Integrantes: Karla Delgado, Daniel Tichy. Laboratorio Ingeniera gentica y biotecnologa Vegetal, BIT210. Profesor Miguel Ibeas.
Introduccin El estudio de los genes ha sido clsicamente estudiado para, con ayuda de tcnicas moleculares, situar y clonar genes de organismos cuyos fenotipos se presentan mutados en ciertos aspectos (1) . Sin embargo, el desarrollo de nuevas tcnicas, (como tilling, mRNAi o mutagnesis insercional, en la cual se enfocar este prctico), ha permitido generar una extensa base de datos de organismos, (por secuenciacin), por lo que conociendo ya la secuencia de genomas, se puede realizar una mutacin en sectores de ste y estudiar su implicancia en el fenotipo de los organismos mutados, estudio que es conocido como gentica reversa. Para la generacin de estas mutantes, se puede realizar mutagnesis con T- DNA, la cual se basa en la insercin de un fragmento de ADN por medio de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, fragmento que se encuentra codificado en un plsmido que se inserta en el genoma del organismo en cuestin de forma azarosa (2) . El uso de estos agentes insercionales permite la identificacin de genes mutados de manera relativamente sencilla, por medio de comparacin con el genoma de la base de datos o con el organismo silvestre, realizando adems tcnicas menos costosas como electroforesis (2) . La planta mutante estudiada en este prctico es de la lnea Salk_123659, que tiene una mutacin realizada mediante insercin de T-DNA en el gen Atg310800 que se encuentra en el cromosoma 3. (Ver figura 1). Este gen codifica para protena Bzip28, factor de transcripcin putativo atado a la membrana (4) . El objetivo de este prctico es realizar la genotipificacin de esta lnea mutante para as determinar si la insercin es de forma heterocigota u homocigota. Esto se realizar mediante PCR utilizando 3 partidores distintos, (uno para el borde RB o LB, y otros dos: uno forward y otro reverse). (5)
Figura 1. Representacin de la insercin de T-DNA en el gen At3g10800.
Materiales y mtodos Extraccin de material genmico Para la extraccin, se utiliz una planta de Arabidopsis thaliana que haba sido crecida y mutada previamente, realizndose una extraccin de DNA para la planta completa debido a que su tamao era reducido, asegurando as mayor cantidad de material gentico para extraer. Se homogeniz en 200 l de buffer TNE/SDS, (200 mM Tris-HCl pH 8, 250 mM NaCI, 25 mM EDTA pH 8, 0.5%SDS) durante unos minutos. Se realiz centrifugacin durante 5 minutos a 12000 rpm y se recuper el sobrenadante. Se agreg 200 l de isopropanol para precipitar el DNA presente y se realiz un vortex por 5 segundos. Para concentrar el material gentico presente en un pellet, se centrifug por 5 minutos a 12000 rpm y se elimin el sobrenadante. El pellet se lav con 200 l de Etanol 70%, y luego se centrifug por 5 minutos a 12000 rpm. Se elimin el sobrenadante, y en este paso, se deba mantener el tubo sobre papel durante una hora para asegurar una mayor pureza del material gentico obtenido. Finalmente, el pellet se resuspendi en 20 l de agua. Paralelamente, se realiz esta misma extraccin para la planta silvestre (WT), para que sirviera de control. Reaccin de PCR Para este paso, se agregaron 9 l de cada mezcla, (que se diferencian en los primers utilizados; un mezcla WT y una mezcla MT) y 2 l de DNA genmico extrado anteriormente. Cada tubo se marc como 4.1 (para la mezcla WT) y 4.2 (para la mezcla MT). Los contenidos de cada tubo se muestran en las tabla 1.
Mix Contenido Marca 1) 2) 10X buffer (+MgCl2) 2,5 l 10 mM dNTPs 0,25 l Taq polimerasa 0,2 l Agua 20 l DNA genmico 2 l 10 l Primer Scr659F 0,5 l 4.1 4.2 1) WT 10 l Primer Scr659R 0,5 l 4.1 2) MT 10 l Primer LBb1.3 0,5 l 4.2 Tabla 1. Se muestra la informacin de los tubos que contienen cada Mix utilizado en el prctico, Mix 1 WT y Mix 2 MT. El nmero 4 corresponde al grupo correspondiente, y se muestra que contena cada mix. Mix se refiere a mezcla.
El programa que se utiliz para la amplificacin fue el siguiente:
Desnaturalizacin inicial 94C 10 min Desnaturalizacin 94C 30 seg. Annealing 50C 30 seg. Extensin 72C 1 min 30 seg. Extensin Final 72C 10 min Realizndose 35 ciclos.
Las secuencias de los partidores utilizados se muestran en la tabla 2:
Partidor Secuencia
Scr659F
5' CGAACTACATTCATCATACAACACA 3'
Scr659R
5'CAACTATCTCTCTCACCATGACTAA 3'
LBb1.3 5'
5' ATTTTGCCGATTTCGGAAC 3' Tabla 2. Se muestran los partidores y su correspondiente secuencia usados en cada mix (ver tabla 1).
Electroforesis Se prepar un gel de agarosa al 1% en buffer TAE 1X, donde se carg 20 ul de cada muestras, (las mutantes realizadas por cada grupo con cada mix, y adems la extraccin realizada de la planta silvestre con cada mix), adems 5ul del marcador de peso molecular, (100 bp NEB DNA ladder). Se agreg 5 l de buffer de carga 6X a cada muestra y se carg en el gel, se encendi la fuente de poder y se corri el gel a 100 volt entre 30 y 40 minutos. Resultados Visualizacin de las ampliaciones PCR en gel de agarosa Tal como se explic previamente el material genmico extrado, que en total fue de 8 plntulas completas de Arabidopsis thaliana, 6 de ellas previamente transformadas y 2 de cepas silvestres, fue sometido a amplificacin por PCR usando las dos
mezclas de partidores previamente mezcla de partidores mencionadas en la tabla 1 y 2, con los 16 productos obtenidos se realiz una electroforesis, como se explic previamente, cuyos resultados fueron los siguientes: (Fig. 2A) De estos 16 productos, solamente 3 se amplificaron correctamente, 1.2(wt) 5.1 (wt) y 5.2. El primero mostr una banda de aproximadamente de 400pb y otra de 1000pb, la segunda mostr resultados similares y la tercera solamente mostr una banda de aproximadamente
400pb. De las 13 que no mostraron ninguna, una (3.2) mostr un degradado signo de fragmentacin. Los resultados esperados (Fig. 2B) difieren totalmente de los obtenidos pues se esperaban bandas de aproximadamente 500pb para la presencia del alelo silvestre y una banda de aproximadamente 200pb para el alelo mutante. La presencia de una sola banda es prueba de homocigosis y la presencia de ambas prueba de heterocigosis. Fig.2 A) Gel de electroforesis de agarosa al 1% de los fragmentos amplificados por PCR, de Arabidopsis thaliana, obtenidos con los partidores Scr659F y Scr659R en 1.1(wt),2.1, 3.1, 4.1, 5.1, 5.1(wt) y 6.1. Y con los partidores Scr65 Scr659F y LBb1.3 5' en 1.2, 1.2(wt), 2.2, 3.2, 4.2, 5.2, 5.2(wt) y 6.2. Por otra parte corresponden a plantas cepa silvestre 1.1(wt) 1.2(wt) 5.1(wt) y 5.2(wt) St corresponde al estndar de peso molecular 100 bp DNA Ladder de New England Biolabs inc. B) Gel de electroforesis de agarosa al 1% con los resultados esperados de los fragmentos amplificados por PCR, de Arabidopsis thaliana, obtenidos con los partidores Scr659F y Scr659R en los carriles wt y con los partidores Scr65 Scr659F y LBb1.3 5' en mut. Col-0 corresponde a la cepa silvestre, bZip28-1.5 corresponde a una lnea de mutantes insercionales homocigotos del gen Atg310800,bZip28-1.6 corresponde a una lnea de mutantes insercionales heterocigotos del gen Atg310800. L corresponde al estndar de peso molecular1 kb Plus DNA Ladder de OGeneRuler.
A B Discusin Los resultados en primera instancia parecen ser contradictorios, y los son, de los 16 productos esperados solo se obtuvieron 3, esto puede ser explicado debido a en primera instancia una extraccin de material gentico deficiente, ya sea porque en el proceso de homogenizacin se perdi la gran mayora de la muestra, porque no se recuper suficiente sobrenadante despus de la primera centrifugacin o porque se elimin el pellet junto con el sobrenadante despus de la segunda centrifugacin o despus de la tercera. En segunda instanciar esto pudo haber sido debido a problemas al momento de realizar la amplificacin PCR, ya sea por haber tomado una alcuota de mezcla WT/MT carente de partidores o que la muestra haya sido tan pequea que se haya evaporado tras la primera subida de temperatura, otra posibilidad pero ms pequea es que el partidor LBb1.3 5' se haya encontrado degradado o mal diseado, lo cual explicara la ausencia de amplificaciones en los productos que fueron amplificados con este partidor, a excepcin de 1.2(wt) y 5.2 pero esto se explicar a continuacin. En tercera instancia puede haberse debido a una deficiente carga de los productos en el gel de agarosa, pero esta posibilidad es la menos probable, siendo la primera la ms plausible. Una vez analizadas las bandas obtenidas estas vuelven a ser contradictorias entre s, tanto 1.2 (wt) como 5.1 (wt) muestran la misma banda de aproximadamente 400pb, a pesar de que supuestamente se usaron mezclas de partidores distintas para amplificar cada uno, una posible explicacin a esto es que al momento de tomar la alcuota de la mezcla, o de cargar la muestra en el gel la1.2(wt) se haya cambiado por la 1.1(wt) o la 5.1(wt) se haya cambiado por la 5.2(wt). Tambin se observa una banda del mismo tamao en 5.2 usando la mezcla de partidores MT, una posible explicacin a este resultado es que como ocurri con las muestras de las cepas silvestres, la muestra mutante 5.2 se haya intercambiado con la 5.1 al momento de cargar el gel, o se hayan tomado las alcuotas de mezcla de partidores al revs, as mismo la presencia de una banda del mismo tamao que la plantas de cepa silvestre es otra contradiccin, una posible explicacin a esto es que o las cepas silvestres no eran silvestres y eran mutantes o que la muestra 5.2 de la cepa mutante posee al menos un alelo silvestre que fue amplificado con la mezcla de partidores WT y no MT como se supone debi haber sido. Otro incgnita es la presencia de una banda de 1000pb tanto en 5.2 como en 1.2(wt) una posible explicacin a esto es que los partidores hayan hibridado en zonas distintas a las originalmente ideadas y se haya amplificado un fragmento que est al lmite de la procesividad de la Taq polimerasa, estando as en baja proporcin en comparacin a la otra banda. En sntesis como principal teora para explicar estos resultados y su diferencia con respecto a los resultados esperados, teniendo en cuenta que la hiptesis con mayor probabilidad de ser cierta es aquella que se basa en menos asunciones es que la muestra 5.2 posee al menos una banda con el alelo silvestre y que se carg al cambiada con respecto a 5.1, lo mismo ocurri para 1.2(wt) con 1.1(wt), mientras que la ausencia de bandas en los otros 13 productos se debi probablemente a una extraccin deficiente.
Conclusiones En vista de los resultados contradictorios y la gran cantidad de asunciones que hay que formular para explicarlos, junto con el hecho de que menos del 20% de los productos esperados fue amplificado exitosamente es pertinente concluir que no se logr realizar la genotipificacin de la lnea mutante es decir, no se logr determinar si las plantas de estudio son heterocigotas u homocigotas para la insercin analizada.
Referencias (1) Griffiths, J .F. A. et al. (2002). Gentica. McGraw-Hill Interamericana (2) Patrick J. Krysan1, Jeffery C. Young. (1999)T-DNA as an Insertional Mutagen in Arabidopsis. The plant Cell. (3) Jakoby, M.,Weisshaar, B.,Droge- Laser, (2002). bZIP transcription factors in Arabidopsis. Encontrado a travs de www.arabidopsis.org (4) Gua de laboratorio N4: Genotipificacin de Mutantes Insercionales mediante PCR, Universidad Andrs Bello.
Biolabs. 100 bp NEB DNA ladder, producto N3231, www.neb.com Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.). 1989.