BROMATOLOGA

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

LICENCIATURA EN CIENCIAS QUMICAS













FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES



2010























INTERROGATORIOS INICIALES





Productos crneos

Definicin de carne. Nociones sobre composicin de chacinados y embutidos frescos. Cambios
qumicos por proliferacin bacteriana. Ensayos qumicos de estado higinico. Fundamento de
todas las determinaciones includas en la gua de T.P. Normas de higiene y seguridad a tener en
cuenta durante la prctica. Legislacin argentina.
Muestra: Traer muestra suficiente para anlisis por duplicado (consultar sobre marcas y tipos).


Harina

Nociones sobre estructura y composicin del grano de trigo. Procesamiento y molienda del grano.
Composicin de la harina. Influencia del procesamiento del grano en su composicin. Grado de
extraccin. Tipificacin de harinas.
Definicin de fibra cruda y dietaria. Fundamentos del mtodo de fibra insoluble en detergente
neutro.
Almidn. Caractersticas generales, composicin. Tipos de almidn. Gelatinizacin, gelificacin y
retrogradacin.
Fundamento de las tcnicas analticas includas en la gua de T.P. Normas de higiene y seguridad a
tener en cuenta durante la prctica. Legislacin argentina.
Muestra: la provee la ctedra.


Leche

Definicin. Composicin qumica y propiedades fsicas. Relacin entre acidez y pH. Fundamento
de todas las determinaciones includas en la gua de T.P. y del mtodo gravimtrico para grasas
(Rosse-Gottlieb). Normas de higiene y seguridad a tener en cuenta durante la prctica. Evaluacin
de resultados y conclusiones sobre genuinidad y estado higinico. Evidencias o conjeturas sobre
adulteraciones.
Legislacin argentina.
Muestra: Traer muestra suficiente para anlisis por duplicado (consultar sobre marcas y tipos).


Productos azucarados

Miel. Caractersticas generales. Composicin.
Mtodos de valoracin qumicos de hidratos de carbono (Munson y Walker, iodometra) y fsicos
(polarimetra y refractometra). Fundamento de las tcnicas includas en la gua de T.P. Normas de
higiene y seguridad a tener en cuenta durante la prctica.
Legislacin argentina.
Muestra: la provee la ctedra.


Alteraciones de lpidos
Indice de cidos grasos libres (IUPAC, II.D.1, modificado), Indice de perxido (A.O..A.C.,
965.33, 1990; A.O.C.S., Cd 8-53, 1963), Fundamento de las tcnicas includas en la gua de T.P.
Normas de higiene y seguridad a tener en cuenta durante la prctica.
Legislacin argentina.
Muestra: la provee la ctedra.




MODELO DE INFORME


Informe N
Fecha de entrega:
Nombre y apellido:

NOMBRE DE LA PRCTICA

Muestra analizada
Identificacin (marca, lote):
Caractersticas:.

DETERMINACIONES REALIZADAS:

a) Nombre de la determinacin ( referencia de la metodologa)
Resultado obtenido

b) , c) ... Nombre de la determinacin ( referencia de la metodologa)
Resultado obtenido

CONCLUSIONES

a) Cdigo Alimentario Argentino
Registrar las especificaciones de esta norma respecto de determinaciones fsico qumicas para este
tipo de alimento (o el ms parecido). Comparar con los resultados obtenidos.

b) En caso de contar con el rotulado,
Copiar los valores dados en el rotulado nutricional y comparar con los resultados obtenidos.


ANEXO DE DATOS DE LABORATORIO

DETERMINACIONES REALIZADAS

a) Nombre de la determinacin
Datos de laboratorio (masa de muestra, pesadas, diluciones, etc.)
Resultado obtenido

b), c) ... Nombre de la determinacin
Datos de laboratorio (masa de muestra, pesadas, diluciones, etc.)
Resultado obtenido



OBSERVACIONES





LECHE

El Cdigo Alimentario Argentino vigente, define con el nombre de "leche", sin calificativo
alguno, al producto obtenido por el ordeo total e ininterrumpido, en condiciones de higiene, de la
vaca lechera en buen estado de salud y alimentacin, proveniente de tambos inscriptos y
habilitados y sin aditivos de ninguna especie (CAA, Art. 554).
La leche proveniente de otros animales deber denominarse con el nombre de la especie
productora.

Finalidad del anlisis

Las determinaciones que se realizan comnmente en el anlisis qumico de la leche,
permiten comprobar si sus valores responden a los caractersticos de composicin genuina, poner
al descubierto alteraciones y adulteraciones o fraudes e indicar (entre ciertos lmites) el estado de
conservacin.

Un examen rutinario incluye frecuentemente las determinaciones de densidad, grasa,
slidos totales, acidez, descenso crioscpico, estimacin del grado de contaminacin (ensayos de
azul de metileno o resazurina).

Preparacin de la muestra (AOAC 925.21, 1990)

Antes de tomar porciones para el anlisis, llevar la muestra a aproximadamente 20C y
mezclar por trasvase a otro recipiente limpio, repitiendo la operacin hasta asegurar una muestra
homognea. Si no han desaparecido los grumos de crema, entibiar la muestra en bao de agua
hasta casi 38 C, mezclar y luego enfriar a 15-20 C. En caso de tener que medir un volumen para
alguna determinacin, llevar la muestra a esa temperatura antes de pipetear.

Densidad

Puede determinarse con balanza hidrosttica, picnmetro o lactodensmetro, a la
temperatura de 15 C.

Determinacin de densidad con lactodensmetro (AOAC 925.22, 1990)

Se vierte la leche preparada para el anlisis, en un recipiente cilndrico, evitando formacin
de espuma e incorporacin de aire. Introducir el lactodensmetro de modo que ocupe la parte
central del lquido, se espera a que alcance el nivel correspondiente y luego se lee la densidad
cuidando que la visual enrase con la superficie libre de la leche. Leer la temperatura.
Un tipo difundido de lactodensmetro, es el Quevenne, cuyo vstago con escala graduada
comprende valores entre 15 y 40 que corresponden a las milsimas de densidad por encima de la
unidad, es decir, que el nmero 32 del lactodensmetro indica la densidad 1,032.

El instrumento est calibrado a 15 C y a esa temperatura, por lo tanto, el nmero ledo
representa la densidad de la leche. A temperaturas diferentes, debe recurrirse a tablas especiales de
correccin.

Cuando la discrepancia con respecto a los 15 C no es mucha (no ms de 5 C), se puede
obtener la correccin sumando o restando 0,0002 a la densidad hallada, o bien 0,2 a los grados
ledos en el lactodensmetro, por cada grado de temperatura respectivamente superior o inferior a
15.

Extracto seco (Slidos totales) (AOAC, 925.23, 1990)

Lo constituye el residuo remanente de la evaporacin de las materias voltiles de la leche a
la temperatura de ebullicin del agua.

A un cristalizador de dimetro no menor de 5 cm se agrega arena calcinada de manera que
quede una capa delgada en el fondo del mismo. El conjunto se seca en estufa a 100 C durante 1
hora, se enfra y tara, luego se agregan al cristalizador 5 ml de leche, exactamente medidos, y se

pesa nuevamente. Evaporar en bao de agua hirviente durante 10-15 min., exponiendo a la accin
del vapor la mxima superficie posible del fondo del recipiente. Colocar luego en estufa de 98-100
C, secando hasta constancia de peso. En todos los casos enfriar en desecador y pesar rpidamente.
Referir el residuo a % en volumen de muestra, informndolo como "slidos totales".

Materia grasa

Mtodo de Gerber (CAA, Tomo II, 13-8, 1989)

Este mtodo volumtrico, muy difundido en el control de rutina de leche, en especial, y de
productos lcteos en general, consiste en la separacin de la materia grasa por disolucin en cido
sulfrico de todos los componentes, seguida por centrifugacin en tubos especialmente calibrados.

El mtodo emplea tambin alcohol amlico, que ayuda a romper la emulsin de las grasas y
previene la carbonizacin de las mismas.

Reactivos:

- H
2
SO
4
para Gerber (dens. 1,813-1,817 a 20 - aprox. 90 %)
- Alcohol amlico puro (dens. 0,809-0,813 a 20), libre de grasa, comprobado por un ensayo en
blanco.

Medir con pipeta 11 ml de H
2
SO
4
para Gerber e introducirlos en el butirmetro evitando
mojar las paredes internas del cuello. Luego, agregar con rapidez 11,0 ml de leche con pipeta
aforada, cuidando que forme un estrato encima del cido y no se mezcle con l, e inmediatamente
agregar 1 ml de alcohol amlico. Se tapa el butirmetro con el tapn especial correspondiente y se
agita en forma efectiva pero con cuidado (*), teniendo en cuenta que se produce una fuerte
elevacin de la temperatura. Se coloca el butirmetro en un bao de agua a 65-70 C por 5-10 min.
(con el tapn hacia abajo). Retirado del bao, se seca exteriormente y se centrifuga 3-5 min.. La
centrfuga consiste en un plato chato en el cual, mediante tubos metlicos, se adaptan los
butirmetros dispuestos de forma tal que los tapones de cierre queden dirigidos hacia afuera y la
porcin graduada hacia el eje de la centrfuga. Se vuelve al bao de agua por 4-5 min., se lee
inmediatamente el espesor de la capa de grasa acumulada en la parte superior calibrada del
butirmetro. Por ajuste adecuado del tapn de cierre, se puede hacer coincidir la base de la
columna de grasa con el cero de la escala. Leyendo a la altura del menisco de la columna de grasa,
se obtiene directamente el % de grasa de leche. Si no es posible ajustar la superficie inferior de la
columna de grasa a cero, se ajusta a la marca de % completo ms prxima, y se tiene en cuenta al
efectuar la lectura del menisco superior.

La lectura del butirmetro corresponde a % g de grasa por 100 cm
3
de leche.

Si se verificara aguado en la leche analizada, deber recalcularse el % de grasa para
determinar si existe desgrasado respecto del tenor graso especificado en el CAA para la leche
analizada.

(*) Para proteger la mano del calor que se desprende, conviene tomar el butirmetro con
un trapo, sujetando con el dedo pulgar el tapn de goma, con firme presin. Los tres lquidos del
interior se mezclan volteando varias veces el butirmetro. En algunos casos, se forman cogulos
albuminoides que persisten; los mismos se eliminan agitando (siempre con precaucin)
fuertemente, despus de un tiempo prudencial.

Nota 1: Siendo dificultosa la separacin de los glbulos pequeos de grasa en leches
"homogeneizadas", se recomienda volver a centrifugar despus de calentar en bao de 65-70 C,
procediendo as hasta que la lectura alcance un mximo.

Nota 2: Se recomienda la realizacin de ste ensayo por duplicado simultneo, sirviendo cada
butirmetro como mutuo contrapeso para el equilibrio de la centrfuga.


Extracto seco no graso (CAA, Tomo II, 13.9, 1989)


Se determina por diferencia de los valores porcentuales de extracto seco y de grasa,
obtenidos anteriormente (a la hora de calcular esta diferencia tener en cuenta que las unidades del
extracto seco y de grasa sean coherentes).

El valor del extracto seco no graso (ESNG) constituye un valor bastante constante para
todas las leches, debido a que dentro del conjunto de sustancias que forman el extracto seco total,
el tenor graso es el ms variable.

Si el valor de % ESNG hallado resultara inferior al especificado en el CAA, deber
calcularse el % de aguado como:

% de aguado =100 * (%ESNG
CAA
-% ESNG)
%ESNG
CAA


Acidez (AOAC, 947.05, 1990)

La leche fresca, en estado normal, no contiene prcticamente cido lctico. Al
determinarse la acidez total, el gasto de lcali es debido al CO
2
disuelto, fosfatos cidos, protenas
(principalmente casena), y citratos cidos contenidos en la leche. El cido lctico producido
durante el "agriado", se debe fundamentalmente a la accin de microorganismos del tipo de los
estreptococos lcticos, sobre la lactosa.

Reactivos :

- Solucin de NaOH 0,1 N valorada.
- Solucin de fenolftalena 0,5 % en etanol 95 %.

Medir con pipeta aforada, 10,0 ml de muestra y colocarlos en una cpsula de porcelana.
Aadir 1 ml de fenolftalena. Titular con bureta de 10,0 ml con NaOH 0,1 N hasta aparicin de
color rosa dbil persistente (utilizar como contraste el interior blanco de la cpsula).

Los resultados se expresan en cido lctico % de muestra (p/v).

1 ml de NaOH 0,1 N = 0,0090 g de cido lctico.

Para expresar la acidez en grados Dornic (forma corriente en la industria lctea), se
multiplica por 100 el resultado anterior.

Si se verificara aguado en la leche analizada, deber recalcularse la acidez para comparar
con la especificacin del CAA para este parmetro.

Ensayo de azul de metileno (Egan H., Kirk R., Sawyer R., 1987)

Sirve entre ciertos lmites, para indicar el grado de conservacin y pureza de la leche,
usando una prueba qumica para sustituir o completar el examen bacteriolgico, siendo ste
ensayo considerado como una medida de la contaminacin bacteriana.

En un tubo de ensayo (ancho), se vierten 40 ml de leche y 1 ml de azul de metileno. El
tubo de ensayo se mantiene a 38-40C y, para evitar el contacto con el aire durante el ensayo,
deber colocarse un tapn de algodn.

Obsrvese el tiempo necesario para obtener la decoloracin, haciendo caso omiso de lo que
ocurre en la capa superior de leche contenida en el tubo. En base a ese tiempo se puede llegar a las
siguientes conclusiones:

1- leche muy mala : si no conserva el color ms de 20 min.
2- leche mala : si conserva el color de 20 min. a 2 hs.
3- leche mediocre : si conserva el color de 2 hs. a 5 1/2 hs.
4- leche buena : si conserva el color por ms de 5 1/2 hs.

Anlisis de la Fosfatasa Alcalina


La determinacin de fosfatasa alcalina est destinada a decidir si un producto lcteo ha sido
pasteurizado en condiciones de tiempo y temperatura adecuadas. El CAA y las Normas Mercosur
exigen que la prueba de fosfatasa alcalina en productos lcteos d negativa.

Preparacin de muestra:
- leche en polvo: reconstituir aprox. 1g en 10 mL de agua (mantener la temperatura por debajo
de 35C).
- leche fluida: tal cual
- manteca: pesar aprox. 1 g de muestra, extraerla por debajo de la superficie con un cuchillo
limpio.
- crema de leche: tal cual

Nota: si las muestras quedaran turbias, filtrar por papel. La centrifugacin no da buenos
resultados

Fundamento del mtodo:
La determinacin de actividad fosfatasa se basa en la hidrlisis enzimtica, en medio
alcalino, del fenilfosfato disdico (NaFF) a fenol y posterior determinacin colorimtrica del
fenol liberado con 4-aminoantipirina (4-aminofenazona) y ferricianuro como agente oxidante.

Reactivos

- solucin sustrato: NaFF (1.4 mM) en buffer de pH 10 de aminometilpropanol (3 M) y
4-aminoantipirina (29 mM). Conservar en heladera durante no ms de 5 meses.
- reactivo de color: ferricianuro de K (10 mM). Estable durante 5 meses a temperatura
ambiente y al abrigo de la luz.
- estndar: solucin de fenol (200 UI/L)

Procedimiento:
Preincubar 0.5 mL de solucin de sustrato unos minutos a 37C. Luego, agregar 50 L
de muestra, mezclar e incubar exactamente 10 min
1
. Realizar paralelamente el estndar y un
blanco de reactivos. Agregar 2.5 mL de reactivo de color y retirar los tubos del bao.

Medir A (520 nm), dentro de los 30 min. Ajustar el cero del espectrofotmetro con
agua destilada.
Esquemticamente:
blanco estndar muestra
sustrato (mL) 0.5 0.5 0.5
incubar a 37C en bao de agua x unos minutos (4 min)
muestra (L) - - 50
estndar (L) - 50 -
H
2
O destilada (L) 50 - -
mezclar bien (vortex)
incubar a 37C x 10 min exactos
react. de color (mL) 2.5 2.5 2.5
mezclar inmediatamente (vortex)
leer a A (520 nm)



1
El tiempo y la temperatura de reaccin son crticos. Un min o 1C en exceso o defecto pueden producir un error de
10%.


Determinacin de pH (CAA, Tomo II, 13.10,1989)

Se medir el pH con pH-metro. Se realiza la calibracin del equipo por medio de buffers
adecuados (pH 4,00 - 7,00), y luego se procede directamente a la medicin del valor de pH
correspondiente a la muestra en estudio. (Consultar al personal docente para el uso del equipo).






Butirmetro de
Gerber para
Leche
Lectura del
Butirmetro
(g grasa / 100 cm
3
de
leche)















PRODUCTOS CARNEOS


Finalidad del anlisis

El examen veterinario y bacteriolgico de las carnes y derivados, es irremplazable, y
resulta de fundamental importancia para apreciar el estado higinico de las mismas, siendo
completado por la realizacin de algunos exmenes fsico y qumicos.

Para carnes, el anlisis qumico total no tiene inters habitualmente en la prctica. Sin
embargo, en el caso de productos crneos tales como los chacinados, el anlisis qumico permite
controlar el cumplimiento de las disposiciones alimentarias vigentes y, por otra parte poner al
descubierto determinados fraudes o adulteraciones.

Para los chacinados frescos resultan de inters las determinaciones del contenido en agua,
grasas, nitrgeno total, cenizas, sal y almidn; pudiendo necesitarse llevar a cabo, tambin, test
para otros posibles ingredientes como colorantes, conservadores, etc.

En la realizacin del presente trabajo prctico se realizar la determinacin de nitrgeno
bsico voltil (el primer da), importante para apreciar el estado higinico. Tambin se
determinarn el contenido en agua, materias grasas y nitrgeno total.

Preparacin de la muestra (AOAC, 983.18,1990)

En el caso de salchichas y otros embutidos se analiza el contenido sin la piel (para ello se
retira el material que interesa con una cuchara, tratando de no tocarlo con las manos). La masa del
embutido es picada a mquina, como mnimo dos veces, y luego mezclada rpidamente en un
mortero. Si el producto ya es una pasta mezclar bien en un mortero o recipiente apropiado (se
pueden utilizar homogeneizadores rotatorios como los "starmix", "multimix" y tipos parecidos. En
estos casos evitar que a causa de la gran velocidad se origine el calentamiento de la muestra). Ser
necesario disponer de una cantidad de muestra preparada, igual al total necesario para efectuar
todas las determinaciones por duplicado. Normalmente con 100-150 g es suficiente para los
ensayos, pero la composicin de algunos productos crneos no es homognea, y an esa cantidad
puede no garantizar un buen resultado medio. Resulta obvia la importancia de una
homogeneizacin lo ms completa posible para evitar errores analticos. La muestra preparada se
guarda en envases hermticos y en lugar fresco; o bien se separa una parte para determinar la
humedad y el resto se deseca, se muele y se guarda para otras determinaciones.

Nitrgeno bsico voltil (Pearson D., 7.2, 1993)

Reactivos :

- MgO puro.
- Agente antiespumante (puede ser alcohol octlico o un antiespumante siliconado).
- Solucin de cido brico al 2 %
- Indicador combinado : 0,016 % rojo de metilo y 0,083 % verde de bromocresol en alcohol.
- Solucin de H
2
SO
4
0,02 N valorado.

Procedimiento:

Antes de comenzar a realizar la determinacin, asegrese de tener disponible un equipo de
destilacin. Consulte con un docente acerca de su armado.

Colquense en un baln (macro) de Kjeldahl 10 a 15 g de muestra preparada y agrguense
2 g de MgO, 300 ml de agua destilada, unas gotas de antiespumante y unos trozos de porcelana
porosa o piedra pmez. Instalar inmediatamente el baln de Kjeldahl en el aparato de destilacin
apropiado.

A un matraz de Erlenmeyer de 500 ml se aaden 50 ml de solucin de cido brico al 2 %
y 12 gotas del indicador.

Conectar el aparato y colocar el Erlenmeyer receptor de tal manera que la punta o extremo
del refrigerante quede sumergida en la solucin de cido brico. Calintese el baln de Kjeldahl
de manera tal que el lquido contenido entre en ebullicin en exactamente 10 min. Destilar durante

25 min. (exactos), manteniendo la misma intensidad de calentamiento. Enjuagar el refrigerante
con agua destilada, recogiendo tambin en el matraz de Erlenmeyer, Titular el destilado con el
cido sulfrico 0,02 N.

Expresar el resultado como mg de NBV por 100 g de muestra.


Determinacin de agua (AOAC, 950.46-A, 1990)

Preparar un cristalizador de paredes altas y de 5-6 cm de dimetro, forrndolo
interiormente con papel "aluminio". Agregar aproximadamente 12 g de arena calcinada y una
varilla de vidrio corta. Tarar el conjunto. Pesar 3-4 g de muestra preparada, aadir 5 ml de alcohol
etlico 95, mezclando totalmente y extendiendo sobre la base del cristalizador en forma de capa
fina. Realizar un presecado en bao Mara hasta evaporacin del etanol (demanda aprox. 20 min.).
Llevar a estufa de vaco a 100-105 C durante 2 hs. Enfriar en desecador y pesar, continuando
luego el secado por perodos de 30 min. hasta peso constante.

Determinacin de grasas (AOAC, 985.15, 1990)

Transferir cuantitativamente el contenido del cristalizador utilizado en la determinacin de
agua, a un cartucho de celulosa. Al realizar esta operacin es conveniente perforar con la varilla el
papel "aluminio" o instalarlo en el cartucho de tal manera que permita la circulacin y drenaje
continuo del solvente en el cartucho de celulosa. Cubrir con un poco de algodn y colocar en el
cuerpo del extractor Soxhlet.

En el baln de extraccin colocar 2 o 3 piedras pmez chicas y cargar el cuerpo del
extractor una vez y media con cloruro de metileno (ver esquema adjunto). Extraer durante 4 hs.
como mnimo, calentando con una intensidad tal que se logre una condensacin de 5-6 gotas por
segundo.

Una vez finalizada la extraccin destilar la mayor parte del ter a bao Mara,
recuperndolo. Pasar luego el extracto a un Erlenmeyer chico tarado, con la ayuda de un poco de
solvente. Evaporar en rotavap (en campana) y secar a 100 C durante 30 min. Enfriar y pesar.
Referir el dato a % de muestra.


Extractor Soxhlet



Protenas totales (Mtodo de Kjeldahl-Arnold-Gunning, A.O.A.C., 928.08, 1990).

Reactivos :


- K
2
SO
4
p.a. Na
2
SO
4
p.a.
- CuSO
4
p.a. (puede usarse CuSO
4
. 5 H
2
O)
- H
2
SO
4
concentrado.
- Solucin H
2
SO
4
0,1 N valorado.
- Solucin concentrada de NaOH (40 o 45 %).
- Solucin NaOH 0,1 N valorada.
- Solucin de rojo de metilo en etanol (0,5 % p/v).

Etapa de digestin:

Pesar 0.5-0.75 g de muestra (de acuerdo al contenido estimado de nitrgeno) en un
pequeo trozo de papel satinado. Envolverla y dejarla caer en un tubo de digestin de Kjeldahl.
Agregar 6 g de Na
2
SO
4
, 0.3 g de CuSO
4
(aproximadamente 0.8 g CuSO
4
.5H
2
O) y 12 ml de
H
2
SO
4
concentrado. Consulte com un docente y siga las instrucciones del equipo para digerir la
muestra, utilizando las siguientes condiciones:

1 paso: 125C 30 minutos
2 paso: 270C 30 minutos
3 paso: 400C 120 minutos

Etapa de destilacin:

Dejar enfriar el tubo de digestin a temperatura ambiente y agregar aproximadamente 20 ml de
agua (cuidado con la violencia de la reaccin!).Colocar exactamente 50,0 ml de H
2
SO
4
0,1 N
valorado en un erlenmeyer de 500 ml y agregar 4 5 gotas de rojo de metilo. Realizar la
destilacin de acuerdo con las instrucciones del equipo.

El destilado se titula con solucin de NaOH 0.1 N valorado.

Factores para la conversin de N a protena

- Carne: 6,25 (es el ms empleado si se desconoce la procedencia de la protena)
- Leche: 6,38
- Gelatina: 5,55
- Trigo y vegetales en general: 5,7
- Arroz: 5,85
- Huevos: 6,68


Determinacin de adulteraciones en carnes por sustitucin de otra especie animal

La identificacin de las especies animales en productos crnicos es importante desde el
punto de vista econmico y cultural. Permite la deteccin de adulteraciones, como la introduccin
de ciertos tejidos animales de menor valor econmico o desde el punto de vista religioso, la
adicin de una determinada especie animal que puede estar contraindicada o prohibida.
Los mtodos analticos actuales para la extraccin e identificacin de las protenas de las
diferentes especies crnicas, son tcnicas serolgicas (inmuno difusin radial doble, Elisa y
tcnicas electroforticas) que utilizan los antgenos y antisueros especficos de cada especie
animal para el establecimiento de un diagnstico concluyente en los productos crnicos.

Objetivo. El objeto de esta prctica es concluir sobre la genuinidad de los productos crnicos
analizados (sin tratamiento trmico), empleando un mtodo de Inmuno difusin radial doble.


Deteccin de antgenos crnicos de diferentes especies por inmunodifusin.

La inmunodifusin se basa en la formacin de bandas de precipitacin antgeno-anticuerpo
(Ag-Ac) en medios semislidos, emplendose comnmente azarosa.

La difusin puede ser simple (solo se mueve el Ag o el Ac) o doble (se mueven Ag y Ac).
La formacin de inmunocomplejos se ve afectada por el pH, temperatura, fuerza inica del medio
y la concentracin relativa de Ag y Ac. La zona ptima de concentracin para la formacin del
precipitado Ag-Ac se llama zona de equivalencia.

Mtodo: inmunodifusin doble (Ouchterlony).

Se basa en una reaccin de precipitacin entre el antgeno crnico, previamente extrado en
solucin fisiolgica tamponada, con el inmunosuero o antisuero correspondiente preparado en
conejo.

Materiales:
1) Agar base para inmunodifusion (*):
- Agar noble .........................................................1,5 g.
- Solucin fisiolgica bufferada a pH 7, 2 (**);
c.s.p....................................................................100 ml.
- cido fenico o Fenol puro 0,25 g.
- ( alternativa: Merthiolate en solucin..1/5000)

(* ) Preparacin del agar base:
a. En un erlemmeyer disolver los ingredientes indicados calentando a bao Maria hirviente.
Dejar entibiar y controlar pH.

b. Fraccionar en tubos de ensayo estriles, colocando 9 ml. de medio por tubo, tapar y
conservar en heladera, por un periodo no mayor de 15-20 das.

(**) Preparacin de la Solucin fisiolgica bufferada a pH 7,2: Mezclar: 1840 ml. de Solucin
fisiolgica de Cloruro de Sodio (1) +160 ml. de Solucin buffer (2). Controlar el pH despus de la
mezcla.
(1) Solucin fisiolgica de Cloruro de Sodio :
Cloruro de Sodio: 8,56 g.
Agua destilada c.s.p/100 ml.

(2) Buffer de fosfatos pH 7,2: Mezclar 700 ml. de sol. (a) y 300 ml. de Sol. (b)

Solucin (a):
PO
4
HNa
2
12 H
2
O: 23,65 g.
Agua destilada c.s.p. 1000 ml.
Solucin (b):
PO
4
H
2
K: 9078 g.
Agua destilada c.s.p. 1000 ml

Bromatologa Departamento de Qumica Orgnica
Ao 2010 Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - UBA

2) Placas de Petri: de aproximadamente 100 mm. de dimetro esterilizadas.

3) Sacabocados: de aproximadamente 3 mm. de dimetro interno.

4) Esquema de perforaciones: roseta, puede ser confeccionado sobre una base de papel
milimetrado o cartulina delgada, y mantenido entre dos laminas de plstico autoadhesivo
transparente.






5) Pipeta autmatica 20 ul y tips amarillos

6) Papel de filtro.

7) Cmara hmeda: recipiente plstico que asegure el mantenimiento de una superficie plana y
una atmosfera con elevada humedad relativa.
8) Estufa de cultivo: regulada a 35-37 C.

9) Antisueros: en ampollas de 1 ml:

1) Antiequino
2) Antibovino
3) Antiporcino.

Soluciones de antgenos o mezclas de antgenos a determinar:

Se preparan extractos salinos del producto crnico a analizar.

Preparacin de la muestra:
a. Se muelen finamente 100 g. de muestra y se le agregan 100 ml. de solucin fisiolgica
bufferada a pH 7,2; mantener en heladera a 4 C, con agitacin peridica, durante 12 hs.
b. Filtrar por gasa, centrifugar a mxima velocidad (4500 r.p.m) durante 20-30 separar el
sobrenadante y de ser necesario filtrar por papel de filtro de poro mediano.

Procedimiento:

1. Fundir a bao Maria los tubos de agar base para inmunodifusion, que sean necesarios de
acuerdo al volumen de trabajo.
2. Enfriar suave y espontneamente, hasta aproximadamente 50-55 C, para evitar la
formacin de excesiva cantidad de agua de condensacin en las placas.
3. Verter el contenido del tubo en la placa de Petri, sobre una superficie plana, de manera de
asegurar una pelcula de espesor homogneo. Dejar solidificar, y si no se usa
inmediatamente, conservar en heladera.
4. Sobreponer la placa sobre el esquema de perforaciones, y efectuar las mismas con el
sacabocados.

5. Identificar las placas y pocillos a sembrar. Descargar aproximadamente 20 ul en el pocillo
central el antgeno a investigar y en los circundantes, los distintos antisueros. En el caso de
tener que procesar muchas muestras, conviene colocar en el centro el antisuero y en los
pocillos de alrededor, los antgenos problema. Colocar la placa en un recipiente plstico
hermtico en cuya base previamente se ubic un papel de filtro humedecido con agua de
forma tal de generar un ambiente con alta humedad.
6. Llevar a estufa a 35-37C durante 24 hs.
7. Efectuar la lectura de las bandas blanquecinas de precipitacin sobre fondo oscuro. Donde
haya correspondencia entre antgeno y anticuerpo aparecern dichas bandas.

Ejemplo: Muestra 1: Muestra 2: Muestra 3:

Suero antibovino + + +
Suero antiequino - - +
Suero antiporcino - + +

Muestra 1: Contiene carne bovina
Muestra 2: Contiene carne bovina y porcina
Muestra 3: Contiene carne bovina, porcina y equina






























2

HARINAS

Segn el Cdigo Alimentario Argentino (Art. 661), se entiende por harina sin otro
calificativo, al producto obtenido de la molienda del endospermo del grano de trigo que responda a
las exigencias de ste. Las harinas tipificadas comercialmente con los calificativos: cuatro ceros
(0000), tres ceros (000), dos ceros (00), cero (0), medio cero ( 0), harinilla de primera y harinilla
de segunda, corresponden a los productos que se obtienen de la molienda gradual y metdica del
endospermo en cantidad de 70-80 % del grano limpio.

El anlisis de rutina puede incluir la determinacin de humedad, cenizas, tiza agregada, SO
2

(excepto en harina integral), grasa, protenas, acidez, Fe, tiamina, cido nicotnico, mejoradores,
agentes blanqueadores y examen microscpico. Industrialmente interesan otro tipo de anlisis, por
ejemplo, gluten, ensayos fsico-mecnicos sobre la masa obtenida de la harina, determinacin del
tamao de la partcula, actividad diastsica, color y el "filth test" (bsqueda de pelos de roedores y
restos de insectos).

Preparacin de la muestra

Antes de tomar muestra para anlisis, invertir y girar alternativamente el recipiente para
asegurar una mezcla homognea. Evitar temperaturas y humedades extremas cuando se abre el
frasco. Mantenerlo hermticamente cerrado en todo otro momento.

Humedad (Mtodo indirecto: A.O.A.C., 925.10, 1990; Mtodo oficial de la Junta Nacional de
Granos).

Pesar exactamente alrededor de 2 g de muestra en pesafiltro con tapa, previamente calentado
a 130 3 C, enfriado a temperatura ambiente en desecador y pesado. Destapar el pesafiltro y
secarlo con su contenido y la tapa 1 hora en estufa provista de abertura de ventilacin a 130 3 C
(el perodo de secado de 1 hora comienza cuando la temperatura de la estufa es realmente 130C).
Cubrir el pesafiltro dentro de la estufa, pasar a desecador, destapar all y pesar tapado en cuanto
llegue a temperatura ambiente.

Informar la prdida de peso como % de humedad.

Nota: es importante que se respete el tiempo de 1 hora y que durante el mismo NO SE ABRA LA
ESTUFA.

Cenizas

Se consideran como tal el residuo inorgnico que queda despus de quemar la materia
orgnica, generalmente a 500-550 C. Su composicin rara vez corresponde a la de las materias
minerales del producto debido a prdidas por volatilizacin, descomposicin e interaccin entre
constituyentes.

El porcentaje de cenizas de la harina es un ndice del grado de molienda, es decir, de la
perfeccin lograda en la separacin de salvado y germen del endosperma.




3

Mtodo directo ( A.O.A.C., 923.03, 1990).

Pesar exactamente de 3 a 5 g de muestra bien mezclada en una cpsula de 6 cm de dimetro,
previamente calcinada hasta peso constante en mufla a 550C (en el laboratorio se utilizar 700C,
para harinas). Incinerar sobre tela de amianto hasta carbonizacin y luego en mufla a 550C. Enfriar
en desecador y pesar tan pronto alcance la temperatura ambiente. Repetir la operacin hasta llegar a
peso constante.

El resultado se expresa en % de sustancia seca.

Nota 1: Si las cenizas quedan con trazas de carbn, humedecerlas con 3-5 gotas de agua, romper las
partculas de carbn con una varilla de punta chata, enjuagarla y evaporar cuidadosamente a
sequedad sobre un tringulo colocado sobre la tela metlica, antes de calcinar.

Nota 2: Esta determinacin debe realizarse por duplicado. Para informar considerar ambos
duplicados y evaluar la reproducibilidad (el error relativo debe ser menor del 3%).


Fibra insoluble en detergente neutro (Journal of the A.O.A.C., 50(1): 50-55 (1967); AOAC,
920.86, 1990)

Reactivos:

- Solucin de detergente neutro (dodecil sulfato de sodio, EDTA, etilenglicol, buffer de pH 6,9-7,1)
- Antiespumante
- Acetona
- Sulfito de sodio anhidro

Pesar exactamente 0,5-1,0 g de muestra y transferirla a un Erlenmeyer de 250 ml
esmerilado. Agregar en el siguiente orden, 100 ml de solucin de detergente neutro, 10 gotas de
antiespumante y 0,5 g de sulfito de sodio. Conectar al condensador y calentar de manera tal que
entre en ebullicin en 5-10 min.. Cuando la solucin entr en ebullicin, reducir el calentamiento
para evitar la formacin de espuma. Hervir exactamente 60 min. (contar el tiempo a partir del
momento en que comenz la ebullicin), agitando peridicamente para suspender los slidos
adheridos a las paredes. Filtrar inmediatamente a travs de un crisol de vidrio de poro grueso
previamente tarado, aplicando vaco en forma suave, Lavar el Erlenmeyer con un mnimo de agua
caliente (80-90 C), volcar en el crisol y succionar hasta casi sequedad. Repetir el lavado con agua
caliente dos veces ms. Luego lavar dos veces con acetona (aproximadamente 5 ml por vez) y
succionar hasta sequedad. Secar el crisol en estufa a 100 C durante 8 horas o toda la noche.

Calcinar durante 3 horas a 500-550 C, enfriar en desecador y pesar. La diferencia de peso
obtenida se refiere a porcentaje de muestra y se consigna como fibra insoluble en detergente neutro.

Nota 1: Esta determinacin no se realizar sobre harina de trigo. Solicitar la muestra
correspondiente al personal docente.

Nota 2: Debido a inconvenientes de orden prctico, en el laboratorio no se realizar la etapa de
calcinacin. El resultado se informar como el peso obtenido, referido a 100, luego del secado a
100 C.

4

Fibra insoluble en detergente neutro (modificacin: tratamiento con amilasa)

Reactivos:

- Solucin de detergente neutro (dodecil sulfato de sodio, cido etilendiamitetractico (EDTA),
trietilenglicol, buffer de pH 6,9-7,1)
- Acetona
- - amilasa estable al calor
- Agua destilada en ebullicin

Pesar exactamente 0,5-1,0 g de muestra perfectamente molida y transferirla a un Erlenmeyer
de 250 ml esmerilado. Agregar 100 ml de solucin de detergente neutro y 0,2 ml de amilasa
Conectar al condensador y calentar de manera tal que entre en ebullicin dentro de los 5 min de
haber comenzado el calentamiento. Cuando la solucin entr en ebullicin, reducir el calentamiento
para evitar la formacin de espuma. Hervir exactamente 60 min. (contar el tiempo a partir del
momento en que comenz la ebullicin), agitando peridicamente para suspender los slidos
adheridos a las paredes. Filtrar inmediatamente a travs de un crisol de vidrio de poro grueso
previamente tarado, aplicando vaco en forma suave. (Para tarar el crisol colocar el crisol seco
aproximadamente 30 minutos a 100C). Lavar el erlenmeyer con un mnimo de agua a ebullicin,
volcar en el crisol y succionar hasta casi sequedad. Repetir el lavado con agua caliente dos veces
ms, arrastrando la fibra contenida en el erlenmeyer con la ayuda de un policeman. Lavar la residuo
en el crisol dos veces con agua en ebullicin. Luego lavar dos veces con acetona (aproximadamente
5 ml por vez) y succionar hasta sequedad. Secar el crisol en estufa a 100 C durante 8 horas o toda
la noche.

Calcinar durante 3 horas a 500-550 C, enfriar en desecador y pesar. La diferencia de peso
obtenida se refiere a porcentaje de muestra y se consigna como fibra insoluble en detergente neutro.

Nota 1: Esta determinacin no se realizar sobre harina de trigo. Solicitar la muestra
correspondiente al personal docente.
Nota 2: Debido a inconvenientes de orden prctico, en el laboratorio no se realizar la etapa de
calcinacin. El resultado se informar como el peso obtenido, referido a 100, luego del secado a
100 C.










PROPIEDADES FUNCIONALES DEL ALMIDON

Finalidad del anlisis: Observar las propiedades funcionales de almidones de distintas fuentes,
analizando las diferencias.

5

Introduccin:

El almidn es el hidrocoloide ms ampliamente usado en la tecnologa de alimentos, Esto es
debido a su gran versatilidad funcional, ya sea en sus formas natural o modificada, y adems por su
costo relativamente bajo.
Los cambios de viscosidad que ocurren cuando el almidn se calienta en medio acuoso, as
como la capacidad de gelificar y la estabilidad de las pastas y geles formados son de fundamental
importancia en tecnologa de aliemntos.
Como resultado de su estructura y composicin particulares, cada almidn tiene un
comportamiento distinto enm cuanto a la viscosidad de sus pastas, al tipo de gel formado y a al
tendencia a la gelificacin y a la retrogradacin. De esta manera, eligiendo el almidn correcto se
pueden controlar las caractersticas de un producto.


Determinacin de propiedades funcionales del almidn.

Determinacin de la concentracin aproximada necesaria para gelificar.

Preparar 40 ml de solucin al 10% de almidn en agua destilada. A partir de esta solucin
preparar soluciones de concentracin 8%; 6%, 4% y 2 % de almidn.
Transferir 10 ml de solucin 10% a un tubo de ensayos grande y colocar en un bao de agua a
ebullicin. Agitar con varilla constantemente hasta ebullicin. Continuar el calentamiento con agitacin
durante 5 minutos. Enfriar en bao de agua fra.
Repetir este procedimiento para las restantes diluciones.
Informar la concentracin mnima necesaria para gelificar.


Tendencia a la retrogradacin


En un tubo de centrfuga, suspender 2 g de almidn en 40 ml de agua destilada. Colocar el tubo
con la suspensin en bao de agua en ebullicin. Agitar constantemente hasta ebullicin para evitar la
formacin de grumos. Continuar el calentamiento con agitacin por 5 minutos. Enfriar en agua fra y
observar las caractersticas del gel formado (por ejemplo transparente, opaco, gomoso, elstico, etc.).

La tendencia a la retrogradacin se estima a partir del volumen de agua separado luego de su
almacenamiento a 4C durante un tiempo estipulado. Colocar a 4C hasta la siguiente clase de
laboratorio. Centrifugar durante 20 minutos y luego extraer por succin (usar pipeta Pasteur) el agua
separada. Informar el volumen de lquido separado.

Informar las caractersticas del gel formado y el volumen desplazado por retrogradacin para
cada almidn estudiado.

Confeccionar una tabla, tal como se muestra a continuacin, para presentar los datos
correspondientes a tres almidones diferentes. Comparar sus propiedades y comentar las posibilidades
de emplear uno u otro para diferentes tipos de productos alimenticios.

Tipo de almidn Caractersticas del gel Tendencia a retrogradar
6









































PRODUCTOS AZUCARADOS

Los azcares son nutrientes proveedores de energa y junto a otros hidratos de carbono
superiores constituyen, en general, ms del 50 % de la dieta humana. Los principales son: sacarosa
(obtenida por ej. de caa de azcar o remolacha azucarera); glucosa (proveniente de hidrlisis de
almidones, principalmente de sacarosa); y otros como fructosa, lactosa, maltosa, etc.

7

Como ejemplo de producto azucarado se encarar el anlisis de miel. sta, como cualquier
producto alimenticio, debe cumplir con normas de calidad organolpticas fisicoqumicas, y
microbiolgicas.

MIEL

a) DEFINICIN
Se entiende por miel el producto alimenticio producido por las abejas melferas a partir del
nctar de las flores o de las secreciones procedentes de partes vivas de las plantas o de excreciones
de insectos succionadores de plantas que quedan sobre partes vivas de plantas, que las abejas
recogen, transforman, combinan con sustancias especficas propias y almacenan y dejan madurar en
las panales de la colmena.
Por su origen botnico se clasifican como Miel de flores a la obtenida principalmente de los
nctares de las flores y Miel de mielada a la obtenida a partir de secreciones de las partes vivas de
las plantas o de excreciones de insectos succionadores de plantas que se encuentran sobre ellas.
b) COMPOSICIN
La miel es una solucin concentrada de azcares, mayoritariamente glucosa y fructosa.
Contiene adems una mezcla compleja de otros hidratos de carbono, enzimas, aminocidos, cidos
orgnicos, minerales, sustancias aromticas, pigmentos, cera y granos de polen.
c) DETERIORO
El deterioro se refiere a la alteracin de las caractersticas propias de la miel, consecuencia del
sobrecalentamiento, el envejecimiento y la fermentacin. Esto se mide a travs de la acidez libre, la
actividad enzimtica y la cuantificacin del hidroximetilfurfural (HMF)


Toma de muestra (A.O.A.C., 969.38 B, 1990).

Las mieles que presentan cristalizacin de azcares (granulacin) deben homogeneizarse
introduciendo el envase en un bao de agua a una temperatura no mayor de 60. Agitar hasta
disolucin de los cristales, enfriar y tomar la porcin para el anlisis. Si no se observa granulacin
basta agitar con una varilla.


Contenido de Agua

La miel es un alimento de humedad intermedia. Su contenido de agua suele oscilar entre 14
a 20%, dependiendo de las condiciones climticas, periodo del ao, humedad inicial del nctar y
grado de maduracin alcanzado en la colmena as como de su origen biogeogrfico. La variacin de
la humedad interviene en los fenmenos de granulacin y marca la estabilidad del producto desde el
punto de vista microbiolgico. El ndice de refraccin, la humedad y el contenido de slidos
solubles totales, son parmetros correlacionados. El porcentaje mximo de humedad permitido es
del 18% segn la legislacin vigente.

Se determina por refractometria a 20C o por secado en estufa de vaco a 60-70C. En el
Laboratorio se determinar por refractrometria

8

Humedad, mtodo refractomtrico ( A.O.A.C., 969.38 B, 1990):

Procedimiento:
Abrir el doble prisma y esparcir la muestra con ayuda de una varilla sobre la cara inferior,
cerrar los prismas firmemente y dejar un minuto para que la temperatura de la muestra y el aparato
se equilibren. Buscar en el campo del visor la franja que indica reflexin total; ajustar dicha franja
en el punto de interseccin de la cruz del visor, rotando el tornillo compensador si la lnea no fuera
ntida y presentara coloracin.

Leer el ndice de refraccin directamente sobre la escala, hacer 2 o 3 lecturas y
promediarlas. Calcular el % de agua a partir de la siguiente tabla (A.O.A.C., 940.39, 1990):




Como el refractmetro a utilizar no cuenta con camisa termostatizada, se har circular agua
durante las observaciones, se leer la temperatura en el termmetro del aparato y se corregir la
lectura para obtener la equivalencia a 20, como se indica en la nota al pie de la tabla.
El instrumento se calibra con agua destilada a 20C (ndice de refraccin = 1,3330).



9

Hidratos de Carbono

Aunque los azucares pueden determinarse por mtodos qumicos (mtodos de reduccin del
cobre A.O.A.C., 920.183, 1990, iodometria de aldosas), estos en su mayora carecen de
especificidad y no pueden distinguir la glucosa de otros monosacridos. La cromatografa liquida de
alta resolucin (HPLC), con detector de ndice de refraccin, es un mtodo de eleccin para el
anlisis de hidratos de carbono.

Existen adems mtodos enzimticos, sensibles y especficos, para cuantificar azucares. Se
encuentran disponibles comercialmente una serie de paquetes de reactivos especialmente
preparados en composicin y concentracin adecuadas para ser empleados en al anlisis de
determinados componentes de alimentos.

Estos conjuntos de reactivos (o "kits") son ampliamente empleados en el rea de anlisis
clnicos y de aguas, y se introdujeron con xito en los laboratorios de anlisis de alimentos.


Determinacin de Glucosa

Mtodo de la glucosa oxidasa-peroxidasa (Trinder, 1972)

La determinacin de la glucosa se realizar mediante un mtodo enzimtico colorimtrico.

Fundamento: se basa en la oxidacin de glucosa a cido glucnico por accin de la enzima
glucosa oxidasa (E.C.1.1.3.4)
2
con formacin de H
2
O
2
. El perxido de hidrgeno formado, en
presencia de la enzima peroxidasa, produce una oxidacin en la que se une el fenol con la 4-
aminofenazona para dar una quinonaimina coloreada. La intensidad del color, medido por la
absorbancia, es proporcional a la concentracin de glucosa presente en la muestra.


GOD
C
6
H
12
O
6
+ O
2
C
6
H
10
O
6
+ H
2
O
2
3

POD
2 H
2
O
2
+ 4-AF + fenol quinona coloreada+ 4 H
2
O

Materiales:

1 matraz de 100 ml
1 vaso de 50 ml.
1 embudo, papel de filtro.
Tubos de ensayo corto
Micropipeta automtica (50 l)

2
Las enzimas se nombran segn un cdigo de cuatro nmeros (EC.a.b.c.d) que hacen referencia al tipo de reaccin que
catalizan, al grupo cataltico y al sustrato sobre el que actan

10

Espectrofotmetro UV-visible con cubetas de 1 cm de paso de luz.

Preparacin de la muestra: Pesar y diluir convenientemente la muestra tal para que la
concentracin de glucosa sea alrededor de 100 - 200 mg%. Pesar a la dcima de mg y trasvasar
cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml mediante lavados con agua destilada. Disolver
mezclando y sin calentar. Aadir 1 ml de crema de almina, mezclar bien y llevar a volumen. Filtrar a
travs de papel de filtro, desechando los primeros 10 ml. Mantener la solucin filtrada a 20C. Si la
solucin est perfectamente lmpida, no filtrar. En caso de duda, consultar a un docente.

Procedimiento:

1. Colocar 50 l de muestra en un tubo de ensayo
2. Agregar 5 ml del reactivo de trabajo preparado.
3. Incubar en bao de agua a 37C durante 10 minutos.
4. Realizar el mismo procedimiento con una solucin standard de glucosa 0.1%
y un blanco con agua.
5. Medir la absorbancia de las muestras a 505 nm en cubetas de vidrio o plstico.


Clculos:

Abs muestra x Conc. Standard (g/100 ml)
% glucosa = ---------------------------------------------------- x 100
Abs standard x Conc. Muestra (g/100 ml)



Hidroximetilfurfural (HMF) y posible presencia de Dextrinas

El 5-hidroximetil-2-furaldehdo o hidroximetilfurfural (HMF) es un producto generado por
la deshidratacin -catalizada por cidos- de azcares y/o por reaccin de Maillard a partir de
azcares reductores.


La miel recin extrada contiene muy poca cantidad de HMF, sin embargo su contenido
puede aumentar por sobrecalentamiento y tambin durante su procesamiento y posterior
almacenamiento. Este producto suele ser sometido a tratamiento trmico con el fin de reducir la
viscosidad y prevenir la cristalizacin y/o la fermentacin. Con respecto al almacenamiento, si la
miel se mantiene por largos perodos a temperaturas promedio entre 12 y 15 C, la formacin del
HMF ser mnima, pero a temperaturas superiores se ver favorecida, debido principalmente al
valor de acidez propio de la miel.
Por otra parte, la miel, compuesta principalmente por azcares, ha sido tradicionalmente
objeto de adulteraciones con jarabes. stos se obtienen de manera muy econmica a partir de la
hidrlisis cida del almidn. Durante este tratamiento se forman dextrinas y HMF en cantidades
11

importantes, con lo cual, la presencia de altos niveles de estos compuestos en miel sugieren la
posibilidad de que el alimento haya sido adulterado con este tipo de productos.
Por lo anteriormente expuesto, el contenido de HMF constituye un parmetro de genuinidad
de importancia en miel. Segn el Cdigo Alimentario Argentino (C.A.A.) la cantidad mxima
permitida de HMF en la miel es de 40 mg/kg.



Determinacin de hidroximetilfurfural por H.P.L.C.

Principio: El hidroximetilfurfural ser determinado en una solucin acuosa de miel, clara y
filtrada, utilizando cromatografa lquida de alta performance en fase reversa, equipada con un
detector UV-visible. Se cuantificar utilizando una curva de calibracin construida a partir de las
seales de estndares conocidos.
Reactivos
a. Agua bidestilada o Millipore necesaria para preparar todas las soluciones a utilizar.
b. Fase mvil: agua-metanol (90+10), ambos calidad HPLC.
c. Solucin acuosa estndar de HMF (aproximadamente 400 mg/L).
d. Solucin de Carrez I: disolver 15 g de K
4
Fe(CN)
6
.3H
2
O en agua y llevar a 100 ml.
e. Solucin de Carrez II: disolver 30 g de Zn(CH
3
.COO)
2
.2H
2
O y llevar a 100 ml.

Equipamiento
Equipo para HPLC marca Spectra System P2000, Thermo Separation Products, equipado
con una vlvula inyectora Reodyne provista de un loop de inyeccin de 10 l, detector UV-visible
Spectra 100, Thermo Separation Products, y un integrador Data Jet Integrator, Thermo Separation
Products. La columna a utilizar ser Phenomenex Sphereclone s u ODS (2); 250 mm x 4,6 mm id x
5 m. La deteccin se realizar a = 272 nm

Procedimiento

Curva de calibracin:

Preparar, a partir de la solucin madre entregada por el docente, soluciones estndar de
HMF de concentraciones 1, 2, 5 y 10 mg/L (consultar).
Inyectar por triplicado 20 l de cada una de las soluciones estndar de HMF. Las
corridas se realizarn en modo isocrtico, a temperatura ambiente, con un flujo de 1 ml/min. A
partir de los resultados obtenidos, grafique la curva de calibracin correspondiente (rea vs.
concentracin estndar de HMF).

Muestra:

Pesar exactamente 5 g de miel en un vaso de precipitados de 50 ml. Disolver la muestra
en aproximadamente 25 ml de agua (bidestilada o millipore) y transferir cuantitativamente a un
matraz de 50 ml. Agregar 0,5 ml de la solucin de Carrez I y mezclar. Agregar 0,5 ml de solucin
de Carrez II, mezclar y llevar a volumen con agua (pueden agregarse unas gotas de etanol para
prevenir la formacin de espuma). Filtrar en papel, descartando los primeros 10 ml del filtrado.
Posteriormente, filtrar a travs de un filtro de membrana de 0.45 m.
12


Inyectar la muestra por triplicado. A partir de las reas obtenidas y utilizando la curva de
calibracin, calcule el valor, en mg/kg, del contenido de HMF del producto analizado.


Determinacin de presencia de dextrinas

Procedimiento
Colocar aproximadamente 1 g de miel en un vaso de precipitado de 50 ml. Agregar 4 ml de agua
destilada y disolver completamente la miel. Tomar 2 ml de la solucin anterior, colocarlos en un
tubo de ensayos y agregar 1 ml de etanol.
Observar el resultado:
a) Lquido limpio: miel no adulterada.
b) Lquido blanco-lechoso: miel adulterada.

Actividad Diastsica

Las enzimas son componentes minoritarios de la miel, pero su actividad enzimtica es fundamental
para la transformacin del nctar en miel, ya que modifica azcares complejos en simples, de fcil
asimilacin. El Cdigo Alimentario Argentino contempla la determinacin de la actividad
Diastsica (una de las enzimas de la miel) como una forma de valorar calidad, no por su
importancia dietaria, sino por su sensibilidad al calor e inactivacin por sobrecalentamiento o
envejecimiento de la miel.

Principio del mtodo: El sustrato de almidn tamponado, se incuba con la muestra, producindose
la hidrlisis enzimtica, que se determina por el agregado de reactivo de yodo, el cual produce
coloracin con el remanente del almidn no hidrolizado.

Materiales
Buffer acetato pH: 5.3 (1,59 M)
Acetato de sodio 3 H
2
O 87 g
cido actico glacial 10,5 ml
Agua destilada c.s.p. 500 ml
Disolver el acetato de sodio en 400 ml de agua, aadir el cido actico disuelto en 50ml de agua y
completar hasta 500 ml. Ajustar a pH: 5,3 con acetato de sodio o cido actico, segn el caso.

Solucin de cloruro de sodio 1 %
Cloruro de sodio 1 g
Agua destilada c.s.p. 100 ml

Solucin de almidn (0.05 %)
Almidn soluble 0.050 g
Agua destilada csp 100 ml
Disolver el almidn en 80 ml de agua y llevar a ebullicin 3 min. luego llevar a 100 ml.
Conservar en frasco color caramelo en la heladera.

Solucin de Iodo 0.1 N
Ioduro de potasio 20,0 g
13

Iodo 12,7 g
Agua destilada csp 1000 ml
Disolver el IK en 100 ml de agua, luego agregar el I
2
sublimado y completar a 1,0 litro.
La solucin de trabajo se prepara por dilucin de la solucin de Iodo 0.1 N (1:10) con una solucin
de NaF (2 %). Conservar en frasco color caramelo en la heladera.

Preparacin de la muestra

Pesar 10,00 g de muestra de miel en un vaso de precipitado de 50 ml y aadir 10 ml de buffer pH:
5,3.

Procedimiento

1. Colocar en una gradilla 10 tubos de ensayo y agregarle 1 ml de solucin de cloruro de sodio al 1
%.
2. Agregar al primer tubo 1 ml de la muestra y mezclar.
3. Pasar luego 1 ml del primer tubo al segundo, mezclar y continuar as hasta el noveno tubo,
desechando el ltimo ml (las diluciones sern: 1/2; 1/4; 1/8; hasta 1/512).
4. El tubo dcimo sirve de testigo
5. Colocar a cada tubo 1 ml de solucin de almidn 0,050 % e incubar por 30 min a 37 C.
6. Retirar, enfriar rpidamente y colocar una gota de solucin de trabajo de yodo a cada tubo y
agitar.
Observar la coloracin.

Expresin de los resultados

U.D = (dilucin mayor que permanece incolora) x 2

Valor normal de miel: no menos de 32 U.D.
Cantidades menores de 32 U.D. corresponden a una miel vieja, calentada, mal procesada o
adulterada. Existen mieles de bajo contenido de diastasa, por ejemplo, mieles de citrus.

Tabla de equivalencias del mtodo de Bianchi y el I.D que corresponde al nmero de de la escala de
Gothe.






ID (Gothe) U.D.
Bianchi Mnimo Mximo
0 0.99 2.88
4 2.93 4.16
8 4.32 5.70
16 7.28 8.08
32 9.01 14.68
64 15.22 27.25
128 33.48 67.87
14



Acidez Libre

La acidez libre se mide en funcin de los cidos orgnicos que naturalmente contiene la miel. Los
valores normales de acidez se incrementan si la miel ha fermentado y esto sucede en mieles con
elevados porcentaje de humedad donde se han desarrollado mohos y levaduras. El CAA establece
un valor mximo permitido.

Reactivos

Solucin de NaOH (0.05 N)

Determincacin

Pesar aproximadamente 10 g de muestra en un vaso de precipitados de 250 ml y agregarle 75 ml de
agua destilada. Agitar y disolver completamente. Colocar el electrodo del pHmetro en la solucin,
registrar el pH inicial y luego agregar NaOH 0.05 N con un flujo aproximado de 5 ml/min hasta
alcanzar un pH de 8.50. Expresar los resultados como meq de NaOH 0.05 N/Kg de muestra.





15

ALTERACIONES DE LPIDOS

Indice de cidos grasos libres (IUPAC, II.D.1, modificado)
Los aceites y grasas, debido a la accin de las lipasas, contienen cidos grasos libres en mayor o
menor cantidad segn sean las condiciones de manufactura y tiempo de almacenamiento del
producto. El Cdigo Alimentario Argentino menciona el mximo valor de acidez libre permitido en
aceites comestibles (Art. 525).
Se expresa en mg de KOH requeridos para neutralizar los cidos grasos libres presentes en 1 g
de grasa.

Reactivos:
- Sol. de etanol: ter etlico (1:1 v/v) neutralizada = 60 ml.
- NaOH 0.05 N valorado.
- Sol. de fenolftalena al 1 %

Pesar exactamente, en un Erlenmeyer tarado de 125 ml, 1-2 g de muestra y disolverla en 60 ml
de la mezcla de solventes previamente neutralizada a la fenolftalena con NaOH diludo. Agitar y
titular con NaOH 0.05 N valorado, utilizando una pipeta de 2 o 5 ml graduadas al 0.1 ml (No
introducir la pipeta mojada en el frasco del NaOH 0.05 N, sino sacar 10 ml en un vasito y pipetear
de all).
Calcular e informar la acidez libre en mg de KOH por g de aceite y en g de cido oleico por 100
g de aceite, que es otra forma comn de expresarla. (PM cido oleico = 282.4).
Nota: Punto final: que la coloracin rosa del indicador permanezca 15-30 seg.
Clculo de resultados:

IA (mg KOH / 1 g grasa) = (V x N x f)
NAOH
M
KOH
/ m
M

IA (g cido oleico / 100 g aceite) = (V x N x f)
NAOH
M
ACIDO OLEICO
x 100

/ (1000 x m
M
)



Donde: IA: ndice de acidez V
NaOH
: ml de NaOH gastados en la titulacin
N
NaOH
: normalidad del NaOH f
NaOH
: factor del NaOH m
M
: masa de muestra (g)

Indice de perxido (A.O.A.C., 965.33, 1990; A.O.C.S., Cd 8-53, 1963)

Las grasas y aceites, por accin de diversos factores fsicos o biolgicos (disponibilidad de oxgeno,
presencia de ciertas enzimas y metales, accin de la luz, el calor y la humedad, etc.) sufren procesos de
rancidez oxidativa.
16

Este mtodo determina todas las sustancias que bajo las condiciones del test, oxidan al ioduro de
potasio, y las expresa en trminos de miliequivalentes de perxido por 1000 g de muestra. Se asume
generalmente que todas las sustancias son perxidos u otros productos similares de la oxidacin de
grasa. Es aplicable a todas las grasas y aceites tpicos, includas las margarinas. El mtodo es
altamente emprico y cualquier cambio en el procedimiento puede provocar variacin de los
resultados.

Reactivos:

- Mezcla cido actico-cloroformo (3:2)
- Solucin saturada de KI.( se prepara en el momento)
- Solucin de Na
2
S
2
O
3
0,1 N (valorada).
- Solucin de Na
2
S
2
O
3
0,01 N (valorada).
- Solucin de almidn 1%.

Pesar 5,00 0,05 g de muestra en un Erlenmeyer de 250 ml de capacidad, con tapa esmerilada.
Agregar 30 ml de la mezcla de solventes. Agitar hasta disolucin total de la muestra. Agregar 0,5 ml de
la solucin saturada de KI, usando pipeta (preferiblemente de tipo Mohr). Dejar la solucin
exactamente 1 min., con ocasional agitacin, y agregar despus 30 ml de agua destilada.
Titular con solucin de Na
2
S
2
O
3
0,1 N, agregndole gradualmente y con agitacin constante y
vigorosa. Continuar la titulacin hasta que el color amarillo haya casi desaparecido. Agregar
aproximadamente 0,5 ml de solucin indicadora de almidn. Continuar la titulacin agitando
vigorosamente el Erlenmeyer cerca del punto final, para liberar todo el I
2
de la capa clorofrmica.
Agregar la solucin de Na
2
S
2
O
3
gota a gota hasta desaparicin del color azul. Si el gasto de Na
2
S
2
O
3

0,1 N es muy pequeo (< 0,5 ml), repetir la determinacin y titular con solucin de Na
2
S
2
O
3
0,01 N.
Conducir paralelamente un blanco (el volumen gastado debe ser < 0,1 ml de Na
2
S
2
O
3
0,1 N).

Clculo de resultados:

IPO (meq. de perxido / 1000 muestra = (M B) x N x f x 1000 / m
M


Donde:

M = ml de Na
2
S
2
O
3
gastados en la titulacin de la muestra.
B = ml de Na
2
S
2
O
3
gastados en la titulacin del blanco.
N = normalidad de la solucin de Na
2
S
2
O
3
.
f = factor de la solucin de Na
2
S
2
O
3

m
M
= masa de muestra (g)

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