Revista Enologa N2

Ao IV Mayo-Junio 2007


AISLAMIENTO, SELECCIN Y MULTIPLICACIN COMERCIAL DE
LEVADURAS VNICAS AUTCTONAS, DE LAS REGIONES VITIVINCOLAS
DE LA PROVINCIA DE MENDOZA

FORMENTO, Juan Carlos; ERCOLI, Eduardo; DIAZ-PERALTA, Eduardo; SFREDDO,
Elisabeth; NAZRALA, Jorge; GALIOTTI, Hugo; SNCHEZ, Laura; LUQUEZ, Claudia;
BIERE, Carlos; GOMEZ, Francisco; PEREIRA, Carolina; GENOVART, Javier;
RIVEROS, Rommy.

Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad Nacional de Cuyo


INTRODUCCIN
Las regiones vitivincolas argentinas, como tambin del resto del mundo,
deben sustentarse en un conocimiento profundo, detallado y particular del medio
ecolgico correspondiente a su mbito geogrfico y en la identificacin, seleccin
y caracterizacin de sus cultivares bsicos y de sus levaduras autctonas. Entre
los numerosos factores que influyen sobre la calidad del vino, la composicin de
las uvas y los procedimientos de fermentacin son considerados como los ms
importantes. Entre los factores que regulan la fermentacin, la cepa de levaduras
es fundamental en cuanto a su aptitud para formar distintos compuestos (Strydom,
1985. Martini, 1996). Existen antecedentes en los distintos pases vitivincolas,
especialmente en Italia y Francia, sobre ecologa y distribucin de las levaduras de
diversas regiones vitcolas (Minarik, 1978. Strydom,1985. Delfini, 1985. Caridi,
1991. Ciani, 1994. San Romao, 1982. Fleet y Heard, 1993. Ribereau Gayon, 2000).
Para el aislamiento de levaduras, estos autores han utilizado muestras de uvas,
RESUMEN
La tipicidad y el carcter de los vinos se sustentan en diversos factores, entre estos; el
conocimiento y caracterizacin de las levaduras autctonas de la zona de la cual provienen
sus uvas. El objetivo de este trabajo es el aislamiento, seleccin y multiplicacin de
levaduras nativas de los viedos de cada una de las zonas vitivincolas de Mendoza,
realizndose actualmente en el departamento de Rivadavia. Se ha realizado anteriormente
esta tarea en los departamentos de Lujn de Cuyo, Tupungato, Maip y Junn resultando
seleccionadas un nmero reducido de cepas que pueden favorecer a la tipicidad y
caracterizacin de cada micro-regin. La FCA-32 es producida industrialmente en el
exterior como levadura seca activa y comercializada regionalmente y las FCA-211 y FCA-
216 se producen industrialmente en el pas y se comercializan como levaduras
concentradas activas en pasta.
El aislamiento de levaduras se realiza a partir de muestras de uvas extradas de diferentes
viedos en cada regin. Recientemente se ha comenzado a trabajar en la bsqueda de
levaduras en las yemas de las plantas de vid en diferentes estados fenolgicos. Las levaduras
aisladas son seleccionadas por sus caractersticas mediante estudios microbiolgicos, para
luego realizar una segunda seleccin evaluando sus cualidades enolgicas a travs de micro
vinificaciones. Posteriormente con las levaduras ya seleccionadas se realizan vinificaciones a
nivel piloto. Las cepas que se distinguen durante esta etapa son sometidas a ensayos a escala
semi -industrial e industrial para confirmar las cualidades de las mismas.
Palabras clave: levaduras autctonas, Mendoza, aislamiento, biotecnologa.

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vendimias estrujadas, mostos en fermentacin y vinos en diferentes etapas de su
elaboracin y conservacin. En este trabajo se utiliz una metodologa de
bsqueda y extraccin de muestras del tipo clsico, pero a partir de un trabajo
relacionado con la distribucin de las levaduras en los diferentes rganos areos
de la vid (Lquez y col, 2007) se ha comenzado a utilizar paralelamente este
nuevo mtodo.

Objetivos
- Aislar cepas de Saccharomyces cerevisiae.
- Preseleccionar las cepas con aptitudes enolgicas.
- Definir los parmetros de multiplicacin de las cepas seleccionadas.
- Multiplicar industrialmente las levaduras seleccionadas y comercializarlas.
- Conservar las cepas en el cepario regional de levaduras de la Ctedra de
Microbiologa.
- Cuantificar la distribucin de levaduras en diferentes rganos de la planta de
vid en los diferentes estados fenolgicos.

Metodologa:
Extraccin, aislamiento, purificacin y mantenimiento de cepas de
levaduras a partir de muestras de uva de diferentes cepajes extradas de viedos
ubicados en los anteriores departamentos mencionados. Se recolectaron
muestras de las variedades: Malbec, Cabernet Merlot, Syrah, Bonarda,
Chardonnay, Semillon, Chenin, Pedro Jimnez y otras de distintos viedos. Con los
siguientes criterios para seleccionar las parcelas de extraccin:
Distancia que supere los 1000 m del punto de toma de muestra hasta la ms
prxima bodega.
Que no se hubiese agregado orujo de uva para el mejoramiento del suelo en
los ltimos 5 aos.
Para el aislamiento de levaduras a partir de uva fresca se utiliz la siguiente
rutina: cada muestra se almacen en recipientes individuales de plstico estriles.
Las uvas se estrujaron dentro de cada recipiente de recoleccin. El mosto
obtenido se transfiri a recipientes de fermentacin estriles adicionados con
dixido de azufre a razn de 50 ppm a fin de rescatar los microorganismos
capaces de soportar condiciones habituales de vinificacin. Esta operacin se
realiz de manera de evitar contaminaciones entre muestras de distinto origen. En
laboratorio, los mostos se colocaron en estufa a 28C. Al final del proceso de
fermentacin se procede al aislamiento en medio agar levadura glucosado, por el
mtodo de agotamiento por estras. Se toman cinco (5) colonias por muestra que
responden microscpicamente al gnero Saccharomyces que fueron purificadas
en el mismo medio de cultivo. En total se han obtenido hasta la fecha ms de 600
cepas. Las que han sido sometidas a caracterizacin enolgica. Para el
mantenimiento de las cepas se sembr cada una en picos con agar inclinado y se
conservan a temperaturas de refrigeracin. Adems, las cepas se congelan a -
80C en glicerol al 30% (Garca Lpez, 2002).

Estudio microbiolgico:

Preseleccin y seleccin:
El total de cepas se estudiaron macro y microscpicamente, y actualmente
forman parte del cepario de la Ctedra de Microbiologa. A todas estas cepas se
le estudiaron sus cinticas de fermentacin, la sedimentacin en mosto, la
formacin de cido a partir de glucosa, y el crecimiento en agar lisina. Del total de
las cepas testeadas, se preseleccionaron por presentar resistencia alcohlica, por
su capacidad de sedimentacin, por resistir 100 ppm de SO
2
total, por no mostrar

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un halo mayor a 2 mm en agar glucosa extracto de levadura con CaCO
3
y por
tener un crecimiento negativo en agar lisina. Posteriormente se seleccionan cepas
que, adems de las caractersticas anteriores, desprendieran entre 5,5 y 6 gramos
de CO
2
durante el proceso de fermentacin. Finalmente se decide seleccionar las
cepas de levaduras que liberaron las mayores concentraciones de CO
2
sobre el
total de las aisladas inicialmente. A estas ltimas cepas se las caracteriza por su
produccin de H2S, carcter floculante y utilizacin de galactosa.

Caracterizacin enolgica de las levaduras seleccionadas:
A cada cepa aislada se le realizaron las siguientes determinaciones: (previo
a cada estudio y para todas las cepas se debi contar con un cultivo en fase de
crecimiento exponencial y luego de cada siembra la incubacin se realiz en
estufa a 28C, se trabaj con mosto tyndalizado que contena 224g/L de azcares
reductores)
Formacin de pelcula, anillo o sedimento: se realiza en tubos conteniendo
mosto que fue sembrado con la cepa en estudio y colocado en estufa. Los
resultados se observan a las 72 horas. Las cepas que presentan pelcula y/o
anillo son descartadas.
Formacin de cido a partir de la glucosa: se realiza en medio slido agar
levadura glucosado con carbonato de calcio, mediante una siembra de
agotamiento por estras. Luego de una semana se observan los resultados y
se descartan aquellas cepas que presentan un halo transparente mayor a
dos mm alrededor de las colonias.
Resistencia al alcohol: se realiza sembrando cada cepa en mosto
previamente alcoholizado al 10%. Luego de 48 horas se observan los
resultados y se descartan aquellas levaduras que no mostraron crecimiento.
Crecimiento en medios de cultivos especficos: las cepas se siembran en
agar lisina (Oxoid) a fin de identificarlas dentro del gnero Saccharomyces.
(Fugelsang, 1997). Luego de 72 horas se descartan las cepas que mostraron
crecimiento.
Cinticas de fermentacin: cada cepa aislada es sembrada en mosto a
razn de 2.000.000 cl/mL a fin de observar cada una de las fases de
crecimiento. Diariamente se registra la prdida de peso del recipiente
fermentador.
A continuacin se muestran ejemplos de los trabajos realizados en los laboratorios
de Enologa y Microbiologa en la seleccin de las mejores cepas de distintas
regiones y como son evaluadas a nivel industrial en las bodegas.

levaduras 2005-2007
lisina
cepa forma celular sedim cido R10% ol SH
2
lisina s/N c/N fecha de f& g CO2 cintica
501-6 apiculadas anillo colonia rosada +++ 5,18 156,06
503-A esfricas si - + + - - + 6/12-15/12 3,29 130,53
503-D alargadas si - + + - - + 6/12-15/12 3,56 145,19
510-1 esfricas si + +++ - - + 8/11-17/11 6,36 145,74
510-2 esfricas si -/+ + ++ - - + 6,07 129,96
510-3 esfricas si - ++ - - + 17/12-27/126,45 124,58
Cuadro 1: Determinaciones para la preseleccin de levaduras aisladas en la regin JUNN.




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Estudios y Seleccin de la Regin MAIP

Seleccin del viedo y toma de muestra:
Se recolectaron muestras de las variedades Chardonnay, Cabernet, Chenin,
Merlot, Sauvignon, Malbec, Pedro Gimnez, Syrah, Bonarda, Moscatel y
Criolla, obtenidas de diferentes viedos ubicados en el Departamento de
Maip. De cada muestra se aislaron cinco colonias de levaduras del tipo
Saccharomyces, en funcin a sus caractersticas macroscpcas.

Preseleccin y seleccin:
En total se obtuvieron 150 cepas, las que se estudiaron macro y
microscpicamente, y que actualmente forman parte del cepario de la Ctedra
de Microbiologa FCA UNCuyo y estn siendo mantenidas a temperaturas de
congelacin. A todas estas cepas se les estudiaron sus cinticas de
fermentacin, la sedimentacin en mosto, la formacin de cido a partir de la
glucosa, y crecimiento en agar lisina. Del total de las cepas, 90 cepas se
preseleccionaron por presentar resistencia alcohlica al 12%, por su capacidad
de sedimentacin, por resistir 100 ppm de SO
2
total, por no mostrar un halo
mayor a 2 mm en agar glucosa extracto de levadura con CaCO
3
y por tener un
crecimiento negativo en agar lisina. Posteriormente se seleccionaron 16 cepas
que, adems de las caractersticas anteriores, desprendieron entre 5,5 y 6
gramos de CO
2
durante el proceso de fermentacin.
Finalmente se decidi seleccionar 7(siete) cepas de levaduras que fueron las
que liberaron las mayores concentraciones de CO
2
sobre el total de las aisladas
inicialmente Dichas cepas fueron: 211-1, 212-4; 213,1; 216-2; 217-2; 218-5;
230-3. Como testigo se utiliz la cepa Saccharomyces cerevisiae FCA 32.
A estas ltimas siete cepas se las caracteriz por su produccin de H
2
S,
carcter floculante y utilizacin de la galactosa. Cuyos resultados son: la cepa
213-1 produjo mayor cantidad de H
2
S con respecto a la cepa FCA 32,
considerndose de produccin media. Las cepas 211-1 y 230-3 mostraron la
menor capacidad de produccin con respecto a la cepa testigo. Todas las
cepas mostraron un pobre carcter floculante includa la testigo y por su
capacidad de metabolizar la galactosa confirman su identidad como
Saccharomyces cerevisiae.

Las distintas cepas seleccionadas presentaron curvas con cinticas de
fermentacin muy similares (grfico 1). Todas tuvieron muy buena tolerancia al
alcohol, aunque las seleccin 212 no pudo fermentar todos los azcares Con la
seleccin 212 se obtuvo un vino ms cido. Los niveles de produccin de glicerol
son buenos pero la cepa que ms produjo fue la testigo. Las selecciones 211 y
218 produjeron menos acetaldehida que la testigo.










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Grfico 1: Curvas de fermentacin de distintas cepas seleccionadas de Sacharomyces cereviciae, en
mostos de Cabernet Sauvignon


Ensayo tpico de vinificacin de una cepa FCA a nivel industrial
Cepas ensayadas: FCA en estado lquido y una cepa comercial del mercado
Varietal ensayado: Ros de Malbec de Agrelo

Objetivos: Realizar una comparacin a nivel industrial de las fermentaciones
producidas por las levaduras seleccionadas de la FCA y una LSA testigo en
mostos ros du nuit.



Comparacin descenso de B Lev. FCA y Testigo
0
2
4
6
8
10
12
14
16
20-mar 25-mar 30-mar 4-abr 9-abr
fecha
B
FCA TESTIGO (BCS 103)

Grfico 2: Comparacin del descenso de B testigo vs FCA.
0
50
100
150
200
250
300
fecha
cepa
23/3
32
25/3
32
27/3
32
29/3
32
31/3
32
2/4
32
4/4
32
6/4
32
fecha
a
z

c
a
r

(
g
/
L
)
f ca 32 211-1 212-4 213-1 216-2 217-2
218-5 230-3

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Por los resultados analticos y sensoriales se podra acotar que la levadura
FCA, comparada con el testigo en las condiciones del ensayo puede otorgar
mejores cualidades sensoriales a los vinos de tipo rose obtenidos. Mientras que
el testigo tuvo una capacidad fermentativa superior, lo hizo en menos tiempo,
ambas llegaron a rastros de azucares reductores.

Metodologa empleada para la elaboracin industrial de levaduras:
Se parti de cepas, suministradas por las Ctedras de Microbiologa y Enologas
de la Facultad de Ciencias Agrarias de la U.N.Cuyo como parte de respectivos
Convenios de Cooperacin con Empresas de Biotecnologa. Las cepas son
suministradas bajo condiciones de asepsia, luego para todos los procesos de
produccin se sigui rigurosamente un protocolo que incluye verificacin de
pureza, multiplicacin industrial de la cepa (bajo condiciones de temperatura, pH y
esterilidad controlados), controles de pureza de la pasta obtenida (8 x 10
10
a
1 x 10
11
por gramo de clulas viables); concentracin y secado o congelamiento
de las mismas.

Registro Internacional de Cepas y Caracterizacin Molecular
Las cepas de levaduras aisladas de las distintas regiones de la provincia de
Mendoza que presentaron un excelente comportamiento tanto a nivel enolgico
como biotecnolgico fueron registradas como cepa indita en la Universidad de
Davis, a travs de la secuencia ribosmica de las mismas, constatando de esta
manera que no son cepas comerciales registradas con anterioridad. Se realiz
tambin una caracterizacin molecular, en un laboratorio nacional, de cada cepa
de levadura producida industrialmente.

CONCLUSIONES:
Las cepas aisladas y seleccionadas son probadas tanto en mostos tintos como en
mostos blancos, para determinar su comportamiento y caractersticas enolgicas
comparndolas con levaduras comerciales.
La degustacin de los vinos obtenidos en estas vinificaciones se efectan con
jueces entrenados. Se realizan pruebas de ordenamiento y descripcin de los
perfiles sensoriales de los vinos elaborados.
Los resultados sensoriales de los vinos obtenidos en los diferentes ensayos
confirman que las cepas aisladas de las distintas regiones de la provincia de
Mendoza otorgan buenas caractersticas diferenciales respecto de las cepas
genricas comerciales.
La FCA-32 es producida industrialmente en el exterior como levadura seca
activa y comercializada regionalmente y las FCA-211 y FCA-216 se producen
industrialmente en el pas y se comercializan como levaduras concentradas
activas en pasta.

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Recibido: Enero 2008
Aceptado: Enero 2008





NDLR: Trabajo presentado en el XI Congreso Latinoamericano de Viticultura y
Enologa, 26 al 30 de Noviembre de 2007, Mendoza, Argentina.
Si desea contactarse con alguno de sus autores, comunquese a
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