MANUAL DE PROTOCOLOS Y PROCEDIMIENTOS

LABORATORIO 109- UNIDAD EXPERIMENTAL

ENSAYO DETERMINACIN PROTENAS BRADFORD

Fundamento

El ensayo de Bradford determina colorimtricamente la concentracin de protenas en
la muestras a analizar. Su fundamento reside en la unin del colorante azul Brillante
de Coomassie G-250 a las protenas. Este colorante presenta tres formas: catinico
(rojo), neutro (verde) y aninico (azul). Bajo condiciones acidas el colorante se
encuentra predominantemente en su forma catinica doblemente protonado (rojo), sin
embargo cuando se une a las protenas presentes, se convierte a un estado no
protonado (azul). Este viraje de color se detecta espectrofotomtricamente por un
lector de microplacas a 595 nm cuantificando la reaccin.

MATERIALES

Elementos de proteccin personal
Micropipeta 100- 1000 L
Micropipeta 10- 100 L
Micropipeta 5- 10 L
Tubos de ensayo limpios
Puntas azules,amarillas y blancas
Solucin Mezcla ( Etanol 98 %, DMSO stock, acido actico 1%)
Solucin Etanol 70%
Solucin DMSO stock
Medio RPMI sin suero
Standard proteins BSA Bio- rad
1x Dye reagent Bio-Rad
Espectrofotmetro Multiskan Go Thermo Scientific 595 nm
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Tabla 1. Reactivos compatibles empleando el procedimiento estndar. *

Los lmites de concentracin para la compatibilidad con el microensayo son de
1/25 de los valores de la Tabla 1.

Protocolo Estndar

Para la ejecucin de la prueba estndar se pueden emplear tres formatos diferentes
siendo 5 mL y 1 mL para el ensayo en cubeta y 250 L para microplacas. El rango de
linealidad para este ensayo empleado albumina de suero bovino (BSA) es de 125-
1000 g /mL.

Procedimiento:

1. Atempere el 1x Dye reagent y agite por inmersin un par de veces antes de su uso .

2. Agregue cada solucin de la muestra patrn y desconocida en tubos limpios
separados pozos de microplaca. Posteriormente aada el 1x Dye reagent y mezcle,
para microplacas utilice un mezclador de microplacas. Los volmenes necesarios se
mencionan a continuacin:


Acetone, 10%
Acetonitrile, 10%
Ammonium sulfate, 1
M
Ampholytes, 310,
0.5%
ASB-14, 0.025%
Ascorbic acid, 50 mM
Bis-Tris, pH 6.5, 0.2 M
b-mercaptoethanol, 1
M
Calcium chloride, 40
mM
CHAPS, 10%
CHAPSO, 10%
Deoxycholic acid, 0.2%
DMSO, 5%
Dithioerythritol (DTE),
10 mM
Dithiothreitol (DTT), 10
mM
Eagle's MEM
Earle's salt solution
EDTA, 0.2 M
EGTA, 0.2 M
Ethanol, 10%
Glucose, 20%
Glycerol, 5%
Glycine, 0.1 M
Guanidine-HCl, 2 M
Hank's salt solution
HCl, 0.1 M
HEPES, 0.1 M
Imidazole, 0.2 M
Magnesium chloride, 1 M
MES, 0.1 M
Methanol, 10%
Modified Dulbecco's PBS
MOPS, 0.1 M
NAD, 2 mM
Nonidet P-40, 0.25%
Octyl b-glucoside, 0.5%Octyl
b-thioglucopyranoside, 1%
PBS
Phenol Red, 0.5 mg/mL
PIPES, 0.2 M
PMSF, 2 mM
Potassium chloride, 2 M
Potassium phosphate, 0.5 M
SB 310, 0.1%
SDS, 0.025%
Sodium acetate, pH 4.8, 0.2
M
Sodium azide, 0.5%
Sodium bicarbonate, 0.2 M
Sodium carbonate, 0.1 M
Sodium chloride, 2.5 M
Sodium citrate, pH 4.8 or
6.4, 0.2 M
Sodium hydroxide, 0.1 M
Sodium phosphate, 0.5 M
Sucrose, 10%
TBP, 5 mM
TBS (25 mM Tris, 0.15 M
NaCl,
pH 7.6), 0.5x
TCEP, 20 mM
Thio-urea, 1 M
Tricine, pH 8, 50 mM
Triethanolamine, pH 7.8,
50 mM
Tris, 1 M
Tris-glycine (25 mM Tris,
192 mM
glycine)
Tris-glycine-SDS, (25 mM
Tris,
192 mM glycine, 0.1%
SDS),
0.5x
Triton X-100, 0.05%
Tween 20, 0.01%
Urea, 4 M

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3. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos . Las muestras no deben
incubarse por ms de 1 hora a temperatura ambiente .

4. Ajuste el espectrofotmetro a 595 nm. Lleve el instrumento a cero empleando una
cubeta de agua y de 1x Dye reagent. Realice la lectura de las absorbancia de los
estndares y las muestras desconocidas. Si el lector de espectrofotmetro o de
microplacas no llega a cero con el blanco, se debe restar el valor del blanco al
estndar y las muestras desconocidas.

5. Elabore la curva de calibracin representando grficamente la medida media para
cada patrn de BSA vs su concentracin en g/mL. Utilice la curva estndar para
determinar la concentracin de protenas de cada muestra desconocida .


Protocolo de microensayo

Para la ejecucin de la prueba microensayo se pueden emplear dos formatos
diferentes siendo 2 mL para el ensayo en cubeta y 300 L para microplacas. El rango
de linealidad para este ensayo empleado albumina de suero bovino (BSA) es de 1.25-
10 g /mL


Procedimiento:

1. Atempere el 1x Dye reagent y agite por inmersin un par de veces antes de su uso .

2. Agregue cada solucin de la muestra patrn y desconocida en tubos limpios
separados pozos de microplaca. Posteriormente aada el 1x Dye reagent y mezcle,
para microplacas utilice un mezclador de microplacas. Los volmenes necesarios se
mencionan a continuacin:






3. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos . Las muestras no deben
incubarse por ms de 1 hora a temperatura ambiente .

4 . Ajuste el espectrofotmetro a 595 nm. Lleve el instrumento a cero empleando una
cubeta de agua y de 1x Dye reagent. Realice la lectura de las absorbancia de los
estndares y las muestras desconocidas. Si el lector de espectrofotmetro o de
microplacas no llega a cero con el blanco, se debe restar el valor del blanco al
estndar y las muestras desconocidas.

ENSAYO VOLUMEN STANDARD Y
MUESTRA
VOLUMEN 1X DYE
REAGENT
5 mL 100 L 5 mL
1mL 20 L 1 mL
Microplaca 5 L 250 L
ENSAYO VOLUMEN STANDARD Y
MUESTRA
VOLUMEN 1X DYE
REAGENT
2 mL 1 mL 1 mL
Microplaca 150 L 150 L

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5. Elabore la curva de calibracin representando grficamente la medida media para
cada patrn de BSA vs su concentracin en g/mL. Utilice la curva estndar para
determinar la concentracin de protenas de cada muestra desconocida

CALCULOS PARA LA REALIZACIN CURVA CALIBRACIN

Curva standard de microplacas BSA (125-1000 g/mL) por triplicado

Pozo N
Volumen
standard
(L)
Origen
standard
Volumen
diluyente
(L)
Concentracin
Protena BSA
(g/mL)
1 60 2000 g/mL stock 20 1500
2 40 2000 g/mL stock 40 1000
3 40 Pozo 1 40 750
4 40 Pozo 2 40 500
5 40 Pozo 4 40 250
6 40 Pozo 5 40 125

Curva standard de microplacas BSA (1,25-10g /mL) por triplicado

Pozo N
Volumen
standard
(L)
Origen
standard
Volumen
diluyente
(L)
Concentracin
Protena BSA
(g/mL)
1 5 2000 g/mL stock 995 10
2 500 Pozo 1 500 5
3 500 Pozo 2 500 2,5
4 500 Pozo 3 500 1,25


BIBLIOGRAFIA


Quick Start Bradford Protein Assay Instruction Manual. Bio-Rad Laboratories, Inc.