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Reverse Genetics in Arabidopsis

Arabidopsis thaliana, planta modelo
Mais de 33 000 genes preditos e aumentando
A gentica reversa o melhor mtodo para estudar a funo dos genes
Formaram-se consrcios para obter tais ferramentas
Existem hoje cerca de 426 000 linhas de mutantes de insero
de T-DNA/transposo
NASC
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Arabidopsis thaliana tem um papel fundamental na
investigao em plantas

Por ser uma planta modelo
O seu genoma ficou completamente sequenciado no ano 2000
Cerca de 33 000 genes preditos no TAIR9 genome release
Para alm da funo dos genes, interessa descobrir as vias
de regulao da expresso gnica e da sinalizao.
A investigao bsica em Arabidopsis gera conhecimento
cientfico que a base para o melhoramento de uma
produo sustentvel de alimentos.
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IMPORTANTE (back ground)

TRANSFORMAO j conhecida para a introduo de um gene de
interesse
Uma caracterstica codificada por um gene
Expressar ou remover esse gene numa clula Vector
Seleccionar os transformados resistncia (NptII resistncia kanamicina, por
ex.)
Frequncia de transformao entre 1 e 5 %.
Obter uma planta a partir de uma clula transformada Regenerao.

Introduzir os genes nas clulas (Vectores)
Agrobacterium
Um engenheiro gentico natural causa tumores Crown Galls
Transformao eficiente para a maioria das dicotiledneas
Problemtico com algumas monocotiledneas
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Barrel
Explosive
Charge
Vent
Stop plate
Petri Dish
with cultures
Projectile
DNA coated
pellets
Biolstica

Funciona!
No h Agrobacterium residual
Usado com diferentes tipos de DNA,
partculas revestidas e em diferentes
sistemas
INFILTRAO
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A mutagenese por
insero de T-DNA
o mtodo mais
utilizado em
gentica reversa.

Tambm utilizado
para activation
tagging (activao da
transcrio) e
promotor /gene
trapping
Pela utilizao de um
gene reprter.

Exemplos dos tipos de vectores
utilizados nas coleces de
mutantes de insero mais
utilizadas.



LB left border
RB right border
bla resistncia ampicilina em bactria
sul - resistncia sulfadiazina em plantas
nptII - resistncia kanamicina em plantas
uidA GUS
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T-DNA - plasmdeo Ti
So tambm inseridos genes de resistncia a
antibiticos, para permitir seleccionar as clulas
transformadas.
Virulence (VIR) genes
So activados e levam
transferncia do T-DNA
para a planta.
Tudo o que est entre
o left e o right borders,
transferido.
Alterao do plasmdeo
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Vectores binrios
Desenvolvidos para melhor
manipular o plasmdio. Os
genes da virulncia e o T-DNA
podem estar fisicamente
separados.

O plasmdeo com o T-DNA
pode replicar tanto em Agro
como em E.coli
Plantas para transformar
Cultura de Agrobacterium
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FLORAL DIP
Mtodo de
transformao mais
utilizado para
Arabidopsis
As protenas Vir protegem o T-DNA e
facilitam a sua incorporao no genoma da
planta
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Integrao do T-DNA no genoma
da planta
General transformation protocol
O/N Agro culture
Sterile explants
with dividing cells
- Flowers
Inoculate (mins-hrs)
(bacterial attachment)
Co-cultivate (days)
Transfer of t-DNA
Wash
Transfer to medium
with bactericidal
antibiotics (days)
Kill off Agrobacterium
Transfer to medium
with bactericidal
antibiotics plus
selective antibiotics
Kill off Agrobacterium
and select transgenic
cells
Transfer to
regeneration
medium plus
selective
antibiotics
Regeneration
of transgenic
plants
Transformation
Recovery of transgenic plants
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FST
FLANKING
SEQUENCING
TAG

A flanking sequence sempre dada a partir do primer do LB - left
border
Forward: the direction LB>plant flanking DNA sequence is in the 5 to 3direction. (plant
flanking sequence shown is in the same DNA chain as gene; ex. SALK_073950)
Reverse: the direction LB>plant flanking DNA sequence is in the opposite direction. (plant
flanking sequence shown is in complementary DNA chain relative to gene -> reverse
complement; ex. SALK_065930)
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Insero de transposo

Descobertos inicialmente no milho por Brbara
Mcclintock. A transposio um fenmeno
natural que ocorre in vivo jumping genes
so segmentos de DNA mobilizveis. Movem-se
directamente de um stio para outro no
genoma.
Possuem inverted repeats que so locais que vo ser reconhecidos pela
transposase.
Quando este elementos saltam podem inserir-se no meio de um gene,
inactivando-o.

Sistema Ac/Ds






Ds Dissociation elemento
com o gene da transposase
inactivo

Ac Activator transposase
funcional. Para Ds se mover, o
Ac tem que estar activo
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Gene para estudo
Aquisio da linha mutante
Anlise in silico
Germinao das sementes
Extraco de DNA
PCR
Electroforese
Seleco dos mutantes homozigticos estudo do fentipo


PROCEDIMENTO
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At5g14380 AGP6

Posio 54838-55290


At5g14380_AGP6 TATCATGCTTGGTTTATGACTCGAGTCTTGAAGAGTAGAAAAGGAAGAAAATTCGAACAT
At5g14380_AGP6 TGCAAATAAAATAAAGAGGAATTAAAAACTGCACTGCACATCAAACGATGATGACAAAAA
At5g14380_AGP6 AATGATGCATATAACACAAACAAAAAGATAGAATTAAAGAGAAGTTGTCTGTTTTCTAGC
At5g14380_AGP6 TCTGTCAGAACATTAACAAATGTCTTCGAAACCGTAAGCCCCAGAAAACTTCACCATGCA
At5g14380_AGP6 GAAGTTTGTATGTTTTGGACCTTTGGTAATGACTTGTGTGTCAGTTGTGTCTTCATATTG
At5g14380_AGP6 GGGTTTTAATTTGGGCTTAGTTCGAAAGTACAGTAAACTCTTTAAGATTGCCCAAAATGT
At5g14380_AGP6 ATTTTGAGACTCTAATTCTAATTTTCTGCAATACAATCAATGAATCAAACAAAAGTCAAA
At5g14380_AGP6 ATCTCAGTCTCAGCTACTAATATTAGTATTCAAAAAAAAAAAAATTGTGTACGAATCCAT
At5g14380_AGP6 AAATAGAAGAATTGGTTTCTATGCCTGTTTAATTTTAAAGTACTTTCTAAAAGTAGATTA
At5g14380_AGP6 TAAGATTCATCGTTTCTCTCATATCCATCAATTTCCCTAATTTTTCTCATCTTCAAAAAC
At5g14380_AGP6 ATATAAATTCACACCCCCATGTCTTATTCTTACATCCTAAAGCTTTTGCAGTATTTCTCC
At5g14380_AGP6 ATAGAATAAGAAAAATAAAACAAAAATAAATAAATAAAAAATACTGCTTTAGCTTTTGGA
At5g14380_AGP6 GTATCCTCCTTTTAATCTCAATAAAAAAACTATTAAAACAGAAAAAAAAATGGCACGTCA
At5g14380_AGP6 ATTTGTCGTTTTGGTTCTATTGACTTTAACTATCGCCACCGCTTTCGCCGCCGACGCTCC
At5g14380_AGP6 CTCAGCTTCTCCCAAAAAATCTCCATCACCCACTGCCGCACCAACCAAGGCTCCGACTGC
At5g14380_AGP6 GGCCTCTTCTCCAAAAGCATCTTCTCCGGCTGCCGAAGGACCCGTCCCCGAGGATGACTA
At5g14380_AGP6 CTCTGCCTCTAGTCCTAGCGACTCTGCTGAGGCACCTACCGTCTCCTCCCCACCGGCTCC
At5g14380_AGP6 CACCCCCGACAGCACTTCCGCCGCTGATGGACCAAGCGATGGACCCACTGCAGAGTCACC
At5g14380_AGP6 CAAGAGTGGTGCCGTGACAACTGCTAAGTTCTCTGTTGTCGGCACAGTCGCCACCGTCGG
At5g14380_AGP6 CTTCTTCTTCTTTTCTTTCTAAGTTAAGTCGTCCA-CGTTTTGCTTGGATGGATCAGAGA
At5g14380_AGP6 TTTGTATAATCTTTTGAGTTGAGGCCGTAAATTTATTTTATATATACGTTTATAAATCGA
At5g14380_AGP6 GATTAATTGGAGTAAATATAAACCTAAATGTCATTTTGAATTTGGTTAGAACAAATTTTC
At5g14380_AGP6 ATATTTTGTTTAATAAACTTATTTTTTTTGGAAATGCTTATGATTTGTGTGGTCTAATGG
At5g14380_AGP6 TCTTTTAGTTCCTATTGTCATGTGTTGTGAATTAGATATCATGAATGATATAAATGGATA
At5g14380_AGP6 TTTCTACATTTTT

AGP6
At5g14380
Posio 54838-55290

0 TATCATGCTTGGTTTATGACTCGAGTCTTGAAGAGTAGAAAAGGAAGAAAATTCGAACAT
60 TGCAAATAAAATAAAGAGGAATTAAAAACTGCACTGCACATCAAACGATGATGACAAAAA
120 AATGATGCATATAACACAAACAAAAAGATAGAATTAAAGAGAAGTTGTCTGTTTTCTAGC
180 TCTGTCAGAACATTAACAAATGTCTTCGAAACCGTAAGCCCCAGAAAACTTCACCATGCA
240 GAAGTTTGTATGTTTTGGACCTTTGGTAATGACTTGTGTGTCAGTTGTGTCTTCATATTG
300 GGGTTTTAATTTGGGCTTAGTTCGAAAGTACAGTAAACTCTTTAAGATTGCCCAAAATGT
360 ATTTTGAGACTCTAATTCTAATTTTCTGCAATACAATCAATGAATCAAACAAAAGTCAAA
420 ATCTCAGTCTCAGCTACTAATATTAGTATTCAAAAAAAAAAAAATTGTGTACGAATCCAT
480 AAATAGAAGAATTGGTTTCTATGCCTGTTTAATTTTAAAGTACTTTCTAAAAGTAGATTA
540 TAAGATTCATCGTTTCTCTCATATCCATCAATTTCCCTAATTTTTCTCATCTTCAAAAAC
600 ATATAAATTCACACCCCCATGTCTTATTCTTACATCCTAAAGCTTTTGCAGTATTTCTCC
660 ATAGAATAAGAAAAATAAAACAAAAATAAATAAATAAAAAATACTGCTTTAGCTTTTGGA
720 GTATCCTCCTTTTAATCTCAATAAAAAAACTATTAAAACAGAAAAAAAAATGGCACGTCA
780 ATTTGTCGTTTTGGTTCTATTGACTTTAACTATCGCCACCGCTTTCGCCGCCGACGCTCC
840 CTCAGCTTCTCCCAAAAAATCTCCATCACCCACTGCCGCACCAACCAAGGCTCCGACTGC
900 CACAACCAAGGCTCCTTCAGCTCCAACCAAGGCTCCAGCCGCCGCACCTAAATCATCTTC
960 GGCCTCTTCTCCAAAAGCATCTTCTCCGGCTGCCGAAGGACCCGTCCCCGAGGATGACTA
1020 CTCTGCCTCTAGTCCTAGCGACTCTGCTGAGGCACCTACCGTCTCCTCCCCACCGGCTCC
1080 CACCCCCGACAGCACTTCCGCCGCTGATGGACCAAGCGATGGACCCACTGCAGAGTCACC
1140 CAAGAGTGGTGCCGTGACAACTGCTAAGTTCTCTGTTGTCGGCACAGTCGCCACCGTCGG
1200 CTTCTTCTTCTTTTCTTTCTAAGTTAAGTCGTCCACGTTTTGCTTGGATGGATCAGAGAT
1260 TTGTATAATCTTTTGAGTTGAGGCCGTAAATTTATTTTATATATACGTTTATAAATCGAG
1320 ATTAATTGGAGTAAATATAAACCTAAATGTCATTTTGAATTTGGTTAGAACAAATTTTCA
1380 TATTTTGTTTAATAAACTTATTTTTTTTGGAAATGCTTATGATTTGTGTGGTCTAATGGT
1440 CTTTTAGTTCCTATTGTCATGTGTTGTGAATTAGATATCATGAATGATATAAATGGATAT
1500 TTCTACATTTTT



PRIMERS
AGP6_F1-GGCCTCTTCTCCAAAAGCAT
AGP6_F2-TGGGGTTTTAATTTGGGCTTA
AGP6_R1-TTGCTTGGATGGATCAGAGA
A vermelho est a
sequenciao feita a
partir do primer da
insero Ds-34

Blast (basic local
alignment search
tool) da sequncia
flanqueadora com o
gene
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Rapid gDNA extraction (in the lab)
Based on the method of Edwards et al. (Edwards et al., 1991. A simple and rapid method for the preparation of plant
genomic DNA for PCR analysis. Nucl. Acids Res. 19, 1349).
TE
Reaco de PCR
Lista de Componentes da reaco para 25 L Programa de PCR usado.
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3 primers
DNA
polimerase
Mg
2+
dATP
dTTP
dCTP
dGTP
AGP 6 F2 (Forward)
AGP 6 R1 (Reverse)
DS_3-4 (primer especifico para a
insero)

Procede-se realizao de uma electroforese em gel de
agarose a fim de se analisar os produtos de PCR obtidos.
PROCEDIMENTO - electroforese

Os tipos selvagem, mutante homozigtico e
mutante heterozigtico vo apresentar perfis
diferentes.
Wild-type - apenas uma
banda de maior dimenso
Mutante homozigtico -
apenas uma banda de
pequena dimenso
Mutante heterozigtico -
duas bandas
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PROCEDIMENTO :: PCR
Aps a extrao do DNA genmico, faz-se um PCR com 3 primers

2 especficos para a nossa sequncia Primer 3 um Forward e um
Reverse

Um para a insero que ser o LB ou Ds
Sem insert, o fragmento amplificado corresponde
ao intervalo entre os 2 primers do gene o Forward-
LP e o reverse - RP
Na presena do insert forma-se um fragmento
sensivelmente menor, que corresponde ao intervalo
entre o primer da insero e um dos do gene, que
dependendo da orientao o forward ou o reverse.
Com a insero, o fragmento entre os 2 primers do gene torna-se
demasiado grande para ser amplificado.
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wt
900 bp
Local de insero de T-DNA
Primer
Forward
Primer
Reverse
Primer especfico
para T-DNA
Primer
Forward
Primer
Reverse
500 bp
mut
T-DNA
Exemplo

Com 2 PCRs cada com 2
Primers

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If using RIKEN BRC lines (Ds transposon inserts):
Similar procedure but different insertion specific sequences (Insertion primer will be
Ds3-4)
http://rarge.gsc.riken.jp/dsmutant/Ds_PCR_primers.pdf
If using SALK T-DNA mutant lines:
Copy/paste available flanking sequences for each mutant line.
Go to T-DNA Express webpage (SiGnal), for info on primer design:
http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html
Design specific primers using Primer3 tool (or any other primer designing tool) -
http://frodo.wi.mit.edu/
Left border primer will be LB
LB
Ds 3-4
Electroforese em Gel de Agarose
Nota: Os gis de agarose (0,8 1% [p/v] em tampo TBE 1x [Trizmabase 40 mM, cido
actico glacial 10% e EDTA 10 mM]) com brometo de etdio 250 ng/mL.
A separao electrofortica foi feita em tampo TBE 1x. Aps electroforese os fragmentos de
DNA foram visualizados utilizando um transiluminador de UV. Como marcadores de
tamanhos moleculares foram utilizados o GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder .
Resultados:
M

g
D
N
A

W
T

g
D
N
A

m
u
t

P
l
a
n
t
a

1

P
l
a
n
t
a

2

P
l
a
n
t
a

3

P
l
a
n
t
a

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W
T

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Fig.: Gel electrofortico dos resultados observados aps tcnica de
PCR
Mutante homozigtico para a insero
Mutante heterozigtico para a insero
http://www2.fc.up.pt/agplab/