BB-12. Food Research International. 54,93101.
31
Sivapathasekaran, C et al., 2010. Artificial neural network modeling and genetic algorithm based medium optimization for the improved production of marine biosurfactant. Bioresource technology, 101(8), 2884-2887. Schuck, P et al., 2012. Spray drying of dairy bacteria: new opportunities to improve the viability of bacteria powders. International Dairy Journal. 31, 12-17.
Su L, et al., 2012. Development of an oriental-style dairy product coagulate by microencapsules containing probiotics and filtrates from fermente rice. Society of Dairy Techology, 60 (1), 49-55.
Taylan, O. 2006. Neural and fuzzy model performance evaluation of a dynamic production system. International journal of production research, 44(6), 1093-1105.
Youssefi, S et al., 2009. Comparison of artificial neural network (ANN) and response surface methodology (RSM) in the prediction of quality parameters of spray-dried pomegranate juice. Drying Technology, 27(7-8), 910-917.
Yu, C., et al., 2006. A neural network approach to predict survival/death and growth/no- growth interfaces for< i> Escherichia coli</i> O157: H7. Food microbiology, 23(6), 552- 560. Yu, C et al., 2010. Microencapsulation of Gram-Negative Bacteria by Spray Drying. International Journal of Food Engineering, 6(2), 1556-3758.