UNIVERSIDAD PARTICULAR DE CHICLAYO

FACULTAD DE MEDICINA
SEMINARI
O N 3
SONDAS GNICAS
COMERCIALES
DOCENTES:
Dr. Guzmn Vigo Csar Alberto
Lic. Guzmn Tello Marco

INTEGRANTES:
Campos Vargas Rosa Mileydi - 20131038
Gonzales Yaipen Omar 20131061
Marlo Manayay Csar Ying 20132043
Tineo Medina Luisa Janella- 20131147
Torres Rios Lizbeth 20121200
21/04/14
21/04/2014
UNIVERSIDAD PARTICULAR DE CHICLAYO
FACULTAD DE MEDICINA
SEMINARI
O N 3
SONDAS GNICAS
COMERCIALES
DOCENTE:
Dr. Luis Cotrina Escalante
INTEGRANTES:
Tineo Medina Luisa Janella
Poo C!rdo"a Diana
Ro#$n %el$&ue 'ern$n
C(u#)*n S$nc(e %er!nica
Ca#ac(o Paola
16/12/2013
INTROD+CCI,N

INTROD+CCI,N
Una sonda es un reactivo biolgico constituido por un fragmento de ADN que
posee una secuencia de -ases co#)le#entaria a la del genoma de un microorganismo.
Las sondas gnicas son molculas de ADN sealadas con un marcador que tienen
el poder de reconocer genes en los cromosomas y establecer si dichos genes son
normales o portadores de alteraciones.
ntre las principales venta!as de las sondas genticas hay que destacar la
sencille" de su manipulacin# que permite su adaptacin a cualquier laboratorio. l
principal inconveniente es su coste. s una tecnolog$a muy utili"ada en la actualidad en
laboratorios nivel %%
Una de sus aplicaciones m&s e'tendida consiste en el establecimiento de
diagnsticos prenatales# que son reali"ados sobre muestras de clulas fetales. l an&lisis
gentico del feto permite establecer si el nio que va a nacer es portador o no de un gen
defectuoso o deletreo.
(or lo tanto# desde el punto de vista tico# el diagnstico prenatal es aceptable y
v&lido si respeta la vida e integridad del embrin y del feto humano# y siempre que de su
estudio vayan a derivarse beneficios para su curacin o conservacin. l diagnstico
prenatal debe tener como fin la curacin y no una sentencia de muerte que#
irremediablemente# condu"ca al aborto del feto. l portador de una malformacin
congnita no pierde por esto las prerrogativas propias de un ser humano# a quien debe
tribut&rsele el respeto a que tiene derecho todo paciente.
l diagnstico mediante el empleo de sondas gnicas puede utili"arse tambin
despus del nacimiento# por e!emplo# para precisar la naturale"a y amplitud de una
alteracin gentica) o para el caso de pare!as procedentes de familias *de riesgo* en
particular para las mu!eres que deseen saber si son *portadoras * de un determinado
precursor de enfermedad +,ros -../0.
O.JETI%OS:
Determinar que es una sonda y cu&ntos y cu&les son los tipos que e'isten.

%dentificar el diseo de una sonda y la forma en la que se prepara.
Determinar el tamao de la sonda y la relacin que tiene con su estabilidad.
Anali"ar la hibridacin in situ as$ como las aplicaciones que tiene.
/NDICE
INTROD+CCI,N
O.JETI%OS
CAP/T+LO I : SONDAS GNICAS
0.0 De1inici!n
1.2 Ti)os de sondas
0.2 Clases de #arca3e )ara "isualiaci!n de las #ol*culas dianas
0.2.0 Radiacti"idad
0.2.4 Marca3e in#unol56ico

0.7 Pre)araci!n de la sonda
0.7.0 El dise8o de la sonda
0.7.4 Elecci!n de la sonda:
0.7.2Ta#a8o de la sonda:
0.7.7 Esta-ilidad de la sonda 9 la interacci!n con su -lanco
0.7.: Sondas de do-le cadena contra cadena sencilla:
0.: %enta3as de las sondas 6en*ticas
CAP;T+LO II : 'I.RIDACI,N IN SIT+
4.0 De1inici!n
4.4 Moduladores de (i-ridaci!n
4.4.0 Co#)le#entariedad <secuencia de -ases=
4.4.4 Te#)eratura
4.4.2 )' 9 )roductos &u>#icos
4.2 'i-ridaci!n ?In Situ? @luorescente <@IS'=
4.2.0 Protocolo -$sico
4.2.4 @IS' en Meta1ase
4.2.2 @IS' en Inter1ace
4.2.7 Otras "ariantes de @IS'
CAP/T+LO III : APLICACIONES
2.0 A)licaciones
2.4 Ano#al>as
2.4.0 Ano#al>as nu#*ricas

2.4.4 Ano#al>as estructurales
CONCL+SIONES
.I.LIOGRA@/A
CAP;T+LO I: SONDAS GANICAS
0.0.B De1inici!n
1ioqu$micamente una sonda es una molcula de ADN o A2N homologa a una
secuencia de A2N o ADN diana# con la que h$brida de forma estable y especifica +por
asociacin de bases complementarias0.
La sonda es una copia fiel de un gen o de un fragmento de A2N o ADN y se unir&
e'clusivamente esa secuencia de la que es copia. sto es lo que se llama especificidad
de la sonda.
Una ve" que la sonda se une a la secuencia diana se detecta y cuantifica. La
deteccin solo es posible si la sonda se ha marcado con un grupo detectable.

Dependiendo del n3mero de estos grupos incorporados y de la seal que emitan la sonda
puede tener diferente sensibilidad.
0.4.B Ti)os de sondas
Distintos tipos de sondas de &cidos nucleicos pueden ser utili"adas para la
hibridacin in situ4
1. 5ondas de DNA doble cadena. (ueden ser preparadas utili"ando tcnicas
como 6nic7 translation# random priming o (829# en las cuales el nucletido
marcado es incorporado. (82 y random priming proporcionan una buena
actividad espec$fica. stas sondas pueden ser desnaturali"adas antes de usar.
8uando se usan para detectar una cadena simple como m2NA# estas son menos
sensibles debido a que la concentracin de la sonda marcada es reducida.
2. 5ondas de DNA de cadena simple +largas0. (ueden ser preparadas
utili"ando 6primer e'tension9 en templados de cadena simple o por (82 con un
nucletido marcado. :ste 3ltimo es el m&s usado porque es m&s f&cil de llevar a
cabo y las marcas pueden sinteti"arse con poca cantidad de material.
l (82 permite una gran fle'ibilidad en la eleccin de las secuencias marcadas
por el uso de primers. stas marcas han sido ampliamente usadas.
3. ;ligonucletidos +entre <= y >= bases0. 5on marcados incorporando
oligonucletidos modificados durante la s$ntesis qu$mica o adicionando una cola
marcada. Una de las desventa!as es que algunos oligonucletidos marcados no
se incorporan y por tanto la sensibilidad disminuye.
4. 5ondas de 2NA de cadena sencilla. (ueden ser sinteti"adas por el uso de
una 2NA polimerasa +5(?# @A o @/ 2NA polimerasa0. La secuencia de la sonda
es clonada en un vector que flanquear& dos sitios distintos de iniciacin.
La cadena de 2NA anti sentido +sonda0 es sinteti"ada en direccin opuesta al gen
endgeno. 5e recomienda lineari"ar la sonda de 2NA con en"imas que de!en el e'tremo
BC cohesivo# porque se ha reportado# que el e'tremo /C romo promueve la s$ntesis de
transcritos anormales.

0.2.B Clases de #arca3e )ara "isualiaci!n de las #ol*culas dianas
(ara visuali"ar las molculas diana se utili"a una sonda marcada# bien
radiactivamente# o mediante marca!e inmunolgico. (ara el uso de ADN de doble cadena
primeramente es necesario desnaturali"arlo mediante calor o en condiciones de alta
alcalinidad. sta sonda de cadena simple marcada se une a la diana) y los lugares de
unin se detectan porque los mtodos de marca!e de!an una seal detectable mediante
fotograf$a. n los mtodos m&s avan"ados se utili"an marca!es mediante fluorescencia
que emiten seales detectadas mediante lDser# como el utili"ado en la (82 a tiempo real.
0.2.0.B Radiacti"idad
5e puede marcar radiactivamente la sonda utili"ado nucletidos que tengan alguno
de sus &tomos con un istopo radiactivo.
l istopo m&s utili"ado es el (/<# con alta actividad espec$fica +.<== 8iEmmol
puro0 y emite part$culas de alta energ$a +-FA GeH0 por lo que sondas marcadas con este
elemento tienen un elevado rendimiento y sensibilidad.
l marca!e puede ser en diferentes posiciones. l (/< tiene un periodo de
semidesintegracin relativamente corto# -> d$as# lo que obliga a usar las sondas
marcadas dentro del periodo de una semana despus del marca!e# y adem&s la emisin
de part$culas durante largo tiempo puede alterar la estructura de la sonda.
0.2.4.B Marca3e in#unol56ico
Aunque el marca!e radiactivo es muy sensible# conlleva el peligro asociado a la
utili"acin de radiactividad. (ara evitar este peligro se desarrollaron otros mtodos de
marca!e basados en anticuerpos. Las sondas se marcan utili"ando nucletidos que llevan
unida una molcula +digo'igenina0# a la solucin se le aaden anticuerpos espec$ficos que
se unen a esa molcula) y estos anticuerpos llevan asociado un compuesto luminiscente o
fluorescente +8omo el 8D(I5tar0 que de!a impronta fotogr&fica.
0.7.B Pre)araci!n de la sonda

(ara sondas de cadena sencilla# se debe usar la secuencia reversa
complementaria. 8uando las sondas son sinteti"adas por transcripcin# involucra generar
m2NA del gen endgeno. 8uando se disean los oligos marcados# es importante recordar
que la secuencia antisentido es la hebra complementaria reversa de la cadena l$der y
debe ser le$da de BC a /C.
n general es preferible usar sondas espec$ficas# ya que esto garanti"a una buena
hibridacin. 'isten situaciones en las cuales esto no puede llevarse a cabo# por e!emplo#
si los genes todav$a no est&n clonados de las especies usadas para la hibridacin o si la
secuencia gnica es muy similar entre especies. sto puede favorecer una hibridacin
entrecru"ada. (ara evitar esto# se requiere una alta selectividad que redu"ca la presencia
de bases mal apareadas# aumentando de esta manera la especificidad. 5i los modelos de
e'presin son los mismos# como se pueden ver con una sonda homloga# es un
e'perimento alentador# aunque no prueba la especificidad. La hibridacin entrecru"ada
provee informacin preliminar muy valiosa.
0.7.0.B El dise8o de la sonda
1. La hibridacin entrecru"ada utili"a sondas largas +J-== pb0 usadas ba!o
condiciones selectivas especialmente despus de la digestin con nucleasas# ya
que una sonda adem&s de homloga# debe ser lo suficientemente amplia para
llevar a cabo la hibridacin.
2. (ara sondas pequeas +oligonucletidos de <=I/= pb0 es muy probable que
alg3n gen distinto al de inters tenga una secuencia idntica.
Alternativamente se puede hacer un screening y ste puede ser reali"ado por
b3squeda de secuencias en bases de datos.
3. Los m2NA poseen las secuencias poli+@0 y poli+U0# al transcribirse a cDNA
se evita que la sonda no incluya esta cola# porque secuencias largas# ricas en ,8
dan una gran estabilidad a la sonda por los triples enlaces que se forman entre
estas bases.
5e necesitan dos elecciones m&s para la preparacin de la sonda4 el tipo de
&cidos nucleicos y la marca que se incorpora en la sonda. Algunos mtodos alternativos
est&n disponibles para la s$ntesis de la sonda.

0.7.4.B Elecci!n de la sonda:
Las sondas largas de cadena simple +2NA o DNA0 proporcionan una alta
sensibilidad en la deteccin de cadena sencilla. Los oligonucletidos son muy sensibles y
la seal puede ser incrementada por el uso de un coc7tail de sondas que flanquear&n en
regiones distintas.
(ara estudios de m2NAs estrechamente relacionados# las sondas espec$ficas#
pueden ser obtenidas por s$ntesis de oligonucletidos. 5e disean primers que ser&n
usados para la amplificacin del fragmento deseado de DNA en el (82. stos fragmentos
pueden ser clonados y usados para sinteti"ar cadenas dobles o sencillas de DNA o 2NA.
Alternativamente# para el caso de sondas de 2NA# pueden ser marcadas
directamente sin clonacin incluyendo el primer marcado en el sitio de iniciacin de la
2NA polimerasa. Kinalmente las sondas de DNA de doble cadena son recomendadas
para blancos de doble cadena y esto puede ser suficientemente sensible para detectar
abundancia de cadena sencilla.
0.7.2.B Ta#a8o de la sonda:
Las sondas largas pueden emitir una seal m&s fuerte debido a que incorporan
mayor n3mero de nucletidos marcados dentro de ella. 5in embargo# las sondas que son
tan largas dan seales dbiles# debido a que la sonda penetra menos eficientemente en el
te!ido. La me!or estrategia es usar una secuencia larga como templado para la s$ntesis de
la sonda pero asegurar que la sonda generada es lo suficientemente pequea para poder
penetrar. Guchos procedimientos est&n basados en que la sonda de B=I-B= bases porque
emiten seales ptimas para la hibridacin en secciones de ciertos te!idos. 5e ha
encontrado que las sondas de 2NA que miden por arriba de - 7b proveen seales
ptimas para la hibridacin in situ# en embriones fi!ados en para formaldhe$do. La
penetracin est& influenciada por el tamao de la sonda aunque tambin depende de la
naturale"a del te!ido# de la forma de fi!acin y si el pre tratamiento ha sido reali"ado para
remover las prote$nas celulares.
l tamao de la sonda puede ser controlado durante la reaccin de s$ntesis4
a. 5ondas de DNA# sinteti"adas por 6nic7 translation9# el largo est& determinado por
la cantidad de DNasa en la reaccin.

b. 5ondas marcadas por 6random priming9 el tamao est& determinado por la
concentracin del primer.
c. (rimers que puedan ser elegidos para deteminar el tamao de la sonda sinteti"ada
por (82.
d. 5ondas largas de DNA pueden ser cortadas parcialmente por incubacin a altas
temperaturas.
e. 5ondas largas de 2NA son parcialmente cortadas por hidrlisis alcalina limitada. 5i
el tamao de la sonda es cortada por hidrlisis hay que revisar el tamao de la
sonda# porque si sta es muy pequea# sta no hibridar& ba!o condiciones
selectivas standard# dando una ba!a seal.
0.7.7.B Esta-ilidad de la sonda 9 la interacci!n con su -lanco:
n e'perimentos de hibridacin los puentes entra la sonda y la secuencia blanco
!uega un rol importante. l largo decrementa la estabilidad en el siguiente orden 2NAI
2NA# DNAI2NA# DNAIDNA. La estabilidad de los h$bridos est& influenciada por las
condiciones de hibridacin# por la concentracin de formamida# sales y la temperatura.
0.7.:.B Sondas de do-le cadena contra cadena sencilla:
Un n3mero de reacciones competentes ocurren durante la hibridacin in situ con
sondas de doble cadena. Las sondas de cadena sencilla proveen las siguientes venta!as4
a. La sonda no se agota porque no se autoliga.
b. No son cadenas largas porque deben penetrar en la seccin de te!ido o en los
cromosomas.
1.5. %enta3as de las sondas 6en*ticas
Las venta!as de estas tcnicas son que nos permiten investigar directamente al
microorganismo# sin necesidad de que se encuentre viable# ni de que est en cultivo puro.
Loy en d$a se utili"a para identificar microorganismos no cultivables# de lento crecimiento
o dif$cil y de identificacin comple!a. s posible utili"arlo en cualquier tiempo de muestra

biolgica y permite la identificacin de genes no e'presados fenot$picamente. 5on
tcnicas muy v&lidas# pues el ADN es muy estable.
Los inconvenientes m&s importantes son que se necesitan un n3mero m$nimo de
copias del fragmento de &cido nucleico problema que se quiere detectar# por eso en las
muestras con escasos n3mero de unidades infecciosas se obtiene una ba!a sensibilidad.
n ocasiones este problema se resuelve detectando A2N en ve" de ADN# pues el primero
suele estar en mayor cantidad.
;tra forma de intentar resolver este problema consiste en aumentar en vitro el
n3mero de copias mediante tcnicas de amplificacin.
Actualmente disponemos de sondas +,enI(robeM# 5yngeneM0 para identificacin
de G. tuberculosis# G. avium# G. intracellulare# G. 7ansasii y G. gordonae. ntre las
principales venta!as de las sondas genticas hay que destacar la sencille" de su
manipulacin# que permite su adaptacin a cualquier laboratorio. l principal
inconveniente es su coste. s una tecnolog$a muy utili"ada en la actualidad en
laboratorios nivel %%.
CAP;T+LO II: 'I.RIDACICN IN SIT+
4.0.B De1inici!n

s una tcnica de hibridacin que se reali"a directamente sobre te!ido# clulas o
cromosomas locali"ados sobre un soporte slido# habitualmente un portaob!etos. La
visuali"acin puede reali"arse por medios isotpicos# en"im&ticos o con fluorescencia#
siendo evaluada en un microscopio. (ermite identificar las clulas donde se produce la
hibridacin que detecta la alteracin genmica o transcripcional. La visuali"acin de
resultados puede reali"arse por marca!e con fluorescencia de la sonda +K%5L0 o
cromognico +8%5L# 5%5L0. ste 3ltimo tiene la venta!a de poder reali"arse en
microscopio de campo claro y poder almacenarse casi indefinidamente las preparaciones
,. Los usos m&s frecuentes en (atolog$a molecular son la deteccin de amplificaciones.
4.4.B Moduladores de (i-ridaci!n
La calidad en la unin de las cadenas de &cidos nucleicos en un proceso de
hibridacin viene determinada por unos moduladores que imponen una mayor o menor
e'igencia de perfeccin o 6astringencia9 +6stringency90.
4.4.0.B Co#)le#entariedad <secuencia de -ases=
Una purina siempre est& encarada a una pirimidina. Las dos cadenas de
polinucletidos de la doble hlice est&n conectadas mediante uniones hidrgeno entre
bases. n condiciones normales# una , se une espec$ficamente con una 8# mientras que
una A solamente se puede unir con una @. l par de bases ,8 tiene tres uniones
hidrgeno# mientras que el par A@ tiene solamente dos. 8omo consecuencia# se necesita
m&s energ$a para romper el par ,8 que el par A@. l hecho de que una cadena de ADN
sea complementaria a la otra permite una reproduccin e'acta del material gentico) as$#
cada cadena puede servir como molde para la s$ntesis de otra. 8ualquier hibridacin en la
que la complementariedad sea inferior al A=N se considerar& como noIhomloga y# por
tanto# ocurre en condiciones de ba!a astringencia +temperatura ba!a yEo concentracin alta
de sales0.
4.4.4.B Te#)eratura

La temperatura elevada rompe los puentes de hidrgeno y separa las hebras del
ADN +desnaturali"acin0. sto ocurre alrededor de los .=O +temperatura de fusin0.
8uando una solucin de DNA que ha sido calentada se enfr$a lentamente se produce la
rehibridacin dando lugar a la estructura inicial. @al reasociacin ocurre slo si las
secuencias de bases son complementarias.
4.4.2.B )' 9 )roductos &u>#icos
l pL alto +pLJ--0 rompe los puentes de hidrgeno# por lo que se produce
desnaturali"acin. sto tambin pueden producirlo agentes qu$micos como la urea y la
formamida e incluso el agua destilada# que impide la neutrali"acin de los grupos fosfato
de la molcula por salida sodio y magnesio) al ser los grupos fosfato de marcado car&cter
negativo# su repulsin causa la separacin f$sica de las hebras y# por tanto# su
desnaturali"acin.
La concentracin ba!a de sales en una solucin donde se produce una hibridacin
impone una condicin de alta astringencia# permitiendo slo uniones de gran
complementariedad.
4.2.B 'i-ridaci!n ?In Situ? @luorescente <@IS'=
s una tcnica molecular que permite locali"ar un determinado fragmento de la
secuencia de los &cidos nucleicos y pone de manifiesto la presencia o ausencia de
secuencias gnicas espec$ficas. 5e puede aplicar sobre n3cleos interf&sicos de
e'tensiones celulares o cortes de te!ido o directamente en cromosomas. La posibilidad de
poder utili"ar las tcnicas de K%5L sobre clulas que no est&n dividindose es importante
en aquellas neoplasias con ba!a tasa de divisin celular# como en los s$ndromes
linfoproliferativos crnicos. (ara ello utili"a sondas marcadas con fluorocromos.
Dependiendo del tipo de sonda utili"ada es posible evaluar la presencia de
reordenamientos en los n3cleos.
Las sondas son pequeas secuencias de cadena sencilla de ADN#
complementarias a la secuencia de inters del &cido nucleico. (odemos utili"ar distintos
tipos de sondas4

ADN satlite4 estas sondas hibridan con las regiones P o Q satlites u otras
secuencias repetitivas de la regin centromrica del cromosoma. 5on de utilidad
para detectar alteraciones cromosmicas numricas. 8omo hemos dicho
anteriormente# esta tcnica puede aplicarse sobre clulas en divisin o n3cleos
interf&sicos# por tanto podemos detectar anomal$as cromosmicas numricas sin
necesidad de tener clulas en metafase.
Las sondas de pintado cromosmico contienen una librer$a de secuencias
genmicas que abarcan todo un cromosoma o una determinada regin. 8on estas
sondas podemos detectar alteraciones estructurales o numricas de los
cromosomas# pero slo en clulas en metafase. s muy 3til cuando tenemos
cromosomas de mala calidad.
Las sondas de secuencia 3nica +locus espec$fico0# hibridan con secuencias
cromosmicas muy concretas# correspondiente a una banda cromosmica o a un
gen. 8on estas sondas podemos visuali"ar alteraciones estructurales o numricas
tanto en n3cleos en interfase como en metafase. (odemos detectar la presencia
de clulas tumorales residuales con una anomal$a caracter$stica de estirpe o
subtipo# como la t +.)<<0 en la leucemia mieloide crnica# la t+-B)-A0 que afecta al
(GLE2A2P en la leucemia mieloide aguda.
Los cromosomas que son usualmente anali"ados por K%5L son los -/# -R# <-# S e T#
que son los m&s propensos a sufrir anomal$as. st&n relacionados a enfermedades como
el s$ndrome de (atau +-/0# el s$ndrome de dUards +-R0# el s$ndrome de DoUn +<-0#
el s$ndrome de @urner +S0 y el s$ndrome del superhombre +T0# entre otros. 5in embargo#
como son posibles marcados adicionales del cromosoma# otros cromosomas pueden ser
visuali"ados con esta tcnica. K%5L usa segmentos de una 3nica hebra de ADN que son
tintados# o etiquetados# con una sustancia fluorescente que puede ligarse a un
cromosoma espec$fico) estos segmentos de ADN son llamados sondas. n un principio se
empleaban sondas de car&cter radiactivo# pero este tipo de marca!e fue reempla"ado por
los fluorforos por mayor seguridad# eficacia y facilidad de deteccin.
La tcnica K%5L puede reali"arse a los cromosomas en metafase o en interfase.
4.2.0.B Protocolo -$sico

l primer paso de la tcnica consiste en la desnaturali"acin del DNA para separar
la doble hlice. A la muestra desnaturali"ada se le aade entonces la sonda de inters
+fragmento de ADN marcado fluorescentemente0. (rimero# las sondas hibridan a las
regiones espec$ficas para las que han sido diseadas. Despus# se tien los n3cleos con
un color de contraste inespec$fico +generalmente DA(%0. Las sondas de DNA pueden
marcarse con molculas fluorescentes denominados fluorforos +mtodo directo0 o no
fluorescentes que se detectan con anticuerpos fluorescentes +mtodo indirecto0. (or
3ltimo# se visuali"a la muestra preparada ba!o un microscopio de fluorescencia.
4.2.4.B @IS' en Meta1ase
8uando las clulas est&n en metafase# sus cromosomas se encuentran
condensados a modo de preparacin para la divisin celular. (ara detenerlas en
metafase# se emplea colchicina# un agente despolimeri"ante de
los microt3bulos encargado de separar las crom&tidas hermanas de un cromosoma#
impidiendo as$ el avance de la divisin celular.
ste tipo de K%5L se utili"a para detectar microdeleciones espec$ficas#
translocaciones o para identificar material e'tra de origen desconocido. Los tipos de
sondas usadas son4
Los csmidos son secuencias 3nicas que hibridan con fragmentos pequeos. 5e
emplean en estudios de microdeleciones.
Las sondas satlites est&n formadas por secuencias altamente repetidas que se
encuentran cerca de lo centrmeros. n la mayor$a de los casos son espec$ficas
de cada cromosoma. 5e usan para determinar aneuploidias o para identificar el
origen de cromosomas marcadores.
Las sondas completas consisten en la suma de varias sondas que hibridan en
distintas "onas del cromosoma y as$ marcar el cromosoma completo. 5e usan
para ver translocaciones.
4.2.2.B @IS' en Inter1ace

No siempre es posible tener n3cleos fi!ados en metafase para reali"ar el K%5L# y
los resultados obtenidos no ser&n tan espec$ficos. 5in embargo# el K%5L en interface tiene
la venta!a de que no es necesario cultivar previamente las clulas durante diversos d$as
antes de poder anali"ar sus cromosomas. Adem&s# cuando las clulas se encuentran en
interface# la cromatina est& en torno a -= === veces m&s descondensada que en
metafase# lo cual permite una mayor resolucin a la hora de detectar anomal$as
pequeas. 5e emplea sobre todo para la deteccin de aneuploid$as o grandes
delecciones# duplicaciones. No es posible distinguir entre un cariotipo normal y un
cariotipo que presente una translocacin equilibrada. Adem&s# puede ser empleado en el
an&lisis de tumores slidos# que se dividen con muy poca frecuencia.
4.2.7.B Otras "ariantes de @IS'
@IS' en (e-ra
ste tipo de K%5L +tambin llamado *Kiber K%5L* o *Lalo K%5L*0 se aplica sobre
hebras de ADN desproteini"adas +es decir# desprovistas de las histonas
encargadas de su compactacin0. sta tcnica permite detectar pequeas
reorgani"aciones porque admite una mayor resolucin +permite incluso la
visuali"acin de genes individuales0. La tcnica puede ser usada para detectar
delecciones en clones y para estimar huecos en los proyectos genoma.
@IS' in"erso
s una tcnica que se usa mucho para determinar la procedencia de
un cromosoma marcador. ste tipo de K%5L tiene la peculiaridad de ser el ADN
problema el que se marca. l procedimiento consiste en recortar un fragmento de
cromosoma o dicho cromosoma marcador de una porta donde se encuentran
todos los cromosomas fi!ados. 5e encuentran teidos con ,iemsa o con una
sonda# esto sirve para marcar ese ADN y convertirlo en una nueva sonda. A
continuacin# ponemos los cromosomas de un donantes sin anomal$as
+generalmente procedente de sus linfocitos y de un varn para contemplar todas
las opciones# es decir# tener los cromosomas S e T0 en un porta y aadimos la

sonda preparada. speramos ver que hay hibridacin de la sonda +cromosoma
marcador0 con alguno de los cromosomas del donante por complementariedad en
su secuencia. As$# podemos determinar que ese cromosoma marcador procede del
cromosoma con el que hibrida. Una ve" identificado# el cromosoma marcador
pasar$a a ser llamado un cromosoma derivativo.
@IS' on a c(i)
sta nueva tcnica conlleva numerosas venta!as# como la necesidad de utili"ar
menor cantidad de reactivos# el empleo de un menor n3mero tiempo de an&lisis
+ya que en menos de una hora se pueden anali"ar los n3cleos# frente a las <I/
horas que precisa el procedimiento de K%5L convencional0# su rapide" para la
obtencin de resultados# su alta sensibilidad o su menor coste# con comparacin
con la tcnica convencional de K%5L.
La principal aplicacin de este novedoso sistema es en el campo del diagnstico
cl$nico# sobre todo en el estudio de enfermedades neuronales# como es el caso de
la enfermedad del Al"heimer en su estad$o temprano# aunque no se descarta su
uso en otros campos como en la industria alimentaria.
5e emplea un chip microflu$dico con estrechos canales# por los que se hace pasar
la suspensin celular purificada por capilaridad# lavada previamente con (15. Una
ve" adheridas o fi!adas las clulas a los canales por calor# digerimos las clulas
mediante la adicin de proteinasa V y desnaturali"amos su material gentico#
nuevamente por un incremento de temperatura. @ras estos pasos# ya pueden ser
aadidas las sondas y reactivos necesarios# que difundir&n a lo largo de todo el
canal# pudiendo observar los n3cleos ba!o el microscopio en el mismo chip y de
manera ordenada.
K%5L on chip es una tcnica muy 3til para detectar anomal$as cromosmicas
+aneuploid$as0# entre otros defectos. n el caso del Al"heimer# es habitual utili"ar
muestras de linfocitos procedentes de sangre perifrica# fibroblastos o muestras de
orina.

@IS' #ulticolor
s una adaptacin del K%5L que permite la visuali"acin de los </ pares
de cromosomas a la ve"# teidos con diferentes sondas fluorescentes.
A nivel comercial slo hay B colores distintos posibles# por lo que se puede usar la
sonda de un color concreto o combinar dos tipos de sondas para crear un nuevo
color. l sistema de deteccin del equipo empleado debe estar adaptado a los B
colores. Un programa inform&tico se encarga de anali"ar las im&genes y formar el
cariograma4 organi"a los cromosomas de acuerdo a la emisin de las sondas que
tiene integradas y las combina hasta dar las </ combinaciones. 5e utili"a con
frecuencia en el estudio de clulas tumorales. l poder de dicho mtodo reside en
su habilidad para4
Determinar r&pidamente si hay alg3n cromosoma adicional en el cariotipo y de qu
cromosoma se trata# porque su color permitir& identificarlo.
Determinar si est& presente alg3n cromosoma translocado y qu cromosomas
est&n implicados en la translocacin por la combinacin de dos colores asociados
a cromosomas diferentes en un mismo cromosoma.
2&pida identificacin de material cromosmico de un cromosoma que haya sido
insertado en otro cromosoma por la variacin del color del fragmento insertado
respecto al color de todo el cromosoma.
%dentificacin de cromosomas pequeos o fragmentados que frecuentemente
implican el problema de averiguar su origen# como es el caso de los cromosomas
marcadores.
stas aplicaciones del 5VT se deben a que cada cromosoma est& teido
completamente de un 3nico color +de una 3nica sonda0 y por eso# viendo el color
que van a tener todos los cromosomas de la muestra podemos saber que
anomal$a presenta el paciente.
5in embargo# aunque se pensaba que iba a desbancar al cariotipo tradicional#
tiene una serie de desventa!as que han frenado su uso# especialmente el uso
cl$nico. stas son4
o l elevado precio.

o Genor definicin que el K%5L convencional. 5lo se pueden ver cromosomas y
translocaciones grandes# sin poder observar bandas.
CAP;T+LO III: APLICACIONES
2.0.B A)licaciones
sta tcnica ha resultado ser muy 3til en el campo de la medicina reproductiva#
con aplicacin en el diagnstico gentico preimplantatorio +D,(0. 2esulta una forma muy
preco" de diagnstico que# apoy&ndose en las tcnicas de reproduccin asistida# posibilita
el estudio de embriones antes de ser transferidos al 3tero materno y# por consiguiente#
antes de que se lleve a cabo la implantacin embrionaria.
(ara el an&lisis de anomal$as cromosmicas embrionarias# tanto numricas como
estructurales# puede utili"arse la tcnica D,(IK%5L. (ara este fin se requiere una biopsia
embrionaria# mediante la cual se e'trae una clula del embrin en cultivo *in vitro*.
5eguidamente# se procesa la muestra de tal manera que quede fi!ado el n3cleo en
interface y se hibrida con sondas espec$ficas para el estudio cromosmico de la patolog$a
que se sospecha pueda estar presente en el embrin.
2.4.B Ano#al>as
2.4.0.B Ano#al>as nu#*ricas
Alteraciones en cromosomas se'uales4 Alta frecuencia de mosaicismo en
pacientes implica que# en muchos casos# slo se den defectos leves en el
desarrollo. ,ran relevancia en Gedicina 2eproductiva por ir asociado# en mayor o
menor grado# a problemas de fertilidad. @ales son los casos de s$ndrome de
Vlinefelter# trisom$a S y monosom$a S.
dad materna avan"ada# aborto de repeticin de causa desconocida yEo fallo de
implantacin4 G&s de la mitad de los casos son debidos a alteraciones en los
cromosomas -/# -?# -R# <-# <<# S e T. n estos casos# la seleccin de aquellos
embriones normales para los cromosomas citados# aumenta las probabilidades de
conseguir una gestacin a trmino.

Kactor masculino grave4 8on este estudio embrionario# se pueden evitar las
alteraciones cromosmicas surgidas en la descendencia de aquellos grupos de
pacientes con calidad seminal ba!a y que tienen que recurrir a la tcnica de
microinyeccin intracitoplasm&tica del espermato"oide +%85%0.
2.4.4.B Ano#al>as estructurales
5urgen espont&neamente# en la mayor$a de los casos# como consecuencia de un
fallo de meiosis durante la oognesis o espermatognesis# en los casos en que los padres
presentan cariotipos normales. Algunas veces# alg3n miembro de la pare!a puede ser
portador de una anomal$a estructural equilibrada# que podr$a transmitir a su
descendencia. De esta manera# por medio del estudio gentico espec$fico de embriones
de la pare!a portadora# podr$an distinguirse aquellos embriones desequilibrados
cromosmicamente de los equilibrados. Una ve" hecha esta seleccin de embriones#
podr$an transferirse con total tranquilidad al 3tero materno los embriones que no
presentan la alteracin gnica.
Una aplicacin adicional del K%5L en interfase es obtener mayor informacin sobre
la organi"acin de los cromosomas en el n3cleo interf&sico +los llamados territorios
cromosmicos0.
Adem&s de ser 3til para reali"ar diagnsticos preimplantatorios# el K%5L tiene
aplicacin en medicina para detectar enfermedades y determinar el pronstico de las
mismas# as$ como para evaluar la remisin de algunas enfermedades# como el c&ncer.
8on K%5L es posible diagnosticar enfermedades incapaces de ser detectadas por otros
mtodos tradicionales que implicaban el an&lisis de cromosomas en metafase. Adem&s su
utili"acin es mucho m&s sencilla que los mtodos citogenticos m&s habituales# los
cuales requieren clulas en divisin# as$ como un mayor esfuer"o en tiempo y traba!o para
la preparacin manual y an&lisis de las muestras.
@ambin puede utili"arse para la deteccin directa de patgenos a partir de sangre
o restos de te!idos de un paciente. sto supone una gran venta!a teniendo en cuenta que
muchos microorganismos no son cultivables en condiciones de laboratorio.
l K%5L tambin se usa para comparar genomas de dos especies biolgicas y
deducir relaciones evolutivas. Asimismo# se puede usar en el &rea de la colog$a
Gicrobiana para identificar microorganismos dentro de un biofilm# as$ como para observar

su distribucin y locali"acin dentro del biofilm o reali"ar ensayos de colocali"acin
utili"ando sondas de distinto color para cada microorganismo.
CAP;T+LO I%: CONCL+SIONES
Las sondas son molculas de ADN o A2N homologas a una secuencia de
A2N o ADN diana yson de cuatro tipos.
(ara la establecer el diseo y la preparacin de una sonda ses debe tener ne
cuenta en tamao y la hibridacin.
l largo de la sonda decrementa su estabilidad.
La hibridacin in situ es una tcnica que se utili"a directamente sobre te!idos y su
aplicacin se da principalmente en anomal$as numricas y estructurales.
CAP/T+LO % : .I.LIOGRA@/A
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