Jos Mara Snchez Montero,

Grupo de Biotransformaciones
(BTG). Departamento de Qumica
Orgnica y Farmacutica.
Facultad de Farmacia.
Universidad Complutense de
Madrid.
Plaza de Ramn y Cajal, s/n. Ciudad
Universitaria, 28040 Madrid.
Tel. 91 394 18 21 Fax 91 394 18 22
jsanchez@farm.ucm.es
Naturalmente el objetivo de este
artculo no es hacer un estudio
exhaustivo de todas las metodo-
logas de modelado molecular,
ni tratarlas siquiera desde un
punto de vista matemtico. El
gran auge del modelado mole-
cular y la biocatlisis tiene un
comn denominador y es el r-
pido avance producido en biolo-
ga estructural, lo que ha puesto
de manifesto la estructura tri-
dimensional de muchos bioca-
talizadores. Su conocimiento es
fundamental para ambas dis-
ciplinas. En muchas ocasiones
la prediccin de la actividad y
selectividad de un biocataliza-
dor ante un sustrato no natural
puede ser compleja. En este sen-
tido, el Modelado Molecular es
la herramienta que conecta estas
estructuras con las observacio-
nes experimentales. El Mode-
lado Molecular puede defnirse
como una descripcin simpli-
fcada o idealizada de un siste-
ma molecular o proceso entre
molculas, ideada para facilitar
clculos y predicciones. Desde
el punto de vista de la utilizacin
de estas enzimas o clulas para
llevar a cabo reacciones fuera
de su medio natural, es decir en
los seres vivos, la Biocatlisis se
enriquece cuando los fenme-
nos que generan y modulan la
actividad cataltica de las enzi-
mas se estudian con una visin
multidisciplinar. Las tecnologas
y herramientas moleculares han
avanzado rpidamente en los
ltimos 50 aos, de tal manera
que es posible plantear hipte-
sis, disear experimentos e in-
terpretar resultados utilizando
informacin tanto experimental
como terica.
Las Biotransformaciones se-
ran, aquellos procesos en los
que se emplean biocatalizadores
para la transformacin de sus-
tratos no naturales para dicho
biocatalizador y se obtienen
productos de alto valor aadido.
La Biocatlisis, al igual que la
qumica orgnica, que ha evolu-
cionado a partir de una descrip-
cin emprica a una disciplina
basada en el mecanismo y una
ciencia basada en la estructura,
est tambin evolucionando a
un diseo racional de la ciencia
basada en la estructura. El co-
mienzo de la biocatlisis estuvo
marcado por aproximaciones
empricas como el cribado,
(screening) o simples extrapo-
laciones de sustratos conocidos.
El modelado molecular puede
ayudarnos a responder a impor-
tantes preguntas que se plantean
al llevar a cabo un proceso bio-
catalizado: i) Explicar a nivel
molecular el comportamiento,
en muchos casos conocido de
una enzima. ii) Sugerir como
cambia la selectividad de una
reaccin por modifcacin del
sustrato, enzima o condiciones
de reaccin. iii) Predecir cuan-
titativamente el grado de este-
reoselectividad de una reaccin
catalizada por una enzima.
En la Tabla I podemos ver la
evolucin de las distintas tcni-
cas computacionales. Podemos
decir de un modo general, que
las dos estrategias seguidas ha-
bitualmente en modelado, son
las denominadas directas e in-
directas. En la primera se tienen
que conocer las caractersticas
tridimensionales de un receptor
generalmente a partir de datos
cristalogrfcos y se interpreta
la actividad o inactividad de las
molculas en trminos de com-
plementariedad con el receptor.
Esto es lo que se conoce por el
trmino de docking. Su objeti-
vo es la obtencin de la estructu-
ra del complejo receptor-ligan-
do de energa ms baja (se debe
cumplir que E < 0), y el anlisis
de las principales interacciones
implicadas en la unin frmaco-
receptor.
En la Figura 1, podemos ver
Metodologas de Modelado
Molecular en Biocatlisis para la
explicacin racional de resultados
InformtIca y LImS
La Biocatlisis ha encontrado en el Modelado Molecular una herra-
mienta de gran utilidad, pues permite interpretar de manera racional
el proceso de interaccin entre una enzima y su sustrato, y proporcio-
na datos fables que permiten predecir el comportamiento del siste-
ma. Por otra parte el auge experimentado por la Biologa estructural
ha permitido incrementar en los ltimos aos el nmero de estruc-
turas en 3D para su utilizacin en modelado. Sin duda, los grandes
avances en el campo de la Bioinformtica, asociados al empleo de
medios computacionales cada vez ms sofsticados, auguran que en
poco tiempo nuestra capacidad de extraer conclusiones racionales de
los procesos biocatalizados debera aumentar de forma considerable
en los prximos aos y este rea de investigacin debera experimen-
tar un considerable aumento.
80 MARZO/ABRIL11 farmeSpaa InDUStrIaL
farmeSpaa InDUStrIaL MARZO/ABRIL11 81
la interaccin que se producira
entre la acetil colinesterasa de
Torpedo californica (receptor)
y el cloruro de donepezilo (li-
gando), para el tratamiento de
las fases iniciales de la enferme-
dad de Alzheimer. El frmaco
bloquea el sitio cataltico de la
enzima lo que impedira que se
produjese la hidrlisis del neu-
rotransmisor acetilcolina que
es su sustrato natural. Este co-
nocimiento permitira disear
nuevos anlogos ms potentes.
La segunda estrategia, (es-
tructura tridimensional del
receptor no conocida), se basa
en el anlisis comparativo de
las caractersticas estructurales
de sustancias conocidas activas
o inactivas con el fn de defnir
un farmacforo (parte de la mo-
lcula que produce los efectos
fsiolgicos especfcos de un
medicamento) apropiado para
la actividad biolgica estudiada
siendo la aplicacin ms desta-
cada las relaciones cuantitativas
estructura actividad en tres di-
mensiones (QSAR 3D).
La prediccin cuantitativa in
silico de la actividad enzimtica
y la selectividad sigue siendo un
objetivo de gran inters en bio-
catlisis.
Los estudios de las dos lti-
mas dcadas han demostrado
cmo las enzimas pueden uti-
lizarse adecuadamente, tanto
en disolucin acuosa como en
entornos no convencionales
para stas, como por ejemplo
disolventes orgnicos, lquidos
inicos etc., lo que permite po-
ner en prctica nuevas metodo-
logas, incluso en los ambientes
ms extremos.
Las simulaciones molecula-
res nos permiten la construc-
cin de modelos virtuales de
sistemas qumicos. El principal
inters del modelado molecu-
lar en biocatlisis es el conoci-
miento a nivel molecular de las
interacciones enzima-sustrato.
En muchos casos persiguiendo
como meta, la prediccin de la
actividad y selectividad, como
comentamos anteriormente.
Hay distintos algoritmos que
nos sirven para predecir el Doc-
king de un sustrato en el centro
activo de una enzima, as como
para el clculo de su energa de
interaccin y para la simulacin
de su energa de solvatacin. La
aplicacin de estos mtodos a
la biocatlisis est basada en el
clculo de la energa libre de la
reaccin que a su vez deriva de
la simulacin del estado de tran-
sicin.
Un ejemplo de lo anterior-
mente dicho se muestra a con-
tinuacin:
En la acilacin de diferentes
(1,n)-alcanodioles utilizados
como intermedios en la prepa-
racin de una gran variedad de
compuestos de inters como
agentes antibacterianos entre
otros, se utiliz la lipasa de pn-
creas porcino mediante la rea-
lizacin de un docking manual
de los diferentes sustratos en la
estructura descrita del centro
activo, para el 2-fenil-1,3-pro-
panodiol (Fig 2A ). Se postul el
posible papel del residuo Phe216
como importante para el correc-
to reconocimiento del sustra-
to, ajustando las dimensiones
de los sustratos a un tringulo
cuyas dimensiones coinciden
con los residuos Ser153, His264
(correspondientes a la trada
cataltica) y la mencionada Phe
216. Un estudio ms refnado
de docking ha confrmado di-
cha hiptesis, al verifcarse las
distancias previstas y las interac-
ciones propuestas (Fig 2B).
Cuando los fenmenos son
demasiado complejos para ser
simulados, otros mtodos de
clculo, tales como la quimio-
metra pueden ser utilizados.
Quimiometra es la ciencia de
las mediciones realizadas sobre
un sistema o proceso qumico
sobre el estado del sistema por
aplicacin de mtodos matem-
ticos o estadsticos. Consta de
una serie de tcnicas heterog-
neas, entre las cuales el diseo
estadstico de experimentos y
anlisis estadsticos multiva-
riante son los ms importantes
para la aplicacin en Biocatli-
sis.
Un diseo estadstico experi-
mental permite conocer los fac-
tores que tienen mayor impacto
sobre los resultados. Usando
este mtodo, muchas variables
pueden ser estudiadas al mismo
tiempo, y utilizando esta infor-
macin, las condiciones expe-
rimentales se pueden mejorar
hasta llegar a las condiciones
ptimas.
Todos los mtodos estadsti-
cos multivariable tienen la ca-
pacidad de extraer la informa-
cin relevante contenida en un
sistema complejo descrito por
un amplio nmero de variables
(hasta varios miles) y esta in-
formacin se representa en un
espacio de dimensionalidad
reducida, haciendo as posible
su interpretacin. Los mtodos
estadsticos multivariable es-
Figura 1. Interaccin del cloruro de donepezilo bloqueando el centro activo de la acetilcoli-
nesterasa de Torpedo californica
Tabla I. Evolucin de las tcnicas computacionales en funcin del conocimiento de la estructura del ligando y el receptor.
Figura 2. (A) docking manual para el 2-fenil-1,3-propanodiol. (B) docking automtico para el
2-fenil-1,3-propanodiol.
A
B
82 MARZO/ABRIL11 farmeSpaa InDUStrIaL
tn basados en diferentes bases
matemticas. En particular los
mtodos QSAR usan las pro-
piedades estructurales de las
molculas (generalmente ad-
quiridas por mtodos de simu-
lacin) como la base de partida
para el anlisis estadstico, que
eventualmente encuentra co-
rrelaciones entre la estructura
molecular y respuestas medibles
experimentalmente. Debido a
su capacidad inherente de sim-
plifcar el anlisis de sistemas
complejos, la quimiometra en-
cuentra una amplia aplicacin
para el estudio y optimizacin
de procesos industriales.
1.-Modelado Molecular e
ingeniera racional de enzimas
Algunos de los logros ms rele-
vantes de las tcnicas computa-
cionales en Biocatlisis provie-
nen de la ingeniera racional de
enzimas. Esta aproximacin a
la evolucin del biocatalizador
es a veces vista en competen-
cia con la evolucin dirigida.
La modelizacin molecular es
muy adecuada para optimizar
interacciones enzima -sustrato
as como el mecanismo catal-
tico de la enzima. Sin embargo,
el diseo computacional en ge-
neral es mucho menos efciente
en la identifcacin de los efec-
tos de las mutaciones que se
encuentran alejadas del centro
activo: estas mutaciones pueden
todava alterar la estructura de
la protena y modifcar el com-
portamiento del catalizador o la
estabilidad de la enzima. En este
contexto, la evolucin dirigida
puede ofrecer una solucin al
problema.
Estudios recientes han pues-
to de manifesto la utilizacin
de los mtodos de simulacin
molecular en la induccin de
la promiscuidad cataltica de
las enzimas, es decir reacciones
para las que en principio un li-
gando no es el sustrato natural
de esa enzima.
2. Reconocimiento Enzima -
Sustrato y selectividad de la
enzima
Las tcnicas de modelizacin
molecular se han convertido
en herramientas de rutina en
la descripcin de las interaccio-
nes enzima-sustrato. Ms temas
de inters tales como la mejora
de la estabilidad de la enzima y
la modelizacin del efecto del
disolvente sobre las reacciones
biocatalizadas han sido investi-
gadas en una proporcin menor.
En el primer caso, esto se debe a
que la estabilizacin de la enzi-
ma se consigue ms a menudo
a travs de diferentes rutas (por
ejemplo, mediante evolucin di-
rigida).
La mayora de los estudios
computacionales realizados en
el campo de la Biocatlisis se
concentran en la prediccin de
la selectividad de la enzima. Esto
implica el clculo de la constan-
te de la selectividad (k
cat
/ K
M
),
que depende de la energa libre
del estado de transicin de la
reaccin. En este sentido, los de-
nominados mtodos ab initio de
la Mecnica Cuntica (QM) son
capaces de reproducir los datos
experimentales sin emplear pa-
rmetros empricos. Como es
lgico al aumentar el nmero de
ncleos y de electrones, es ma-
yor el nmero de funciones de
base precisas para construir los
orbitales moleculares (O.M.s),
con las consiguientes difculta-
des de clculo que acarrea, En
razn de la evaluacin completa
o no de todas las integrales elec-
trnicas, se puede hablar de m-
todos ab initio y de mtodos se-
miempricos. El inconveniente
principal de la utilizacin de los
mtodos ab initio es que la com-
plejidad del clculo restringe sus
aplicaciones a dianas qumicas a
nivel de unas pocas decenas de
tomos. Por tanto, la compleji-
dad de un sistema biocataltico
limita drsticamente la posibili-
dad de aplicar mtodos de QM,
forzando a la Qumica Compu-
tacional hacia el uso de mtodos
de Mecnica Molecular Clsica
(MM), basados en un conjunto
de ecuaciones y parmetros de-
nominados Campos de Fuerza).
La MM considera los tomos
de una molcula como un con-
junto de masas interaccionando
va fuerzas armnicas o elsti-
cas. Esto permite la simulacin
de macromolculas (es decir,
protenas), pero la naturale-
za emprica de los campos de
fuerza que deben ser correc-
tamente parametrizados, hace
que el tratamiento de cualquier
efecto electrnico sea inviable.
Se han ajustado empricamente
las ecuaciones y los parmetros
para que coincidan con los re-
sultados experimentales. A un
conjunto de ecuaciones y pa-
rmetros se denomina campo
de fuerza y la mayora de pro-
gramas de Modelado Molecu-
lar pueden elegir entre varios
campos de fuerza, como por
ejemplo MM2 (o MM3), AM-
BER etc.
Los mtodos mecacunti-
cos (QM) pueden superar estas
limitaciones, ya que se basan
en la solucin de la ecuacin
de Schredinger y aunque este
enfoque sigue siendo compu-
tacionalmente demasiado caro
para ser til como herramienta
de prediccin de rutina, el con-
InformtIca y LImS
Figura 3. Simulacin del complejo teradrico acil enzima, entre el R-ketoprofeno y el S-ketoprofeno.
farmeSpaa InDUStrIaL MARZO/ABRIL11 83
tinuo crecimiento del poder
computacional se espera que
hagan ms asequibles los clcu-
los de QM
Una solucin intermedia se
basara en la utilizacin de m-
todos hbridos de QM-MM, los
cuales tratan la parte reactiva
relativamente pequea de los
sistemas biocatalticos a nivel de
QM y todo lo dems por MM,
ofreciendo una buena alternati-
va de clculo.
3. Simulacin de anlogos del
estado de transicin
La cintica de las reacciones
biocatalizadas depende de la
energa libre de sus estados de
transicin, en las que las espe-
cies qumicas no son estables.
Sin embargo, los mtodos de
MM solo pueden usarse cuan-
do las estructuras son estables
y adems son incapaces de tra-
tar la ruptura y formacin de
enlaces. La estrategia ms co-
mn para modelar in silico, las
interacciones entre las enzimas
hidrolticas y sus sustratos a ni-
vel de la MM es la simulacin
del intermedio tetradrico, que
es una especie qumica estable
unida covalentemente al resi-
duo cataltico de la protena y
que imita el estado de transicin
de la reaccin.
En la Figura 3 se representa
el complejo acil enzima de la
lipasa de Candida rugosa, y el
R-y S-ketoprofeno. Para la ob-
tencin de estos complejos en
primer lugar se obtuvieron los
confrmeros de mnima ener-
ga por Mecnica Molecular y
posteriormente se realiz una
dinmica molecular.
En el caso del R-ketoprofeno,
el anillo de benceno mas exter-
no queda hacia fuera del cen-
tro activo compuesto por los
aminocidos Ser209, His449,
Glu341, mientras que en el S-
ketoprofeno el anillo queda ms
hacia el interior del centro ac-
tivo, y en este caso hay interac-
ciones -stacking con la Phe-296
y 345, mientras que en el caso
del R, solo con la Phe-245. Por
tanto podemos concluir que la
interaccin con el R es menos
favorable ya que los anillos es-
tn prcticamente dispuestos
perpendicularmente el uno
respecto del otro. De esta forma
podramos predecir la selectivi-
dad de esta enzima tanto en las
reacciones de hidrlisis de sus
steres como en la reacciones de
sntesis de los cidos correspon-
dientes.
En otros experimentos lleva-
dos a cabo por otros grupos se
ha visto que mediante la simu-
lacin de anlogos del estado de
transicin para la hidrlisis de
una serie de disteres se pudo
demostrar que la enantioselecti-
vidad es una funcin de la longi-
tud de la cadena del cido.
4. Descripcin GRID de la
naturaleza qumica del centro
activo
El enfoque GRID que comple-
menta la simulacin de anlogos
del estado de transicin permite
una descripcin ms precisa de
la interaccin enzima-sustrato
y fue aplicado en el estudio de
la selectividad de la penicilina
G amidasa (PGA). Adems de
proporcionar directrices para el
acoplamiento de los sustratos en
el centro activo de la enzima, la
visualizacin de los campos de
interaccin molecular (MIF)
generados por diferentes sondas
(hidrofbicas, dadores de enla-
ces- H, aceptores de enlaces-H
y grupos cargados) permiti
una exploracin fcil y rpida
de la naturaleza qumica del
centro activo, consiguiendo as
un esquema completo de los
requerimientos estructurales del
sustrato para el reconocimiento
ptimo del mismo. Adems, el
estudio estableci las normas
generales para la enantiodiscri-
minacin ilustrando cmo los
enantimeros tienen diferentes
interacciones con dos porcio-
nes qumicamente distintas
del centro activo. Las tasas de
acilacin determinadas experi-
mentalmente fueron utilizadas
para validar el modelo, que pro-
porciona slo una prediccin
cualitativa.
El Docking con los cidos S
y R-ketoprofeno confrm los
resultados predichos en el apar-
tado anterior, ya que la energa
de interaccin fue ms favorable
en el caso del S y la distancia
respecto al residuo cataltico fue
menor en el S-ketoprofeno que
en el R (2,96 del S frente a 9
del R como puede apreciarse
en la fgura.
Aunque en los ejemplos ex-
puestos hasta ahora se alcan-
zaron buenos resultados en la
racionalizacin de las estrategias
experimentales, todos fallan en
hacer una prediccin cuantita-
tiva de la selectividad de la en-
zima, incluso cuando el anlisis
GRID se combina con aproxi-
maciones al anlogo al estado
de transicin.
Esta limitacin se debe a que
todos los enfoques descritos se
basan en varias aproximaciones
signifcativas.
Figura 4. Docking automtico entre R-ketoprofeno y el S-ketoprofeno y el centro activo de la
lipasa de Candida rugosa.
Figura 5. Superposicin de confrmeros del R-ketoprofeno en el centro activo de la lipasa
donde se pone de maniesto las diferentes orientaciones del sustrato.
84 MARZO/ABRIL11 farmeSpaa InDUStrIaL
El primer problema se puede
achacar a la naturaleza simplif-
cada de los clculos del campo
de fuerza empleado. Por otra
parte, el segundo gran proble-
ma viene del hecho de que las
pequeas diferencias de energa
originan grandes variaciones en
la selectividad, que pueden ser
enmascaradas por las grandes
fuctuaciones causadas por el
movimiento normal de las pro-
tenas.
5. Prediccin de la
enantioselectividad de la
enzima por mtodos de
Mecnica Cuntica y / o
Mecnica Molecular
El primer y ms clsico estudio
sobre la prediccin cuantitativa
de la diferencia de energa libre
entre los dos intermedios tetra-
dricos de dos enantimeros fue
descrito por Colombo y cols. en
la resolucin de una mezcla ra-
cmica de 1-feniletanol por aci-
lacin catalizada por subtilisina.
El enfoque consisti en un mo-
delo con todos los tomos con
solvatacin explcita completa,
energa libre de perturbacin
(FEP), simulaciones de MD
(dinmica molecular), y cargas
atmicas derivadas de metodo-
logas de QM y /o MM.
Los resultados en ese estu-
dio de 1999 probablemente re-
presentan la mejor prediccin
cuantitativa de la enantioselec-
tividad descrita hasta ahora en
la bibliografa, pero a pesar de
todo, la tasa de error an puede
considerarse como elevada. Sin
duda, la principal difcultad a la
hora de llevar a cabo una pre-
diccin cuantitativa adecuada
de la enantioselectividad deri-
va del hecho de que, aunque se
pueda establecer de una forma
muy precisa cual es la energa
libre del estado de transicin del
enantimero preferentemente
reconocido dentro del centro
activo, el otro enantimero
puede tener diferentes tipos de
orientaciones, que implican in-
teracciones con diferentes zonas
del centro activo como se puede
visualizar en la Figura 5.
Correlacin entre la selecti-
vidad de la enzima y descripto-
res moleculares
Dado que el clculo preciso
de la energa libre de una reac-
cin biocatalizada sigue siendo
una tarea difcil, el desarrollo
de las alternativas ms simples
y directas es un rea activa de
investigacin.
Cabe sealar que para que
una herramienta de prediccin
sea atractiva debe ser competiti-
va con el tiempo empleado en el
laboratorio para realizar un ex-
perimento. En general, no hay
motivos para esperar dos meses
para la prediccin de una medi-
da que puede ser realizada expe-
rimentalmente en dos semanas.
En este sentido, los mtodos
de MD, FEP, y QM no son pro-
bablemente los ms apropiados
para el desarrollo de modelos de
prediccin, al menos a la luz de
los instrumentos de clculo co-
mnmente disponibles.
Como consecuencia, varias
estrategias alternativas se han
desarrollado, destinadas a sim-
plifcar clculos y evitar el cl-
culo de la energa del estado de
transicin de la reaccin.
Estas ideas se han aplicado en
el estudio de enantioreconoci-
miento de alcoholes terciarios
por carboxilesterasas. Demos-
traron cmo una prediccin
cuantitativa de la enantioselecti-
vidad se puede realizar evitando
el clculo de la energa libre del
estado de transicin.
El anlisis geomtrico de los
intermedios tetradricos, cons-
truido por Docking manual y
simulaciones de MD, puso de
manifesto la correlacin cuan-
titativa entre la enantioselecti-
vidad y un descriptor geom-
trico nico, defnido como la
distancia entre el nitrgeno de la
histidina cataltica y uno de los
tomos de oxgeno del sustrato.
Aunque la validez de este tipo de
descriptores no se puede asumir
como general, la identifcacin
de correlaciones similares en di-
ferentes sistemas biocatalticos
representa una ruta original y
sencilla para la prediccin de la
enantioselectividad en un plazo
razonable de tiempo.
6. QSAR 3D para la prediccin
de la enantioselectividad
Los mtodos QSAR 3D (relacio-
nes cuantitativas estructura-ac-
tividad en tres dimensiones) uti-
lizan los datos provenientes de
simulaciones moleculares como
entrada para el anlisis estads-
tico multivariante y represen-
tan la fusin entre el Modelado
Molecular y la Quimiometra.
Aunque el uso de QSAR 3D est
bien establecido en el diseo de
frmacos, la aplicacin de estos
mtodos en Biocatlisis se ha
llevado a cabo no hace muchos
aos. Los trabajos pioneros de
Tomi y cols representan un
ejemplo de cmo las prediccio-
nes cuantitativas de k
cat
/ K
M
son
viables a travs de un enfoque
QSAR 3D, que correlaciona los
descriptores sistema qumico
con los datos experimental-
mente medibles. La prediccin
cuantitativa de la enantioselec-
tividad de la lipasa de Bulkhol-
deria cepacia se logr mediante
el desarrollo de un mtodo en el
que la energa libre de unin se
calcula de manera aproximada
a travs de una combinacin li-
neal de la energa de interaccin
del complejo enzima-sustrato
y la superfcie polar y no polar
accesible al disolvente. El peso
de cada parmetro se calcul
por anlisis PLS, y el alto coef-
ciente de correlacin de predic-
cin (Q2 = 0,84) confrma la
validez de la aproximacin. Por
otra parte, el QSAR 3D tambin
puede emplearse en Biocatli-
sis en sistemas en los cuales no
se conoce la estructura tridi-
mensional del biocatalizador,
mediante el empleo de estudios
CoMFA (acrnimo de Compa-
rative Molecular Field Analysis).
Aplicando esta metodologa, se
pudo predecir la estructura del
sustrato modelo en la biorre-
duccin de diferentes cetonas
empleando clulas enteras de G.
candidum y S. octosporus, repre-
sentados en la Figura 6. El cdi-
go de colores es el que sigue: i)
Zonas de bajo impedimento es-
trico (verde). Son zonas donde
la presencia de restos qumicos
del sustrato favorece la interac-
cin enzima-sustrato. ii) Zonas
de alto impedimento estrico
(amarillo). Son zonas donde la
presencia de grupos en el sus-
trato disminuye la afnidad de la
ADH por el sustrato. iii) Zonas
electrostticas: rojas, donde una
elevada densidad electrnica
InformtIca y LImS
Figura 6. Aplicacin del mtodo COMFA para la prediccin de las zonas de reconocimiento de
la enzima utilizando diferentes sustratos.
farmeSpaa InDUStrIaL MARZO/ABRIL11 85
favorece la interaccin y azules
donde una elevada densidad
de carga negativa desfavorece la
interaccin. La principal ventaja
de esta metodologa para mode-
lar el centro activo de una enzi-
ma desconocida es que permite
predecir, sin siquiera haberla
aislado.
7. Estudio del efecto de los
disolventes.
El efecto de la solvatacin debe
ser estudiado ya que el Mode-
lado Molecular debe intentar
interpretar y predecir resultados
experimentales y los procesos
biocatalticos se llevan a cabo en
presencia de disolventes.
Inicialmente, la mayora de
los clculos de modelado inclu-
yen las molculas de agua que se
encuentran en la estructura del
cristal, pero no las molculas de
agua adicionales del disolvente,
cuyo efecto generalmente se si-
mula utilizando un parmetro
dielctrico dependiente para
intentar imitar la solvatacin.
Ke y cols. utilizaron un mtodo
mejorado para simular el agua
disolvente, un modelo electros-
ttico continuo, pero los resul-
tados fueron similares a los ob-
tenidos del modelo ms simple.
Este tratamiento incompleto de
solvatacin es claramente una
aproximacin. Est claro que el
disolvente puede cambiar la se-
lectividad de la enzima, aunque
existe an desacuerdo sobre por
qu esto ocurre.
Una de las posibles explica-
ciones propuesta atribuye la ca-
pacidad de estereodiscrimina-
cin a la diferente solvatacin de
los complejos diastereoisom-
ricos enzima-sustrato. En este
sentido, Ke y Klibanov estudia-
ron la enantioselectividad de la
-quimotripsina en la acilacin
de un diol proquiral, encontran-
do que el estado de transicin
que conduca hacia la acilacin
en el hidroxilo pro-R colocaba
un resto de 3,5-dimetoxifeni-
lo en un bolsillo de la enzima,
mientras que el estado de tran-
sicin conducente a la acilacin
en el hidroxilo pro-S dejaba un
resto arilo expuesto hacia el di-
solvente. La propuesta de estos
autores correlacionaba la enan-
tioselectividad observada con
los coefcientes de actividad ter-
modinmica de la zona arom-
tica expuesta, no como una pre-
diccin cuantitativa, sino una
correlacin directa en el sentido
de mejor solvatacin de partes
expuestas, mayor enantioselec-
tividad. Sin embargo, este m-
todo no pudo ser extrapolado a
otros sustratos.
La capacidad de ciertas en-
zimas para trabajar de manera
efciente en medios no acuosos
(disolventes orgnicos, lquidos
inicos o fuidos supercrticos)
es ampliamente conocida. Las
lipasas son enzimas especial-
mente interesantes, dado su
excepcional actividad en disol-
ventes orgnicos, por lo que el
estudio mediante Modelado
Molecular de su comportamien-
to en dichos medios constituye
un campo de trabajo muy ha-
bitual. Una aplicacin intere-
sante la constituyen las enzimas
termoresistentes. En este caso
cuando se utilizan para trabajar
en lquidos inicos, debido a la
naturaleza de estos disolventes
pueden resistir temperaturas de
hasta 120 C, muy por encima
de su temperatura de estabili-
dad. Nuestro grupo ha demos-
trado recientemente al estudiar
mediante dinmica molecular
el comportamiento de estas en-
zimas, concretamente con lipasa
de Bacillus thermocatenulatus en
el lquido inico tetrafuorobo-
rato de 1-etil-3-metil imidazo-
lio, que la energa necesaria para
romper un puente de hidrogno
es el doble en el caso del lqui-
do inico respecto del agua. La
estabilidad en disolvente inico
a alta temperatura se justifca
parcialmente por la alta energa
necesaria para la ruptura de los
puentes de hidrgeno disolven-
te-protena., aunque efectos hi-
drofbicos podran contribuir
muy signifcativamente a la es-
tabilidad. Para realizar este ex-
perimento ha sido necesaria la
construccin de una caja de mo-
lculas de lquido inico para
realizar la dinmica molecular
tal y como se ve en la Figura 7A,
as como una caja de molculas
de agua, Figura 7B. La tempera-
tura de simulacin fue de 363 K
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Figura 7. Caja de molculas de disolvente en la lipasa de Bacillus thermocatenulatus (A) liquido inico (B) agua