Biologa

Molecular
Ao 2010
1
Parte I
Parte I
Bases Tericas de la
Biologa Molecular
Moderna
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Tema 1: Material Gentico
1. Los cidos nucleicos
Los cidos nucleicos son las biomolculas que se encargan de contener la informacin gentica capaz de sintetizar
protenas funcionales, y adems intervienen en la sntesis de sta, ya que forman parte de las estructuras celulares
que pueden unir los aminocidos en orden correcto.
El cido desoxirribonucleico es el centro de almacenamiento, por lo que su duplicacin asegura la continuidad
gentica. sta informacin se organiza en unidades !ereditarias que controlan los rasgos de un organismo, o genes.
El cido ribonucleico es el que transporta las instrucciones para la sntesis proteica "m#$%&, la interpreta "t#$%& y la
expresa "r#$%&. El proceso de sntesis del #$% se denomina transcripcin, mientras que su utilizacin en la sntesis
proteica, traduccin.

2. Estructura
'.(. )rimaria
Los cidos nucleicos poseen como estructura primaria a un polmero de nucletidos, pudiendo poseer desde quince
!asta varios cientos de millones de stos para ser funcionales. *olo se componen de cuatro nucletidos diferentes,
cada uno formado por un grupo fosfato unido por un enlace fosfoster a una pentosa que a su vez se une a una base
orgnica. Estas bases son compuestos !eterocclicos que contienen nitrgeno y carbono en sus anillos, pudiendo ser
purinas o pirimidinas.
El carcter bsico de los nucletidos se debe al fosfato, deprotonado a p+ intracelular, lo que es ,til en la atraccin
de protenas. Las clulas y los lquidos extracelulares contienen peque-as concentraciones de nuclesidos
"nucletidos sin fosfato&.
.uando los nucletidos se polimerizan, el grupo !idroxilo fi/ado al carbono 01 del az,car de un nucletido forma un
enlace ster con el fosfato de otro nucletido, des!idratndose. 2na !ebra de cido nucleico tiene una orientacin
qumica desde el extremo terminal 31 "con un !idroxilo o un fosfato libre en esta posicin& !asta el extremo terminal 01
"con un !idroxilo libre en sta&.
'.'. *ecundaria
El 4$% consta de dos !ebras de polinucletido asociadas, que se entrelazan entre s para formar una doble hlice.
Las dos columnas de az,car5fosfato se ubican en la parte externa, y las bases en el interiore, apilndose una sobre
otra en planos paralelos. Las dos !ebras tienen orientaciones antiparalelas, y mantienen un registro exacto y
complementario debido al apareamiento de bases entre ellas6 % se aparea con 7 por dos enlaces de !idrgeno,
mientras que 8 se aparea con . por tres, lo que es permitido por el tama-o, forma y composicin qumica de las
bases, pudiendo contribuir incluso a la estabilidad de la doble !lice, as como tambin lo !acen las fuerzas de 9an
der :aals entre bases adyacentes apiladas.
En cualquier caso, una purina debe aparearse con una pirimidina ms peque-a, en los tpicos enlaces de Watson y
Crick. 7ambin pueden tener lugar otras interacciones, como las uniones 8;7, 8;. o 8;2.
La geometra de las columnas de az,car5fosfato es ms compatible con una !lice dextrgira, lo que se ve en el
4$% al igual que una periodicidad cada <,0= nm "debida al apilamiento de bases& y cada 0,= nm "debida a un giro
completo&. Esto es caracterstico de la forma B del 4$%, la forma normal, que tambin presenta dos !endiduras de
distinto anc!o6 la mayor y la menor, lo que permite una accesibilidad desde el exterior de la !lice a las bases,
mediante molculas que se fi/an al 4$% unindose a los grupos qumicos de las bases en las !endiduras.
%dems de la forma >, se !an descrito6 la forma A, presente con !umedad muy elevada o en !bridos con #$%,
muc!o ms compacta que la > y con cierta inclinacin del apilamiento de bases? y la forma Z, presente en cidos
nucleicos ricos en combinaciones .8, que la !acen levgira y zigzagueante "de a! su nombre&, adems de
inestable. )or otra parte, tambin se nota una estructura de 4$% con triple !ebra "por e/emplo, en recombinacin y
reparacin&, frecuentemente con cadenas ricas en . y 7, donde intervienen los apareamientos de Hoogsteen.
$o existen enlaces de !idrgeno entre restos consecutivos de la !ebra de 4$%, lo que aumenta la flexibilidad de la
doble !ebra.
3. Estructura cromosmica
0.(. >acterias
El 4$% es la molcula biolgica ms asimtrica, ya que su relacin altura@dimetro es de casi (<
A
veces. La longitud
total del 4$% celular es de cien mil veces la de la clula, por lo que su empaquetamiento en cromosomas es esencial
para la arquitectura celular. En la mayora de las clulas bacterianas, los genes estn codificados sobre cromosomas
circulares con un solo origen de replicacin. 9arios mecanismos se ocupan de compactar ste 4$% como para caber
dentro de la clula bacteriana, fundamentalmente el contrarresto de las cargas negativas de los fosfatos negativos por
la asociacin con poliaminas catinicas, como la espermita y la espermidina, adems de la asociacin con otras
protenas de compactacin "como la +5$*& y el superenrollamiento.
0.'. Eucariotas
3..!. "ucleosomas
En eucariotas, el 4$% se encuentra compactado en un comple/o con protenas denominado cromatina. Las protenas
ms abundantes asociadas a 4$% son las histonas, bsicas y en cinco tipos, +(, +'%, +'>, +0 y +=. En una
fraccin de stas, algunos de los grupos laterales de sus aminocidos son modificados posttraduccionalmente por
distintos mtodos "acetilacin, metilacin, etc&. Las secuencias de aminocidos de stas estn notablemente
conservadas, excepto quizs en +(.
El 4$%, en ba/a concentracin salina, se puede observar como una cadena de nucleosomas, estructuras
nucleoproteicas que lo protege de la !idrlisis. Estn formados por un nucleo proteico con 4$% arrollado a su
3
alrededor, lo que lo empaqueta unas cinco veces. El n,cleo es un octmero que contiene dos !istonas +'%, dos +'>,
dos +0 y dos +=, formando una estructura discoide que puede enrollar algo menos de dos vueltas de 4$% alrededor,
representando este ms del 3<B del peso. El 4$% entre dos nucleosomas vara en longitud entre especies. El
ensamblado de los nucleosomas no es espontneo, ms all de ser termodinmicamente favorable, sino que ocurre
mediado por protenas luego del paso de la !orquilla de replicacin. .ada una de las !istonas contiene terminales
amino flexibles que se extienden desde sus dominios globulares, ricos en lisinas capaces de interaccionar con los
fosfatos del 4$% del nucleosoma y de sufrir acetilacin reversible, que neutraliza la carga y elimina la interaccin con
el 4$%, por lo que disminuye el grado de empaquetamiento.
3... #structuras superiores
En medio isotnico, el 4$% aparece como fibras de 0< nm de dimetro, donde los nucleosomas se empaquetan en
una disposicin en espiral con seis nucleosomas por giro, sirviendo la +( para fi/arse al 4$% en el interior del
solenoide, una por nucleosoma. Esta es la causa de las propiedades pticas de este tipo de estructuras. La +( se fi/a
tanto al 4$% de entrada como al de salida del nucleosoma, funcionando como CcerraduraD, evitando corrimientos por
sobre la longitud del 4$%. En regiones de transcripcin activa, el 4$% se presenta en forma predominantemente
nucleosmica y no se organiza en fibra de 0< nm.
La cromatina se organiza en grandes unidades denominados cromosomas. En las clulas que no estn en proceso
de divisin, stos no son visibles, aunque s en los procesos mitticos y meiticos. La condensacin de los
cromosomas en la metafase se debe a varios rdenes de plegamiento y arrollamiento de las fibras de cromatina de
0< nm. *i bien las !istonas son las protenas predominantes, otras protenas tambin intervienen en la organizacin
cromosmica. El 4$% se une en forma de asas a un arma$n cromosmico que posee la forma del cromosoma en
metafase y es flexible. El arrollamietno del armazn para formar una !lice "estructura en roseta&, y su posterior
empaquetamiento induce a la forma tpica en cruz.
4e esta manera, podemos notar las regiones asociadas al arma$n "*%#& que se pudieron determinar mediante
digestin con enzimas de restriccin y recuperacin del 4$% unido al mismo. Las *%# se encuentran entre unidades
de transcripcin, es decir, los genes se localizan en las asas de cromatina, lo que puede influir sobre la transcripcin
de genes vecinos. La unin 4$%5armazn es !idrofbica y entrpicamente conducida, lo que las !ace resistentes a
p+, fuerza inica, etc.
En interfase, el armazn est extendido y se denomina matri$, unida al 4$% por regiones unidas a la matri$ "E%#&.
4. Topologa
El 4$% celular est altamente compactado. *in embargo, el mecanismo de plegamiento no solo debe disminuir el
volumen ocupado por ste, sino tambin permitir acceder a la informacin contenida en el 4$%, tanto en la
replicacin como en la transcripcin. El superenrrollamiento es una caracterstica intrnseca de la estructura terciaria
del 4$% que se manifiesta en todos los 4$% celulares y que se encuentra estrictamente regulada.
El 4$% mantiene algunas propiedades invariables cuando es sometido a deformaciones continuas, como ser los
cambios conformacionales debidos a las fluctuaciones trmicas o las interacciones con protenas, por lo que se
puede estudiar ba/o una rama de la matemtica denominada topolog%a.
=.(. $,mero de enlace
El superenrollamiento se produce cuando el 4$% est sometido a alg,n tipo de tensin estructural. Los 4$%
procedentes de un determinado tipo celular tienden a poseer un grado de superenrolamiento caracterstico. La
estructura se encuentra sometida a una tensin cuya magnitud est regulada, y que proviene generalmente de un
desenrollamiento de la doble !lice, es decir, disminuye el n,mero de vueltas esperable. Esta tensin provoca una
tensin termodinmica energtica que en parte puede utilizarse para generar una super!lice y en parte, para
disminuir la torsin local. 7odas las clulas desenrollan activamente el 4$% mediante enzimas, y paralelamente lo
mantienen tensionado para compactarlo.
El n&mero de enlace es una propiedad topolgica de molculas de cido nucleico con enlace topolgico, "es decir,
que pueden permanecer unidas a,n si se rompiese el apilamiento de bases y las interacciones dbiles& que puede
pensarse como el n,mero de veces que una cadena atraviesa un plano imaginario que corte a la otra por la mitad,
longitudinalmente. Es siempre un n,mero entero, y ser positivo si el enrollamiento es dextrgiro "por lo tanto,
siempre lo ser en 4$%&. %dems, el n,mero de enlace "'k& debe ser igual al n,mero de pares de bases dividido por
(<,3.
.laro que para que existe y est definido un n,mero de enlace, no debe !aber cortes en las !ebras de 4$%, ya que
si as fuera podra ser desenrrollado y separado. El n,mero de enlace puede variar en F( mediante el corte de una
!ebra "y la rotacin de 0G<H de uno de los extremos&, sin afectar los enlaces ni el n,mero de pares de bases del 4$%.
4os formas de 4$% que difieran ,nicamente en una propiedad topolgica se denominan topoismeros,
puntualmente, en topologa del 4$% se considerarn topoismeros a dos formas de 4$% con ILJ ; '.
El n,mero de enlace puede resolverse como la suma del retorcimiento ":r& y la torsin "7K&, pensndose el primero
como el enrrollamiento del e/e de la !lice, y al segundo como la relacin espacial entre bases adyacentes. Estos
parmetros no tienen por qu ser n,meros enteros y son propiedades geomtricas y no topolgicas.
=.'. 7opoisomerasas
Las enzimas que aumentan o disminuyen el grado de enrrollamiento del 4$% son las topoisomerasas que
modificarn el n,mero de enlace. +ay dos clases de topoisomerasas, las de tipo ( que realizan un corte transitorio en
una de las !ebras de 4$% "ILJ ; (& y las de tipo (( que realizan cortes en ambas !ebras, adems de su funcin
estructural, como ms de la mitad de la composicin proteica del armazn "ILJ ; '&. stas son ,tiles para evitar la
destruccin del material gentico por la torsin energtica que sucede al separar las !ebras de cido nucleico en
procesos de replicacin y transcripcin. )or lo general, una topoisomerasa es una ligasa unida a una nucleasa y a un
sensor de topologa. *on blanco de medicamentos, fundamentalmente anticancergenos. La accin del replisoma
genera un ILJ de !asta (<<.
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Tema 2: Replicacin del DNA
1. Principios bsicos de sntesis
La sntesis de protenas y cidos nucleicos /uegan un papel fundamental en el dogma central. %nlisis detallados de
ambos procesos demuestran una serie de coincidencias particulares, que fi/an los cuatro principios bsicos de la
sntesis de cadenas de biopolmeros6
a& Los biopolmeros se componen de un n,mero limitado de distintos bloques monomricos, generalmente con una
ba/a variabilidad "veinte aminocidos, cinco nucletidos&.
b& Los monmeros se agregan de a uno por vez y con la mxima precisin posible.
c& La sntesis comienza en un punto de inicio especfico, crece direccionalmente y tiene un sitio de terminacin
prefi/ado.
d& Es com,n que se modifique el producto sinttico primario para que pueda cumplir sus funciones.
2. Sntesis de D!
'.(. 8eneralidades
El apareamiento regular de bases en la estructura de doble !lice del 4$% sugiri que la sntesis de nuevas !ebras
de 4$% se daba por copiado de !ebras progenitoras. En la replicacin de una molcula bicatenaria de 4$% se copian
ambas cadenas originales, lo que nos permite afirmar que es un proceso semiconservativo.
El proceso se da en direccin 31 01 a partir de nucletidos trifosfato, que permiten que se convierta en
termodinmicamente favorable. Las enzimas encargadas de la sntesis son las 4$% polimerasas, las cuales no
pueden iniciar la sntesis de la cadena de novo, sino que requieren de una corta !ebra preexistente de cido nucleico
"denominado primer& para comenzar el crecimiento de la cadena, agregando nucletido al extremo 01. Existen varias
4$% polimerasas que cumplen funciones diferentes en la replicacin.
El 4$% d,plex est constituido por dos !ebras entrelazadas, por lo que el copiado de pares de bases reqiere
desenrollarlo, lo que se logra mediante !elicasas, que generarn estres de torsin capaz de generar
superenrollamientos eliminados por topoisomerasas. La actuacin de estas protenas produce una regin mvil
denominada !orquilla de crecimiento donde la polimerasa agrega nucletidos, que se crea por accin de una !elicasa
especial. 2na #$% polimerasa forma cortos primers de #$% en las !ebras desenrolladas, y sern alongados por la
4$% polimerasa.
2na complicacin importante es que los nucletidos slo se pueden agregar a las nuevas !ebras en crecimiento en
direccin 31 01, por lo que la !ebra que se desenrrolla en esa direccin "la hebra gu%a& se replica continuamente,
mientras que la restante "la hebra retrasada& se replica en fragmentos iniciados por primers, denominados de
LJazaJi. Luego, una ligasa unir segmentos adyacentes.
'.'. .aractersticas generales
La replicacin del 4$% posee tres caractersticas fundamentales6
a& Es semiconservadora, tal como demostraron Eeselson y *ta!l.
b& Es bidireccional, donde cada replicn "regin de 4$% abastecida por un origen& posee a su origen de replicacin
en su regin central.
c& .omienza en sitios especficos del cromosoma, y su paso de iniciacin es el determinante de la terminacin o no
del proceso, por lo que est notablemente regulado. Esto sucede en orgenes de replicacin, que oscila entre solo
uno en #. coli "de unos '=< pb, con nonmeros y teiscaidecmeros de reconocimiento&. En eucariotas, se !a
analizado el caso de ). cere*isiae y *9=<, un virus. En el primer caso, se notan unos =<< orgenes de replicacin
denominados secuencias de replicacin autnoma "%#*& de unos (M< pb con una secuencia consenso "el elemento
A& de unos (( pb, donde se unir un comple/o de seis protenas "el L#., comple/o de reconocimiento del origen&
mediante !idrlisis de %7), y que se mantendr unido durante todo el ciclo celular. En el caso del *9=<, se nota un
origen de replicacin de unos G3 pb con tres secuencias consenso. $o obstante, los orgenes de replicacin suelen
contener un segmento rico en %7 lo que facilita el desenrollamiento del d,plex de 4$%.
'.0. Eaquinaria enzimtica
El copiado del 4$% presenta ciertos problemas elementales6
a& Las 4$% polimerasas no pueden disociar el d,plex de 4$%
b& Las 4$% polimerasas no pueden iniciar cadenas, solo alargarlas
c& Las dos cadenas del d,plex de 4$% tienen polaridad opuesta, pero las polimerasas solo adicionan nucletidos en
el extremo 01
.3.!. +eplicacin procariota
Los primeros estudios sobre la replicacin del 4$% se dieron sobre #. coli. 4e a! que para comprender los
principios bsicos del proceso es ,til y didctico conocer las generalidades de la replicacin procariota.
La iniciacin de la replicacin procariota se daba por una protena codificada por un gen llamado 4na%. Entre diez y
veinte subunidades de sta se unen a cuatro nonmeros del oriC, formando un comple,o inicial. ste deber
superenrollar negativamente al 4$% "para compactarlo y facilitar la disociacin local&. )ara esto se requiere %7), y se
abrirn regiones denominadas teiscaidec-meros "de trece pares de bases& que darn origen al comple,o abierto.
La apertura consiguiente del d,plex se da por la protena 4na>, un !exmero de subunidades idnticas, que se
ubicar como una abrazadera alrededor de cada una de las monocadenas, por !idrlisis de %7) y por accin de
4na. que escolta a 4na> !acia 4na% para formar el comple,o preiniciador. Las cadenas separadas estn impedidas
de reasociarse mediante prote%nas de unin a las monocadenas "**>&. Las !elicasas 4na> se movern !acia el
extremo 01, y muestra determinada procesi*idad, determinada por el fin de la cadena, o por accin de otra protena.
5
)ara que las polimerasas puedan alargar cadenas complementarias de 4$% necesitan de cortas secuencias de
cidos nucleicos, denominadas primers, que generen un extremo 01 libre. stos son sintetizados por la enzima 4na8,
que se unir a una 4na>, generando el primosoma.
En cada !orquilla de crecimiento, una cadena "la adelantada& se sintetizar de manera continua a partir de un solo
primer, mientras que la otra, la retrasada no podr !acerlo ya que el crecimiento progresa en la direccin contraria del
desplazamiento de la !orquilla de crecimiento. )ara esto, se utiliza un copiado discontinuo, es decir, los sitios
descubiertos por el primosoma son copiados en varios primers cada tanto, y stos sern alargados !asta encontrarse
con el prximo primer agregado. Esto genera fragmentos de copiado, denominados fragmentos de .ka$aki de entre
(<< y '<< nucletidos.
La extensin de la !ebra adelantada y de los fragmentos de LJazaJi de la !ebra retrasada es llevada a cabo por la
4$% polimerasa NNN, mientras que el reemplazo de los primers por desoxirribonucletidos se lleva a cabo por la 4$%
polimerasa N "que tiene actividad exonucleasa 3101& )or ,ltimo, la 4$% ligasa ser la que una los fragmentos
adyacentes.
#. coli posee tres 4$% polimerasas, las 4$% poli N, NN y NNN. La 4$% pol N no solo act,a en el relleno de brec!as, sino
tambin en la reparacin del 4$%. La 4$% pol NN act,a en la respuesta *L* inducible.
La 4$% pol NNN es una !oloenzima grande y comple/a compuesta por diez polipptidos diferentes, tres formando el
n&cleo "O, polimerasa, P, exonucleasa 0131& y el resto cumpliendo funciones distributivas. Es altamente procesiva
"se separa de la !ebra plantilla luego de agregar 3.(<
3
nucletidos& debido a la presencia de la subunidad Q que
forma un dmero en forma de rosca alrededor del d,plex de 4$% para asociarse luego al n,cleo y mantenerlo en
posicin cerca del extremo 01 de la cadena en crecimiento, lo que permite que el sitio activo del n,cleo est cerca de
la !orquilla de crecimiento. La carga y descarga de la abrazadera al n,cleo se da por el comple,o / formado por las
subunidades R, S, S1, T y U. La subunidad V dimeriza dos n,cleos y coordina la sntesis de las cadenas adelantada y
retrasada.
4os molculas del n,cleo se unen a cada !orquilla para adicionar nucletidos a la !ebra adelantada y a la retrasada.
stas dos molculas se unen por un dmero de V. El n,cleo que sintetiza la cadena adelantada se desplaza /unto a su
abrazadera, mientras que la !elicasa se encuentra unida al n,cleo que sintetiza la !ebra retrasada. .omo la direccin
de sntesis en la !ebra retrasada es opuesta a la de la !ebra adelantada, se formar un bucle entre la polimerasa y la
!elicasa, que crecer a medida que avance el proceso. .uando se complete el fragmento de LJazaJi en crecimiento,
el n,cleo que sintetiza la !ebra retrasada se separar del 4$% y una primasa se une a un sitio de la !elicasa para
sintetizar un nuevo primer, que atrae una nueva abrazadera Q, y luego de unirse, se ad!iere al n,cleo polimersico.
Los dos n,cleos estn ligados a la subunidad V en orientacin opuesta, lo que permite el desfase de la regin de
sntesis, pero impide un desfase temporal ya que la velocidad de sntesis es la misma. La subunidad V tambin
contacta la !elicasa 4na>, activndola, y permitiendo una sntesis de !asta (<<< bp por segundo.
.3.. +eplicacin eucariota
Los eucariotas poseen cinco tipos de polimerasas, llamadas 4$% pol O, Q, R, S y P. Es all que el mecanismo de
replicacin es muy similar al procariota "existe una secuencia de origen, es bidireccional, existen primasas, se
diferencian !ebras adelantadas y retrasadas, etc& tambin existen ciertas diferencias. 4e !ec!o, en la !orquilla
act,an dos 4$% polimerasas, la O y la S "o la P&.
En *9=<, al sitio de origen de la replicacin se une una protena llamada ant%geno 0 o 0ag. sta es la que posee
actividad !elicasa y disocia el 4$% mediante %7) y la protena #)% "anloga a las **>&. 2na molcula de 4$% pol O
"anloga a la primasa 4na8& se una a cada !ebra para formar primers, estimulada por el factor de replicacin .
"#W.&. )osteriormente, el ant%geno nuclear de clula proliferante "o ).$%, un trmero& se fi/a a los extremos 01 del
primer y desplaza a la )ol O de stos, e induciendo la unin de la )ol S "el ).$% es anlogo a la subunidad Q de
procariotas, y tambin participa en el aumento de la procesividad&. El antgeno 7 seguir separando las !ebras de
4$%, y el comple/o primasa5).$%5)ol S se asociar a los primers en su extremo 01 para elongarlos.
3. Telmeros
Los cromosomas eucariotas son lineales y poseen extremos especializados llamados telmeros, secuencias
oligomricas repetitivas que evitan el acortamiento del material gentico en las !ebras rezagadas. La enzima que
act,a en este caso es una transcriptasa reversa especial denominada telomerasa que alarga la plantilla de la cadena
retrasada desde su extremo !idroxlico 01. .ontiene un sitio cataltico que polimeriza desoxirribonucletidos dirigidos
por una plantilla de #$%. Las clulas somticas se replican en ausencia de la actividad telomerasa.
En .1ytricha por e/emplo, la repeticin sintetizada por la telomerasa permite la formacin de !orquillas y estructuras
stem2loop que inducirn a la separacin de las cadenas recin sintetizadas de la !ebra de #$% de la polimerasa,
para permitir la formacin de una nueva repeticin.
Tema 3: Mutabilidad y reparacin del DNA
1. "ntroduccin
La secuencia de 4$% puede modificarse como resultado de errores de copiado introducidos por las polimerasas y
por agentes ambientales qumicos o fsicos. *i los cambios en la secuencia del 4$% no se corrigen, las clulas
somticas pueden sufrir la disminucin o la eliminacin de su funcionamiento, y las germinales pueden evitar la
generacin de descendencia viable. 4e a! que el mantenimiento del 4$% sea clave para la supervivencia de las
especies. )or otra parte, si no existiesen mutaciones, la variacin gentica necesaria para impulsar la evolucin
faltara y no !abran surgido especies nuevas.
6
El 4$% es una molcula altamente reactiva, y su modificacin por agentes qumicos o fsicos no es rara. *u
estructura de doble !ebra es una proteccin extra, ya que se ve que el 4$% es ms estable que el #$%. Las bases
nitrogenadas pueden sufrir un gran n,mero de modificaciones rpidas, como la formacin de aductos, o la
modificacin covalente. stas pueden provenir de agentes externos "inducidos& o internos "espontneos&. *uceden en
todo tipo de cido nucleico, tanto 4$% como #$%, tanto nuclear, como mitocondrial, como bacteriano.

2. #utaciones
2na mutacin es una alteracin irreversible de la secuencia del 4$% de un individuo, que, por lo tanto, podr
transmitirse por !erencia a su descendencia. Las clulas poseen una tasa normal de mutacin debido a errores en la
replicacin, y a mecanismos reparativos que detectan y revierten el cambio. 2n mut-geno es un agente qumico o
fsico que aumenta la velocidad de mutacin.
Las mutaciones pueden cambiar una forma de alelo a otra, generalmente desde una forma salva/e a una mutante
que puede alterar o no el fenotipo de acuerdo a las relaciones de dominancia entre stas.
'.(. 7ipos
Existen diversas clasificaciones de las mutaciones, entre ellas6
a& *eg,n la clula donde suceden6 pueden ser mutaciones germinales o som-ticas. Estas ,ltimas son ms comunes,
ya que las clulas somticas se dividen ms, pero no se transmiten a las clulas reproductoras y por lo tanto no son
!eredables. Las mutaciones germinales, en cambio, son espordicas y minoritarias, adems de no ser
fenotpicamente observables, ya que la gran mayora es letal.
b& *eg,n su magnitud6 pueden ser grandes "que incluyen !asta mutaciones cromosmicas completas, donde se
altera la estructura cromosmica en general&, medianas "que incluyen secuencias relativamente cortas& o peque-as
"puntuales en ciertas bases&.
c& *eg,n su mecanismo, podrn ser endgenas "o espontneas, como ser los errores replicativos, la modificacin
oxidativa de bases, la eliminacin espontnea de bases, etc.& o e1genas "como por agentes qumicos, fsicos o
biolgicos&.
'.'. Eutaciones puntuales
Las mutaciones puntuales pueden ser de tres tipos6 sustituciones, inserciones o deleciones.
Las sustituciones de un nucletido por otro es relativamente com,n en 4$% codificante, regulatorio y no codificante.
*e clasifican en transiciones "si se mantiene la naturaleza qumica de la base, purina5purina o pirimidina5pirimidina& o
trans*ersiones.
stas pueden ser "si se dan sobre una secuencia codificante&6
a& *innimas, cuando el codn resultante codifica para el mismo aminocido que el codn original
b& 3issense, cuando el codn resultante codifica para un aminocido distinto al codn original, lo que puede generar
una protena defectuosa y@o disfuncional. )uede ser conservativa "si genera un aminocido similar& o no conservativa.
c& "onsense, cuando el codn resultante es un codn de terminacin
Las sustituciones de varios nucletidos suelen ser ms infrecuentes.
Las inserciones y deleciones son infrecuentes en 4$% codificante "no lo son en 4$% no codificante&. stas pueden
dar origen a desplazamientos del marco de lectura, lo que generar protenas no funcionales y generalmente ms
cortas, y tambin fenmenos nonsense al generar o eliminar codones de terminacin.
3. aturale$a de las mutaciones
La tasa general con la que se producen mutaciones espontneas en cualquier sitio del cromosoma oscila entre (<
5G
y
(<
5((
por duplicacin del 4$%, con algunos sitios que son hotspots, donde las mutaciones surgen con ms frecuencia,
y otros donde las mutaciones son menos probables.
%lgunas secuencias propensas a sufrir mutaciones son las repeticiones de dos, tres o cuatro nucletidos simples,
denominadas microsatlites de 4"A. Esto ocurre por un CresbalnD de la polimerasa al copiarlas, lo que aumenta o
disminuye el n,mero de copias, situacin posiblemente adversa para el organismo.
0.(. Errores en la replicacin
La maquinaria de duplicacin consigue un altsimo grado de precisin mediante la actividad correctora de pruebas.
sta me/ora su fidelidad en un factor de (<<, aunque no es infalible, y ciertos nucletidos incorporados eluden la
deteccin y generan mutaciones permanentes en una de las !ebras !i/as.
Existen mecanismos para detectar y reparar los apareamientos incorrectos, lo que aumenta la precisin entre dos o
tres rdenes de magnitud adicionales. )ara esto debe buscar los apareamientos incorrectos temporales de manera
veloz, y luego corregirlos de manera puntual, en la !ebra !i/a y no en la progenitora.
En #. coli, la enzima dimrica Eut* busca los apareamientos incorrectos mediante la distorsin de todo el 4$%, y los
detecta ya que stos facilitan la torsin con muc!a ms facilidad. Eut* reclutar a EutL que activar a Eut+, una
enzima que producir una incisin de una cadena cerca del sitio de mal apareamiento, y 2vr4 "una !elicasa&
desenrolla el fragmento para que una exonucleasa digiera la cadena nicJeada !acia el sitio de apareamiento
incorrecto. La brec!a monocatenaria ser duplicada por )ol NNN.
)ara detectar cul es la !ebra !i/a y cul es la !ebra progenitora, #. coli utiliza la metilacin de adeninas en
secuencias 8%7.. stas aparecen ms o menos cada '3< pares de bases y es donde se unir Eut+. .uando se
detecte una regin de mal apareamiento cercana, la unin de EutL y Eut* a sta, inducirn el corte sobre la !ebra no
metilada a,n "la !ebra !i/a&. 4e acuerdo la posicin relativa entre el corte y el sitio de mal apareamiento, se utilizarn
distintas exonucleasas6 la #ecX que degrada 4$% en direccin 3101 o la exonucleasa que lo degrada en direccin
0131.
Las clulas eucariotas poseen !omlogos de Eut* "E*+& y de EutL "EL+ y )E*&. 4e !ec!o, poseen varias E*+
con distinta especificidad de acuerdo a los errores que detectan. $o obstante, carecen de Eut+. La deteccin de la
7
!ebra !i/a se da por el !ec!o de que sta est fragmentada "en fragmentos de LJazaJi& mientras que en la cadena
adelantada, por actividad del ).$%.
0.'. Lesin del 4$%
*e denomina lesin del 4"A a los da-os originados por sustancias qumicas o fenmenos fsicos, y no a los
originados por el proceso de replicacin. Existen lesiones espontneas endgenas, y lesiones inducidas exgenas.
El tipo de da-o espontneo ms frecuente es por accin del agua, irnicamente. sta produce la desaminacin de
citosinas generando uracilos "base extra-a& que se aparea con la adenina y no con la guanina. La adenina y la
guanina tambin se desaminan generando !ipoxantina "+58& y xantina "Y5.&. Estos productos son antinaturales, por
lo que pueden ser fcilmente detectados. 7ambin se notan despurinaciones por !idrlisis espontneas del enlace $5
glucosdico. Las citosinas metiladas son hotspots, ya que su desaminacin espontnea genera timinas, lo que
dificulta su deteccin y correccin.
El 4$%, adems, es vulnerable al da-o por alquilacin, oxidacin y radiacin. En la alquilacin se transfieren grupos
metilo o etilo a las bases o a los fosfatos, por e/emplo, en la L
G
5metilguanina, que se aparear con la timina. La
oxidacin se produce por especies reactivas del oxgeno, como el oxo8 que se podr aparear con la citosina y la
adenina. La radiacin ultravioleta suele generar un dmero de timinas "o timina5citosina& que comprende un anillo
ciclobutano, e impide el apareamiento 75% correcto, induciendo la detencin de la polimerasa. Las radiaciones
gamma y Y son ionizantes y rompen ambas cadenas del 4$%, adems de generar especies reactivas de oxgeno.
Ltros agentes que lesionan el 4$% son los anlogos de bases "que se aparean de manera imprecisa, como el 35
bromouracilo, un anlogo de la timina que se aparea con la guanina& y los agentes intercalantes "planos y que
causan la eliminacin o la adicin de un par de bases, como el etidio o la acridina&. stos ,ltimos inducen el agregado
de nuevos nucletidos para aparearse con el agente, o la delecin de otras por la distorsin del molde.
4. %eparacin de las lesiones del D!
Existen diversos mtodos para reparar las lesiones del 4$%. En el ms directo, una enzima reparadora revierte la
lesin. 7ambin se ven sistemas de reparacin por escisin donde el nucletido se elimina del 4$%, ya sea
eliminando solo el nucletido da-ado o un segmento corto de 4$% monocatenario que lo contiene.
=.(. #eversin directa
2n e/emplo de reversin directa es la fotorreacti*acin, donde la enzima 4$% fotoliasa captura energa de la luz y la
utiliza para romper los enlaces covalentes de un dmero de timinas. sta no est presente en !umanos ni en otros
mamferos placentarios, y utiliza W%4+ y E7+W como cofactores.
Ltro e/emplo, es la eliminacin del metilo de la L
G
5metilguanina mediante una metiltransferasa que no se podr
volver a utilizar.
=.'. #eparacin por escisin
Es el mecanismo predominante en los eucariotas.
5..!. +eparacin por escisin de base 6B#+7
2na enzima denominada glucosilasa reconoce y elimina la base da-ada "!idrolizando %7)& mediante la !idrlisis del
enlace glucosdico generando un monosacrido absico que ser eliminado en un paso endonucleoltico adicional por
la %) endonucleasa. Luego )ol N "o )ol Q& completar el sitio vaco y una ligasa sellar la mella.
Las 4$% glucosilasas son especficas de lesin y las clulas poseen muc!as 4$% glucosilasas con especificidades
diferentes. stas poseen mecanismos especficos para proyectar !acia afuera de la !lice los sitios incorrectos.
Existen glicosilasas de seguridad que evitan la generacin de ciertas mutaciones comunes. )or e/emplo, si no se
eliminase a tiempo un oxo8, ciertas glicosilasas eliminan las adeninas que se apareen con este en las !ebras !i/as.
7ambin existen sistemas que eliminan timinas de apareamientos 758, ya que consideran que stas surgieron
errneamente de desaminaciones de citosinas.
Existe un tipo de >E# ms comple/o. En ste, se utiliza la endonucleasa %) para eliminar entre ' y (< pares de
bases desde el sitio donde se detecta el residuo absico. Luego, la )ol S "o P& en con/unto con el ).$%, el #W. y la
endonucleasa WE$( llenarn el !ueco.
5... +eparacin por escisin de nucletido 6"#+7
Las enzimas de la reparacin por escisin de nucletido no reconocen lesiones particulares, sino que reconocen
distorsiones en la forma de la !lice doble como las causadas por un dmero de timina o por un aducto qumico
abultado.
En #. coli, la realizan cuatro protenas6 2vr%, 2vr>, 2vr. y 2vr4. 2n comple/o entre 2vr% y 2vr> busca en todo el
4$%, la 2vr% detecta las distorsiones y la 2vr> desnaturaliza el 4$%, !idrolizando %7), para crear una burbu/a
monocatenaria alrededor de la lesin. Luego 2vr> recluta a 2vr. que ser la encargada de generar una incisin a
oc!o nucletidos !acia 31 y otra a cinco !acia 01. El segmento de (0 residuos se tornar accesible por la !elicasa
2vr4, y )ol N llenarn la brec!a remanente.
En eucariotas, se encuentran ms de '3 polipptidos para realizar estas tareas. Entre ellos Y). y '0> "anlogos a
2vr%&, Y)% y Y)4 "anlogos a 2vr>& y las protenas #)%. Las protenas que generan las escisiones sern E#..(5
Y)W en el lado 31 y Y)8 en el lado 01. El segmento de 4$% monocatenario eliminado es de '= a 0' nucletidos de
longitud, y se llenar la brec!a mediante )ol S o .
Este mtodo tambin permite rescatar la #$% polimerasa cuya progresin se detuvo por la presencia de una lesin
en la cadena transcrita de un gen, y esta reparacin acoplada a transcripcin comprende el reclutamiento de
protenas de la reparacin por escisin de nucletido !acia la #$% polimerasa detenida. La deteccin se da por la
accin del 7WNN+ que incluye a las protenas Y)% y Y)4.
=.0. #eparacin de roturas bicatenarias
sta recupera informacin de secuencia del cromosoma !ermano. La informacin para reparar una lesin puede
provenir de la otra molcula !i/a de la !orquilla replicativa por recombinacin. Esto permitir que el sistema de
reparacin por escisin de nucletido pueda actuar, reparando la mutacin detectada.
8
=.=. *ntesis de translesin
.uando una 4$% polimerasa encuentra una lesin que no se repar puede suceder que vea detenida su progresin.
En este caso, la maquinaria replicativa tiene que intentar copiar a travs de la lesin o se ve forzada a detener la
duplicacin. El mecanismo que permite saltear estos sitios de lesin se denomina s%ntesis de translesin, que
probablemente genera mutaciones pero evita la sntesis de cromosomas duplicados de manera incompleta.
Este mecanismo utiliza polimerasas especiales, tales como las protenas 2mu. y 2mu41. Estas no estn presentes
normalmente en las clulas, sino que su sntesis es inducida solo en respuesta al da-o del 4$% mediante respuestas
*L*. El da-o del 4$% conduce a la destruccin proteoltica del represor Lex%, lo que permite la expresin de los
genes que codifican las polimerasas. La activacin se da por una protena denominada #ec%.
=.3. Eliminacin de agentes mutagnicos
Es otro mtodo de evitar mutaciones, pero no es un mecanismo reparativo, sino que evita que las lesiones ocurran
ya que neutraliza el efecto mutagnico de los mutgenos del medio.
2n e/emplo claro es el de la superxido dismutasa "*L4&, que evita la acumulacin de radicales peligrosos "como el
superxido& que pudieren causar lesiones oxidativas. 7ambin debemos mencionar la catalasa, que inactiva el
perxido de !idrgeno transformndolo en agua y oxgeno molecular.
Tema 4: Recombinacin
1. "ntroduccin
El intercambio gentico opera constantemente para mezclar y reordenar los cromosomas, no solo durante el
crossing o*er de la meiosis. El proceso encargado de llevarlo a cabo es la recombinacin homloga, y comprende el
intercambio fsico de secuencia de 4$% entre cromosomas.
Es un proceso celular indispensable y es catalizado por enzimas altamente reguladas. Entre sus funciones
principales encontramos6
a& )roveer variabilidad gentica
b& #ecuperacin de secuencias perdidas de 4$% a partir de una cadena indemna en un cromosoma !omlogo
c& #einiciar !orquillas de replicacin detenidas o da-adas
d& #egular la expresin de ciertos genes
)or otra parte, su utilidad en ingeniera gentica !a sufrido un importante incremento en los ,ltimos tiempos.
2. #odelos
Eeselson y *ta!l comprobaron que la recombinacin es conservadora y comprende la ruptura directa y el resellado
del 4$%. +oy se sabe que tambin puede llegar a comprender destruccin y resntesis.
Los pasos fundamentales de la recombinacin !omloga son los siguientes6
a& %lineacin de dos molculas de 4$% !omlogas, es decir, idnticas o casi idnticas para una regin de al menos
cien pares de bases
b& Nntroduccin de roturas en el 4$%, en una o ambas cadenas
c& Wormacin de regiones de apareamiento de bases entre las molculas de 4$% que se recombinan, tambin
conocido como in*asin de cadenas, lo que genera entrecruzamientos o 8niones de Holliday.
d& Eovimiento de las uniones de +olliday, o migracin de las ramas.
e& Escisin de la unin de +olliday, regenerando dos molculas de 4$% d,plex separadas.
Existen dos modelos que explican la recombinacin siguiendo estos pasos, el de +olliday y el de la reparacin de la
rotura bicatenaria.
'.(. Eodelo de +olliday
Wue el primer modelo propuesto, aunque en la actualidad se sabe que la mayora de los fenmenos de
recombinacin no lo siguen, ya que ste no contempla neosntesis de 4$%.
*e inicia por un corte en una !ebra de cada molcula de 4$% en una ubicacin idntica, para que las cadenas
cercanas a ste puedan despegarse e invadir el d,plex !omlogo !asta aparearse con l. La invasin es simtrica y
genera una sola unin de +olliday que podr migrar para aumentar la longitud del 4$% intercambiado, aunque se
generen heterod&ple1 "regiones de diferencia secuencial&. La terminacin de la recombinacin puede generarse de
dos maneras distintas, una en la que los sitios de corte aparecen en las dos cadenas de 4$% que no se rompieron
"sitio (&, y otra, en la que aparecen en las dos cadenas de 4$% antes rotas "sitio '&.
*i la estructura se resuelve mediante el corte en el sitio (, se generarn productos de recombinacin por empalme, o
productos recombinados, donde existirn sectores provenientes de ambas molculas de 4$% en cada producto.
*i la estructura se resuelve mediante el corte en el sitio ', se generarn productos en parche, o productos no
recombinados, donde cada uno poseer un Cparc!eD de 4$% de la otra molcula de 4$%.
'.'. Eodelo de la reparacin de las roturas bicatenarias
*e inicia por una rotura bicatenaria en una de las dos molculas de 4$%. El otro d,plex permanecer intacto. Luego,
una enzima degrada la molcula rota para generar regiones 01 protruyentes de 4$% monocatenario. stas invadirn
luego el d,plex de 4$% !omlogo no roto, y sus extremos 01 libres pueden servir como cebadores para la sntesis de
4$% nuevo. Este alargamiento puede utilizar el d,plex !omlogo como plantilla y sirve para regenerar las regiones
del 4$% que se destruyeron durante el procesamiento de las cadenas. $tese que si los dos d,plex de 4$%
originales no tenan secuencias idnticas cerca del sitio de rotura, la informacin puede perderse al eliminar esta
regin, lo que es conocido como con*ersin gnica.
Las dos uniones de +olliday !alladas en los intermediarios de la recombinacin se mueven por migracin de ramas y
se resuelven, pudiendo dar tambin productos recombinados "ambas resueltas por cortes en distintos sitios& como no
recombinados "ambas resueltas por cortes en el mismo sitio&.
9
Las roturas bicatenarias se producen frecuentemente, y si no se las repara, podra ser peligroso para la clula. La
recombinacin !omloga en bacterias sirve fundamentalmente para reparar roturas bicatenarias generadas por
distintas causas. 7ambin participa en la reactivacin de !orquillas de replicacin colapsadas, ya sea por la rotura de
una de las cadenas, o por una lesin. En eucariotas, en cambio, participa fundamentalmente en la generacin de
variabilidad gentica.
3. #a&uinaria proteica de recombinacin procariota
En #. coli, la recombinacin sigue mediante el mecanismo de la +ecBC4.
0.(. .omple/o #ec>.4
La enzima #ec>.4 procesa las molculas de 4$% rotas para generar regiones monocatenarias y contribuye a
cargar la protena de intercambio de cadenas "#ec%& sobre stos.
La #ec>.4 est compuesta por tres subunidades provenientes de los genes recB9 recC y rec4, y posee actividad
tanto !elicasa "> y 4& como nucleasa. *e une al 4$% en un sitio de rotura bicatenaria y se mueve mediante !idrlisis
de %7), desenrollando el 4$% y degradando ambas cadenas. % su actividad la controlan elementos del 4$%
conocidos como sitios : o sitios chi "de crossover !otspot instigator, de secuencia 8.788788& que estimulan la
recombinacin !omloga. stos alteran la actividad nucleasa "por accin en #ec4&, ya que luego de atravesarlo, no
escindir ms la cadena que recorre en direccin 0131, y escindir ms rpidamente la que recorre en 3101. )or lo
tanto, generar un extremo 01 protruding con un sitio c!i terminal.
#ec>.4 tambin participa en reclutar a #ec% para que se una al 4$% simple !ebra, y no lo !agan las **>. )or otra
parte, los sitios c!i aumentan la frecuencia de recombinacin. 4e !ec!o se observa una disminucin de la frecuencia
de recombinacin que cae lentamente !acia un lado del sitio c!i, pero lo !ace abruptamente !acia el otro.
Los sitios c!i tambin representan un mtodo de control sobre el material gentico exgeno en bacterias, ya que ste
posee una menor cantidad de sitios c!i especficos para la bacteria en cuestin, por lo que no se activar para
recombinar y ser rpidamente degradado.
0.'. )rotena #ec%
Es la protena central de la recombinacin !omloga, ya que participa en el intercambio de cadenas, catalizando el
apareamiento de molculas de 4$% !omlogas, lo que requiere buscar coincidencias de secuencia entre ambas y
generar regiones de apareamiento de bases. La forma activa de #ec% es un filamento de 4$%5protena de tama-o y
composicin variable, aunque generalmente contiene unas (<< subunidades proteicas y 0<< nucletidos.
La estructura del 4$% dentro de ste filamente est muy extendida por lo que cuando se une la #ec%, la longitud del
4$% se extiende, lo que facilita la b,squeda de secuencia !omlogas. La unin de #ec% al 4$% es cooperativa y
puede darse sobre 4$% bicatenario, tricatenario, etc., pero con muc!a menor velocidad, aunque siempre en direccin
31Z01.
En primer lugar, el filamento de #ec% tiene que armarse sobre una de las molculas de 4$% participantes para luego
buscar !omologa en la otra molcula. Esto es posible porque posee dos sitios de unin al 4$%, el primario y el
secundario "que puede unirse a 4$% bicatenario, y suele tener menor afinidad&. Es en el sitio secundario donde la
molcula barre el 4$% !asta encontrar una !omologa de al menos (3 nucletidos y desencadena el intercambio de
cadenas.
2na vez que se ubica una regin de complementariedad de bases, #ec% promueve la formacin del comple/o
estable mediante la generacin de una estructura de tres cadenas "molcula con,unta&. La cadena de 4$% en el sitio
primario de unin se aparea con su complemento en el d,plex de 4$% en el sitio secundario. La terminacin del
intercambio requiere que las dos cadenas se entrelacen, y la #ec% se unir ms a los productos para impulsar su
estabilidad.
0.0. .omple/o #uv%>
El movimiento del sitio de la unin de +olliday necesita el intercambio de pares de bases entre los dos d,plex de
4$% !omlogos. #uv% es una protena tetramrica de unin a la unin de +olliday que la reconoce por su
conformacin estructural, y permite la unin de la protena #uv>. sta es una %7)asa !examrica "se unen dos
!exmeros por tetrmero de #uv%& que provee la energa para impulsar el intercambio de pares de bases que mueve
la rama de 4$%.
0.=. )rotena #uv.
La resolucin de las uniones de +olliday se da por una endonucleasa principal, la #uv. dimrica, que funciona en
con/unto con el comple/o #uv%>. .orta dos de las cadenas de 4$% !omlogas que tienen la misma polaridad,
generando extremos que terminan en grupos fosfato 31 y ox!idrilos 01 que podrn ligarse por la ligasa. #uv. escinde
el 4$% con una especificidad secuencial modesta "77 78&, secuencias que se encuentran lo suficientemente
distanciadas en el genoma como para asegurar la migracin de rama antes de la resolucin.
4. %ecombinacin 'omloga en eucariotas
=.(. #ecombinacin y meiosis
La recombinacin !omloga cumple funciones adicionales importantes en los eucariotas, fundamentalmente, ser
decisiva en la meiosis, donde es necesaria para el apareamiento cromosmico correcto "lo que mantiene la integridad
del sistema& y la generacin de variabilidad gentica en las gametas.
%ntes de la divisin meitica, la clula posee dos copias de cada cromosoma "cromosomas homlogos, uno de cada
progenitor& que se duplicarn. Los productos de duplicacin "crom-tides hermanas&, se mantendrn /untos. %ntes de
que suceda la divisin propiamente dic!a, los cromosomas !omlogos deben alinearse y aparearse lo que permite
una sencilla recombinacin, que deber terminar antes de la separacin cromosmica.
10
*in recombinacin, los cromosomas con frecuencia no se alinean adecuadamente para la primera divisin meitica y
esto conlleva a fenmenos de no disyuncin. Los fenmenos de recombinacin !omloga observados durante la
meiosis se conocen como recombinacin meitica.
=.'. >ases moleculares de la recombinacin meitica
La finalizacin de la meiosis requiere la activacin de la expresin de muc!os genes que no se necesitan durante el
crecimiento, como spo!!, que introduce una protena "*po((& que genera roturas bicatenarias en el 4$%
cromosmico para iniciar la recombinacin. sta corta el 4$% en varios sitios del cromosoma sin selectividad
secuencial, pero si con selectividad temporal "apenas comienza el apareamiento de cromosomas !omlogos&. Estos
cortes suelen darse en regiones cromosmicas que no tienen abundantes nucleosomas.
El corte se da mediante el ataque de una tirosina especfica sobre el esqueleto de ribosa5fosfato, y sucede en ambas
!ebras del 4$%, debido a dos subunidades distintas, que lo !arn con dos nucletidos de separacin entre los cortes.
Este mecanismo permite que los extremos 31 queden unidos a la enzima covalentemente "sin prdida energtica&, y
sern los sitios iniciales de procesamiento para crear las colas de 4$% monocatenario.
El procesamiento de los extremos para generar colas monocatenarias se debe al comple/o enzimtico E#Y "de
subunidades Ere((, #ad3< y Yrs'&, que degradar las cadenas unidas a *po((, lo que permite la generacin de los
extremos 01 protruding de ( Jb, y elimina la *po(( unida.
Los !omlogos eucariotas a #ec% son #ad3( y 4mc( "la primera se presenta en clulas que puede dividirse tambin
por mitosis, la segunda en las que no pueden !acerlo&. stas act,an de forma muy similar a #ec%, y es sorprendente
que sean casi especficas para la recombinacin entre cromosomas !omlogos y no afecten a las cromtides
!ermanas.
En las clulas se observa la interaccin de las protenas descritas y muc!as ms en las llamadas f-bricas de
recombinacin. )or e/emplo, tambin se observa la accin de #ad3' que facilita la formacin de los comple/os
#ad3(54$% "tal como lo !aca #ec>.4&. La migracin de las ramas y la resolucin de las uniones de +olliday no
estn del todo comprendidas aunque se conocen algunas protenas implicadas como la resolvasa EusM(.
(. )on*ersin del tipo de apareamiento
La recombinacin !omloga tambin puede servir para cambiar la secuencia del 4$% en un sitio especfico, lo que
puede utilizarse en la regulacin de la expresin gnica. )or e/emplo, en ). cere*isiae, controla los tipos celulares
que pueden presentarse6 diploide, !aploide a, o !aploide O. 4os clulas !aploides, una a y una O, pueden fusionarse
para generar una diploide que sufrir meiosis para dar dos clulas a y dos O.
Los genes que codifican reguladores de la transcripcin que determinarn si una clula es a o O se controlarn
mediante conversin del tipo de apareamiento, de acuerdo a cul de estos genes se encuentren en un locus especial
"el locus 3A0&. %s, en las clulas de tipo a, ser el gen a( el que se encuentre en E%7, y en las de tipo O sern los
genes O( y O'. En otra parte separada del cromosoma se encuentran los loci +E# y +EL que contienen los genes a
y O respectivamente, pero que no los expresan "son cassetes mudos&, sino que funcionan de almacen de la
informacin gentica.
La conversin del tipo de apareamiento se inicia con la introduccin de una rotura bicatenaria en el locus E%7 por la
endonucleasa +L especfica de secuencia. Luego E#Y producir la reseccin de una de las cadenas, y se unirn
#ad3( y #ad3' a las monocadenas, para buscar secuencias !omlogas e iniciar la invasin de cadenas y el
intercambio gentico.
Las secuencias !omlogas encontradas, claramente, estarn en los loci +E# o +EL, y sern las elegidas para la
invasin de las cadenas. *i en E%7 se encuentran genes O, se producir la invasin de cadenas con +EL "que
contiene los genes O& y viceversa. Luego de la recombinacin, la informacin gentica que estaba en los loci +E
estar en los loci E%7, sin intercambio recproco "es decir, no se copiar el gen que estaba en E%7 en las
secuencias +E&.
3.(. +ibridacin de cadenas dependiente de sntesis
$o obstante, actualmente se cree que el mecanismo de recombinacin en la conversin del tipo de apareamiento
diverge del de reparacin de rotura bicatenaria luego de la invasin de cadenas, ya que en el primero nunca se ven
productos recombinados, sino siempre en parc!e. )ara explicar la conversin gnica sin crossing2o*er se propuso la
hibridacin de cadenas dependiente de s%ntesis "*4*%&.
Este asegura que luego de la invasin de cadenas, el extremo 01 invasor sirve como cebador para sintetizar 4$%
nuevo tanto en cadena adelantada como retrasada, que se separarn del molde. Este 4$% de doble !ebra contendr
la secuencia del gen a o O, y se unir al sitio en el 4$% que primero fue cortado por +L. )ara que se complete la
recombinacin, la cadena 01 de E%7 debe ser eliminada para que el 4$% neosintetizada pueda unirse, lo que elimina
el gen O del locus E%7.
+. )onsecuencias gen,ticas de la recombinacin 'omloga
.omo vemos, ninguno de los pasos de la recombinacin !omloga necesita el reconocimiento de una secuencia de
4$% especfica, ya que las pocas que se utilizan son muy comunes. )or lo tanto, puede generarse a partir de
cualquier par de molculas que presente una determinada secuencia !omloga. Esto corrobora la !iptesis de que la
frecuencia de recombinacin es proporcional a la distancia entre los genes que recombinan. $o obstante, tambin
!ay que tener en cuenta las probabilidades de recombinacin, relacionadas con los sitios c!i y con la estructuracin
del 4$%.
Ltra consecuencia importante es la explicacin de los fenmenos de conversin gnica observados que no utilizan el
mecanismo *4*%. Nmaginemos una clula con un cromosoma !omlogo que contiene el alelo > de un gen, mientras
que el otro contiene el alelo b. Luego de la duplicacin, la composicin gnica de la clula sera >>bb. *e esperara
que de las cuatro gametas generadas, dos posean el alelo > y dos el alelo b, pero es com,n observar proporciones
06(, e incluso =6<.
11
Esto puede explicarse mediante conversin gnica independiente de *4*%, si pensamos que luego de la
recombinacin, pueden quedar molculas de 4$% con la combinacin >b. Esto, necesariamente generar uno o ms
!eterod,plex que podrn ser arreglados por enzimas de reparacin del material gentico. stas podrn utilizar el
mecanismo $E#, y por tanto eliminar un fragmento de 4$% que contenga al "o a los& nucletidos mal apareados, y
resintetizar el fragmento utilizando la otra !ebra como molde, pudiendo eliminar la identidad del alelo, y por lo tanto,
transformando un alelo > en uno b o viceversa.
-. .tras recombinaciones
Existen ciertos procesos genticos que rearreglan secuencias de 4$% y permiten una estructura genmica ms
dinmica. Los mecanismos ms importantes que realizan estas tareas son las recombinaciones sitio espec%ficas
".**#& y las recombinaciones transposicionales.
La primera es la recombinacin entre dos elementos de secuencia definidos, mientras que la transposicin se da
entre dos secuencias especficas o no especficas, generando una modificacin en el orden de los genes. %mbos
generan grandes impactos en la estructura cromosmica.
*e basan en la accin de ciertas protenas denominadas recombinasas que reconocen secuencias especficas
donde suceder la recombinacin, los /untan formando un comple/o protena54$% "el comple,o sin-ptico& y catalizan
la ruptura y reunin de las molculas de 4$%. Lbviamente su actividad est altamente controlada.
[.(. #ecombinacin especfica de sitio conservadora
Es la responsable para la mayora de las reacciones en las que un segmento determinado de 4$% es movido,
siempre y cuando contenga un elemento de secuencia corto, o sitio de recombinacin. stos transportan dos tipos de
elementos, secuencias unidas especficamente por las recombinasas y secuencias donde ocurren la ruptura del 4$%
y su reunin.
Esto puede insertar un segmento de 4$% en un sitio especfico, eliminar un segmento de 4$% o invertirlo, de
acuerdo a la organizacin de los sitios de recombinacin. Las secuencias de reconocimiento de la recombinasa
"simtricas& flanquean una secuencia asimtrica central denominada regin crosso*er, que ser donde suceda la
ruptura y la reunin de la cadena. *u asimetra genera una determinada polaridad, por lo que la recombinacin entre
un par de sitios invertidos invertir el segmento de 4$% entre ellos.
Existen dos tipos de recombinasas para .**#, las serina recombinasas y las tirosina recombinasas. %mbas se
diferencian en el intermediario covalente que se genera entre la protena y el 4$% a la !ora de cortarlo. %mbos
intermediarios conservan la energa del enlace roto, lo que permite la reversin del proceso a la !ora de reunir la
cadena. Es por esto que el mecanismo es conser*ador, ya que las recombinasas no generan extremos no ligados
luego de su actividad, y no requieren %7) para funcionar.
Las funciones principales de este tipo de recombinacin incluyen la insercin de 4$% almacenado en fagos, altera la
expresin gnica, mantiene integridades estructurales, etc.
[.'. 7ransposicin
Es una forma de recombinacin gentica que mueve ciertos elementos de un sitio del 4$% a otro. Estos elementos
son llamados elementos transponibles o transposones, y su movimiento puede suceder con o sin su duplicacin.
Los elementos transponibles muestran una peque-a selectividad de secuencia a la !ora de elegir sus sitios de
insercin, por lo que pueden insertarse dentro de genes, eliminando su funcin, o tambin en sus secuencias
regulatorias, lo que los transforma en una excelente fuente de mutaciones y enfermedades, lo que permiti su
utilizacin como mutgenos y vectores. *e encuentran en los genomas de toda forma de vida conocida y pueden
representar un gran porcenta/e de stos "por e/emplo, ms de la mitad del genoma !umano&.
Existen tres tipos principales de transposones6
a& Los transposones de 4$%. Estos permanecen como 4$% dentro de un ciclo de recombinacin y se mueven
utilizando mecanismos que involucran el corto y la reunin de las !ebras de 4$%. *uelen transportar un gen que
codifica su propia transposasa "si es as, se denominan autnomos&.
b& Los retrotransposones similares a los virales "L7#&
c& Los retrotransposones poli5%
Estos ,ltimos requieren de la transcriptasa reversa, ya que utilizan un intermediario de #$% que ser el molde para
regenerar la secuencia mvil que se unir al 4$% receptor.
;..!. 3ecanismo de transposicin
Los tres tipos de transposones utilizan mecanismos similares de recombinacin para insertarse en un nuevo sitio. El
ms simple es el de corte y pegado.
)ara iniciarla, la transposasa se une a los extremos de los transposones, unindolos y generando un comple/o
protena54$% estable "el comple/o sinptico o transpososoma&, que asegura que ambos cortes se produzcan al
mismo tiempo y protege los extremos del 4$% de las 4$%sas. El fragmento poseer !idroxilos501 terminales y
fosfatos531 terminales. Luego cortar el 4$% blanco, generando extremos 315) protruyentes "por eliminacin de una
regin de la !ebra 01 terminal& que se unirn a los 015L+ del transposn. %s quedarn dos mellas, una en cada
cadena, entre el 015L+ del 4$% blanco y el 315) del transposn, que ser rellenada por una 4$% )ol adecuada, y una
ligasa.
12
Tema 5: Trancripcin y modi!icacione
pottrancripcionale
1. "ntroduccin
El primer paso para la expresin de la informacin almacenada en el material gentico, es la transcripcin del 4$%
para sintetizar molculas de #$% mensa/ero. 4esde el punto de vista qumico y enzimtico, la transcripcin es muy
similar a la duplicacin del 4$%, mientras que las diferencias principales son6
a& La #$% polimerasa no necesita un cebador
b& El #$% sintetizado no permanecer apareado al 4$% molde, sino que se separar luego de unos pocos
nucletidos apareados. Esto permite que se puedan transcribir un gen mediante varias polimerasas al mismo tiempo,
lo que es necesario para aumentar rpidamente la expresin gnica.
c& Es menos precisa, ya que existen menos mecanismos de revisin
d& La transcripcin copia en forma selectiva solo ciertas partes del genoma y produce muc!as copias. La eleccin de
qu regiones transcribir no es azarosa, sino que, contrariamente, est muy controlada.
(.(. 8enes
2n gen es una secuencia de 4$% necesaria para codificar un producto gnico, es decir, un #$% maduro funcional o
una protena. Existen dos regiones de funciones diferentes dentro de stos, una estructural, codificante y que
comprende los intrones y los exones "a veces llamada pseudogen& y una regulatoria, no codificante.
2. )iclo de la transcripcin
'.(. )olimerasas
Las bacterias tienen una sola #$% polimerasa, mientras que en las clulas eucariotas !ay tres. La )ol NN es la
encargada de transcribir la mayora de los genes "todos los codificadores de protenas&. La )ol N y la )ol NNN participan
en la transcripcin de genes especializados codificadores de #$%, la )ol N codifica el gran precursor de r#$%,
mientras que la )ol NNN transcribe los genes de los t#$%, #$%s peque-os y el r#$% 3*.
La #$% polimerasa bacteriana comprende dos copias de la subunidad O, y una de las subunidades Q, Q1 y \. En
eucariotas se presentan notables !omologas entre #)>( y #)>' con Q y Q1, #)>0 y #)>(( con O, y #)>G con \.
*us estructuras y organizaciones son muy similares, lo que permite que cumplan la misma funcin y la interaccin
con otras protenas.
La forma de cada enzima es seme/ante a la de la tenaza de un cangre/o, cuyas pinzas estn formadas por las
subunidades Q y Q1 "u !omlogas&. El sitio activo est en la base de las pinzas y puede fi/ar dos iones Eg
]]
. 7ambin
posee diversos canales que permiten que el 4$%, el #$% y los ribonucletidos entren en el sitio activo.
'.'. )asos
*on tres y bien definidos, la iniciacin, el alargamiento y la terminacin. La iniciacin comienza cuando la #$%
polimerasa se une a una secuencia de 4$% denominada promotor "comple/o cerrado&, lo desenrolla y genera una
burbu/a de 4$% monocatenario de unos (= pb "comple/o abierto&. *olo una de las cadenas actuar como molde, lo
que queda definido con la orientacin de unin de la polimerasa. *e sintetizar un fragmento de ' pb, y luego se
alargar !asta los (< nucletidos? cuando este fragmento sea el correcto "suelen observarse varios intentos fallidos&
se entrar en la fase de alargamiento al cambiar la conformacin de la polimerasa "se ad!iere ms firmemente al
molde&. Esto permite que desenrolle el 4$% molde, se mueva, lo renaturalice y cumpla funciones de revisin. Luego
de que la polimerasa transcribi el gen, la terminacin "detencin y liberacin del transcrito& se desencadena por
ciertas protenas o por estructuracin del producto.

3. Transcripcin bacteriana
0.(. )romotores
Lo que convierte a la polimerasa en una enzima funcional es la adicin de un factor de iniciacin llamado ^. En el
caso de #. coli el predominante es el ^
[<
, y los promotores que son reconocidos por este poseen dos secuencias
conservadas separadas por unos ([ nucletidos. stas estn en posiciones 5(< y 503 upstream del sitio de inicio de la
sntesis de #$%. *us secuencias no son idnticas sino que son secuencias consenso "778%.% para 503 y 7%7%%
para 5(<&. Los promotores consecuencias ms cercanas a stas son ms fuertes, es decir, inician ms transcritos en
un momento dado. En algunos promotores fuertes, !ay un elemento de 4$% adicional al que se une la #$%
polimerasa y se denomina elemento 8< y aumenta la unin de la polimerasa porque provee una interaccin
especfica adicional. Ltra clase de promotores ^
[<
carece de una regin 503 y posee un elemento 5(< extendido.
El factor ^ puede dividirse en cuatro regiones y las que reconocen los elementos 5(< y 503 son la ^' y la ^=. % la
regin = se unir mediante un motivo !lice5giro5!lice. La regin ', en cambio, se detecta por una !lice pero es
donde se desnaturalizar el 4$% para generar el comple/o abierto lo que comple/iza su estudio. Los elementos 2)
son reconocidos por un dominio carboxilo terminal de la subunidad O denominado O.74, flexible.
0.'. 7ransicin al comple/o abierto
La transicin desde el comple/o cerrado al abierto comprende cambios estructurales en la enzima y el 4$% "entre las
posiciones 5(( y ]0&. Esta transicin no necesita energa de la !idrlisis del %7), sino que deriva de un cambio de
conformacin espontneo del comple/o 4$%5enzima !acia un estado ms favorable energticamente. Es irreversible
y garantiza que se complete la transcripcin.
En el interior del sitio activo, la cadena que no se transcribir se ubica fuera del sitio activo, mientras que la que lo
!ar por l, para volver a cerrarse M nucletidos despus de abrirse. Las pinzas de la parte anterior de la enzima
13
aprietan con firmeza el 4$% corriente aba/o, mientras que la regin $5terminal de ^ pasa de bloquear la cadena de
4$% en el sitio activo "es un imitador del 4$%& a estar en la parte externa de la enzima.
0.0. .omienzo de la polimerizacin
)ara esto se necesita que el nucletido iniciador se introduzca en el sitio activo y se mantenga establemente sobre la
plantilla mientras se presenta el $7) siguiente con la geometra correcta. La enzima, para esto, deber entablar
interacciones especficas con el nucletido para permitir el ataque qumico sobre el $7) entrante "lo que explicara la
necesidad de las secuencias consenso&.
Luego de esta unin, sigue el periodo de iniciacin aborti*a, en el que la enzima sintetiza molculas de #$% cortas
"de menos de (< nt& que se liberarn de la polimerasa. .uando consiga crear un #$% de ms de (< nucletidos, se
forma un comple/o terciario estable que permitir ingresar en la fase de alargamiento. *e cree que esta iniciacin
abortiva se realiza para expulsar el factor ^ del sitio activo de la enzima, lo que explica su eliminacin al comenzar el
alargamiento.
0.=. %largamiento y terminacin
%dems de la polimerizacin, la #$% polimerasa realiza dos funciones de revisin, la edicin pirofosforol%tica "elimina
un nucletido incorporado incorrectamente por reincorporacin de ))i& y la edicin hidrol%tica "que permite eliminar
ms de un nucletido&. Esta ,ltima se estimula por los factores 8re que tambin estimulan el alargamiento.
Las secuencias terminadoras desencadenan la disociacin de la polmerasa y la liberacin de la cadena de #$% que
produ/o. En las bacterias, los terminadores podrn ser de tipo +ho independientes y +ho dependientes.
El primer tipo !ace que la polimerasa termine por dos elementos de secuencia, una repeticin invertida corta y un
segmento de unos M pb de %;7. .uando la polimerasa transcribe la secuencia repetitiva invertida, el #$% resultante
puede formar un estructura de !orquilla que causa la terminacin porque distorsiona el comple/o de alargamiento, lo
que permite la fcil apertura de la secuencia rica en %;2.
El segundo tipo posee elementos de #$% que unirn a un factor #!o. sta es una protena anular con seis
subunidades idnticas que se une al #$% ni bien sale de la polimerasa, y posee actividad %7)asa que la utiliza para
la separacin del #$% de la plantilla y la polimerasa. *us sitios de unin "o rut& presentan una secuencia de unos =<
nucletidos especfica, y se encuentra luego del sitio de finalizacin de la traduccin.
4. Transcripcin eucariota
El proceso es casi idntico, aunque !ay diferencias en la maquinaria utilizada en cada caso, no solo porque existen
tres polimerasas distintas, sino porque stas no solo necesitan un factor ^ para ser funcionales, sino que tambin
requieren la presencia de factores generales de transcripcin9 multimricos y altamente conservados. %dems, in
vivo, se requieren otros factores que modifiquen el estado de la cromatina y activen el proceso, muy lento de otra
manera.
=.(. Nniciacin
El promotor central de los eucariotas es el /uego mnimo de elementos de secuencia necesario para la iniciacin
precisa de la transcripcin por la )ol NN. *uele tener unos =< nucletidos y se extiende corriente arriba o aba/o del sitio
de la iniciacin. Entre las secuencias que se pueden encontrar, vemos al elemento >#E "en 503, reconocido por el
7WNN>&, la ca/a 7%7% "solo en genes inducibles&, el iniciador Nnr "centrado en ](&, el elemento promotor de corriente
aba/o "4)E, reconocido por el 7WNN4& y en ciertos casos las islas .p8. .om,nmente un promotor contiene dos o tres
de estos elementos. 8eneralmente, y corriente arriba, !ay otros elementos de secuencia necesarios para la
transcripcin eficaz.
Los factores de transcripcin generales contribuyen para que la polimerasa se una al promotor y desnaturalice el
4$%, para que la polimerasa escape del promotor y se dedique a la fase de alargamiento. El con/unto de estos
factores y la polimerasa preparados para la iniciacin se denomina comple,o de preiniciacin.
ste comienza a formarse en la ca/a 7%7%, que es reconocida por el factor de transcripcin general denominado
7WNN4, puntualmente, por su subunidad 7>) "7%7% binding protein&. El resto de sus componentes se denominan
genricamente 7%W "7>) associated factors& que actuarn en la unin a otros promotores o regulan la actividad del
7>). ste distorsiona muc!o la secuencia 7%7%, y permite la unin de otros factores, tales como 7WNN%, 7WNN>, 7WNNW
/unto a la polimerasa, 7WNNE y por ,ltimo 7WNN+, siempre en secuencias upstream. Luego, se desnaturalizar el
promotor por 7WNN+ "mediante !idrlisis de %7)& y se contin,a con un periodo de iniciacin abortiva, para que luego
suceda el escape del promotor.
%ntes de que esto suceda, una CcolaD de la polimerasa "denominada .74& que contiene 3' repeticiones de una
secuencia !eptapeptdica, que se fosforilar mediante una subunidad del 7WNN+. Esto permitir el desprendimiento de
los factores de transcripcin generales "excepto 7>)& utilizados en la iniciacin.
5.!.!. 0B<
La 7>) utiliza una extensa lmina Q para reconocer el surco menor de la ca/a 7%7%, ya que necesita distorsionar la
estructura local del 4$%. 4e !ec!o logra una conformacin casi plana de esta secuencia, arqueando el 4$% en unos
M<H. 4os pares de cadenas laterales de fenilalanina se intercalan entre los pares de bases, y tambin !ay
interacciones entre los fosfatos del 4$% y los residuos bsicos de la lmina Q. 4e a! que la ca/a 7%7% no sea un
promotor de secuencia, sino de distorsionabilidad.
5.!.. .tros factores de transcripcin generales
a& Los 7%W son unas diez u once subunidades, de las cuales dos se unen a elementos del 4$% a la altura del
promotor "como las secuencias Nnr o 4)E&, mientras que otros se unen a enzimas modificadoras de !istonas. %lgunos
regulan la unin del 7>) al 4$% mediante una solapa in!ibidora que se une a la superficie de unin al 4$% de la
7>).
b& El 7WNN> es una sola protena que ingresa luego del 7WNN% e interacciona tanto con el 4$% como con el 7>).
)arece ser el conector entre el 4$%, el 7>) y la polimerasa, siendo importantsimo en la determinacin de la
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direccionalidad de la transcripcin. )arece que su extremo $5terminal se inserta en el surco de la )ol NN como lo !aca
el factor ^.
c& El 7WNNW posee dos subunidades y se asocia con la )ol NN. Estabiliza el comple/o previo a la unin de 7WNNE y 7WNN+
d& El 7WNNE presenta dos subunidades y recluta "y regula& al 7WNN+
e& El 7WNN+ es el factor ms comple/o y se compone de A subunidades. .ontrola la transicin %7) dependiente del
comple/o de preiniciacin !acia el comple/o abierto. *u masa molecular es similar a la de la polimerasa. 7ambin
participa en la reparacin de los apareamientos incorrectos de nucletidos.
5.!.3. <rote%nas adicionales
El molde de 4$% in vivo est condensada en nucleosomas y cromatina, lo que complica la unin de la polimerasa y
los factores de transcripcin. Las protenas reguladoras de la transcripcin llamadas activadores, contribuyen a
reclutar la polimerasa !acia el promotor y estabilizan su unin en ese sitio, fundamentalmente mediante la interaccin
con partes de la maquinaria de transcripcin.
.on frecuencia esta interaccin se da mediante el comple,o mediador que se encuentra asociado a la cola .74, que
adems regula la actividad quinasa del .74 sobre el 7WNN+. Est formado por ms de '< subunidades "en !umanos&,
pero solo una, *rb=, es indispensable para la transcripcin de casi todos los genes. Las dems suelen tener
especificidad de accin sobre ciertos tipos de genes en especial. El mediador suele estar organizado en mdulos que
pueden disociarse unos de otros en ciertas condiciones in vitro.
=.'. %largamiento
2na vez que se inici la transcripcin, la polimerasa cambia a la fase de alargamiento, lo que recluta otro con/unto de
factores, denominados factores de alargamiento9 0=(() o h)<0. stos se reclutan !acia la cola .5terminal de la
subunidad grande de la )ol NN "favorecen su forma fosforilada& ya que sta se encuentra a continuacin del canal por
el que sale el #$% neosintetizado.
El factor de alargamiento central es la quinasa )57EWb que no solo fosforila el .74 "en su serina5'&, sino que
tambin activa y recluta otros factores, como el !*)73 "recluta enzimas para la formacin de la caperuza& y 7%75*W(
"recluta factores de empalme, *.%W&, y tambin participa en el control del ciclo celular. Ltro factor importante es el
7WNN* que estimula el ritmo general del alargamiento frente a secuencias que la frenaran, y que contribuye a la
lectura de prueba propia de la polimerasa, como tambin un anlogo de la edicin !idroltica bacteriana.
=.0. 7erminacin
Es similar al dependiente de #!o en procariotas, ya que se encontr una regin de terminacin bastante extensa
"3<<5'<<< pb&, y se prev la existencia de una protena de pausa similar a #!o. 4e !ec!o, #!o detiene la
transcripcin in vitro por parte de la #$% )ol NN. )or otra parte, no se encontraron regiones palindrmicas que den
cuenta de un mecanismo de terminacin similar al independiente de #!o. La terminacin est acoplada al corte y la
poliadenilacin del 01 final del transcripto.
=.=. Ltras polimerasas
Los eucariotas poseen otras dos polimerasas, )ol N y )ol NNN. %mbas estn relacionadas con )ol NN e incluso
comparten varias subunidades, pero no obstante inician la transcripcin a partir de distintos promotores. %dems,
cada una traba/a con su propio set de factores generales de transcripcin, aunque 7>) es universal.
La separacin y purificacin de las #$% polimerasas eucariotas puede llevarse a cabo mediante cromatografa de
intercambio inico. 2tilizando *ep!adex54E%E que une protenas aninicas, y eluyendo un extracto total de protenas
celulares a mayores concentraciones de $a.l, se observa un gran pico al comienzo de la elucin, correspondiente a
las protenas catinicas y neutras. %l comenzar a aumentar la fuerza inica, se comenzarn a despegar las protenas
aninicas unidas a la matriz, y si cada fraccin obtenida se trata con 4$% y ribonucletidos trifosfato, se observan
tres picos, correspondientes a las tres #$% polimerasas eucariotas. )ara identificarlas, se utiliza O5amanitina, un
veneno que in!ibe la sntesis de #$%. % una concentracin de ( _g@mL, solo in!ibe la #$% polimerasa NN, mientras
que a (< _g@mL, in!ibe tambin a la #$% polimerasa NNN. La polimerasa N es insensible a la amanitina.
5.3.!. +"A polimerasa (
*olamente expresa el gen que codifica para el precursor del r#$%. +ay muc!as copias en tndem de este gen en
cada clula "incluso en distintos cromosomas&, y se expresan muc!o ms que cualquier otro, encontrndose /untos
en los nucleolos. La unidad de repeticin es de ms o menos =< Jb, en donde '[ Jb representa una regin no
codificante, mientras que los (0 Jb restantes contienen los tres precursores para el ribosoma separados por
secuencias que suman G Jb. stos sern eliminados luego, previa modificacin qumica de algunos residuos de
uracilo "en pseudouracilo& y la metilacin de algunos !idroxilos en posicin '1. Esto permite una deteccin de las
secuencias "ya que la modificacin qumica es reproducible& y un corte del precursor en los r#$% maduros. stos se
ensamblarn con las protenas ribosomales mediante la accin de *no#$%s "#$% peque-os nucleolares& y las
subunidades grandes y peque-as de los ribosomas abandonarn el n,cleo para ensamblarse en el citosol.
*u promotor se compone de dos partes, un elemento central y el elemento de control corriente arriba "2.E&. El
primero se localiza alrededor del sitio de inicio de la transcripcin, mientras que el ,ltimo entre 5(<< y 5(3<, aunque
ambos poseen un M3B de !omologa. El inicio de la transcripcin requiere dos factores de transcripcin, el *L( "que
comprende al 7>) y a tres 7%Ws especficos& y el 2>W.
El comple/o se une a la mitad ms cercana al sitio de inicio de la transcripcin del 2.E, mientras que el 2>W se une
primero a la mitad ms le/ana, reclutando a )ol N.
La terminacin se da por una protena terminadora "77W5( en ratn& y una regin rica en 2;7 fcil de desnaturalizar,
lo que permite la separacin sencilla del #$%.
5.3.. +"A polimerasa (((
15
Los promotores para )ol NNN son variados, y la mayora se localiza doKnstream "codifican regiones esenciales para
los #$%&. %lgunos "como los que regulan la sntesis de t#$%& consisten en dos regiones llamadas >ox % y >ox >
separadas por una corta secuencia. Ltros contienen >ox % y >ox . "para 3* r#$%&, o incluso ca/as 7%7%.
#equiere otros factores de transcripcin, como 7WNNN> "que contiene a 7>) y dos 7%Ws& y 7WNNN. "para los genes de
t#$%s& y tambin 7WNNN% "para los de r#$%, una protena con dedos de zinc&. En el caso de los promotores para
t#$%, el comple/o 7WNNN. se une al promotor, recluta a 7WNNN> /usto antes del sitio de inicio de la transcripcin y ste
ser el encargado de unir a la )ol NNN, que los desplazar para iniciar el copiado. En el caso de los promotores para
r#$%, primero se unir 7WNNN%, y luego 7WNNN. y 7WNNN>.

(. #odi/icaciones posttranscripcionales
En eucariotas, la secuencia codificadora de un gen est interrumpida en forma peridica por segmentos de
secuencia no codificadora, por lo que muc!os genes son mosaicos que presentan bloques de secuencias
codificadores "o exones& y otras interpuestas "o intrones&. La eliminacin de los intrones, la edicin del #$% y la
adicin de estructuras terminales funcionales son las modificaciones posttranscripcionales ms comunes en
transcritos eucariotas.
3.(. .apping
Es la adicin de una base de guanina modificada al extremo 31 del #$%. sta est metilada y se une por medio de un
enlace 31531 inusual que comprende tres fosfatos. *e crea en tres pasos enzimticos, en el primero se elimina un
fosfato del extremo 31 del transcrito "generalmente termina en una purina&, luego se a-ade el 87) "por una m#$%
guanililtransferasa& y por ,ltimo, se modifica por la metilacin "en el !idroxilo '1 de la base unida a la caperuza, y a
veces tambin en la misma posicin de la base anterior&.
El #$% adquiere su capuc!n cuando todava tiene unos '<5=< nucletidos de longitud "poco despus de inicial el
alargamiento&, mientras que la maquinaria de generacin de ste se disociar rpidamente luego de la defosforilacin
de la serina53 en el .74.
3.'. )oliadenilacin del extremo 01
Est vinculada estrec!amente con la terminacin de la transcripcin. La cola .74 participa en el reclutamiento de las
enzimas necesarias para la poliadenilacin. sta porta dos comple/os proteicos conforme se aproxima al extremo final
del gen, el .)*W y el .stW. .iertas se-ales en el transcrito desencadenan la transferencia de stos !acia el #$% "las
llamadas se-ales de poli5%&, y una vez que stos se !aya unido, reclutan otras protenas que escinden al #$% y lo
poliadenilan luego, y otras que se unen a la cola de poli5% ")>)&.
La poliadenilacin est a cargo de la poli5% polimerasa que a-ade unos '<< nucletidos. .abe destacar que luego de
la escisin del transcrito, la polimerasa sigue sintetizando 4$% in,til y se separar luego de un largo tiempo. *e cree
que esto sucede por un cambio estructural en la polimerasa que disminuye su procesividad, o por la ausencia de
capuc!n.
3.0. Empalme del #$%
La cantidad de intrones que !ay en un gen vara en gran medida, desde uno !asta ms de 03<. *us tama-os
tambin varan, siendo generalmente ms largos los intrones "!asta M<< Jpb&. )or esto, los transcritos primarios
pueden ser muy largos, y deben ser modificados ya que la maquinaria de traduccin no puede reconocer y saltear
intrones. El proceso de eliminacin de intrones y reunin de exones se conoce como empalme del +"A y tiene que
realizarse con gran precisin ya que un solo nucletido puede alterar el marco de lectura, e inutilizar el producto.
)or otra parte, algunos pre5m#$% pueden empalmarse en ms de una forma, lo que genera m#$% alternativos, lo
que se conoce como empalme o splicing alternati*o, y permite que un gen pueda dar origen a ms de un producto
polipeptdico "denominados isoformas, que pueden tener funciones similares, distintas o incluso antagnicas&. *e
calcula que un G<B de los genes !umanos se empalman as, y en muc!os casos sirve como un mero mtodo de
regulacin gnica, ya que permite incluir exones que generen protenas disfuncionales, o incluir intrones que impidan
su salida al citosol.
+. Empalme del %!
G.(. `umica
Los lmites entre los intrones y los exones estn marcados por secuencias especficas. El sitio de empalme 31 "*E3&
suele tener una secuencia % 828%82, donde el primer dmero 82 est conservado, mientras que el sitio de
empalme 01 "*E0& suele tener una secuencia %8 8, donde %8 est conservado. $tese que las secuencias
conservadas estn dentro del intrn, lo que es lgico. 7ambin pueden encontrarse sitios de ramificacin "*#& en el
interior del intrn, con una adenina conservada, que suelen continuarse con un segmento polipirimidnico o segmento
<y.
El empalme se logra mediante dos reacciones de transesterificacin sucesivas en las que se rompen enlaces
fosfodister y se forman nuevos. El '15L+ de la % conservada desencadena la primera reaccin, ya que act,a sobre
nuclefilo para atacar el grupo fosforilo de la 8 conservada en el *E3. Esto generar un sitio de ramificacin y un
intermediario con estructura de lazo. En la segunda reaccin, el 015L+ del exn saliente se convierte en un nuclefilo
que ataca el grupo fosforilo en el sitio de empalme 01, lo que une los exones y libera el intrn como grupo saliente,
que conservar su forma de lazo y ser rpidamente eliminado para no generar la reaccin inversa.
.omo se ve, no existe prdida de energa por el mecanismo, aunque se observa consumo de %7) debido a la
funcin de la maquinaria de empalme "en la generacin de los rearreglos&.
7ambin se observa empalme trans entre exones pertenecientes a distintos m#$%s, frecuentemente en protozoos.
G.'. El spliceosoma
Las reacciones de transesterificacin antes descritas estn mediadas por una maquinaria molcula denominada
spliceosoma, que comprende unas (3< protenas y 3 molculas de #$%, y cuyo tama-o es similar al de un ribosoma,
16
y que tambin se cree que act,a como una ribozima. 2na sola reaccin de empalme requiere varias molculas de
%7).
Los cinco #$% "2(, 2', 2=, 23 y 2G& se denominan +"A nucleares pe>ue?os o sn+"A y no pasan los 0<<
nucletidos. Los comple/os que forman con protenas se conocen como ribonucleoprote%nas nucleares pe>ue?as o
sn+"<s y su combinacin da origen al spliceosoma, /unto con otras protenas de unin laxa.
G.0. Eecanismos de empalme
Las sn#$)s reconocen el *E3 y el *#, acercndolos y catalizando las tranesterificaciones. 4e a! que se vean
interacciones #$%5#$%, #$%5protena y protena5protena. *er 2( el que reconozca el *E3 "interaccin #$%5#$%&,
lo que permite su unin a 2G. )or otra parte 2' reconoce *#, e interacciona con 2G para acercarlo a *E3. La
protena 2'%W "que no es una sn#$)& reconoce el segmento )y y el *E0 y ayuda a la unin de la >>) "protena de
unin al punto de ramificacin, no sn#$)& para luego ser desplazada por 2'.
El comple/o formado por 2(, >>) y 2'%W unidos al m#$% se denomina comple,o inicial o comple,o #. Luego se
unir 2' y !ar sobresalir la adenina activa como protrusin no apareada "comple/o %&. La unin de 2=, 23 y 2G "o
partcula de tri5sn#$), formada por interaccin #$%5protena entre 2= y 2G, y por interaccin protena5protena con
23& se asociar a 2( y 2' generando el comple/o >, y eliminar 2( para que 2G tome su lugar "unida a *E3&.
Los pasos anteriores se conocen como reordenamiento (. El reordenamiento (( desencadenar la catlisis. 2= se
libera del comple/o, permitiendo la interaccin entre 2G y 2' "comple/o .&, lo que genera el sitio activo y ubica al #$%
en una posicin adecuada en su interior. Esta simplicidad de generacin del sitio activo busca disminuir la cantidad de
empalmes aberrantes.
La segunda reaccin de transesterificacin est dada por accin de la sn#$) 23 que acerca los dos exones. Las
sn#$) quedarn unidas al intrn en forma de lazo, pero se separarn luego de que ste sea degradado rpidamente.
@.3.!. (ntrones con autosplicing
El empalme mediante spliceosoma no es el ,nico mtodo de empalme en la clula. 7ambin se presentan intrones
con autosplicing que no lo utilizan, y varan en sus mecanismos, pudiendo ser de tipo N o de tipo NN. El autoempalme
requiere que el intrn se pliegue para adquirir una conformacin especfica que catalice la qumica de su propia
liberacin. En los intrones de tipo NN, la qumica del empalme y los intermediarios de #$% son los mismos que para los
pre5m#$% nucleares, utilizando un residuo de % dentro del sitio de ramificacin para atacar el enlace fosfodister en
el *E3.
Los intrones del grupo N se empalman utilizando un nucletido o un nuclesido de guanosina libre. *u 015L+ ataca al
extremo 31 del intrn, y la segunda reaccin de transesterificacin es com,n a la del empalme de pre5m#$%. Esto
generar un intrn que no posee forma de lazo, y contiene una guanosina terminal. Los intrones del grupo N suelen
ser ms peque-os que los del grupo NN "=<<5(<<< nucletidos& y comparten una estructura secundaria "ayudada por
protenas& que alo/ar a un nucletido de guanosina ribsica y presenta el *E3 para determinar el sitio preciso de
ataque nucleoflico de ste, es decir, su secuencia es importante en el mecanismo. Nn vitro, se nota el efecto a altas
concentraciones de sal, que /uegan el mismo papel que las protenas de estabilizacin.
@.3.. +econocimiento sn+"<2sitios de empalme
El reconocimiento puede sufrir dos tipos de errores, el salteo de los sitios de empalme o el reconocimiento errneo
de otros sitios parecidos.
2na forma de solucionarlo fue mediante el transporte de la #$% polimerasa NN de protenas que intervienen en el
empalme. stas se transferirn al transcrito solo cuando se encuentre un *E3 en el #$% sintetizado, por lo que
estarn prontas a actuar en el prximo *E0 que se sintetice. Esto evita que se salteen exones.
Ltra forma de solucionarlo asegura que los *E cercanos a los exones se reconozcan en primer trmino debido a la
accin de prote%nas )+ "por serina y arginina& que se unen a secuencias #)# "potenciadoras exnicas del empalme&
dentro de los exones. Las protenas *# interact,an con los 2'%W de la maquinaria de empalme y los reclutan !acia
*E cercanos. *u regulacin es una fuente importante de la regulacin de la expresin gnica.
@.3.3. )pliceosomas alternati*os
%lgunos pre5m#$% son empalmados mediante ciertos spliceosomas alternativos que contienen componentes
comunes a los spliceosomas usuales "23&, otros !omlogos "2= y 2G& y otros distintos "2(( y 2(' que reemplazan a
2( y 2', pero reconocen secuencias distintas&. El mecanismo qumico que utilizan es el mismo.
G.=. Empalme alternativo
El empalme alternativo puede producirse por varios mecanismos. %dems de seleccionarse exones alternativos, se
pueden extender los exones "por una parte de un intrn&, o saltearse. 7ambin pueden retenerse ciertos intrones.
Esto sucede mediante la utilizacin alternativa de algunos sitios de empalme. Esto permite que exista empalme
alternativo constitutivo o regulado.
@.5.!. #mpalme alternati*o regulado
Las protenas que regulan el empalme se unen a sitios especficos llamados E*E o N*E "potenciadoras intrnicas del
empalme&, o a sitios E** o N** "silenciadoras exnicas del empalme, o silenciadoras intrnicas del empalme
respectivamente&. Estos sitios son importantes para dirigir la maquinaria proteica incluso en empalme no alternativo
"como se coment en G.0.'.&.
Las protenas *# se unen al #$% por medio de un dominio de reconocimiento para el #$%. .ada una posee otro
denominado dominio +) que se encuentra en su extremo .5terminal y media las interacciones entre la protena *# y
las de la maquinaria de empalme.
Los miembros de la familia de las ribonucleoprotenas nucleares !eterogneas "!n#$)s& reconocen la mayora de
los silenciadores. *e unen al #$% pero no poseen dominios #*, lo que simplemente las convierte en bloqueadoras
de los sitios de activacin. Ltro represor com,n es la protena !n#$)N que se une al segmento )y, y !acen que
sobresalga el exn o lo cubren completamente "evitando as su reconocimiento por el spliceosoma&.
G.3. Eezcla exnica
17
El !ec!o de que no !aya intrones en bacterias puede explicarse por trminos evolutivos, ya sea por la prdida de
stos por las bacterias, o por su aparicin en los eucariotas. En el primer caso, se explicara mediante una necesidad
de aumentar el ritmo de duplicacin, mientras que en el segundo requerira alg,n tipo de recombinacin especfica.
Las venta/as que los intrones le confieren a los eucariotas son6
a& )ermiten una separacin en dominios proteicos ya desde el nivel genmico
b& )ermiten un surgimiento de nuevas protenas por duplicacin y divergencia exnica
c& )ermite que se utilicen exones comunes entre genes no relacionados
d& %segura que la recombinacin sea ms probable en un intrn que en un exn, lo que permite mezcla y no ruptura
e& )ermite empalme alternativo, lo que posibilita la prueba exnica sin desec!ar un exn irreversiblemente
f& %segura que !aya ms probabilidad de mutaciones en un intrn que en un exn
-. .tras modi/icaciones posttranscripcionales
[.(. Edicin del #$%
Es un mtodo de cambio de la secuencia de un #$% despus de ser transcripto. Existen dos mecanismos que
median la edicin6 la desaminacin especfica de sitio y la insercin "o delecin& de uridina por un #$% gua.
;.!.!. 4esaminacin espec%fica de sitio
)or sta, un residuo de citidina especfico dentro del m#$% se convierte en uridina por desaminacin. sta est
regulada y puede diferir en distintos tipos celulares. )or e/emplo, generando codones de stop que den productos
proteicos ms cortos. Esta desaminacin se lleva a cabo por la citidina desaminasa.
7ambin se ve desaminacin especfica de sitio sobre adenosinas, generando inosina, catalizada por la enzima
A4A+ "adenosina desaminasa de accin sobre #$%&, presente en tres variedades. La inosina puede aparearse con
citidina y alterar as la secuencia de la protena codificada.
;.!.. (nsercin o delecin de uridina por +"A gu%a
.laramente, este proceso cambia el marco de lectura y los codones con lo que altera el CsignificadoD del mensa/e. La
insercin o la delecin se llevan a cabo por los #$% de gua "g#$%& que suelen no sobrepasar los M< nucletidos y
estn codificados por genes distintos a los del m#$% sobre el que act,an. .ada g#$% se divide en tres regiones, el
ancla AB, la gu%a central y el segmento poli28 3B. El primero determina la regin de m#$% que editar, el segundo la
secuencia buscada "es complementario a sta, con % adicionales&, y el tercero es la fuente de las uridinas a insertar.
El g#$% y el m#$% forman un d,plex con regiones monocatenarias que sobresalen como asas donde se insertarn
las 2. 2na endonucleasa reconoce y corta el m#$% en estas asas, y permite que la 727asa "01 terminal uridilil
transferasa& transfiera 2 !acia la brec!a, que sern ligadas por una #$% ligasa.
[.'. 7ransporte del m#$%
2na vez procesado por completo, el m#$% se transporta desde el n,cleo !acia el citoplasma donde se lo traducir.
El movimiento es un proceso activo y regulado minuciosamente. Los m#$% procesados correctamente representan
solo una peque-a proporcin del #$% total nuclear.
%lgunas de las protenas de unin a m#$% durante su procesamiento se reemplazarn a medida que ste sucede,
mientras que otras "como las protenas *#& no lo !arn. )or otra parte, se unirn algunas protenas adicionales. El
con/unto de todas las protenas unidas a l servirn como identificacin como m#$% exportable. Los m#$% no
procesados y los procesados incompleta o incorrectamente portarn su propio /uego de protenas que bloquearn su
exportacin "como las !n#$)s abundantes en intrones&.
La exportacin se produce por el comple/o de poro nuclear, que permitir el paso de las protenas peque-as
"menores a 3< J4a& y el transporte activo de m#$% y protenas asociadas mayores. %lgunas de stas, portan se-ales
de localizacin nuclear que les permitirn regresar al n,cleo luego de separarse del m#$% en el citosol.
[.0. Eaduracin del t#$%
7odos los pre5t#$%s sufren rupturas y modificaciones de bases. )oseen intrones ms cortos que no presentan
secuencias consenso, sino que son reconocidos por generar estructuras secundarias aberrantes "suelen encontrarse
en el loop del anticodn&. %s, una endonucleasa los elimina, generando dos exones separados, uno con un extremo
01 que contiene un '1501 monofosfato cclico, y otro con un extremo 31 !idroxilo que se adenilar por accin de %7) y
una ligasa. El primero sufrir una apertura del fosfato cclico, de/ndolo en su posicin '1, y el !idroxilo 01 ser el
nuclefilo que ataque al otro exn, eliminando adenosil monofosfato. Luego, una '15fosfotransferasa eliminar el
fosfato en posicin '1, de/ando un enlace fosfodister usual.
Tema ": Re#ulacin de la e$prein #nica
eucariota
1. %egulacin de la e0presin g,nica
La regulacin de la expresin gnica es notablemente diferente en procariotas y eucariotas. En los primeros, se
utiliza para a/ustar su maquinaria enzimtica a su medio fsico y nutricional inmediato, buscando su subsistencia y su
adaptacin rpida. En los segundos, en cambio, al estar protegidas de influencias externas, los genes responden a
pocos cambios ambientales, mientras que la mayora se regula para lograr la diferenciacin celular, es decir, expresar
genes caractersticos en momentos caractersticos para cumplir alguna funcin del organismo entero y no de la clula
individual.
4e ms est decir que la activacin selectiva de genes est cuidadosamente regulada, ya que es la base del buen
funcionamiento de la clula en s, pero tambin de los te/idos y rganos en los que sta est incluida.
(.(. $iveles de control
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Existen diversos Cniveles de regulacinD, es decir, diversos procesos de la expresin gnica que pueden ser
controlados mediante !erramientas celulares para modificar la cantidad y la variedad de productos gnicos. El ms
general es el ni*el genmico, es decir, la accesibilidad de la maquinaria de transcripcin al gen que transcribir, y
est determinado por el nivel de condensacin de la cromatina, inducido por modificaciones covalentes de sus
protenas estructurales.
El ms utilizado por la clula, en cambio, es el ni*el transcripcional, es decir, la regulacin del inicio del proceso de
transcripcin de un gen determinado.
)or otra parte, las clulas eucariotas permiten el control a ni*el de procesamiento, basado en la regulacin de las
maquinarias de splicing y otros procesamientos de los transcriptos as como tambin de la salida al citosol de stos.
7ambin se notan regulaciones a ni*el traduccional, donde se puede controlar el inicio de sta y su continuacin. )or
,ltimo, tambin !ay regulaciones a ni*el posttraduccional, modificando las protenas recin sintetizadas.
(.'. Nnicio del control
Los controles de la expresin pueden tener dos orgenes6 un origen endgeno, cuando censa cambios en la
composicin del medio interno que deben ser solucionados, o un origen e1geno, cuando censa cambios ambientales
que inducen a un cambio de la situacin metablica de la clula en cuestin. En este ,ltimo caso, se requiere alg,n
sistema de comunicacin celular que se convierta en una se-al interna capaz de ser interpretada.
Las se?ales e1tracelulares son llamadas Cprimeros mensa/erosD y poseen receptores en la membrana de las clulas
diana, que permiten su unin e inducen la sntesis intracelular de otros compuestos denominados Csegundos
mensa/erosD. *ern estos los que activarn sistemas de modificacin intracelular "generalmente quinasas& llamados
Cterceros mensa/erosD que podrn al fin y al cabo, regular la expresin gnica en cualquiera de los niveles expuestos
en (.(., aunque generalmente lo !acen a nivel transcripcional.
2. %egulacin transcripcional
La regulacin de la iniciacin de la transcripcin es la forma ms difundida de control gnico en eucariotas. Esto
requiere la interaccin de protenas con el 4$% para modificar su transcripcin.
4e a! que podamos clasificar los elementos del sistema de regulacin en cis, dominios genticos temporales y
espaciales de la expresin, cuya funcin es controlar la produccin derivada del gen que controlan? tambin
encontramos elementos trans, protenas que comandan la regulacin mediante interaccin con los elementos cis.
'.(. *ecuencias reguladoras
Existen tres secuencias reguladoras principales en los genes eucariotas, la ca/a 7%7%, las regiones proximales al
promotor, y las regiones inductoras. 7anto los elementos proximales como las regiones inductoras son secuencias
muy parecidas en funcionamiento y estructura, y se diferencian fundamentalmente por su ubicacin. 4e !ec!o se
cree que la mayora de los genes eucariotas son regulados por varios tipos de secuencias reguladoras.
.!.!. Ca,a 0A0A
En todo gen que se transcriba de manera muy activa en momentos particulares del ciclo celular, o en tipos celulares
diferenciados especficos, se encontr una secuencia muy conservada denominada ca,a 0A0A a unos '350< pares de
bases upstream del sitio de inicio de la transcripcin. sta corresponde a una secuencia consenso de seis pares de
bases, que usualmente es 7%7%7% o 7%7%%%. *u modificacin induce a la prdida de velocidad de transcripcin, y si
se eliminan los nucletidos entre sta y el inicio de la transcripcin se nota que lo que vara es el sitio de inicio, lo que
nos !ace pensar que la ca/a 7%7% sirve en la ubicacin de la polimerasa para iniciar la transcripcin. $o obstante, la
presencia de ca/a 7%7% posibilita una transcripcin a muy ba/o nivel "a un nivel basal&.
.!.. #lementos pro1imales del promotor
*on las regiones de control ubicadas a no ms de 0<< pares de bases upstream del inicio de transcripcin.
8eneralmente poseen grandes efectos sobre la transcripcin, regulando su frecuencia o su eficiencia.
.!.3. #lementos amplificadores
Existen ciertos elementos de control denominados amplificadores ubicados a miles de pares de bases del sitio de
inicio, tanto en direccin upstream como doKnstream, en intrones o incluso luego del ,ltimo exn codificante.
.!.5. (slas CpC
La transcripcin de los genes con promotores "con ca/a 7%7%& comienza en sitios bien definidos. *in embargo, se
nota que la transcripcin de muc!os genes !ouseJeeping comienza azarosamente en segmentos de entre '< y '<<
bases de longitud. *e transcriben a ba/a velocidad y lo !acen a partir de un segmento rico en .8 de !asta 3<
nucletidos de longitud a no ms de (<< pares de bases del inicio de la transcripcin y que puede ocupar !asta '<<
pares de bases. *e denominan islas CpC y son reconocidas por un factor de transcipcin denominado *)(.
'.'. Elementos en trans
..!. #structura
%l estudiar la estructura de los elementos en trans que regulan la expresin gnica, es decir, que se unirn a
elementos proximales a los promotores y a regiones incrementadoras, se observan una distribucin en dominio
proteicos comunes. 2no es un dominio de fi,acin al 4"A que interact,a con los elementos en cis, y tendr
especificidad por los grupos que los nucletidos despliegan !acia el surco mayor y los fosfatos del esqueleto,
mientras que el otro es el dominio de interaccin prote%na2prote%na, el carboxilo terminal, que permitir la interaccin
con otras protenas reguladoras distintas, o con otros reguladores iguales, formando dmeros o tetrmeros que
funcionan en elementos en cis cercanos. Estas interacciones entre protenas se basan en dominios ricos en un
determinado tipo de aminocido, como cidos, bsicos o rgidos "prolina&.
Esto permite explicar por qu las alteraciones del espaciamiento entre los elementos de control se toleran tan bien en
las regiones de control, ya que cuando se cambian las posiciones relativas de stas sobre el 4$%, sus dominios de
activacin pueden seguir interactuando debido a su flexibilidad y a la de los puentes proteicos que los conectan.
... =uncionamiento
19
La regulacin de la expresin gnica por elementos en trans es un mecanismo comple/o dependiente de cada gen.
*uelen funcionar mediante la unin de factores de transcripcin basales, que se enlazarn a la #$% )ol NN para
ubicarla en la ca/a 7%7% y permitir que comience la transcripcin. stos pueden unirse a coacti*adores, protenas de
enca/e y unin protena5protena, que interaccionarn adems con otras protenas regulatorias unidas a secuencias
en secuencias activadoras y secuencias proximales al promotor, ya sean activadores, como represores. La
conformacin y la estabilidad del comple/o formado sern los factores fundamentales para regular la expresin del
gen en cuestin.
'.0. Nnteraccin cis5trans
Los elementos en trans poseen un dominio de interaccin a 4$% que no slo debe unirse a l de manera fuerte, sino
que debe reconocer secuencias consenso de manera casi inequvoca. )ara esto, aprovec!an el !ec!o de que la
realidad qumica que se presenta en el surco mayor de una molcula de 4$% cuando se encuentra un enlace entre
nucletidos por interacciones de :atson y .ricJ. %s, se reconocern ciertos grupos especficos como aminos,
cetonas, metilos, etctera.
)ara !acerlo, se puede servir de distintas !erramientas, ya sea simples aminocidos "la glutamina y la asparagina
reconocen dmeros adenina5timina, mientras que la arginina citosina5guanina&, o de estructuras proteicas ms
comple/as.
.3.!. 4ominios de unin a 4"A
La interaccin proteica con el 4$% suele deberse a moti*os estructurales. En la mayora de stos, las O !lices se
ubican perpendicularmente al 4$%, y sus tomos interaccionan con tomos del surco mayor del 4$%, adems de
estabilizarse con uniones al puente de az,car5fosfato. La clasificacin actual de los factores de transcripcin se basan
en los dominios que contienen, y stos suelen poseer secuencias de aminocidos consenso.
a& Eotivo de !lice5giro5!lice u homeodominio, poseen una regin de G< aminocidos conservada que codifica para
una estructura de tres !lices O, una que se ubicar paralela al e/e del 4$%, y dos paralelas entre s que podrn
interaccionar con el surco mayor. *u sntesis es dirigida por secuencias de 4$% !omlogas denominadas ca,as
hometicas, muy importantes en fenmenos del desarrollo.
b& Eotivo de dedos de zinc. )resentan regiones !elicoidales que se pliegan en torno de un in central de zinc, lo que
produce un dominio compacto. Existen tres variedades6
b(& .'+', protenas con dos cistenas y dos !istidinas de complexin a cinc, que puede insertar un sector !elicoidal en
el 4$%, y pueden unirse entre s girando alrededor del 4$% para generar una interaccin muc!o ms especfica.
b'& .=, protenas con cuatro cistenas de complexin a cinc, que slo poseen dos dedos repetitivos "las .'+' poseen
tres& con simetra rotacional doble, es decir, se unen a secuencias de 4$% consenso que son repeticiones invertidas.
b0& .G, protenas con seis cistenas de complexin a dos tomos de cinc, generando un dominio globular compacto,
que se asocia en dmeros mediante un superenrollamiento de sus O !lices.
c& Eotivos de cremallera de leucina. )osee una leucina cada siete aminocidos, lo que permita una dimerizacin de
dos O !lices !idrfobas "posee un aminocido !idrofbico cada tres o cuatro aminocidos& cada una
interaccionando con un surco mayor contiguo, lo que da la impresin de que Cagarra al 4$%D. 7ambin se pueden
encontrar cremalleras b-sicas que poseen carcter bsico en la zona de interaccin con el 4$%.
d& Eotivos de !lice5bucle5!lice. *e compone de dos regiones O5!elicoidales separadas por un bucle no !elicoidal,
estando stas compuestas fundamentalmente por aminocidos bsicos. )uede formar !eterodmeros.
e& Eotivos #N$8. Es un dominio formado por tres !lices O ricas en cistenas capaz de acomple/arse a dos zinc y
unirse a ubiquitinas.
.3.. Control gnico y dimeri$acin
7res motivos pueden formar dmeros, los dedos de zinc de tipo .=, las cremalleras, y las protenas con !lice5bucle5
!lice..ada monmero tiene un dominio de fi/acin al 4$%. En stos, la formacin de !eterodmeros no influye sobre
su especificidad sino que permite que los dominios de activacin se re,nan para formar un solo factor de
transcripcin. La formacin de!eterodmeros aumenta la cantidad de secuencias posibles de 4$% a las que puede
unirse una familia de factores.
Existen unos '<<< factores de transcripcin capaces de dimerizar lo que aumenta notablemente la variabilidad de
reguladores que pueden existir.
'.=. %ctivacin y represin
La regulacin gnica se basa en la accin de elementos en trans y elementos en cis. El funcionamiento de esta
regulacin, y las causas de este !ec!o son muy variables.
Los activadores suelen estimular el ensambla/e cooperativo de los comple/os de iniciacin de la transcripcin. *e !a
demostrado que algunos permiten la unin simultnea de 7WNN4 y 7WNN% a la ca/a 7%7%, lo que permite la creacin de
un comple/o multiproteico de unin a protenas activadoras unidas a elementos en cis en la regin proximal o en los
amplificadores del gen. #ecin cuando el comple/o total est ensamblado, la transcripcin puede suceder con la
velocidad y la eficacia suficiente para ser ,til en la clula.
La accin de los represores, en cambio, es completamente !eterognea. *e !an determinado mecanismos de
represin donde los represores se unen competitivamente a una secuencia de unin a activadores o factores
generales de transcripcin. Euc!os otros suelen unirse a sitios cercanos a los de los activadores e interaccionar con
stos para disminuir su actividad. 7ambin pueden unirse ms efectivamente a ciertos factores generales de
transcripcin evitando la unin de los activadores a stos.
4e ms est decir que otro mecanismo de control de la expresin gnica es la expresin de los propios factores de
transcripcin. )or otra parte, tambin existen interacciones cromosomales, donde existe complexin entre comple/os
de iniciacin de la transcripcin de regiones de distintos cromosomas. Esto permite una regulacin con/unta de un
grupo de genes relacionados.
3. %egulacin genmica o topolgica
20
El grado de condensacin de la cromatina y su interaccin con otros componentes nucleares son un mtodo
bastante utilizado en la regulacin gentica. *e cree que los cromosomas poseen CterritoriosD definidos y separados
de acuerdo a su condensacin lo que modifica el acceso de la maquinaria de transcripcin o reparacin.
*e basa en que la expresin gnica requiere tanto la laxitud de la cromatina en el gen que se expresar como la
maquinaria transcripcional necesaria para !acerlo. La cromatina condensada de un cromosoma suele agruparse "cis&
o incluso entre varios cromosomas "trans&. Esto permite que la liberacin y la modificacin de estos cl,sters de
cromatina, permitan la modificacin de la expresin gnica de distintos loci que regulan la misma actividad celular.
0.(. .ondensacin de la cromatina y regulacin de la expresin gnica
.uando el 4$% est condensado en forma de cromatina, incluso en su forma laxa, esto representa un impedimento
para la transcripcin en esa zona, ya que aunque est formando un nucleosoma, ste impide su accesibilidad a los
factores de transcripcin, !ablando de una regin promotora. *e observa que las regiones !ipersensibles a la
expresin, que codifican para genes de constante expresin, son laxas y no estn compactadas, lo que representa un
peligro para la estabilidad del 4$%. Las regiones de expresin frecuente pero no constante deben tener un
mecanismo de modificacin de la estructura de la cromatina que permita !acerlas accesibles.
Esta modificacin estructural en la cromatina puede tener lugar incluso antes de que sea necesaria la transcripcin, y
se lleva a cabo por dos procesos, la modificacin covalente de !istonas, y por accin de los comple/os remodeladores
de la cromatina.
3.!.!. 3odificaciones co*alentes en las histonas
Las !istonas son protenas notablemente bsicas, lo que permite su interaccin con el 4$%. *u basicidad est dada
por una gran densidad de residuos aminoacdicos bsicos "principalmente lisina&. )ara regular la composicin
estructural de la cromatina, las !istonas sufren modificaciones en sus colas y en sus dominios globulares.
0.(.(.(. 4E*%.E7NL%.Na$
El papel de la desacetilacin !istnica, sobre los extremos $5terminales de las !istonas nucleosmicas que se unen
a la ca/a 7%7% de los genes que reprimen, conlleva al aumento de la carga positiva en las lisinas de este sector, lo
que permite la interaccin enrgica con los fosfatos del 4$%, y aumenta la afinidad de ste por la superficie
nucleosmica, lo que impide el acceso de los factores de transcripcin generales a la regin promotora. En cambio,
cuando los extremos $5terminales estn !iperacetilados, las cargas de las lisinas estn neutralizadas y las
interacciones con los fosfatos se eliminan permitiendo la interaccin con los factores de transcripcin. *e !an aislado
histonas desacetilasas en !umanos.
*e !a dilucidado el mtodo de accin de stas !istonas desacetilasas en la regulacin de la expresin gnica. En
levaduras, encontramos una !istona desacetilasa "#pd0& que puede interaccionar con un comple/o multiproteico que
contiene a una enzima ubicadora "*in0&. sta interacciona con un represor transcripcional "2meG& que se une a una
secuencia reguladora para ubicar a la #pd0 en un sitio para que desacetile las !istonas cercanas, !aciendo menos
accesible al 4$%. En otros organismos, se !an identificado anlogos al sistema 2meG5*in05#pd0. 4e !ec!o, en
mamferos, se encontr la protena m*in0 que interacciona con una desacetilasa y con un represor de unin a islas
de 35metilcitidina5guanosina.
0.(.(.'. %.E7NL%.Na$
2n mecanismo similar se !a encontrado para la activacin de la transcripcin gnica mediante !istonas
!iperacetilasas. *e !an encontrado protenas de reconocimiento de secuencia activadoras, que se unirn a ciertas
protenas que interaccionarn con los comple/os de las histonas acetilasas, lo que aumentar la accesibilidad por la
maquinaria transcripcional y activar la transcripcin de la regin. 7ambin se !a notado que el comple/o general de
transcripcin, 7WNN4, interacciona con varios dominios de activacin, y posee actividad de !istona acetilasa.
3.!.. Comple,os remodeladores de la cromatina
En levaduras se pudo descubrir un comple/o multiproteico llamado comple,o )DiE)nf que activa ciertos promotores.
%lgunas de sus subunidades poseen !omologa con las !elicasas, y se nota que producen la susceptibilidad del 4$%
nucleosmico, tanto a la degradacin con 4$%sas como a la accin del comple/o transcripcional. *e cree que este
comple/o interacciona con el 4$% nucleosmico induciendo su disociacin transitoria de su superficie. *e !an
encontrado anlogos al comple/o en eucariotas superiores, consumiendo todos %7).
Existen diversos mecanismos para la remodelacin de la cromatina. Entre los ms comunes encontramos6
a& 4esplazamiento de los nucleosomas. .iertas protenas de la familia %ct suelen unirse fuertemente a una corta
secuencia de reconocimiento sobre el 4$% nucleosmico e inestabilizan la interaccin 4$%5!istonas, induciendo al
desplazamiento de stos para separarse de %ct.
b& Expulsin del comple/o de !istonas. .iertas protenas inducen la separacin de las !istonas, destruyendo el
nucleosoma.
c& Expulsin de ciertas !istonas. %lgunos reguladores pueden separar selectivamente a las !istonas +' "% y >& del
octmero, no desestabilizando el nucleosoma "ya que stas no son imprescindibles para su estructura& pero
permitiendo una mayor accesibilidad de la maquinaria transcripcional al 4$%
d& #eemplazo de !istonas. Ltros reguladores pueden reemplazar las !istonas +' por otras con caractersticas
distintas, capaces de una segunda regulacin, o de interacciones diferentes con el comple/o de transcripcin.
0.'. #egulacin epigentica
*e denomina regulacin epigentica a los patrones !eredables de la expresin gnica en los que no intervienen
cambios en la secuencia del 4$%. Existen diversos mtodos de generar regulacin epigentica, aunque la mayora
involucra a modificaciones covalentes del 4$% y de las !istonas, capaces de ser detectados como un Csistema de
lengua/eD !eredable, que pueda ser !eredado en la descendencia, modificando el fenotipo de clulas
genotpicamente idnticas.
% continuacin se presentan diversos mtodos de regulacin epigentica. 2no de stos es la remodelacin de la
cromatina, discutido en 0.(.'.
3..!. 3etilacin del 4"A
21
El 4$% puede metilarse a nivel de las citosinas "generando 35metilcitosinas& adyacentes a guaninas. Esto tiene
diversos efectos a nivel regulatorio. En primer lugar, modifica la estructuracin de la doble !lice, distorsionndola y
evitando interacciones usuales entre s y con las !istonas, lo que modifica el reconocimiento topolgico de la regin.
)or otra parte, tambin se nota el reconocimiento de ciertas enzimas por sistemas desacetilantes de !istonas, y por
otras protenas de reconocimiento a citosinas metiladas, que pueden inducir a la unin de comple/os de remodelacin
de la cromatina u otros reguladores.
3... 3odificacin co*alente de histonas
Los cuatro tipos de !istonas que forman parte del octmero nucleosmico poseen una cola lateral que no cumple
funciones estructurales sino regulatorias. stas poseen ciertos aminocidos especficos que pueden sufrir
modificaciones covalentes capaces de regular la expresin gnica en las regiones de 4$% envueltas en el
nucleosoma en s.
Entre las modificaciones covalentes ms comunes encontramos6
#odi/icacin E/ecto !! En$ima responsable .bser*aciones
%cetilacin %ctivador Lys %cetilasas *e da en +0 y +=
Wosforilacin 4esconocido *er `uinasas *e da en +0
Eetilacin
%ctivador o
represor
Lys y
%rg
Eetiltransferasas *e da en +0 y +=
4eiminacin
%ctivador o
represor
%rg 4eiminasas
7ransforman %rg en citrulina e impiden que stas
sean metiladas
2biquitinacin %ctivador Lys 2biquitilasas #eclutan factores de transcripcin
4eubiquitinacin #epresor Lys 42>s
Existen ms de (<< 42>s, de 3 familias, = son
cisten proteasas y una es una metalo proteasa.
%4) ribosilacin 4esconocido *er
%4)5ribosil
transferasas
)ueden polimerizarse aumentando su efecto
Nsomerizacin 4esconocido )ro Nsomerasas 4istorsionan el esqueleto polipeptdico
4. .tros ni*eles de regulacin
=.(. #egulacin post5transcripcional
Luego de que el transcripto primario fue sintetizado, existen diversos procesos de regulacin de su expresin antes
de que ste pueda servir en la traduccin de protenas.
5.!.!. )plicing alternati*o
En eucariotas, los patrones de splicing no son siempre los mismos. Es all que en ciertos casos s lo sea, es com,n
observar que los transcriptos maduros provenientes de un gen no siempre sean los mismos, a veces por un splicing
azaroso, y otras veces por un splicing alternati*o regulado. )or e/emplo, se observan casos donde existen exones
opcionales que pueden aparecer o no en el producto, intrones que pueden eliminarse o no, exones mutuamente
excluyentes o intrones de longitud variable. Esto no solo permite el aumento de la variabilidad de productos proteicos
relacionados que puede generar un gen, sino que tambin regula la funcionalidad y las propiedades de las protenas
de acuerdo a la regulacin de la maquinaria de splicing.
*e nota splicing alternativo tanto en una misma clula "en diferentes etapas de la vida celular& como tambin en
distintos tipos celulares para generar productos con distintas funciones provenientes de orgenes comunes.
5.!.. 0ransporte a tra*s del poro nuclear
La salida de un m#$% maduro al citosol es un proceso altamente selectivo. La doble membrana lipdica del n,cleo
contiene poros. stos le/os estn de ser sectores estticos, ya que involucran un gran n,mero de mecanismos de
regulacin debido a la posibilidad de controlar qu pasa y qu no pasa desde el interior nuclear al citosol o viceversa.
El primer elemento imprescindible para que esto suceda es el reconocimiento de ciertas secuencias de locali$acin
en los productos nucleares o citoslicos. stas podrn ser reconocidas por ciertas protenas especficas que podrn
interaccionar con algunas de las ms de G<< protenas que conforman la estructura del poro nuclear para atravesarlo
selectivamente.
.uando el m#$% es procesado por el espliceosoma, queda unido a ciertas protenas de localizacin denominadas
!n#$)s, mientras que su caperuza 31 se une a una protena denominada .>.. sta ser la primera que interaccione
con las protenas del comple/o del poro nuclear, permitiendo el inicio del paso por su interior. Luego, ciertas !n#$)s
"denominadas Crestringidas al n,cleoD& son separadas del m#$% mientras ste atraviesa el poro, al mismo tiempo
que otras "las CshuttleD& interaccionan con el comple/o del poro nuclear y permite la salida del m#$%, quedando
unidas a l !asta que ste llegue al citosol. En este momento se separarn siendo reemplazadas por protenas
citoplasmticas ")%>) y m#$)s&, pudiendo volver al interior nuclear.
El regreso al interior nuclear se da mediante el mecanismo del importe de carga. ste se basa en la accin de dos
protenas, #an "una 87)asa& y la importina. sta ,ltima se unir a #an587) en el n,cleo, pudiendo salir al
citoplasma. %ll podrn separarse, unindose la importina a las protenas nucleares "con una secuencia se-al $L*& y
transformndose la #an587) en #an584). %mbos productos pueden atravesar nuevamente el poro, llegando al
interior nuclear, donde la importina liberar su carga y podr reunirse con una #an587), mientras que la #an584)
sufrir el intercambio de su 84) por un 87) nuevo.
5.!.3. #stabilidad del m+"A en el citoplasma
Existen diversos mtodos para controlar la estabilidad del m#$% en el citoplasma. La vida media de un m#$% en l
depende bsicamente del organismo del que se trate, por lo que las tasas de recambio en stos estn usualmente
relacionadas a la de eliminacin. )or otra parte, ciertos mecanismos de inestabilidad extra permiten una regulacin de
la expresin gnica.
2n punto notablemente importante a la !ora de estudiar la estabilidad de los m#$% es su cola de poli"%&501, ya que
su ausencia determina una eliminacin casi inmediata del transcripto. 4e !ec!o, la eliminacin de sta "mediante
22
nucleasas especficas, o mediante ruptura endonucleoltica inespecfica& permite un ataque inmediato de CexosomasD,
comple/os nucleolticos de actividad exonucleoltica 0131.
)or otra parte, la eliminacin de la caperuza en 31 tambin induce a la eliminacin del transcripto, mediante una
actividad exonucleoltica 3101.
5.!.5. #dicin del +"A
La edicin del #$% es una alteracin sitio bespecfica de una secuencia de #$%, sin alterar la secuencia de 4$%
que le dio origen. *e !a visto tanto en m#$%s, como tambin en otros tipos de #$%s. )uede contar con inserciones,
deleciones, o conversiones entre bases. $tese que los primeros dos mtodos alteran el tama-o y el marco de
lectura de los #$%s maduros, mientras que el tercero modifica su secuencia solamente. )or lo general, la insercin o
la delecin de nucletidos se da sobre residuos de uridina, mientras que las sustituciones son llevadas a cabo por
protenas especiales y suelen ser6
a& %denosinas por inosinas, mediante la adenosina desaminasa, que desamina el carbono G, reconociendo una
secuencia consenso de un #$% doble !ebra.
b& .itosinas por uracilo, por un mecanismo similar.
$o obstante, ciertas modificaciones puntuales pueden traer notables consecuencias en la expresin del m#$%. )or
e/emplo, la creacin o eliminacin de un codn de inicio de la traduccin, la modificacin del marco abierto de lectura,
creacin o eliminacin de codones de detencin de la traduccin, etc.
En t#$%s, se observa la utilizacin de la edicin del #$% para lograr una estructura secundaria correcta, para
obtener los puntos de reconocimiento de las aminoacil5t#$% sintetasas, modificaciones del anticodn, etc. 7ambin
es observado en r#$%s, donde apunta fundamentalmente al aumento de la eficacia de stos en su funcin
ribozimtica.
La edicin posee diversas funciones bsicas de la fisiologa celular. En primer lugar, permite el desarrollo de nuevos
productos sin necesidad de incrementar el n,mero de genes, ni producir modificaciones peligrosas en el genoma. )or
otra parte, protege al genoma contra ciertos virus, ya que puede editar los m#$% sintetizados por stos, impidiendo
que desarrollen sus caractersticas virulentas. 4e aqu que su mal funcionamiento sea una de las causas comunes
del cncer y las enfermedades autoinmunes.
5.!.A. )umoilacin
Es la ubiquitinacin del factor de inicio de la traduccin eNW=E "encargado de reconocer la caperuza 31& para activarlo
y permitir su funcionamiento en la sntesis de ciertas protenas esenciales para la proliferacin celular. *u mal
funcionamiento es oncognica.
=.'. .ontrol por metabolito
Es un mecanismo de regulacin gnica que puede tanto clasificarse como posttranscripcional como traduccional. *e
basa en la interaccin del m#$% maduro citoslico con ciertas protenas especficas que regularn su traduccin, y
estando stas reguladas por la concentracin de metabolito en el medio.
2sualmente, el metabolito que regula su actividad es el sustrato "o uno de los sustratos& de la enzima codificada en
el m#$%. El e/emplo ms com,n es el control de la ferritina. .uando !ay ba/os niveles de !ierro, se activa un grupo
de protenas denominado N#E5>) que se unen a la regin 31527# del m#$% citoslico que codificada para la ferritina
"una protena de unin a !ierro&, impidiendo su traduccin. )or otra parte, las N#E5>) activas permiten la
estabilizacin del m#$% que codifica para la transferrina "una protena transmembrana de captura de !ierro&
mediante su unin al 27#501 de ste.
=.0. #egulacin traduccional
Existen diversos mtodos de regulacin traduccional. La mayora involucran interacciones con las regiones 27# 01 y
31, que dificultan la interaccin con las subunidades ribosomales, y con factores de inicio de la traduccin.
2n e/emplo interesante es el control que se basa en el factor de inicio de la traduccin eucariota eNW'. ste posee un
dominio de unin a 87). .uando est unido a ste, puede enlazarse con el metionil5t#$% que comenzar la
elongacin de la cadena polipeptdica. La regulacin por eNW' se da a nivel del contenido energtico celular. *i ste
es muy ba/o, no podr reemplazar su 84) por un 87) y se detendrn los procesos traduccionales inespecficamente
"que son altamente dependientes de %7)&, lo que impedir la sntesis de protenas defectuosas.
=.=. #egulacin posttraduccional
Luego de sintetizadas las protenas, se pueden producir fenmenos de modificacin covalente, protelisis controlada
o protelisis completa de las mismas.
La protelisis completa es fundamental para una gran cantidad de funciones celulares. En ella interviene el
proteosoma, que detectar a las protenas CmarcadasD para su eliminacin mediante se-ales de ubiquitinacin.
(. "ntegracin regulatoria en organismos multicelulares
La integracin metablica y funcional en organismos multicelulares se da por accin de ciertas se-ales
extracelulares.
3.(. +ormonas polipeptdicas
Las !ormonas peptdicas o proteicas no pueden difundir a travs de la membrana plasmtica, sino que se unen a
receptores especficos de la superficie celular que sern los encargados de transmitir la se-al !acia el interior celular
por un proceso denominado transduccin de se?ales.
Esto requiere que los receptores de se-ales extracelulares puedan generar alg,n cambio intracelular transmisible.
)or lo general, estos cambios son fosforilaciones proteicas. )or e/emplo, el interfern R puede unirse a su receptor de
membrana X%c, que al dimerizar "por accin del NW$R& puede activar su actividad quinasa, y fosforilar una protena de
respuesta denominada *tat(O, que tambin dimerizar, y podr ingresar al n,cleo celular para activar la transcripcin
de ciertos genes de respuesta.
3.'. +ormonas liposolubles
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stas pueden difundir a travs de membranas plasmticas y nucleares, pudiendo unirse a factores de transcripcin
especficos pertenecientes a la superfamilia de receptores nucleares.
.ada uno de estos receptores posee una regin $5terminal singular de longitud variable con regiones que funcionan
como dominios de activacin de la transcripcin. El dominio de fi/acin al 4$% est ubicado cerca del centro y
presenta motivos de dedos de zinc de tipo .=? est altamente conservado. El dominio de fi/acin a la !ormona est
ubicado en el extremo .5terminal y contiene un dominio de activacin.
Los receptores se unirn al 4$% en forma de dmeros simtricos, generalmente !eterodimricos, siendo uno de los
monmeros un receptor nuclear com,n llamado #Y#. Los monmeros interact,an entre s de modo tal que los
dominios de fi/acin al 4$% se ubican con la misma orientacin. La unin de la !ormona induce un cambio de
conformacin capaz de modificar la actividad de los factores de transcripcin, pudiendo !acerlos funcionar como
activadores o como represores. En la conformacin unida al ligando, pueden dirigir la !iperacetilacin de !istonas en
nucleosomas cercanos, mientras que la conformacin no unida a ste, puede colaborar en la generacin del comple/o
de iniciacin.
Los receptores nucleares !omodimricos se !allan tanto en el n,cleo como en el citoplasma y su actividad es
regulada mediante el control de su transporte desde el citosol !acia el interior del n,cleo. .uando no est unido a la
!ormona, se asocia a un gran n,mero de protenas in!ibidoras como las +sp[< y +spA<.
*e !an detectado Creceptores !urfanosD, cuyos ligandos no se conocen, y tampoco su funcionalidad intracelular.
+. T,cnicas de estudio de la regulacin de la e0presin g,nica
G.(. Ensayo de la 4$%sa
)ermite determinar las zonas del 4$% que no est presente como cromatina compacta. *e basa en el tratamiento de
un fragmento de 4$% con 4$%sa, que solo digerir las regiones no unidas a estructuras superiores como
nucleosomas. )ermite determinar las regiones promotoras "expuestas& y las no funcionales.
G.'. Nnmunoprecipitacin de la cromatina
)ermite dilucidar las secuencias de 4$% unidas a nucleosomas acetilados, es decir, activos. *e establecen uniones
cruzadas entre los nucelosomas y el 4$% in vivo, mediante el uso de un agente qumico ligante. Luego se asla el
material gentico celular y se lo corta mecnicamente "por e/emplo, mediante aspiracin repetida con pipeta&. *e trata
con un anticuerpo especfico contra !istonas acetiladas, y se precipitan selectivamente los fragmentos unidos a
stos. Luego, se revierte la ligacin cruzada y se separa el 4$% del n,cleo proteico, pudiendo cuantificarse por ).#
para poder ser secuenciado.
G.0. Ensayos de expresin
)ermite dilucidar qu regiones upstream a un gen determinado sirven en la regulacin de su expresin. *e basa en
el corte de una secuencia gnica y de su secuencia regulatoria con enzimas de restriccin. Luego, a una parte de las
molculas obtenidas se les elimina sucesivamente regiones de su extremo 31, generando secuencias regulatorias
cada vez ms y ms cortas pero sin alterar la parte codificante.
% continuacin, se crear un vector plasmdico que contenga un gen reportero, y se insertarn los fragmentos antes
obtenidos en fase con ste. 7ransformando clulas competentes con estos vectores e induciendo la expresin del
gen, se podrn observar que algunas clulas lo expresarn a niveles usuales "lo que indica que el rea eliminada de
la regin regulatoria no influye en su expresin&, otras lo expresarn en ba/os niveles "lo que indica que el rea
eliminada contena elementos regulatorios, aunque prescindibles& y otras no lo expresarn "lo que indica que
probablemente se elimin la ca/a 7%7%&.
G.=. Ensayo de proteccin a la 4$%sa N
7ambin llamado ensayo de !uella o de footprinting. )ermite identificar la secuencia de 4$% en la que se unir una
protena. *e basa en la accin de una endonucleasa inespecfica diluida "4$%sa N& sobre una secuencia de 4$%
sobre la que se sabe, se une un elemento en trans. #ealizando el mismo ensayo sobre una muestra de 4$% no unido
a protena y otro unido a sta, y corriendo los fragmentos "previamente marcados& en un gel de agarosa,
acompa-ado de cuatro calles correspondientes a la secuenciacin qumica del fragmento de 4$%.
*e observar que en la banda correspondiente al fragmento unido a protena !abr una desaparicin de ciertas
bandas correspondientes a la secuencia de unin a la protena. .abe destacar que se deber utilizar protena en
exceso para asegurar que todo el 4$% est unido a sta.
G.3. %nlisis de desviacin de movilidad electrofortica
)ermite determinar protenas fi/adoras de 4$% especficas de secuencia durante su purificacin. *e basa en la
corrida electrofortica de una alcuota de la fraccin de una protena cargada en una columna de intercambio inico
incubada con una sonda marcada radiactivamente que contena la regin promotora. 7ambin se corrern distintas
fracciones de elucin de la columna "mediante concentracin salina& que tambin fueron tratadas con la sonda. En el
gel de poliacrilamida se ver en qu fracciones de la elucin apareci la protena unida a 4$% ya que se ver un
retraso de la movilidad electrofortica del 4$%. % partir de esta Cmanc!aD se podr purificar la protena unida a 4$%
para determinar tanto la secuencia de unin como propiedades de la protena.
.abe destacar que en stos casos se debe utilizar un exceso de 4$%, lo que sirve para detectar sensiblemente
ba/as cantidades de protenas.
G.G. 4eterminacin de la metilacin del 4$%
)ermite verificar si el 4$% de una secuencia determinada est metilado en sus citosinas, o no lo est. *e basa en la
aplicacin del bisulfito de sodio como agente transformante de citosinas no metiladas en uracilos. Luego de
completada la reaccin y de eliminado el bisulfito del medio, se procede a la amplificacin del fragmento mediante
).#.
)ara esto se utilizarn primers especficos para cada secuencia obtenida luego del tratamiento, que diferir
notablemente. .orriendo luego los resultantes en un gel de agarosa, te-ido con bromuro de etidio, se podr dilucidar
el estado de metilacin. )or e/emplo, para la secuencia .8.7., el tratamiento con bisulfito de sodio generara una
24
secuencia 28272? la primera ser amplificada con un primer 8.8%8, mientras que la segunda con una %.%%%.
7ratando a una alcuota del producto de reaccin con un primer y a otra con otro, y observando cul amplifica, se
podr determinar si la secuencia inicial estaba metilada o no.
G.[. Ensayos del doble !brido
El producto codificado por el gen C'"3 de levadura es un activador transcripcional que posee dos dominios
funcionales independientes6 el domino de unin a 4$% y el dominio de activacin. )or lo tanto, si fusionamos una
protena "Y& al dominio de activacin y otra "d& al dominio de unin a 4$% es posible probar si stas dos protenas
interaccionan dentro de la clula.
*i las protenas Y e d se asocian dentro de la levadura, necesariamente se ensamblar el activador C'"3, y por
tanto ser capaz de activar la transcripcin de los genes cuya expresin dependa del mismo, por e/emplo CA<!. Es
posible utilizar el promotor de CA<! para preparar un gen artificial que lleva el promotor de CA<! y la secuencia
codificante del gen de la b5galactosidasa. %s al activarse la transcripcin de CA<!, por accin de C'"3 o del !brido
Yd, se producir la enzima Q5galactosidasa cuya actividad puede determinarse usando un ensayo que resulta en la
tincin azul de las clulas que la estn produciendo.
)ara realizarlo, se deber contar con un plsmido que contenga a la fusin Y5dominio de activacin, y otro que
contenga la fusin d5dominio de unin al 4$%. Nncluso pueden tenerse varios plsmidos, cada uno con una fusin
entre Y y varias protenas que se sospec!e puedan unirse a d.
Tema %: Re#ulacin del ciclo celular en
eucariota
1. "ntroduccin
La mayora de las clulas eucariotas atraviesa una serie de acontecimientos ordenados llamada ciclo celular, que
implica la duplicacin y distribucin de los cromosomas antes de la divisin celular. La regulacin del ciclo celular es
decisiva para el desarrollo normal, y su prdida lleva al cncer.
La replicacin de las clulas es controlada por la regulacin cromnomtrica de la replicacin y la mitosis, cuyos
controladores principales son ciertas quinasas !eterodimricas que contienen una subunidad reguladora y una
subunidad cataltica. stas regulan las actividades de m,ltiples protenas que participan en la replicacin del 4$% y la
mitosis mediante la fosforilacin de stas ,ltimas, para activarlas o reprimirlas.
(.(. 8eneralidades del ciclo celular
El ciclo celular est dividido en cuatro fases principales. En las clulas somticas, los cromosomas se duplican
durante la fase * "de sntesis&. 4espus de atravesar la fase 8', comenzar la mitosis "a su vez dividida en varias
etapas&. Luego, las clulas entran en la fase 8(, que volver a dar paso a la fase *.
En vertebrados y levaduras diploides, las clulas en 8( poseen una cantidad diploide de cromosomas. Las clulas
!umanas de replicacin rpida progresan a travs del ciclo celular completo en un da, donde media !ora
corresponde a la mitosis, y diez !oras a la fase *. Las fases 8 ocupan las trece !oras y media restantes,
generalmente siendo 8( el doble de largo que 8'. En levaduras el ciclo completo dura unos A< minutos.
Las clulas postmitticas pueden CsalirD del ciclo celular y permanecer sin proliferar durante un largo tiempo,
llamando a este estado fase 8<. .uando retornan al ciclo celular, entran en la fase *.
(.'. .ontrol del paso a travs de las fases del ciclo celular
Las concentraciones de las subunidades reguladoras de las quinasas regulatorias antes mencionadas se denominan
ciclinas9 mientras que las subunidades catalticas se llaman >uinasas dependientes de ciclinas 6Cdk7. .ada .dJ
puede asociarse con diferentes ciclinas y esto determina qu protenas sern fosforiladas por el comple/o.
.uando las clulas son estimuladas para replicarse, primero se expresan los comple/os .dJ de 8(, que prepararn a
la clula para la fase * mediante la activacin de factores de transcripcin que causan la expresin de las enzimas
necesarias para la sntesis del 4$% y los genes codificadores de los comple/os .dJ de la fase *. stos son
inicialmente in!ibidos por protenas especficas, que sern degradadas al final de 8( por las propias .dJ de 8(.
Los comple/os .dJ de la fase * fosforilan comple/os de prerreplicacin del 4$% que se encuentran en los orgenes
de replicacin. Esto activa la replicacin e impide la aparicin de nuevos comple/os de prerreplicacin lo que asegura
que cada cromosoma slo se replique una sola vez.
Los comple/os .dJ mitticos se sintetizan durante la fase * y 8' pero son in!ibidos !asta la sntesis completa del
4$%. .uando se activan inducen la condensacin cromosmica, la desintegracin de la envoltura nuclear, el armado
del !uso mittico y la alineacin de los cromosomas en la placa metafsica. .uando la alineacin y unin es correcta,
activan el comple/o promotor de la anafase, que luego degradar proteolticamente las ciclinas mitticas, lo que
permite la descondensacin de los cromosomas, se reconstituya la envoltura nuclear, y suceda la citocinesis. $tese
que la degradacin proteica obliga a que el paso por el ciclo mittico sea irreversible y dirigido.
En los comienzos de una nueva fase 8(, ciertas fosfatasas desfosforilan las protenas que forman los comple/os de
prerreplicacin para que se armen en los orgenes de replicacin, y se inactiva el %)..
En los organismos superiores, el control del ciclo celular es e/ercido por la regulacin de la sntesis y actividad de los
comple/os .dJ de 8(. .iertos factores de crecimiento extracelulares "los mitgenos& inducen la sntesis de comple/os
.dJ de 8(, lo que permite que el ciclo contin,e con la mitosis incluso si son eliminados. El punto en el que el ciclo
celular se torna independiente de mitgenos se denomina punto de restriccin.
2. )ontrol mittico
'.(. 4escubrimiento del E)W y el %).
25
.!.!. Ciclina B y 3<=
Estudios sobre los oocitos de Fenopus lae*is, resultaron en la determinacin de la existencia de un factor promotor
de la maduracin 63<=7 que regula la iniciacin de la mitosis y@o la meiosis en clulas eucariotas. ste era inactivo en
oocitos detenidos en 8' y aumenta su actividad al tratar a los oocitos con progesterona, lo que induce la entrada a la
meiosis N. El E)W disminuye en la interfase entre meiosis N y meiosis NN, y aumentar nuevamente al ingresar a
meiosis NN. Lo mismo se observa para clulas en mitosis, incluso para otras especies.
)osteriormente, se observ que el E)W es un comple/o !eterodimrico compuesto por una ciclina y una .dJ.
+aciendo estudios anlogos en F. lae*is, se observ que una ciclina, denominada ciclina >, aumentaba su actividad
al principio de la mitosis, y disminuy durante la anafase por degradacin. )or :estern blotting, se comprob que la
ciclina > no era ms que una subunidad del E)W.
.!.. Acti*idad del 3<=
*e observ adems que la actividad del E)W est presente incluso en !uevos sin n,cleo, lo que demuestra que est
controlada por un Crelo/ citoplasmticoD independiente de los fenmenos nucleares. )or otra parte, tambin se
comprob que era independiente de la transcripcin, y esto indicaba que los !uevos no fecundados contienen todos
los materiales y !erramientas requeridas para controlar sus ciclos celulares iniciales.
El E)W posee una actividad quinasa sobre la !istona +(. Esto permiti medir su actividad fcilmente, y compararla
con la concentracin celular de la ciclina >. Los acontecimientos iniciales de la mitosis y la meiosis ocurran cuando la
actividad de E)W y la concentracin de ciclina > eran mximas, mientras que la adicin de ciclo!eximida, un in!ibidor
de la sntesis proteica, imposibilitaba la sntesis de ciclina > y la actividad del E)W, lo que anulaba la mitosis. )ara
comprobar la relacin entre ciclina >, E)W y mitosis, se destruyeron todos los m#$% del extracto de !uevo, y se les
agreg cromatina masculina. $o se observ aumento en la actividad de E)W, de concentracin de ciclina > ni de
acontecimientos propios de la mitosis. %l agregar exgenamente m#$% de ciclina >, los otros dos parmetros
estudiados siguieron patrones esperados. Luego, se realiz lo mismo con ciclinas > mutantes que no podan ser
degradadas, y se observ una actividad elevada y constante de E)W, y un bloqueo de los acontecimientos mitticos
finales.
.!.3. +egulacin de la acti*idad del 3<=
Las clulas animales contienen tres ciclinas mitticas, la ciclina %, y dos ciclinas >. stas, como la ciclina > de F.
lae*is, contienen una secuencia !omloga cerca del extremo amino denominada ca,a de destruccin debido a que es
donde se poliubiquitinarn para ser degradadas. Este proceso est controlado por el promotor de la anafase "%).&
que lo estimula.
La adicin de ubiquitina requiere tres tipos de enzimas, una acti*adora de ubi>uitina "E(& en su extremo carboxlico
por una unin a un grupo tioster, una con,ugadora de ubi>uitina "E'& que ser la encargada de mantenerla !asta
transferirla al producto, y una ubi>uitina ligasa "E0& que transferir la ubiquitina al producto. Las subunidades E' y E0
suelen ser especficas para determinados productos, y las E0 son comple/os proteicos.
El %). de !uevos detenidos en metafase tiene poca actividad estimulante de ubiquitinacin, mientras que el aislado
de !uevos estimulados para completar la mitosis, posee una gran actividad, y est fosforilado. .uando el E)W
alcanza su mxima expresin, fosforila y activa al %).. ste se desactivar !acia el final de 8(. La ciclina >, en
cambio, se sintetiza de manera continua durante el ciclo celular.
'.'. 4escubrimiento de reguladores similares a E)W
..!. 4%mero Cdc!3ECdc
El modelo que permiti obtener nuevos descubrimientos en la regulacin mittica del ciclo celular fue
)chi$osaccharomyces pombe, una levadura que crece de tama-o desde su fase 8( !asta antes de dividirse. Las
mutaciones recesivas termosensibles en ciertos genes "llamados genes cdc& impiden que las clulas entren en
mitosis. )untualmente mutaciones en el gen cdc impiden la entrada en la mitosis, o la aceleran. 4e a! que la
protena .dc' !aya sido determinada como un regulador mittico.
La b,squeda de genes emparentados al cdc en otros eucariontes permiti identificar protenas anlogas incluso en
!umanos, que reemplazaban la actividad de .dc' en clulas defectuosas. *e determin que .dc' era una quinasa,
lo que llev a compararla con el E)W, y a encontrar que es anlogo a su .dJ. )osteriormente se !all la protena
.dc(0 anloga a la ciclina > de F. lae*is, lo que dio a pensar que el dmero .dc(0@.dc' forma el E)W de ). pombe,
ampliamente comprobado luego.
... +egulacin del 3<=
La actividad de este dmero est regulada por otras protenas, como .dc'3 "estimulante& o :ee( "in!ibitoria&. stas
fosforilan "o defosforilan& a .dc' "la subunidad cataltica&, y la regulan siempre y cuando sta est unida a .dc(0.
:ee( fosforila un residuo 7yr5(3, mientras que otra quinasa "la llamada .%c& fosforila el residuo 7!r5(G(. La protena
.dc'3, en cambio, es una fosforilasa del sitio 7yr5(3. El E)W bifosforilado o fosforilado en 7yr5(3 es inactivo,
mientras que si est defosforilado, es activo. Esto sucede porque la .dc' inactiva posee una regin flexible que
bloquea el acceso de los sustratos proteicos al sitio activo. *u unin a .dc(0 provoca un cambio conformacional que
permite el acceso al sitio activo, aunque con ba/a afinidad por los sustratos. sta se ver aumentada por la
fosforilacin de la 7!r5(G(, y disminuida por la fosforilacin de la 7yr5(3. %lgo similar ocurre en vertebrados.
Existen otros mecanismos de control sobre la actividad del E)W. 4e ms est decir que toda protena que modifica
covalentemente a sus subunidades a su vez est regulada por otras, y adems, existen muc!as ms protenas
reguladoras que act,an igual que :ee( y .dc'3. 7ambin se !an observado mecanismos de control de la estabilidad
de los transcritos, en otros organismos.
'.0. Eecanismos de regulacin de los fenmenos mitticos
El E)W act,a como quinasa, y las protenas que son fosforiladas por l median muc!os acontecimientos destacables
de la mitosis. % continuacin se comentar la accin del E)W y el %). en algunos de estos acontecimientos6
a& 4esintegracin de la envoltura nuclear. La envoltura nuclear se compone de tres tipos de subunidades proteicas, la
laminina % y . "idnticas excepto por (00 aminocidos en su extremo carboxilo terminal& y la laminina > "que posee
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un grupo isoprenilo, que le permite anclarse a la membrana nuclear&. stas dimerizan y se entrecruzan mediante
interaccin cola5cola y cabeza5cabeza. %l principio de la mitosis, el E)W activo fosforila serinas especficas y los
despolimeriza, lo que permite la desintegracin de la membrana nuclear en peque-as vesculas.
b& .ondensacin de los cromosomas. En levaduras se !a visto que el E)W fosforila "directa o indirectamente& ciertas
protenas denominadas *E. que forman partes de comple/os proteicos denominados condensina. stas "y otras del
comple/o& se fosforilan al entrar en mitosis, e inducen a que se una al 4$% y lo lleva a un estado de
superenrollamiento.
c& *eparacin de las cromtidas !ermanas. *e demostr que para inicial la anafase tambin se requiere la
degradacin de otras protenas que no son ciclinas. .uando se sustituye el m#$% de la ciclina > por uno de una
ciclina > no degradable, se detiene la mitosis, pero la distribucin de los cromosomas se realiz normalmente.
Eliminando la cantidad de %). activo en clulas en mitosis, se observ que en ese caso la distribucin de los
cromosomas se enlenteca o no suceda. Las cromtidas !ermanas no se separan antes de la anafase debido a
ciertas protenas que las ad!ieren llamadas cohesinas, las que comparten ciertas subunidades con las condensinas.
Las co!esinas son reguladas por el %)., ya que ste ubiquitina al inhibidor de la anafase "%N&, lo que debilita la unin
entre cromosomas por la co!esina, y permite su separacin. El %). no act,a sobre la ciclina > !asta el final de la
anafase, ya que es necesario mantener los cromosomas condensados !asta que !ayan sido distribuidos.
d& .itocinesis. El E)W en elevada actividad fosforila la cadena liviana de la miosina, lo que in!ibe su ad!esin a los
filamentos de actina. La inactivacin del E)W al final de la anafase, permite que las fosfatasas defosforile la miosina y
active la maquinaria contrctil, generando la citocinesis.
3. )ontrol sint,tico
Es all que en ). pombe la decisin fundamental para completar el ciclo celular es el de entrar en fase E, en la
mayora de los organismos eucariotas, la decisin primordial es entrar en fase *. 2n e/emplo claro de esta realidad es
)accharomyces cere*isiae que se divide por brotacin. El brote aparece al comienzo de la fase * y crecer !asta
separarse luego de la fase E. Las clulas !i/as crecern durante 8(, y cuando tomen la decisin irreversible de
continuar su ciclo celular, entrarn a fase * y generarn un nuevo brote.
0.(. *)W y .4c
7odas las mutantes de ). cere*isiae poseen un brote de tama-o constante. La mutante en el gen C4G no presenta
brotes. Esto indica que .4c es decisiva para la entrada en fase *, y bloquean a las clulas en 8(.
La protena .4c es !omloga a .dc', e incluso pueden complementar su actividad en los distintos organismos. )or
analoga, pareca probable que un presunto promotor de la fase ) "*)W& que actuara como quinasa de protenas que
expresen las de sntesis del 4$%, fuera un !eterodmero compuesto por .4c y una ciclina. *e encontraron tres
protenas probables para esta funcin6 .ln(, .ln' y .ln0. Estas tres estaban emparentadas, y a su vez eran
parecidas a la ciclina % !umana.
Las clulas pueden crecer a excepcin de que las tres protenas estn ausentes, aunque la ausencia de cualquiera
de las tres bloque a la clula en fase 8(. Los comple/os formados entre .4c y alguna de las .ln constituyen los *)W.
.ln0 se expresa de manera casi constante en el ciclo celular, mientras que las otras dos, durante la segunda mitad de
8( y llegan a un mximo /usto antes de entrar en *.
0.'. %ccin de los *)W
El tama-o celular regula la actividad del comple/o .ln05.4c, activndolo e induciendo que fosforile los factores de
transcripcin *>W y E>W, que controlan la transcripcin de
.ln(, .ln', y otros genes necesarios para la replicacin del
4$%, como los que codifican para la 4$% )olimerasa, las
**>, las ligasas, etc. )or otra parte, tanto .ln(5.4c como
.ln'5.4c fosforilan al %)., inactivndolo. E>W a su vez
activan la expresin de .lb3 y .lbG, dos ciclinas del tipo >.
7anto .4c5.lb3 como .4c5.lbG son inactivados de
inmediato por la fi/acin de *ic(, al entrar en 8(, lo que in!ibe
la entrada a la fase *. ste deber ser eliminado antes de
entrar en *, y lo !ace por protelisis inducida por el comple/o
.dc0=5*.W "de tipo E'5E0&. .uando es degradado, los
comple/os .4c5.lb3@G inducen la replicacin del 4$%.
En la fase *, comienza la transcripcin de otras dos ciclinas
de tipo >, .lb0 y .lb=, que tambin pueden asociarse a .4c
que tambin inducirn la replicacin e iniciarn la formacin
del !uso mittico. %l entrar en 8' tambin se sintetizarn otras
dos ciclinas, .lb( y .lb' que funcionarn como ciclinas
mitticas, tal como !aca .dc(0 en F. lae*is.
0.0. #eplicacin del 4$%
Los orgenes de replicacin de levaduras contienen una
secuencia central conservada de (( pb a la cual se une una protena !examrica, el comple,o de reconocimiento del
origen 6.+C7. stos permanecen asociados durante todas las fases del ciclo, mientras que otras protenas, como
.dcG, .dc=3, Ecm, slo lo !acen durante 8(. Este con/unto de protenas se denomina comple,o de prerreplicacin.
)ara que stos puedan funcionar y replicar el 4$% requieren un comple/o .4c5.lb activo "y una protena .dc[54bf=
sintetizada en 8(&. stos in!iben la formacin de nuevos comple/os de prerreplicacin, lo que asegur a que la
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replicacin se inicie una sola vez por ciclo celular. El %)., al entrar en telofase, eliminar las ciclinas >, por lo que
permitir la formacin de nuevos comple/os de prerreplicacin en ambas clulas !i/as.
4. )ontrol del ciclo celular en mam/eros
Las clulas de mamfero cultivadas en ausencia de factores de crecimiento se detienen en 8<. *i se a-aden factores
de crecimiento, y quedarn comprometidas a finalizar el ciclo siempre y cuando entren en la fase *.
=.(. .dJ1s y ciclinas
Los mamferos utilizan varias .dJ1s emparentadas denominadas .dJ(, ', = y G. La primera es complementaria a
.dc', la segunda lo es a .dc'M. 7ambin poseen numerosas ciclinas, como las % "en realidad son ciclinas del tipo
>&, las >, las 4 y las E "anlogas a .ln&. Las cantidades relativas de las tres ciclinas 4 conocidas son diferentes en
distintas clulas o te/idos. En la fase 8< no se expresan ciclinas ni .dJ1s.
=.'. Nngreso a fase *
Los factores de crecimiento inducen la transcripcin de m,ltiples genes que pueden ser genes de respuesta preco$ o
genes de respuesta retardada. Los primeros se transcriben pocos minutos despus de la adicin de factores de
crecimiento debido a una cascada de transduccin de se-ales que activa sus factores de transcripcin. Euc!os
productos de estos genes estimulan la transcripcin de genes de respuesta retardada. Luego de unos 0< minutos
luego de la estimulacin, los m#$% de respuesta precoz y sus productos disminuyen su concentracin, lo que no
sucede si se bloquea la sntesis proteica. Esto indica que es una protena de respuesta precoz lo que lo produce.
%lgunos de los genes de respuesta retardada codifican factores de transcripcin adicionales como los E'W, y tambin
ciclinas 4, ciclinas E y .dJ ', = y G.
Los factores de transcripcin E'W regulan la transcripcin de ciertas .dJ, y ciclinas, as como tambin la suya propia.
*u capacidad activadora es in!ibida por la unin a la prote%na +b, que incluso los convierte en represores de la
transcripcin por desacetilacin de !istonas. La fosforilacin de la protena #b la inactiva, y sta se lleva a cabo
inicialmente por el comple/o .dJ=@G5.iclina 4. El E'W producido, no solo autoactivar su transcripcin, sino que
permitir la sntesis de las subunidades del comple/o .dJ'5.iclina E, que tambin fosforilar a #b, generando una
retroalimentacin positiva, lo que la independiza de .dJ=@G5.iclina 4 y permite la progresin !acia la fase *
irreversible. La protena #b ser mantenida fosforilada por los comple/os .dJ(@'5.iclina !asta la fase 8(.
)or otra parte, la ciclina 4 tambin es controlada a nivel traduccional, ya que los factores de crecimiento activan al
factor de elongacin de la traduccin eNW5=. El 78W5Q es un qumico que in!ibe a este factor de elongacin y por lo
tanto evita el paso a fase *.
=.0. Nngreso a fase E
El comple/o .dJ'5.iclina % cumple la misma funcin que
el comple/o .4c5.lb3@G de ). cere*isiae,
desencadenando la iniciacin de la replicacin del 4$%
por los comple/os de prerreplicacin y evitando que stos
vuelvan a formarse. La funcin de *ic( es compartida por
tres protenas .cN "in!ibidores de .dJ5.iclina&. La
actividad de los comple/os .dJ(5.iclina % y .dJ(5.iclina
> "que produce la entrada en la mitosis& es regulada por
anlogos de :ee(, .%c y .dc'3 con mecanismos
anlogos a stas, adems de incorporar la regulacin del
transporte nuclear de la ciclina > originalmente
sintetizada en el n,cleo.
Existen dos tipos de .cN1s, las .N) "que in!iben todo tipo
de .dJ& y las N$c= "que solo in!iben las .dJ=&. .laro
est que las protenas N$c= "p(3, p(G, p(M, p(A& in!iben
la fosforilacin de #b. )or otra parte, las protenas .N)
"p'(, p'[ y p3[, con secuencias relacionadas& son
requeridas para el desarrollo embrionario normal, y su
carencia genera organismos deformes o no viables.
(. Puntos de control
4a-os catastrficos a nivel genmico pueden suceder si las clulas progresan a la fase siguiente de su ciclo celular
antes de que la fase anterior se complete de manera correcta. )ara minimizar la ocurrencia de estos errores, el
progreso de una clula a travs del ciclo celular es monitoreado a travs de puntos de control, que verifican ciertas
condiciones intracelulares fundamentales para evitar problemas futuros.
3.(. .ontrol sobre la replicacin del 4$%
Las clulas que no !an replicado todos sus cromosomas no ingresan en fase E. El punto de control implicado en
este caso, reconoce el 4$% no replicado e in!ibe la activacin del E)W. 4os protenas quinasas, %7# y .!J(, son las
responsables de este proceso. %7# se asocia con las !orquillas de replicacin y esto activa su actividad quinasa, por
la que fosforilar y activar a .!J(. sta fosforila a .dc'3 "o sus anlogos&, inactivndola, lo que impide que active
los comple/os .dJ(5.iclina %@>, lo que evita que comience la mitosis. .uando todo el 4$% se !ubiere replicado, la
cascada de fosforilacin se detiene, y la mitosis puede suceder.
3.'. .ontrol sobre el correcto ensambla/e del !uso mittico
Las clulas en metafase que no posean todos los cinetocoros unidos a un microt,bulo, no ingresan en anafase. El
comple/o multiproteico de co!esina contiene *E.( y *E.0, protenas dimricas que se unen a ambas cromtides
!ermanas, conectados por *cc(. .uando todos los cinetocoros !ayan unido un microt,bulo, el factor .dc'< se une a
28
%). para que ubiquitine una protena llamada *ecurina. sta est com,nmente unida a otra protena ms grande
denominada *eparasa, que cuando est libre puede eliminar *cc(, separando las cromtidas !ermanas.
*e encontraron ciertas protenas que regulan el control de la unin de microt,bulos a cinetocoros, como Ead' y
.dc'<. Ead' se asocia a los cinetocoros que no estn unidos a microt,bulos, y si lo est por muc!o tiempo, se
convierte en una forma soluble activa que se une e in!ibe a .dc'<, evitando el comienzo de la anafase.
3.0. .ontrol sobre la segregacin correcta de los cromosomas
La activacin del %). se daba por fosforilacin de ste a partir del comple/o E)W. Esta fosforilacin se da sobre una
subunidad del %). denominada .d!(, que se separar del %). cuando se fosforile, permitiendo que act,e. Luego,
una fosfatasa ".dc(=& eliminar el fosfato de .d!(, permitiendo su reunin al %). y su inactivacin en la
ubiquitinacin de la ciclina >. 4urante la interfase y la mitosis temprana, la fosfatasa .dc(= es secuestrada en el
nuclolo e inactivada.
El grupo de protenas que act,an en este punto de control se denomina red de salida de la mitosis, en la que uno de
los componentes centrales es una 87)asa llamada 7em(. 4urante la anafase, 7em( se asocia con el cuerpo polar
del !uso "centrosoma& y se mantiene como 7em(584) "inactiva&. La protena que activa a 7em( se encuentra en el
crtex de la clula !i/a, y entrar en contacto con ella, cuando los cromosomas lleguen al centrosoma luego de
segregar. La activacin de 7em( "a!ora como 7em(587)& generar una cascada de fosforilacin que fosforilar en
,ltimo lugar a la protena de ancla/e de .dc(= al nuclolo, liberndola y permitiendo su accin, lo que inactiva al %).
y permite que ocurra la telofase y la citocinesis.
3.=. .ontrol sobre el da-o del 4$%
4a-os sobre la integridad del 4$% arresta el ciclo celular en 8(, * o 8', lo que permite su reparacin. Los pacientes
con protenas regulatorias mutantes suelen desarrollar cncer.
El da-o de 4$% debido a la luz 29 activa la Jinasa %7E que fosforilar a .!J' y sta fosforilar a .dc'3 fosfatasa,
marcndola para ser degradada. Esto evitar que .dJ' pierda su fosfato in!ibitorio, y no pueda unirse a las ciclinas E
y %, lo que es necesario para atravesar la fase *. El da-o de 4$% debido a rayos R, activa a la Jinasa %7# "comple/o
entre %7E y #ad0&, que fosforilar a .!J(, que cumple funciones anlogas a .!J'.
Ltra protena funcional es p30 que arresta el ciclo en 8( o 8' cuando las clulas se exponen a radiacin R. p30 es
una protena que se degrada rpidamente por accin de la marcadora Edm'. %7E y %7# in!iben su degradacin al
fosforilarla, lo que impide la accin de Edm'. Luego, p30 funcionar como un activador transcripcional de genes de
respuesta a da-o del 4$%, como por e/emplo, el tetrmero p'(, que in!ibe .dJ1s y se une al ).$%. .uando el da-o
del 4$% es muy grande "por lo que su concentracin es muy elevada&, p30 puede inducir la apoptosis.
+. )iclo celular 1 destino celular
2na clula puede decidir distintos destinos de acuerdo a las se-ales externas que recibe, ya sea diferenciarse,
dividirse, transformarse adaptativamente o morir por apoptosis. Esto es fundamental en el desarrollo de animales
multicelulares, donde la coordinacin entre diferenciacin, morfognesis y apoptosis es imprescindible para el
desarrollo de organismos viables. Las clulas en estado diferenciado no pueden dividirse.
G.(. .apacidad proliferativa
*e denomina as simplemente a la capacidad de dividirse de una clula, en relacin con su grado de diferenciacin.
4e esta manera, podemos encontrar clulas6
a& .on especializacin extrema, totalmente diferenciadas, que no pueden dividirse, como las neuronas, miocitos o
eritrocitos.
b& .on especializacin media, que no se dividen pero pueden !acerlo ba/o ciertas condiciones estimulantes, como
!epatocitos o linfocitos.
c& $o especializadas, que pueden dividirse a gran velocidad, como las clulas madre.
stas ,ltimas son las clulas indiferenciadas que dan origen a todos los te/idos, ya que sus clulas !i/as pueden
diferenciarse o permanecer como clula madre.
G.'. *e-ales externas
El crecimiento y la muerte celular pueden ser influenciados por se-ales qumicas externas que alteran el ciclo celular
de la clula. stas pueden clasificarse en6
a& Eitgenos. *on sustancias qumicas que estimulan la divisin celular, in!ibiendo los puntos de control intracelular,
por lo que suelen producir errores graves.
b& Wactores de crecimiento. Estimulan el crecimiento celular, promoviendo la sntesis de macromolculas pero sin
alterar el rumbo y los puntos de control usuales del ciclo celular.
c& Wactores de supervivencia. Evitan la apoptosis, pero sin solucionar los problemas intracelulares que indu/eron que
suceda.
Los ms utilizados en el estudio del ciclo celular son los mitgenos, ya que permiten evaluar las consecuencias de
los obstculos intracelulares a su continuacin.
G.0. )rotenas #ingo
En la actualidad se !a observado que las .dJ1s no slo son activadas por ciclinas. 4e !ec!o, se !a podido purificar
una serie de protenas en F. lae*is que se unen a las .dJ1s y cumplen funciones anlogas a las ciclinas,
denominadas prote%nas )peedy o prote%nas +ingo. stas no tienen relacin de secuencia con las ciclinas, y por lo
tanto, no sufren los procesos regulatorios que pudiesen afectar a aquellas. 4e !ec!o, esta disminuida sensibilidad a
los procesos in!ibitorios las !ace menos sensibles a los puntos de control y suelen salterselos.
*e !an diferenciado cinco protenas, conocidas como #ingo %( "o *py(&, #ingo %', #ingo ., #ingo ' y #ingo 3. La
primera promueve la proliferancin celular, fundamentalmente interfiriendo en procesos apoptticos, y promoviendo la
meiosis. #ingo. funciona en la induccin de la mitosis, y tiende a saltear los puntos de control de 8'.
*e !a visto una importante funcin de *py( en el control de da-o del 4$%. La unin de .dJ' a *py( evita la
fosforilacin de %7#@%7E sobre .!J(@', por lo que saltea el punto de control de da-o lo que puede evitar la apoptosis
29
celular o el arresto del ciclo celular. )or otra parte, tambin evita la ubiquitinacin y la inacticacin de .dc'3, lo que
activa a los comple/os .dJ(@'5.iclina para que contin,en funcionando y no detengan el ciclo celular. Esto induce a la
replicacin del 4$% y la progresin del ciclo celular sin reparacin del 4$%, lo que es una fuente importante de
cncer.
G.=. %poptosis y necrosis
+ay entre seis y oc!o formas de que una clula muera. 4os de los ms comunes son la apoptosis y la necrosis.
@.5.!. Apoptosis
La apoptosis o muerte celular programada, es un mecanismo central que controla el desarrollo multicelular, conduce
a la eliminacin de estructuras completas, el esculpido de te/idos especficos y la regulacin de la cantidad de clulas.
*e caracteriza por presentar una secuencia bien definida de cambios morfolgicos "la apoptosis propiamente dic!a&,
como la disminucin de tama-o celular, la fragmentacin en cuerpos apoptsicos peque-os limitados por membrana
que suelen ser fagocitados por otras clulas, la fragmentacin del 4$%, etc. *e notan burbu/as en la membrana.
Eediante estudios en C. elegans, se pudo determinar la presencia de las protenas .ed50, .ed5= y .ed5A. Las
primeras dos inducan la muerte celular, mientras que la ,ltima, la evitaba. En !umanos, se aisl la protena >cl5'
anloga a .ed5A. %mbas contienen un ,nico dominio transmembrana y se localizan sobre las membranas externas
de las mitocondrias, el n,cleo y el retculo endoplsmico. Las molculas efectoras de la va apoptsica son de una
familia denominada de las caspasas, por ser cistena proteasas que escinden selectivamente las protenas en los
sitios inmediatos a restos de aspartatos, lo que les confiere ob/etivos especficos como ser lamininas o protenas del
citoesqueleto.
>cl5' se une a protenas inductoras de la apoptosis "como %paf5(, anloga a .ed5= de C. elegans& in!ibiendo su
actividad. 7anto %paf5(, como .ed5=, act,an unindose a otras protenas efectoras ".ed50 en C. elegans, y caspasas
en !umanos&, activndolas y permitiendo que stas cumplan su actividad de proteasa.
Existen a su vez reguladores proapoptsicos que inducen la apoptosis. Entre ellos >ax, una protena similar a >cl5' y
.ed5A, que en altas concentraciones inducen la apoptosis.
En clulas normales, el citocromo c se localiza entre las membranas mictocondriales interna y externa, pero se libera
el citosol en clulas apoptticas. Esta liberacin es bloqueada por >cl5', pero no lo es por >ax en excesiva cantidad,
ya que este permite el ingreso de iones al espacio intermembrana que de alguna manera podr liberar el citocromo c.
.uando el citocromo c se une a %paf5(, activa una cascada de caspasas. La protena p30 participa en la
sobreexpresin de >ax y otros proapoptticos ">ad, >aJ, etc.&
@.5.. "ecrosis
Es una muerte descontrolada generada por da-os causados a te/idos. La membrana plasmtica pierde integridad, lo
que induce la !inc!azn celular y su explosin, por lo que liberar al medio su contenido citoplasmtico, muc!as
veces da-ino para las clulas circundantes. $o se requiere energa "como s sucede en la apoptosis&, y sucede a
cualquier temperatura "las ba/as temperaturas disminuyen la actividad enzimtica caracterstica de la apoptosis,
evitando que suceda&. El 4$% es digerido azarosamente, y se nota la muerte indiscriminada de grupos de clulas.
Tema &: 'ae moleculare del dearrollo de
Drosop'ila melanogaster
1. "ntroduccin
Los controles de la transcripcin especifican diferentes tipos celulares en levaduras y animales. $o obstante, adems
delos diferentes tipos de clulas, los organismos multicelulares ex!iben diferencias regionales en su organizacin
celular. La determinacin de la posicin y el tama-o de las distintas regiones de un organismo se denomina
especificacin de un plan corporal.
La evolucin afect notablemente al plan corporal de los organismos. Los organismos menos evolucionados
presentaban simetra radial, que lentamente dio paso a una simetra axial, para luego dar origen a la simetra biaxial
que presentan los animales superiores. El plan corporal a lo largo del e/e anteroposterior de una gran cantidad y
variedad de phyla "como artrpodos y cordados& est especificado por un con/unto de factores de transcripcin muy
relacionados codificados por los genes Ho1. Las mutaciones de stos causan homeosis, es decir la formacin de una
parte del cuerpo con las caractersticas de otra. Los genes Ho1 codifican protenas en amplias regiones a lo largo del
e/e anteroposterior.
La especificacin del plan corporal en 4rosophila melanogaster comienza con la divisin progresiva del embrin en
dominios cada vez menores caracterizados por patrones exclusivos de expresin de diferentes combinaciones de
factores de transcripcin. *e utiliza este organismo como modelo porque posee una comple/idad similar a la de los
cordados, su genoma est secuenciado y es fcilmente manipulable. *in embargo, se comenz a estudiar el
desarrollo en 4rosophila debido a que existan mutantes naturales de sta.
(.(. 4rosophila melanogaster
El ciclo vital completo de 4rosophila transcurre en (< das. El organismo presenta dos formas de vida, una lar*aria y
una de adulte$ separadas por un estado intermedio de pupacin. En un da, el !uevo fecundado se convierte en larva
"un estadio de crecimiento y alimentacin !erbvora, donde no se observan aparatos sexuales&, luego tres etapas
posteriores "o cris-lidas& toman cuatro das ms.
4urante la embriognesis, un grupo de clulas "los discos imaginales de unas '<< clulas& se separan y transportan
la larva, para dar origen a estructuras epidrmicas del adulto. Ltros grupos de clulas darn origen a rganos
internos. Luego de la etapa larvaria, se formar una cubierta o cscara externa. La pupacin tarda otros cuatro das,
30
donde se lisarn las clulas larvarias restantes "un AAB& y se romper la cscara para permitir la salida de una mosca
adulta que no crecer ms "metamorfosis completa&.
.abe destacar que el organismo en estadio larvario no es una versin peque-a de la mosca adulta, sino que es
completamente distinto y de vida independiente. Esta es una de las ms notables diferencias con el desarrollo de
cordados.
(.'. )erfil celular
El plano para la generacin de una mosca adulta se delinea antes de la fecundacin. .ada oocito est rodeado por
(3 clulas nodri$as "todas provenientes de la misma clula madre& que sintetizan protenas y m#$% que se
transportan !acia el oocito por puentes citoplasmticos. .ada grupo de (G clulas est rodeado por una monocapa
de clulas foliculares. Los espermatozoides se almacenarn en una vescula seminal y fecundarn los oocitos que
lleguen a l, y el !uevo fecundado podr salir al exterior.
La fecundacin activa la embriognesis. El oocito maduro ya posee sus extremos anterior y posterior bien definidos,
en gran parte por la ubicacin de los m#$% producidos por las clulas nodrizas. Las primeras (0 divisiones son
sincrnicas y rpidas "aproximadamente cada (< minutos& y no se acompa-an de citocinesis, generando un sincitio.
2nas tres !oras despus de la fecundacin, los n,cleos alcanzaron la superficie del embrin "generando un
blastodermo sincitial&, para luego formar las membranas celulares alrededor de los n,cleos y dar origen a la bl-stula o
blastodermo celular.
La adquisicin inicial de modelos se producen antes de la formacin de la blstula y se basan en la difusin de
protenas dentro del sincitio en desarrollo.
2. Desarrollo inicial
Existen cuatro sistemas diferentes de genes maternos que regulan la determinacin axial del embrin. stos se
transcriben en las clulas nodrizas durante la oognesis y los m#$%s se transportan !acia el oocito, donde
generarn protenas que regularn la transcripcin de genes cigticos. Estos cuatro grupos fueron clasificados como
genes del grupo anterior, del grupo posterior, del grupo terminal y del grupo dorsoventral.
2n concepto central es el de morfgeno, una sustancia que especifica la identidad celular en funcin de su
concentracin, por lo que un gradiente continuo de concentraciones de ste puede desencadenar un con /unto de
respuestas celulares excluisvas en una cantidad finita de concentraciones umbral. )or sobre stas, se producir una
respuesta, mientras que por deba/o, otra.
9arias protenas en el embrin de 4rosophila act,an como morfgenos, y son factores de transcripcin que
permitirn la regulacin de la expresin gnica de genes cigticos en el embrin precoz de manera espacialmente
restringida. Los productos a su vez controlarn la transcripcin de otros genes cigticos, y esto permite un control
muc!o ms fino.
'.(. Especificacin de la regin anterior
El primer morfgeno descrito en el nivel molecular fue la protena codificada por el locus bicoid. *u m#$% es
transportado !acia el oocito y se deposita en la regin ms anterior de ste "unido a la membrana plasmtica por dos
protenas de membrana denominadas *KalloK y Ex!uberance&. 4e !ec!o, las mutantes para este gen no poseen
te/ido ceflico y torcico. Existen otros productos gnicos ubicados en otras regiones del embrin, como gurken en el
extremo anterodorsal o nanos en el extremo posterior "unido a la protena de membrana LsJar, producida por clulas
nodrizas y transportada por microt,bulos&.
La localizacin anterior de bicoid depende de su 27#501 y de otros tres productos gnicos "como *KalloK o
Ex!uberance&. Las mutaciones de stos, producen fenotipos similares a los mutantes en bicoid, pero con menor
gravedad, lo que indica que el morfgeno es bicoid. 4e a! que una definicin funcional de morfgeno sea Ctoda
sustancia que afecta a un carcter fenotpicos de un organismo, pero que revierte toda mutacin que ocurre sobre
otros productos gnicos que afecten a ste fenotipoD
El gen bicoid codifica para un factor de transcripcin cuya regin de unin al 4$% es un homeodominio. Esta
protena difundir !acia el extremo posterior generando un gradiente de concentracin, mientras que la unin a
protena del m#$% de bicoid impide su difusin libre. 4e !ec!o, la microinyeccin de m#$% de bicoid en mutantes
para esto, generan estructuras anteriores en regiones que no deberan.
El gradiente de concentracin de >icoid promueve la transcripcin del gen cigtico hunchback, y determina la regin
de expresin de +unc!bacJ. La mutaciones de este gen "como de algunos otros& generan embriones con una gran
cantidad de !endiduras, por lo que se denominan genes de la hendidura o gap genes.
'.'. Cap genes
+ay dos fuentes de hunchback en el embrin, una es la transcripcin cigtica del gen ba/o control de >icoid "en la
regin anterior& y la otra es el derivado de la madre que se distribuye de manera uniforme. *in embargo, la protena
+unc!bacJ solo se encuentra en la regin anterior, ya que la exclusin de la protena depende del gen materno
nanos. ste codifica un morfgeno que reprime la traduccin del m#$% de hunchback mediante acortamiento de su
cola de poli"%&, as como tambin lo !ace la protena )umilio. La represin tambin depende de secuencias
especficas en la regin 01527# de hunchback denominadas elementos de respuesta a "anos "$#E&.
Ltros genes gap participan en la adquisicin temprana de modelos a lo largo del e/e anteroposterior de los
embriones. *e expresan en regiones espaciales especficas dentro de las dos !oras que siguen a la fecundacin y
antes de la celularizacin del embrin. *on activados por >icoid "y otras protenas, como .audal&.
Los lmites de expresin de las protenas derivadas de stos "como creppel, cnirps o 8iant& refle/an un equilibrio de
activacin y represin en la que intervienen >icoid y +unc!bacJ6
- La concentracin elevada de +unc!bacJ reprimen la transcripcin de krHppel, pero por deba/o de cierta
concentracin umbral act,a como activador transcripcional, lo que establece el lmite anterior de la protena
creppel. La disminucin de la concentracin de +unc!bacJ !asta el lmite de no activar la expresin de
krHppel establece el lmite posterior de sta.
31
- La concentracin de +unc!bacJ y .audal regulan los lmites de la expresin de los genes knirps y giant. %s,
cnirps se expresar en una regin con elevada concentracin de +unc!bacJ y nula de .audal "es decir en el
extremo anterior& y en una regin con muy ba/a concentracin de +unc!bacJ y relativamente alta de .audal
"es decir, en la regin siguiente a creppel&. )or otra parte, 8iant se expresa en una regin con muy ba/a
concentracin de .audal y nula de +unc!bacJ "es decir, en la regin siguiente a cnirps&, y en una regin con
muy ba/a concentracin de .audal y relativamente alta de +unc!bacJ.
.abe destacar que los genes de la brec!a no son morfgenos y son de origen cigtico "excepto, en parte, por
+unc!bacJ&. *uelen denominarse genes de segmentacin.
'.0. *egmentacin
Eedian te la accin combinada de los genes maternos y de los genes gap, los embriones tempranos de 4rosophila
se dividen en amplios dominios de expresin caracterizados por diferentes combinaciones de factores de
transcripcin. stos se expresan en diferentes cantidades y act,an en diversas combinaciones para subdividir el
embrin en otros dominios de desarrollo. )ara esto, activan la transcripcin de tres grupos adicionales de genes, los
genes de la regla par, los genes de polaridad de segmento y los genes selectores.
Los primeros dos tipos se expresan de manera transitoria y act,an para establecer dominios espaciales en los que se
expresan genes selectores. stos se expresarn de manera continua !asta el adulto y son necesarios para
especificar y mantener la identidad regional.
.3.!. )egmentos y parasegmentos
Los segmentos de la mosca adulta fueron definidos a partir del examen visual del organismo, por lo que cada uno
corresponde a una unidad visual, a diferencia de los parasegmentos, que corresponden al dominio espacial real a lo
largo del e/e anteroposterior sobre el cual un con/unto de genes selectores e/erce su funcin generadora de modelos.
En los comienzos del desarrollo, el embrin est dividido en (= parasegmentos con el lmite anterior de cada uno
demarcado por una banda ntida de clulas que expresan un gen de polaridad de segmento denominado engrailed.
.ada parasegmento contiene la porcin posterior de un segmento y la anterior de otro, por lo que podemos imaginar
que cada segmento est dividido a la mitad por la expresin de Engrailed. Esto permite la divisin de cada segmento
en dos compartimientos, uno posterior, y uno anterior.
En los extremos de los embriones se encuentran ciertas protenas especficas, de la familia 7orso.
.3.. Cenes de la regla par
Nncluyen a fushi tara$u, hairy y e*en2skipped. .odifican factores de transcripcin que se expresan en fran/as de
clulas correspondientes a los parasegmentos de la regin central del embrin. .ada producto se expresar en
parasegmentos pares o en parasegmentos impares.
)or e/emplo, el gen e*e "de e*en2skipped& posee sitios de unin en su regin regulatoria para >icoid, +unc!bacJ,
8iant y creppel. Las primeras dos protenas act,an como activadoras "o instructivas&, mientras que las otras dos
como represoras "o permisivas&. En el parasegmento 0 por e/emplo, se nota una gran concentracin de +unc!bacJ, y
una ba/a concentracin de creppel y 8iant, lo que permite la expresin de Eve. En cambio, en el parasegmento '
existe suficiente concentracin de 8iant para in!ibirlo, y en el =, suficiente de creppel para !acerlo. Luego Eve posee
sitios de unin para su autoactivacin.
.abe destacar que en cada banda, los reguladores de cada gen varan ms all que expresen el mismo producto.
.3.3. Cenes de polaridad del segmento
.ada parasegmento se subdividir asimismo por la accin de los genes de polaridad, como Dingless y engrailed, que
son inducidos por protenas como Wus!i 7arazu o Eve. da la celularizacin es completa y comenzar a /ugar la
se-alizacin intercelular. $o es sorprendente que varios genes de polaridad codifiquen protenas de secrecin que
act,an sobre clula vecinas.
Los genes de polaridad funcionan en el desarrollo de patrones de las clulas de cada segmento y la polaridad en un
parasegmento. *u mutacin o eliminacin no cambia el n,mero de los segmentos, sino que invierte su orientacin, y
suelen generar embriones peque-os y no viables.
Engrailed suele cumplir sus funciones sobre la clula ms anterior de cada parasegmento, mientras que :ingless, lo
!ace sobre la clula ms posterior de cada uno de stos. Esta funcin proviene de la unin de cada una de estas
protenas a receptores de membrana. *e cree que las clulas sensibles a :ingless secretan Engrailed y viceversa, lo
que genera una estimulacin mutua.
.3.5. Cenes selectores
*on los genes Ho1 que codifican protenas regulatorias del desarrollo en los dominios parasegmentarios. .ada
banda del e/e anteroposterior expresar una combinacin exclusiva de factores de transcripcin que controlarn el
desarrollo celular.
32
>icoid
Nanos
Knirps
+unc!bacJ
Caudal
Giant Krppel Knirps Giant
*e necesita su expresin continua para determinar las estructuras de las diversas partes del cuerpo. 4os de los
genes selectores ms estudiados son Antennapedia 6Antp7 y 8ltrabithora1 68b179 que controlan el desarrollo del
cuarto y el sexto parasegmento respectivamente.
Las mutaciones en los genes selectores suelen causar !omeosis. Los genes en los que las mutaciones producen
!omeosis, se denominan hometicos, el primer nombre dado a los genes selectores. *e !an descubierto genes
similares en mamferos y otros phyla.
3. Di/erenciacin dorso*entral
La diferenciacin dorsoventral en 4rosophila tambin es controlada por eventos que suceden en la oognesis y
sucede una media !ora despus de la determinacin del e/e anteroposterior. 4e !ec!o, la forma del oocito maduro
predice la orientacin dorsoventral "la determinacin se dice estoc-stica&. El proceso comienza cuando el n,cleo del
oocito temprano se mueve azarosamente !acia lo que ser el lado anterodorsal del !uevo mediante las lminas de
citoesqueleto. Esta prdida de simetra permite la polarizacin de las se-ales que coordinan los e/es dorsoventrales.
$tese que la determinacin es entonces cigtica y no materna.
% mediados de la oogenesis, comienza la produccin de una se-al similar a un factor de crecimiento epidrmico
denominada 8urJen "relativamente inestable&. .omo el n,cleo est asimtricamente posicionado, el lado dorsal del
oocito ser ms rico en 8urJen y sta podr llegar a un receptor del tipo tirosina quinasa, ubicado en la superficie de
las clulas foliculares que rodean al oocito, por lo que solo activar a las clulas foliculares del lado dorsal in!ibiendo
la produccin de una protena denominada )ipe.
sta "que solo se producir en el lado ventral& es una enzima que cataliza la sulfatacin de los glicosaminoglicanos y
activa una se-al que conlleva a una serie de rupturas proteolticas en el espacio perivitelino del lado ventral. %s )ipe
se unir a :indbeutel y a $udel para activar a 8astrulation defective, que activar a *naJe, sta a Easter y sta a
*pftzle. *pftzle es un ligando caracterstico del lado ventral que se une a un receptor transmembrana del oocito
denominado 7oll. 7odas estas proteasas son proteasas de restriccin.
7oll es una proten quinasa que funciona /unto a otras dos protenas denominadas 7ube y )elle. Xuntas fosforilarn a
.actus, permitiendo su degradacin en el proteasoma, y liberndola de su unin a la protena 4orsal. sta es capaz
de ingresar al n,cleo de las clulas del embrin y activar la transcripcin de ciertos genes, que dirigirn la
determinacin del lado ventral "irnicamente&. $tese que el morfgeno "4orsal& es constitutivo, solo que se
encuentra inactivo por accin de .actus.
Este mecanismo parece ser universal en la determinacin del e/e dorsoventral, incluso ms que el de determinacin
del e/e anteroposterior por >icoid y $anos.
La concentracin de 4orsal disminuye gradualmente desde clulas ventrales centrales !acia el lado dorsal, y !acia
las clulas laterales. 4orsal se une a regiones regulatorias del 4$% de manera combinatoria a otros factores de
transcripcin y reprime la transcripcin de ciertos genes, como decapentaplgico, tolloide, gastrulacin corta y
$erknHllt, mientras activa la transcripcin de tDist, snail, single2minded y romboide. La concentracin de 4orsal
diferencia a las clulas dorsales de las ventrales y a las laterales de las centrales. %s, por e/emplo, 7Kist se expresa
ms en las clulas centrales que en las laterales, debido a que 4orsal est ms concentrada en las primeras. Lo
contrario sucede con #omboide. *nail en cambio solo se expresa en las clulas centrales.
Los patrones dorsales y ventrales se deben a 4ecapentaplgico, una protena se-al secretada que solo es
expresada en las clulas dorsales. 4ecapentaplgico "4pp& funciona como un morfgeno que induce el
establecimiento de distintos tipos celulares del ectodermo dorsal, e incluso participa en muc!os procesos de
desarrollo tardo.
4. 2enes 'ometicos
Los genes selectores aparecen en el genoma en dos aglomeraciones, el comple/o bit!orax ">Y5.& y el comple/o
antennapedia "%$75.&. %mbas estn ubicadas en el cromosoma NNN, y controlan el desarrollo de los parasegmentos <5
3 y 35(= respectivamente. *e cree que su separacin se debi a cambios evolutivos, pero que inicialmente ambos
estaban prximos.
El >Y5. contiene tres genes estructurales, 8ltrabithora1, abdominal A y abdominal B que codifican para factores de
transcripcin y poseen extensas secuencias no codificantes decisivas para la regulacin de sus patrones de
expresin individual en los parasegmentos. El %$75., en cambio, contiene cinco genes, labial, proboscipedia,
deformed, se1 combs reduced y antennapedia.
=.(. 4eterminacin de parasegmentos
2tilizando el comple/o bit!orax, vemos que su eliminacin causa que los parasegmentos 35(= se !acen idnticos al
=. *i se eliminan genes puntuales dentro del comple/o, se observan distintas modificaciones de identidad "por
e/emplo, si se de/a solo 2ltrabit!orax, los parasegmentos = y G permanecen inalterados, mientras que el resto se
identifica a G&. Luego de varios estudios al respecto, se determina que los genes de >Y5. deben expresarse a lo largo
del e/e corporal en el orden 8b12AbdA2AbdB "su orden en el genoma& para generar informacin de modelo normal.
7ambin se realizaron ensayos donde se induce la expresin de ciertos genes en parasegmentos que normalmente
no lo expresaran "por e/emplo, si se induce la expresin de 8b1 en los parasegmentos controlados por el comple/o
%$75., los parasegmentos (53 se !acen iguales al G&.
8racias a estas observaciones, se pudo ver una relacin consistente entre los genes selectors6 los genes que se
expresan ms !acia posterior suprimen la accin de los genes que se expresan ms !acia anterior, por lo que la
expresin ectpica "un fenmeno de ganancia de funcin& de un gen en una regin ms anterior causa una
posteriori$acin de la morfologa, mientras que un fenmeno de prdida de funcin de un gen en una regin, causa
una anteriori$acin de la morfologa.
=.'. Eamferos
33
7odos los genes estructurales en %$75. y >Y5. contienen una regin de !omologa6 una ca,a hometica, que
codifica para un motivo de !omeodominio para la interaccin con el 4$%. Los !omlogos en mamfero no tardaron en
aislarse, y se pudo observar que tambin participaban en la regulacin del desarrollo de regiones especficas a lo
largo del e/e anteroposterior.
$o obstante, se pudieron identificar cuatro aglomeraciones de genes +ox "llamadas +ox% b +ox4&. .ada
aglomeracin est en un cromosoma diferente, y los genes !omlogos ubicados en ellas se conocen como
par-logos.
*i los genes +ox de mamfero fueran equivalentes de los de la mosca, entonces se esperara que las mutaciones en
los genes de los mamferos produ/eran transformaciones !ometicas a lo largo del e/e corporal. La tecnologa
transgnica se utiliz para determinar el papel funcional de stos en el control de identidad regional del ratn y las
!iptesis fueron verificadas.
7ambin se !an observado los genes +ox en distintos organismos de phyla muy le/anos evolutivamente. 4e !ec!o,
se nota un aumento en la cantidad de genes a medida que aumenta la comple/idad corporal de los organismos.
+aciendo anlisis mediante bioinformtica se pudo obtener los mapas cladsticos de relacin filogentica entre los
distintos organismos de acuerdo a sus comple/os +ox. 4e !ec!o, esto demuestra la existencia de un precursor de los
artrpodos y los vertebrados.
(. )ompartamentali$acin 1 organog,nesis
.ada uno de los (= parasegmentos es inicialmente idntico, pero se diversifican por la accin de oc!o genes
!ometicos primarios contenidos en los comple/os antes mencionados. stos son activados con poca precisin
mediante la concentracin de protenas codificadas por los genes gap. Luego, sus lmites respondern a la expresin
de los genes de la regla par.
La diversidad del patrn corporal depende del despliegue de los genes !ometicos que actuarn solos o en
combinacin. 7ambin se cree que cuando act,an en combinacin la concentracin de stos tambin influye en la
determinacin de los parasegmentos. )or otro lado se !a propuesto que algunos productos gnicos son dominantes
parcial o completamente sobre otros.
.uando observamos el desarrollo tardo, especialmente el de los discos imaginales, los genes !ometicos parecen
actuar como si sus unidades de funcionamiento no fueran los parasegmentos sino los compartimientos. 4e !ec!o, las
mutaciones en %ntennapedia o Engrailed producen mutaciones segmentadas y no parasegmentadas. )or e/emplo, la
mutacin de Engrailed produce alas anteriorizadas en su lado posterior, lo que afecta a un segmento, pero no a un
parasegmento. 2na posibilidad es que la larva se construya inicialmente en parasegmentos, pero luego de que stos
se subdividan, el plan corporal adulto se especifique en compartimientos segmentados.
Es posible observar la divisin de estos compartimientos celulares en dos debido a la accin de genes !ometicos,
en los que una mitad se activa el gen selector, y esto la diferencia de la otra.
3.(. Lrganognesis del ala
4urante el crecimiento larval algunos de los discos imaginales son subdivididos en una mitad dorsal y otra ventral por
un gen !ometico denominado -pterus "ap&. ste es expresado en los discos imaginales dorsales y es activado
primeramente en el segundo estadio larvario, cuando aparece en unas (<< clulas "la mitad del disco&. 2n lmite
preciso se forma entre las clulas que expresan ap y las que no lo !acen, y es exactamente paralelo al lmite
dorsoventral del segmento. ste lmite est asociado con el patrn de desarrollo, ya que !ay !ileras de clulas con un
destino morfogentico com,n que se desarrollan a lo largo de ambos lados de ste.
*i el gen ap es eliminado, las clulas dorsales se transforman en ventrales. *i es eliminado de solo una clula, y sta
est cerca del lmite, es adentrada en el grupo ventral, pero si no lo est, forma un c,mulo de clulas independiente
que genera un nuevo lmite que se comportar de la misma manera que el normal. Esto prueba que las clulas del
lmite dorsoventral controlan el crecimiento del propio compartimiento. 4e !ec!o, las clulas originadas a partir de
este c,mulo generan una peque-a ala que sale a partir de la superficie del ala de la mosca.
4e aqu vemos que la diferencia de polaridad entre las clulas "dada por la presencia o ausencia de ap& es suficiente
para desencadenar la formacin de un patrn, debido al rec!azo entre las clulas de polaridad diferente, lo que
permite el crecimiento diferencial y autnomo.
La base molecular de cmo esta polarizacin era suficiente para generar un patrn se debi a la con/etura de que
exista alg,n compuesto capaz de transportar informacin posicional "como un morfgeno& que formara un gradiente
cuyo lmite coincida con el lmite de polarizacin de los discos imaginales. Esto induce a pensar la utilidad de un
elemento escalar "la concentracin de la se-al& y un elemento vectorial "el sentido de difusin de la misma& en la
determinacin de la identidad celular.
*e encontr que en el disco imaginal del ala !ay cuatro poblaciones de clulas delimitadas por los cuadrantes al
dividir el disco en anterior5posterior y dorsal5ventral. Es Engrailed quien determina el carcter anterior5posterior y es
gpterus quien determina el dorso5ventral. El gen engrailed asegura que todas las clulas posteriores expresen el gen
hedgehog, cuyo producto es una protena secretada que puede ser detectada por las clulas que no lo expresan "es
decir, las que no poseen Engrailed, las clulas anteriores&. +edge!og migra muy lentamente, y slo lo !ace dos o tres
dimetros celulares. Las clulas que lo detectan, activan la expresin del gen decapentaplgico "solo si no expresa
+!& que tambin codifica una protena secretada que puede funcionar como un morfgeno de largo alcance,
formando una imagen difusional especular !acia uno u otro lado del lmite de separacin de polaridad.
.uando la concentracin de 4pp llega a un valor determinado, se pueden producir cambios morfolgicos
importantes, como por e/emplo la generacin de venas en el ala, o una mayor curvatura.
Tema (: 'iolo#)a Molecular de *r#anela
34
1. "ntroduccin
Es all que la mayor parte de la informacin gnica almacenada en la clula se encuentra en el 4$% nuclear, otras
organelas presentes en todas las clulas eucariotas tambin poseen su propio genoma, que ms all de ser
notablemente ms peque-o que el nuclear, cumple funciones esenciales en su funcionamiento. Euc!as
enfermedades !eredables, fundamentalmente relacionadas con defectos metablicos, estn ntimamente conectadas
a disfunciones de los procesos moleculares que ocurren en estas organelas.
2. #aterial gen,tico de mitocondrias
Las mitocondrias son organelas eucariotas involucradas en la mayora de las vas metablicas, y en la generacin de
la mayora del %7) celular mediante el sistema de fosforilacin oxidativa "LY)+L*&. #equieren la contribucin de
dos genomas separados fsicamente, ya que la mayora de sus protenas estn codificadas en el n,cleo y deben ser
importadas y procesadas? por otra parte, el genoma mitocondrial contribuye solo en un peque-o set d epolipptidos
esenciales para la funcionalidad del LY)+L*.
Las mitocondrias derivan de O5proteobacterias que ingresaron endosimbiticamente a una clula ancestral eucariota
!ace dos mil millones de a-os. 4urante la evolucin, la mayora de los genes de sta fueron transferidos a los
cromosomas nucleares. Los modos de organizar y expresar los genes mitocondriales es muy diferente en diferentes
p!yla, ms all que el contenido y la funcin est muy bien conservados, conteniendo los r#$%s, los t#$%s y los
m#$%s codificantes para distintas subunidades de miembros del LY)+L*.
'.(. .aractersticas
El genoma mitocondrial posee ciertas caractersticas diferentes al nuclear, entre ellas6
a& Las clulas son poliploides con respecto al mt4$%, ya que cada clula contiene cientos de mitocondrias y cada
una puede contener varias copias del mt4$%. 7odas stas son idnticas "homoplasmia& a excepcin de la ocurrencia
de mutaciones que darn origen a la heteroplasmia. Las mitocondrias se distribuirn al azar en una divisin celular.
.omo una consecuencia de esta poliploida, es com,n encontrar un Cefecto umbralD por el cual un fenotipo
relacionado con mutaciones del 4$% mitocondrial slo ser visible si el n,mero de molculas mutadas es mayor al
G<5M<B del total.
b& El genoma mitocondrial es !eredado de la madre, ya que las pocas mitocondrias paternas que ingresan al oocito
son eliminadas activamente por ubiquitinacin. 4urante la oogneis, el mt4$% sufre un cuello de botella, por el cual
solo una peque-a parte de las molculas se amplifican y transmiten a la descendencia.
c& La tasa evolutiva del mt4$% es ms rpida que la del genoma nuclear, ya que ste est menos protegido por
protenas, est asociada fsicamente con la membrana mitocondrial interna "donde se generan especies reactivas del
oxgeno& y no parece poseer mecanismos de reparacin muy eficientes. La acumulacin de mutaciones somticas
parece /ugar un papel central en el enve/ecimiento !umano.
d& Los genes mitocondriales son traducidos utilizando un cdigo gentico diferente al universal. )or e/emplo, 28%
especifica triptfano, %2%, %2. y %22 son codones de iniciacin y %8% y %88 son los codones de terminacin.
'.'. Estructura
La estructura, el contenido gentico y la organizacin del mt4$% estn altamente conservadas en mamferos6 es una
molcula de doble !ebra, circular, cerrada, de aproximadamente (G,G Jb y representa entre un <,3 y un (B del
contenido total de 4$%. Las dos cadenas del mt4$% pueden distinguirse debido a su contenido diferentes de 8 y 7,
lo que !ace que exista una cadena pesada "+ strand& y una liviana "L strand&. $ormalmente, se organiza como una
estructura superenrrollada. En levaduras, el mt4$% se organiza en estructura supramoleculares llamadas nucleoides
que contienen tres o cuatro molculas de 4$% y unos veinte polipptidos que los asocia a membranas.
2na gran proporcin de las molculas de mt4$% en una clula activa metablicamente, contiene una estructura de
triple !lice denominada loop de despla$amiento 642loop7, en el cual un fragmento !ebra pesada "de unos [<< nt&
permanece !ibridada a la !ebra liviana parental. Es el segmento no codificante y regulatorio ms importante, adems
de ser el ms variable en secuencia y tama-o entre diferentes especies.
'.0. .ontenido
El mt4$% posee 0[ genes, dos r#$%s "('* y (G*&, veintids t#$%s, y (0 m#$%s que sern siete del comple/o N,
cuatro del comple/o NNN y dos del comple/o 9. Estos genes estn distribuidos asimtricamente, y la mayora son
codificados por la !ebra pesada, mientras que la liviana solo codifica oc!o t#$%s y un m#$%. )or otro lado, la
organizacin de estos genes es muy compacta, con todas las secuencias codificantes contiguas o separadas por un
par de bases, incluso presentando solapamientos. 4e !ec!o, en muc!os casos, parte de los codones de terminacin
no estn codificados en el mt4$% sino que son generados por la poliadenilacin posterior.
*e encuentran solo dos regiones no codificantes que funcionan como regiones regulatorias, el 45loop "que contiene
el origen de replicacin para la !ebra pesada L+, los promotores para la transcripcin de ambas !ebras, y las
secuencias .*> y 7%*& y un segmento de unos treinta nucletidos de largo que contiene el origen de replicacin
para la !ebra liviana "LL&.
3. Procesos gen,ticos bsicos
0.(. 7ranscripcin y procesamiento del #$%
3.!.!. 0ranscripcin
%mbas !ebras del mt4$% son transcritas asimtricamente. La mayora de los productos de m#$% maduros
generados, corresponden a genes ,nicos, mientras que solo dos contienen dos genes que se superponen.
Los r#$%s son ms peque-os que los bacterianos o los citoplasmticos, estn metilados y contienen una corta cola
de poli"%& de !asta diez residuos. Los t#$% tambin son ms peque-os y poseen ciertas diferencias estructurales,
como ser la carencia de muc!os nucletidos conservados e incluso de su brazo 4U2. $o obstante, la gran mayora
puede adoptar su conformacin en forma de trbol, y su estabilizacin requiere menos interacciones. La regin del
anticodn y la secuencia ..% estn conservadas.
35
Los m#$%s, por su parte, comienzan
directamente en el codn de iniciacin o poseen
regiones 27# muy cortas. .ontienen una cola de
poli"%& de unos 33 nt inmediatamente despus
del codn de terminacin, y no se presentan
se-ales de poliadenilacin o capping.
La sntesis de #$% en las mitocondrias !umanas
comienza en tres puntos de iniciacin distintos
localizados en el 45loop, uno para la !ebra liviana
y dos para la !ebra pesada "+( y +'&.
La !ebra pesada es transcripta por dos unidades
solapantes. 2na comienza en +( y termina dentro
del gen que codifica para el t#$%
Leu
, por lo que
codifica para ambas subunidades del ribosoma, y
para el t#$%
9al
, mientras que el otro comienza en
+' y cubre casi toda la !ebra pesada. La
frecuencia de transcripcin del primer transcrito
es veinte veces mayor que la del segundo, lo que
genera un balance r#$%@m#$% modificable. La
!ebra liviana da origen a un policistrn.
Los dos promotores principales en mamferos se
denominan +*) y L*), y se componen de un
elemento promotor "con una secuencia consenso
de (3 bp alrededor de los puntos de iniciacin& y un en!ancer "con una secuencia consenso de '[ bp& centrado en
5'3, donde se unir el factor de transcripcin mt7W%. +', en cambio, posee un promotor que no contiene el en!ancer.
La existencia de solo un punto de iniciacin para cada !ebra nos permite pensar que +( puede originar tanto el
m#$% como el r#$%, y la regulacin de sus proporciones se debe al nivel de terminacin. sta se lleva a cabo por un
factor proteico denominado m7E#W que se une a una secuencia tridecamrica, y que puede actuar en ambas !ebras
y en ambas direcciones.
3.!.. 3odificaciones posttranscripcionales
Los transcritos primarios policistrnicos originarn sus productos maduros luego de su ruptura endonucleoltica, que
sucede en puntos marcados por los genes codificantes para t#$%s, luego de plegarse en su forma de trbol
caracterstica. En los pocos casos donde no existen t#$%s flanqueando m#$%s, probablemente se desarrollen
estructuras en forma de trbol en sus extremos.
El procesamiento del #$% requiere al menos cuatro enzimas6
a& 2na endonucleasa en 31, caracterizada como la #$asa ), una ribonucleoprotena que tambin act,a en el nucleolo
b& 2na endonucleasa en 01, todava no identificada
c& 2na %7)".7)&6t#$% nucleotidil transferasa que adicione el extremo ..%
d& 2na poli"%& polimerasa mitocondrial, que parece actuar inmediatamente despus del corte endonucleoltico.
3.!.3. 3a>uinaria en$im-tica
La transcripcin del mt4$% requiere una #$% polimerasa especfica y tres factores de transcripcin6 mt7W%, 7W>(E
y 7W>'E, adems del m7E#W para la terminacin. La polimerasa !umana "mt#$% )ol& es !omloga a la polimerasa
de fagos. mt7W% fue purificado y caracterizado como una protena de '3 J4a que puede desenrollar y doblar al 4$%,
lo que permite la actividad de la polimerasa. Los sitios de unin para ste se encuentran en el 45loop y es mayor para
el L*) que para el +*). En el ,ltimo tiempo se !a identificado un !omlogo !umano al mt7W( denominado 7W>(E
"!omlogo a una r#$% metiltransferasa&, y posteriormente, tambin se !all un factor anlogo, el 7W>'E que es ms
de cien veces ms activo, pero menos activo como metiltransferasa. *e !a propuesto la existencia de factores de
regulacin adicionales, y !ay evidencia fuerte de que as es.
El factor de terminacin "m7E#W& posee tres cierres de leucina pero se une al 4$% como un monmero que es
capaz de doblar al 4$% e interaccionar con la polimerasa para detenerla, ya que se observa que puede unirse al 4$%
y no detener la transcripcin ba/o ciertas condiciones, lo que indicara que su unin no es suficiente para detener la
polimerizacin. *e cree que tambin participara en la iniciacin de la trnascripcin.
0.'. #eplicacin
La replicacin "seg,n el mtodo del despla$amiento de hebra& sucede en la matriz mitocondrial independientemente
de la fase del ciclo celular y de la replicacin nuclear. Es un mecanismo de desplazamiento asincrnico que involucra
dos orgenes de replicacin distintos. La sntesis comienza en L+ y procede a lo largo de la !ebra liviana, para
generar una !ebra pesada, !asta alcanzar LL, donde se la desplazar, y proseguir la replicacin en la otra direccin
para generar la !ebra liviana.
*e !a propuesto otro mtodo de replicacin, el llamado mtodo de las hebras h%bridas, que propone que el 4$%
mitocondrial se replica simtrica y bidireccionalmente a partir de varios orgenes de replicacin, comenzando
unidireccionalmente en el 45loop y estabilizndose por #$%s cortos. *e desarrollar el mtodo de desplazamiento de
!ebra por ser el ms estudiado.
3..!. (niciacin
La iniciacin de la replicacin requiere un corto primer originado por el procesamiento del transcrito de la !ebra
liviana, lo que demuestra la ntima relacin replicacin5transcripcin. )or otra parte, tambin se nota la participacin
36
de las secuencias .*> "formar un primer adecuado& y 7%* "que participan en la detencin de la !ebra de 4$%
sintetizada en el 45loop&.
La iniciacin de la replicacin ocurre en cuatro pasos6
a& El inicio de la transcripcin de la !ebra liviana por la mt#$% polimerasa
b& La !ibridacin del #$% con una regin del 4$% upstream del L+ que contiene las secuencias de los .*>s
c& La maquinaria de procesamiento del #$% cortar convenientemente el transcrito, generando el primer maduro para
la replicacin
d& La 4$% polimerasa mitocondrial comienza la sntesis de la !ebra pesada extendiendo el primer. sta es la 4$%
pol R, constituida por una subunidad O "con las actividades polimerasa y exonucleasa 0131& y una subunidad Q "que
le otorga especificidad y procesividad&. Es sintetizada en el citoplasma e ingresa a la mitocondria por una secuencia
se-al $ terminal que ser eliminada. )osee dominios de funcin desconocida a,n.
Luego, la sntesis podr detenerse en los 7%* "generando la estructura de triple !ebra del 45loop& o podr continuar
para replicar el genoma entero.
La iniciacin de la replicacin de la !ebra liviana ocurre en una regin peque-a que asume una estructura en
!orquilla cuando est monocatenaria. La iniciacin requiere la accin de una primasa especfica capaz de generar un
primer de #$% corto. Esta replicacin asimtrica de ambas !ebras permite que la sntesis sea continua, y pueda ser
completada en una !ora. Luego de la sntesis de ambas !ebras, las molculas de mt4$% !i/as sern separadas,
completadas, ligadas y cerradas en una molcula bicatenaria cerrada y con el nivel de superenrrollamiento necesario.
3... +eplisoma
La 4$% polimerasa requiere para su funcionamiento6
a& 2na !elicasa mitocondrial, identificada como 7KinJle
b& 7opoisomerasas de tipo N y NN, como mt7L)LN, !omloga a la nuclear
c& )rotenas de unin a cadenas simples, mt**>, de unos (G J4a que se presentan como !omotetrmeros
d& 2na 4$% primasa
e& 2na 4$% ligasa similar a la ligasa NNN
f& 2n #$%sa que elimine los primers, identificada como #$%sa +(
7ambin quedan muc!as dudas sobre la funcin principal del mt7W%, y se !a propuesto su participacin tanto en la
estructuracin del material gentico "funcionando como una !istona& y en la reparacin del da-o en el mt4$%.
0.0. 7raduccin
.asi todos los componentes del sistema de traduccin mitocondrial son distintos a sus anlogos citoslicos y
bacterianos. Los ribosomas mitocondriales se ubican en la matriz mitocondrial y normalmente no sobrepasan los cien
por organela. )oseen un contenido ba/o de #$% y por lo tanto, un menor coeficiente de sedimentacin "33*&,
componindose solo de dos subunidades "0A* y 'M*&, a pesar de que las otras, presentes en bacterias, son
simplemente mdulos de stas. )or otra parte, su ba/o contenido de #$% es compensado por un mayor contenido de
protenas, lo que les otorga una masa similar a los otros tipos de ribosomas.
El aparato de traduccin es inusualmente peque-o. Los r#$% y t#$% son ms cortos que sus anlogos citoslicos, y
el comienzo de la traduccin representa un misterio importante, ya que los m#$%s son cortos y no poseen una regin
31527# de tama-o capaz para unir al ribosoma tal como lo !ace en la traduccin citoslica, adems de carecer de
estructuras terminales "como el capuc!n 31& que sirva en el reconocimiento. Esto puede ser la causa de la ba/a
eficiencia traduccional, lo que obliga a la mitocondria a contar con un pool abundante de m#$% que asegura un
correcto nivel de traduccin.
La subunidad peque-a del ribosoma posee la !abilidad de unirse al m#$% independientemente de secuencia, y sin
la actividad de un gran n,mero de factores de iniciacin o de t#$% gua. La interaccin principal entre la subunidad
peque-a y el m#$% ocurre en un segmento de entre 0< y M< nucletidos, pero se necesitan aproximadamente =<<
para que la interaccin sea suficientemente fuerte como para que el ribosoma no se separe del transcrito. Esto
explicara la existencia de transcrito bicistrnicos, que de otra manera no alcanzaran la longitud mnima para ser
transcritos.
El ,nico factor de iniciacin encontrado es el mtNW5', una 87)asa de accin similar al NW5' bacteriano6 se une a la
subunidad menor del ribosoma, facilita la unin del t#$%
fEet
, y la !idrlisis de su 87) permite su liberacin y la unin
de la subunidad ribosmica mayor.
*e purificaron tres factores de elongacin, mtEW57u, mtEW57s y mtEW58, de funcionalidad y accin similar a los
bacterianos !omlogos.
4. %egulacin de la e0presin del mtD!
La biognesis mitocondrial es un fenmeno comple/o, que requiere la participacin y coordinacin de los genomas
nuclear y mitocondrial. La biognesis del LY)+L* involucra por s solo ms de cien genes, la mayora codificados en
el n,cleo.
La proliferacin mitocondrial requiere la regulacin coordinada de los genes de ambos tipos de genoma. 4os tipos de
factores nucleares seran los participantes principales del control de este proceso, los acti*adores "factores de
transcripcin como $#W5(@', *p5(, etc& y los coacti*adores "interaccionan con los activadores para regular la
transcripcin en respuesta a las se-ales fisiolgicas, tales como )#. y )8.5(&. stos controlan la expresin de
ciertas subunidades de los comple/os respiratorios, protenas de transporte transmembrana, grupos !emo, protenas
de los ribosomas mitocondriales, y la maquinaria replicativa y transcripcional, entre otras.
La diferenciacin mitocondrial, en cambio, utiliza mecanismos posttranscripcionales, como el cambio de la estabilidad
del #$% y la eficiencia de la traduccin.
=.(. #egulacin de la transcripcin
*e ven cambios en los niveles de la transcripcin de acuerdo a fases del desarrollo, enve/ecimiento, cambios en las
demandas energticas y estado !ormonal. *e !a postulado al mt7W% como el componente central en esta regulacin.
37
Es all de la dependencia que existe entre la mitocondria y el genoma nuclear, existe cierto grado de autonoma de
la regulacin en la transcripcin del mt4$%. En ausencia de la expresin gnica nuclear, la sntesis y maduracin de
m#$%s mitocondriales pueden ser mantenidas durante largos periodos de tiempo, y ciertas se-ales externas "como
!ormonas, o ba/os niveles de %7)& pueden inducir cambios en la transcripcin mitocondrial. 4e !ec!o, el
!ipotiroidismo induce a una disminucin de la concentracin de todos los m#$%s, cambiando la relacin
m#$%@r#$%. 4e !ec!o, un receptor nuclear puede unirse a elementos de respuesta del mt4$% y estimular la
transcripcin mitocondrial.
La tasa de inicio de la transcripcin en los dos promotores alternativos de la !ebra pesada determinara la relacin
m#$%@r#$%, determinante para la sntesis proteica. %dems, el procesamiento de los policistrones tambin funciona
como un punto regulatorio, ya que controlar la estabilidad final de los #$% luego de ser producidos.
=.'. #egulacin de la replicacin
La expresin gnica de mt4$% puede regularse a nivel de la dosis gnica, es decir, la relacin entre la cantidad de
copias del mt4$% y el 4$% total de la clula, lo que es caracterstico de cada te/ido. *in embargo, estos niveles
pueden cambiar en un tipo celular determinado, y funcionar como una !erramienta regulatoria. La existencia de
factores limitantes que determinan el nivel de mt4$% apoya este !ec!o, y se !a demostrado que pueden funcionar
como tales los nuclesidos o las protenas metablicas implicadas.
La replicacin presenta diversos puntos de control, como ser6
a& La sntesis de los primers de #$%
b& La accin del m7W%
c& La decisin si la replicacin se detiene en los 7%* o contin,a en todo el genoma, y otros.
(. 2enoma de organelas *egetales
3.(. Eitocondrias
El genoma mitocondrial vegetal es ms grande y comple/o que el animal, ya que llega a contar con '3<< Jb. .onsiste
de molculas subgenmicas que varan en forma y tama-o, e incluyen numerosas secuencias repetitivas y distintos
marcos abiertos de lectura. El set de genes no difiere con los de otros eucariotas. Las secuencias no codificantes
pueden llegar a representar !asta el [<B del mt4$% vegetal.
*e nota la presencia de varios promotores en un mismo gen, distintos modos de splicing, modificaciones en los
extremos 01 y 31 y varias copias de los mismos genes en el genoma. %dems, los transcritos suelen tener regiones
27# 31 y 01 cuyo tama-o es especfico de te/ido. )or otra parte, el control de la expresin gnica es totalmente
controlado por el n,cleo.
Los factores de transcripcin presentes son similares al mt7W% y no son requeridos para la unin de la polimerasa a
los promotores, sino que solo parecen aumentar su especificidad "se !allaron ciertos factores de transcripcin, como
el pG0, altamente !omlogos a las subunidades ^&. 4e !ec!o, se encontr una segunda #$% polimerasa, tambin
codificada por el genoma nuclear y que tambin se encuentra presente en cloroplastos.
Es interesante observar que un fenmeno importante de regulacin nuclear de la expresin de genes mitocondriales
se da por rearreglos del 4$% mediante recombinacin, lo que altera la dosis gnica relativa.
Ltro mecanismo regulatorio es la determinacin de la estabilidad del #$% mediante los procesos de maduracin. Los
cambios estructurales posttranscripcionales incluyen6
a& La estructura secundaria similar a t#$% presente en los extremos 31 de los m#$%
b& #epeticiones invertidas que forman !orquillas en el extremo 01 de los m#$%
c& La poliadenilacin de los extremos 01 de m#$% "entre (< y (A residuos& es una se-al de degradacin
d& La edicin sustitutiva "de . por 2 y viceversa& tanto en regiones codificantes como en regiones regulatorias, tanto
de m#$%s, r#$%s y t#$%s.
e& *plicing, tanto de tipo cis como de tipo trans
3.'. .loroplastos
El material gentico de cloroplastos es similar estructuralmente al de mitocondrias, circular, doble !ebra, poliploide y
superenrrollado. *in embargo es notablemente ms grande "entre M< y G<< Jb&, y posee una gran cantidad de
regiones no codificantes y regulatorias. )or otra parte, as como suceda en mitocondrias, una gran parte de su
maquinaria proteica es importada del citosol.
Tema 1+: 'io#nei de or#anela y
direccionamiento de prote)na

1. "ntroduccin
2na clula de mamfero puede tener !asta diez mil tipos diferentes de protenas, cada una de las cuales debe estar
ubicada en la membrana o el compartimiento celular indicado. El proceso de orientacin del polipptido recin
sintetizado es decisivo para la organizacin y el funcionamiento de las clulas eucariotas. )ocas protenas se
sintetizan por el 4$% de mitocondrias y cloroplastos, mientras que la mayora de estas organelas y todas las otras,
as como tambin las de la membrana plasmtica, son codificadas por el 4$% nuclear, son sintetizadas en el citosol y
se distribuyen !acia sus destinos correctos a travs de se-ales clasificatorias y diversos fenmenos de clasificacin.
El primer acontecimiento tiene lugar durante el crecimiento de las cadenas polipeptdicas, ya que algunas contienen
"en su extremo amino terminal& una se-al especfica "o secuencia se?al& que dirige los ribosomas !acia la membrana
externa de organelas "por e/emplo, el retculo endoplsmico&, donde se completa la sntesis proteica. Ltras protenas,
38
son sintetizadas completamente en los ribosomas citoslicos libres y las protenas liberadas podrn migrar !acia su
destino debido a su secuencia se-al, que ser reconocida por protenas receptoras de las organelas.
2. Sntesis de protenas mitocondriales 1 de cloroplastos
Estas organelas crecen por la incorporacin de protenas y lpidos durante la interfase del ciclo celular. % medida
que stas crecen de tama-o, una o ms organelas !i/as se desprenden por brote. Las mitocondrias y los cloroplastos
contienen m,ltiples membranas y espacios limitados por membranas, por lo que la orientacin de algunas protenas
requiere la accin consecutiva de dos secuencias orientadoras y dos sistemas de receptores unidos a membrana,
uno para dirigirla !acia su compartimiento o membrana correspondiente, y el otro para ubicarla dentro de la organela.
La captacin de protenas es un proceso que requiere energa y que depende de protenas integrales de membrana.
'.(. .aptacin5orientacin de protenas mitocondriales
*e !a demostrado que la mayor parte de las protenas importadas !acia la mitocondria se originan como
precursores, con aminocidos en su extremo amino5terminal que no estn presentes en la protena madura, y que
comprenden una o ms secuencias orientadoras que dirigen la protena !acia su destino correcto, y son eliminadas
luego. %unque las secuencias de se-al no son idnticas, comparten motivos comunes, lo que !ace posible la
existencia y utilidad de los receptores. Las secuencias de las protenas mitocondriales que se orientan !acia la matriz,
son ricas en aminocidos bsicos e !idroxilados, mientras que son bastante carentes en aminocidos cidos.
.!.!. +uta de captacin
En el citosol, los precursores solubles de las protenas mitocondriales se fi/an a una o ms c!aperonas que utilizan la
energa del %7) para mantenerlas en un estado no plegado. )untualmente las c!aperonas +sc[< y E*W "factor
estimulador de la importacin mitocondrial& impiden el plegamiento incorrecto o la agregacin de las protenas
precursoras mitocondriales. *i las protenas se plegasen previamente a ingresar a la mitocondria, slo ingresar la
secuencia se-al y ser cortada, mientras que la protena atascada "o intermediario de translocacin& volver al
citosol.
Las protenas unidas a E*W se unirn a un con/unto de receptores de membrana externa llamados 7om0[ y 7om[<,
que las transferirn a otro con/unto de receptores "7om '< y 7om ''& que liberarn el E*W. Las protenas unidas a
+sc[<, en cambio, entregar la protena directamente a los receptores de tipo 7om '< y 7om ''.
stos estn vinculados a 7om =<, el verdadero canal de la membrana externa que forma un canal transmembranoso
con un dimetro suficiente "',3 nm& como para permitir el paso de una cada polipeptdica no plegada.
.uando las protenas entran en la matriz mitocondrial se fi/an a la +sc[< matricial, una c!aperona similar a la +sc[<
citoslica, que est unida a la superficie matricial de la membrana mitocondrial interna, cerca de los canales que la
atraviesan, por la protena )%E. Esto impide la agregacin o precipitacin proteica y el plegamiento prematuro, lo que
es de particular importancia para las subunidades de los comple/os multiproteicos que requieren todas las restantes
para plegarse correctamente. La energa liberada por la !idrlisis del %7) tambin impulsar la translocacin de las
protenas !acia la matriz. )oco despus que la protena llegue a la matriz, una proteasa extrae su secuencia
orientadora. %lgunas protenas importadas pueden plegarse !asta su conformacin sin ayuda adicional, mientras que
la que no lo !acen, necesitan de la +scG<, una c!aperona matricial.
.abe destacar que este proceso ocurre en sectores donde las membranas mitocondriales externas e internas estn
muy prximas, lo que supone que los comple/os canales de ambas "7om =< en la m.m.e. y 7im ==@([@'0 en la m.m.i.&
estn conectados de alguna maneraen sitios de contacto, de los que !abra unos mil por mitocondria.
.!.. Captacin y consumo de energ%a
La importacin de protenas mitocondriales necesitan tres aportes de energa6 en el citosol, fuerza protn motriz a
travs de la membrana interna y en la matriz. .abe destacar que la fuerza protn motriz no es necesaria para la unin
de las protenas a los receptores en la membrana externa. *e cree que funciona arrastrando a la protena !acia
dentro mediante su secuencia se-al cargada, como si se tratase de una electroforesis. La unin a +sp[< matricial,
tambin funciona en el arrastre !acia el interior.
.!.3. +edireccin proteica a compartimientos submitocondriales
Las protenas podrn ir !acia el espacio intermembranoso, o las membranas interna o externa. )ara esto, la protena
podr requerir una segunda secuencia se-al.
a& )rotenas del espacio intermembrana. )ortan dos secuencias se-al. %lgunas entran completamente en la matriz y
luego, ser transportada por un receptor@canal transmembrana. Ltras, utilizan su segunda secuencia se-al como
secuencia de detencin de transferencia que bloquea la translocacin del extremo carboxilo a travs de la membrana
interna. El intermediario anclado a la membrana se ale/a dentro de la membrana interna, y una proteasa del espacio
intermembrana libera la protena. 7ambin existen protenas sintetizadas en el citosol que ingresan al espacio
intermembrana por porinas de la m.m.e. "como la )[<&, cambias de conformacin en ste y quedan recluidas en l.
b& )rotenas de la membrana externa e interna. Las protenas que deben anclarse en la m.m.e. poseen una
secuencia !idrfoba inmediatamente luego de la secuencia se-al, lo que impide que la protena siga transfirindose
!acia la matriz y la ancla en la membrana, sin eliminarse luego? posteriormente funcionar la protena transmembrana
*%E que la ensamblar correctamente. Las protenas de la m.m.i., en cambio, primero se importan !acia el espacio
matricial, en donde se elimina la secuencia de orientacin !acia la matriz, y se incorporan de alguna manera a,n
desconocida.
'.'. .aptacin5orientacin proteica en cloroplastos
El proceso comparte varias caractersticas con la importacin mitocondrial, como por e/emplo, las secuencias se-al
en su extremo amino terminal, los puntos de contacto entre las membranas externas e internas, y la necesidad
energtica.
..!. .rientacin hacia el estroma
Es muy similar a la orientacin !acia la matriz mitocondrial, donde act,a una c!aperona citoslica, receptores de
membrana "7oc MG&, canales de transporte "7oc [3, unido a un regulador de apertura, la 87)asa 7oc0=&, c!aperonas
39
del estroma "+sc[<&, proteasas especficas y c!aperonas de generacin de comple/os "+scG<&. $o obstante, la
mayora de las protenas transmembrana involucradas "unas oc!o o nueve& no son !omlogas a las mitocondriales.
$tese que en este caso, no existe un gradiente de protones capaz de impulsar el ingreso proteico.
... .rientacin hacia el tilacoide
Las protenas cuyo destino es la luz del tilacoide, necesitan la accin de dos secuencias se-al. *e !an descubierto
cuatro sistemas de importacin distintos, cada uno de los cuales transporta un con/unto diferente de protenas desde
el estroma !acia el tilacoide.
2no de ellos "el que transporta, por e/emplo, a la plastocianina& emplea un mecanismo similar al que transloca las
protenas no plegadas !acia el retculo endoplsmico "vase ms adelante&, y funciona incluso en ausencia de un
gradiente de p+.
Ltro mecanismo implica el plegamiento en el estroma y la fi/acin de cofactores redox, para que luego la protena de
membrana tilacoide +ef(<G ayude en su translocacin gracias al gradiente de p+.
7ambin se notan mecanismos de ingreso espontneo y de unin a protenas transportadoras.
3. Sntesis de protenas para los pero0isomas
% diferencia de las mitocondrias y los cloroplastos, los peroxisomas carecen de 4$% y ribosomas y estn limitados
por una sola membrana, por lo que todas las protenas peroxismicas son codificadas por agentes nucleares,
sintetizadas en el citosol e incorporadas en los peroxisomas preexistentes, lo que los !ace aumentar de tama-o y
dividirse.
0.(. Eecanismo de ingreso
Las protenas peroxismicas pueden plegarse en el citosol antes de ingresar a ellos y tambin requerir %7) para
!acerlo. La secuencia se-al es la secuencia *cL o una emparentada, en el extremo carboxilo terminal. 4espus de
que los monmeros de las protenas se asocian, la secuencia se-al se une a una protena receptora soluble del
citosol llamada )7*(#, que se fi/a a una protena receptora )ex(=p ubicada en la membrana peroxismica, y
permitir el ingreso proteico sin separar su secuencia se-al.
Ltras protenas de la matriz peroxismica se sintetizan como precursores con una secuencia amino terminal de unos
'G aminocidos, y se fi/arn a una receptora soluble en el citosol llamada )7*'# que tambin interacciona con
)ex(=p, aunque en este caso, la secuencia s se escindir luego del ingreso.
4. Sntesis de protenas secretables
Estas protenas deben atravesar un sistema de secrecin compuesto por el retculo endoplsmico, el aparato de
8olgi y los lisosomas. )ara !acerlo, deben translocarse a travs de la membrana del #E.
=.(. 7ranslocacin !acia la luz del #E
La sntesis de la mayor parte de las protenas de secrecin comienza en los ribosomas libres del citosol, y traducir
los primeros (G50< residuos, que sern los que dirigirn el ribosoma a la membrana del E# e iniciar el transporte del
polipptido en crecimiento a travs de ella. La secuencia se-al suele tener aminocidos de carga positiva seguidos
por un segmento continuo de entre G y (' aminocidos !idrfobos. El centro !idrfobo es indispensable, ya que
forman un sitio de fi/acin decisivo para la interaccin con las protenas receptoras de la membrana del E#.
)ara que la protena se localice en la luz del E#, la unin con su membrana debe suceder antes de que se sinteticen
[< aminocidos. Esto indica que el transporte es cotraduccional, aunque algunas protenas peque-as pueden
ingresar posttraduccionalmente de manera anloga al ingreso a mitocondrias.
5.!.!. 3a>uinaria
Los dos componentes fundamentales en el reconocimiento de las secuencias se-al en las membranas del E# son la
part%cula de reconocimiento de se?al "*#)& y el receptor de )+<. La *#) se une transitoriamente a la secuencia
se-al para el E# en una protena naciente, a la subunidad mayor del ribosoma y al receptor de *#) en la membrana
del E#. La *#) es una ribonucleoprotena compuesta por seis polipptidos un #$% de 0<< nt. 2na de las protenas
de la *#) ")3=& puede unirse qumicamente a secuencias de se-al para el E#, y contiene una gran cantidad de
residuos de metionina aglomerados, cuyas cadenas laterales !idrfobas protruyen !acia afuera y se unen a las
cadenas laterales !idrfobas del centro de una secuencia de se-al para el E#. Ltras protenas, )A y A(=, interact,an
con el ribosoma, mientras que )GM y )[' son necesarias para la translocacin de la protena. Esto indica que la *#)
tambin impide la sntesis de una protena completa en ausencia de membranas de E#. La subunidad restante ")(A&
funciona como nexo entre )3= y las restantes.
El comple/o de *#) con la cadena polipeptdica y el ribosoma se unir al receptor de *#) en la membrana. ste
contiene dos subunidades, una Q transmembrana "0<< %%& y una O perifrica "G=< %%&. La *#) y su receptor slo
inician la transferencia de la cadena naciente a travs de la membrana del E#, luego se disocian de ella, y sta es
transferida a un con/unto de protenas transmembrana llamadas translocn. ste permitir que la cadena pase
directamente a los centros del translocn, un canal delimitado por protenas dentro de la membrana, evitando que
quede expuesta al citosol, para que no se pliegue !asta llegar al lumen del E#.
4os protenas que forman parte del translocn son 7#%E "una protena que pasa oc!o veces por la membrana y que
puede unirse a la secuencia se-al&y *ecG(p "una protena que pasa diez veces por la membrana, y est unida a
*ecG(Q y *ecG(R formando el comple,o )ec@!, que se une a la subunidad G<* de los ribosomas&. El translocn est
limitado por tres o cuatro comple/os *ecG( en una disposicin aproximadamente pentagonal y con un poro central de
unos ' nm.
5.!.. Costo energtico
40
La subunidad )3= es una 87)asa, as como tambin lo es la subunidad O del *#). La unin al 87) promuvela
formacin del comple/o ribosoma5cadena naciente5*#)5receptor, mientras que su !idrlisis, disocia el comple/o y
forma el comple/o cadena naciente5translocn. El *#) y su receptor se reciclarn para reiniciar el proceso.
=.'. Nnsercin de protenas de membrana en el #E
4urante la va secretora, la topologa de las protenas transmembrana se mantiene, por lo que la orientacin de las
protenas se establecer durante su ad!esin a la membrana del E#, y se mantendr constante. %lgunas de stas
poseen solo un segmento que atraviesa la membrana "generalmente mediante !lices O de !asta '3 aminocidos&, y
se denominan de paso simple, teniendo, la mayora, su extremo amino terminal !idrfilo en la cara luminal. Euc!as
protenas son de paso m&ltiple, e incluso se encuentran muc!as ancladas a la membrana mediante fosfatidilinositol.
*ea como sea, su insercin depende de secuencias topognicas especficas de !asta '3 aminocidos que aseguran
la orientacin adecuada.
5..!. <rote%nas de paso &nico
Las protenas de paso ,nico, suelen poseer una secuencia se-al y una secuencia de detencin de transferencia y
fi,acin a la membrana que se convertir en la !lice O que la anclar. sta detiene la translocacin a travs del
translocn y la expulsin adicional de la cadena naciente !acia la luz del E#, sino que permanece en el traslocn
!asta que termine su sntesis y luego se mover lateralmente a travs de las protenas laterales del translocn para
anclarse en la bicapa fosfolipdica de la membrana. Esto de/ar el extremo amino terminal en la cara luminal, y el
extremo carboxilo, en la cara citoslica.
*i se busca una orientacin opuesta, tambin se recurre a una ,nica secuencia de se?al2fi,acin !idrfoba que
funciona tanto como secuencia se-al como secuencia de fi/acin. sta no ser cortada sino que permanecer en el
translocn mientras el extremo carboxilo terminal es expulsado !acia la luz del E# por medio de transporte
cotraduccional. Esta secuencia se-al se ubica cerca del extremo amino terminal, ya que se incorpora al translocn en
direccin opuesta "en forma de 2&, de/ando el extremo amino terminal !acia el lado citoslico, evitando que ingrese al
#E. El resto de la protena se sintetiza normalmente, de/ando el extremo carboxilo terminal en el lado luminal. Luego,
la protena se desplazar lateralmente, y quedar fi/ada a la membrana por la propia secuencia se-al.
Esto llama la atencin sobre una polaridad de la secuencia se-al. *e comprueba que el segmento flanqueante a sta
que porta la carga positiva neta mayor permanece siempre en la cara citoslica de la membrana. 7ambin se not
que un aumento del tama-o de la secuencia !idrofbica suele generar orientaciones luminales para el extremo
luminal, y viceversa.
5... <rote%nas de paso m&ltiple
*e cree que cada !lice O que atraviesa la membrana en las protenas de paso m,ltiple act,a como secuencia
topognica. El primer segmento iniciar la insercin y formar el comple/o con la *#), el receptor y el ribosoma, para
dar origen al comple/o cadena naciente5ribosoma5translocn inicial, y se insertar como una asa en !orquilla con el
extremo amino terminal citoslico. La cadena crecer y pasar por el translocn !asta que se forme la segunda !lice
O !idrfoba que actuar como secuencia de detencin y fi/acin. $o obstante, la insercin de las !lices 0 y =
"anlogas a las ( y '& no utiliza al *#) ni a su receptor, sino que crecern en el citosol y se incorporarn /untas al
translocn luego de que ste se vace por movimiento lateral de las !lices ( y ', y as sucesivamente.
(. Desnaturali$acin proteica
Existen diversos mtodos de desnaturalizacin proteica para el ingreso de protenas plegadas en el citosol mediante
maquinarias de membrana.
En peroxisomas, se notan tres tipos de mecanismos6
a& El del golpe de poder, en el que las c!aperonas luminales se unen a las protenas que atraviesan la membrana, y
mediante !idrlisis de %7) la C/alanD !acia el interior, induciendo su paso.
b& El del trinquete broKniano, en el que la mera unin de las c!aperonas a la protena que atraviesa la membrana es
suficiente para /alarla, simplemente por su movimiento broKniano en la matriz luminal.
c& El de la desnaturalizacin no /alada, en el que existen secuencias dentro de la protena que interaccionan
activamente con los canales de paso, lo que induce el paso espontneo de la protena, y permite que la
desnaturalizacin de la regin que a,n no atraves el canal sea ms sencilla.
En mitocondrias y cloroplastos, se notan dos mecanismos6
a& El desplegado general de las protenas, mediante urea o c!aperonas citoslicas, previo al ingreso
b& El desplegado local de las protenas, que solo requerir la desnaturalizacin de la secuencia se-al y que
continuar a medida que la protena ingrese en la organela.
+. Parte e0perimental
G.(. *ecuencias se-al
En la siguiente tabla se resumen las secuencias se-al ms comunes para distintos transportes proteicos6
Destino 3bicacin Longitud )aractersticas
$,cleo
"importacin&
Nnterna 3 %%
2n cl,ster de 3 %% bsicos o dos peque-os cl,steres bsicos
separados por (< %%
$,cleo
"exportacin&
Nnterna (( %% *ecuencia rica en leucinas
Eitocondria %mino term. '<5=< %%
*uelen poseer 053 argininas o lisinas no consecutivas, serinas y
treoninas "ntese su anfipaticidad&
.loroplasto %mino term. 5
Euy variables. #icas en serina, treonina, %% !idrofbicos y con
pocos residuos de glutmico y asprtico.
)eroxisoma .arbox. 0 %% *cL
41
7erm.
#etculo
endoplsmico
%mino term. 4ominio bsico seguido por G5(' %% !idrofbicos
Nnterna (G50< %% #esiduos !idrofbicos
G.'. Etodos de estudio del transporte proteico
Existen un mtodo fundamental para el estudio del transporte proteico6 el de los sistemas libres de clulas.
@..!. #studio de la captacin posttraduccional de las prote%nas mitocondriales
*e basa en la purificacin de protenas mitocondriales desplegadas que a,n contengan su secuencia se-al.
4ividiendo la muestra en dos alcuotas y se adiciona a una de ellas una suspensin de mitocondrias energizadas.
7ratando ambas con tripsina, eliminando esta protena luego, y !aciendo un extracto del producto obtenido, se
observa la presencia de protenas que fueron adicionadas con mitocondrias, y la ausencia de las que no lo fueron, lo
que indicara que fueron secuestradas dentro de las mitocondrias, lo que las !izo resistentes a la tripsina.
@... #studio de la tasa de importacin
La tcnica recin descrita puede ser utilizada para monitorear la importacin de protenas a mitocondrias, pero
tambin a cloroplastos, otras organelas e incluso a tilacoides. *i a esta tcnica se le suma alg,n tipo de tcnica de
dosa/e proteico, como por e/emplo un :estern blotting, una q).#, etc., se puede utilizar para analizar la tasa de
transporte de protenas al interior de estos orgnulos.
Tema 11: ,ilenciamiento #nico
1. Silenciamiento g,nico 1 4iologa #olecular
El silenciamiento gnico fue descubierto como una novedosa tcnica de regulacin de la expresin gnica a
principios de la dcada de los 1A<. Es all de que fundamento es sencillo, como as tambin lo es su modo de
operar, la revolucin ms importante asociada a l fue la de la redefinicin de muc!os conceptos clsicos de la
>iologa Eolecular que se !aban mantenido inalterados !asta el momento. Esto sucedi ya que el silenciamiento
funciona a partir de molculas peque-as de #$% que no son codificantes, pero s funcionales.
*e define como transcriptoma al con/unto completo de transcritos producidos por un genoma en un tipo de clula
especfico, en un momento determinado. $otablemente, la concepcin antigua del transcriptoma se refera
,nicamente a m#$%s, t#$%s y r#$%s, lo que tuvo que ampliarse a los #$%s no codificantes.
*e define como reguloma al con/unto de los componentes regulatorios en una clula, los cuales pueden presentar
regulacin cruzada. %ntiguamente, se crea que los ,nicos elementos regulatorios eran protenas, actualmente, se
debieron incorporar #$%s no codificantes en estos circuitos.
*e define como interactoma al con /unto de interacciones moleculares que ocurren dentro de un tipo celular
especfica en un momento determinado. *iguiendo lo propuesto por el reguloma, antiguamente las ,nicas
combinaciones de interaccin posibles eran entre protenas y entre una protena y una secuencia de 4$%.
%ctualmente, se debe extender a relaciones entre protenas como #$%s no codificantes "nc#$%s&, entre stos y el
4$%, y entre nc#$%s.
(.(. El mundo del #$%
% partir de esto, podemos clasificar el #$% en dos grandes grupos, el +"A codificante, que slo estar compuesto
por los m#$%s transcritos por la #$% )ol NN, y el +"A no codificante. ste incluye dos grupos funcionalmente
diferentes, el #$% transcripcional "compuesto por el r#$% y el t#$%& y el #$% regulatorio "compuesto por los #$%s
peque-os, como los #$% interferentes bsi#$%b, los micro#$% bmi#$%b, los #$% peque-os nucleares bsn#$%b y
los peque-os nucleolares bsno#$%b&.
(.'. El mundo de los #$% no codificantes
)odemos clasificar a los #$% no codificantes en tres grandes grupos, de acuerdo a su tama-o, que tiene una
relacin ntima con su funcionalidad celular6
a& Eedianos y grandes, mayores a 0<< nt. *irven en regulaciones de procesos celulares generales, como la impronta
genmica, la inactivacin del cromosoma Y, la metilacin del 4$%, etc. 7ambin pueden participar de la generacin
de otras clases de #$%.
b& )eque-os, entre '3 y 0<< nt. *irven en la regulacin de expresin de genes particulares, aunque tambin pueden
funcionar en la sntesis de telmeros, en la estructuracin de la cromatina, etc.
c& 4iminutos, entre (M y '3 nt. *irven en el silenciamiento gnico y la interferencia por #$%.
2. Silenciamiento g,nico
El silenciamiento gnico es un proceso que conduce a la disminucin o no produccin de un transcrito de un gen
determinado, lo que nota su gran importancia en la regulacin de la expresin gnica. Es un fenmeno exclusivo de
eucariotas y probablemente !aya surgido en defensa del ataque de agentes de modificacin genmica, como virus o
transposones. %yuda a bloquear los #$%s peligrosos o da-inos generados por stos, tanto a nivel transcripcional
como posttranscripcional. Es un proceso altamente dependiente de !omologa, y se !a observado una respuesta
sistmica en organismos comple/os, que permite la respuesta generalizada frente al invasor.
)uede producirse por dos tipos de nc#$%s6
a& Los #$%s peque-os de interferencia "si#$%&, que se presentan en forma de doble cadena y se generan a partir de
#$%s de doble cadena de origen exgeno. *irven para silenciar genes por cliva/e del m#$% con secuencias
exactamente complementarias exclusivamente, aunque tambin pueden afectar su expresin mediante la
modificacin del 4$%.
42
b& Los micro #$%s "mi#$%&, se presentan en forma de cadena simple y son codificados endgenamente por los
genomas de casi todo organismo multicelular. )oseen funciones especficas en el desarrollo, y no act,an en la
defensa.
'.(. 7ipos de silenciamiento gnico
2n gen se puede silenciar de varias maneras. $o obstante, al referirnos a silenciamiento gnico, generalmente se
!ace referencia al dependiente de la interaccin entre #$%s especializados y miembros del genoma o el
transcriptoma.
)odemos clasificar al silenciamiento, entonces, en un silenciamiento dependiente de homolog%a 6H4C)7 y un
silenciamiento por efecto de posicin. Es el primero el que representa un cambio radical en la concepcin actual de la
interactmica, y puede darse por dos mtodos6
a& 2n silenciamiento gnico posttranscripcional ")78*&, que degradar m#$% mediante una interaccin secuencia5
especfica. $tese que esto no afecta la velocidad de transcripcin del gen silenciado.
b& 2n silenciamiento gnico transcripcional "78*&, que modificar la cromatina para impedir o disminuir la incidencia
de la transcripcin. *uele funcionar por metilacin puntual del 4$%, generalmente en regiones promotoras, aunque
tambin puede !acerlo en regiones codificantes.
3. Silenciamiento g,nico posttranscripcional
0.(. 8eneralidades
Wue descubierto a principios de la dcada de (AA<, casi azarosamente, tanto en plantas "petunias& como en animales
"C. elegans&, aunque despus se extendi a casi todo eucariota "exceptuando algunas levaduras, como ).
cere*isiae&. *e observ que la incorporacin exgena de genes determinados al citosol celular, induca a la supresin
del producto de ste, en vez de aumentar su produccin, tal como se esperaba. Este fenmeno fue llamado
cosupresin, ya que los estudios genticos realizados luego mostraban que en el interior celular no exista "o
disminua en cantidad& el gen incorporado. Esto suceda fundamentalmente cuando se incorporaban molculas de
#$% codificantes para el gen, pero de doble !ebra "sense y antisense&, y no si slo se incorporaba el #$% codificante
en cadena simple.
Estudios posteriores, permitieron determinar que el )78* era un mtodo utilizado por numerosos organismos para
defenderse de agentes nocivos externos que buscasen alterar su metabolismo. 4e !ec!o, muc!os virus generan
#$%s de doble !ebra que incorporaran productos extra a sus clulas blanco, o incluso #$%s con ciertas mutaciones
puntuales que afectaran la expresin gnica. 7ambin existen mecanismos similares que involucran transgenes y
#$%s aberrantes "con modificaciones no usuales& que producen el mismo efecto.
El )78*, actualmente, es entendido como un sistema de control de la cantidad de copias de un gen. *e !an visto
casos en los que la supresin de la expresin de gen puede realizarse fcilmente aumentando su transcripcin, lo
que permite un fenmeno de )78* intracelular, independiente de factores exgenos "lo mismo es aplicables a
fenmenos de 78*&. Esto sucede porque las caractersticas imprescindibles para que ocurra )78* son
notablemente generales6
a& El gen debe expresarse a un nivel mnimo y con un estado epigentico adecuado
b& El n,mero de copias del gen en el citosol debe ser lo suficientemente elevada para que el efecto tenga lugar
c& Las secuencias entre el regulador y el gen regulado deben ser altamente !omlogas
0.'. )roceso
El )78* se asocia con fenmenos de metilacin del 4$% y degradacin especfica del #$%. )ara realizarlo, se
llevan a cabo tres etapas6 la iniciacin, que requiere la generacin de #$%s reguladores, la e,ecucin propiamente
dic!a y la propagacin de la se-al "de manera celular y@o sistmica&.
3..!. (niciacin
La iniciacin requiere la generacin de un si#$% de doble !ebra "y entre '< y '3 nt&, que posea dos o tres
nucletidos sobresalientes en sus extremos 01. stos no solo seran los encargados de realizar el silenciamiento
propiamente dic!o "por degradacin del #$%&, sino que tambin podran participar en la metilacin del 4$% nuclear y
en la propagacin sistmica de la se-al, funcionando como se-ales difusibles.
*u sntesis requiere la intervencin de una #$%sa especfica de #$% doble !ebra, que los degraden en fragmentos
con la longitud y estructura adecuada. 4e !ec!o, a principios de la dcada, se identific la #$%sa 4icer "4cr, una
#$%sa de tipo NNN& en 4. melanogaster, como la encargada en esta degradacin y se encontraron diversas !omlogas
en otros organismos.
$o obstante, el requerimiento inicial para que el proceso suceda, es la existencia de #$% de doble !ebra. Euc!as
veces, los agentes nocivos ingresan a la clula como #$% simple !ebra, por lo que se requiere la actividad de +"A
polimerasas +"A2dependientes "#4#)& para generar la !ebra faltante y permitir la accin de 4cr. stas no act,an
sobre los m#$% propios de la clula blanco, ya que son impedidas por las protenas de unin al capuc!n 31 ".>)& y
las de unin a la cola de poli5% ")%>)&. La carencia de cualquiera de ellos es suficiente para la unin de las #4#),
as como tambin lo es una molcula de si#$% de simple !ebra exactamente complementaria a una regin del
transcrito "aunque est unido a .)> y )%>)&, que funcione como primer. $o todos los organismo presentan #4#)s.
La encima 4cr funciona como una regla molecular, que corta #$% de doble !ebra a una distancia fi/a del extremo.
Esto permite que se generen fragmentos de unos '' nt, con extremos 01 sobresalientes y extremos 31 unidos a
fosfato. Es dependiente de %7).
Luego de la sntesis del #$% peque-o doble !ebra, stos se desnaturalizarn y tratarn de unirse a un m#$%
citoslico. *i pueden !acerlo, se desencadenar la respuesta degradativa, si no, sern degradados como cualquier
m#$% extra-o. %lternativamente, pueden ser transferidos "como doble !ebra& directamente al comple,o de
silenciamiento inducido por +"A 6+()C7 que contiene una endorribonucleasa diferente a 4cr, y permitir la unin a
m#$%s de secuencia complementaria perfecta "y su degradacin&.
3... #n$imas implicadas
43
2na de las enzimas implicadas en el proceso de )78* es la 4cr, de unos '<<< %%, y que posee !omlogos en otros
organismos "como .%W5( o c('+=&. *e compone bsicamente de cinco subunidades, dos que codifican para la
actividad #$%sa, una "4E%+& para la actividad !elicasa, una para la actividad de unin al #$% doble !ebra "ds>& y
una para la unin a #$% en su extremo 01 ")%h, de )iKi5%rgonauta5hKille&.
)or otra parte, tambin encontramos las endonucleasas de tipo %rgonauta "%8L5(&, como ser #4E5( y `4E5'.
stas solo contienen el dominio )%h y un dominio #$%sa de tipo + que tambin cumple una funcin deslizante
")iKi&.
El comple/o #N*. se purific !ace poco tiempo, debido a la dificultad que representaba su copurificacin con si#$%.
Es una %7)asa que contienen a factores de iniciacin de la traduccin "eNW'.( y eNW'.'&, y que puede contener, en
algunos organismos, subunidades similares a %rgonauta. Es un comple/o de unos 0<< J4a en !umanos
"considerando al si#$%&.
3..3. #,ecucin
El comple/o #N*. es el encargado de cortar el m#$% blanco. )ara esto requiere de una actividad desenrrollante "del
si#$% que une& y deslizante, para encontrar la secuencia !omloga en el m#$%. .uando esto sucede, corta el
dmero de #$%s en su punto medio, por lo que tambin cumple funciones de endonucleasa. Es una %7)asa, que
requiere de energa para el desenrrollado inicial del si#$%. $o se conoce su mecanismo de accin, y se !a propuesto
que une el si#$% doble !ebra, desenrollando una parte del comple/o, aunque tambin puede funcionar mediante la
unin de solo una !ebra del si#$% y la eliminacin de la otra, in,til.
3..5. Amplificacin
*e !a propuesto que el comple/o #N*. "y anlogos& son ,tiles en la amplificacin de la se-al. )ara esto, luego de su
unin al m#$%, no solo puede actuar como endonucleasa sino que puede facilitar la unin de #4#)s, que utilizarn
al si#$% como primer, y generarn un nuevo #$% doble !ebra que podr ser degradado por 4cr.

4. Silenciamiento g,nico transcripcional
El silenciamiento gnico transcripcional permite la regulacin de la expresin gnica por in!ibicin de la transcripcin
debido a las modificaciones de las estructuras cromosmicas, como por e/emplo, la metilacin del 4$% "en
promotores y secuencias codificantes& y los cambios estructurales de la cromatina. % diferencia de otros mtodos de
accin similar, no !ay requerimientos estrictos de secuencia, aunque suele suceder en secuencias simtricas .8 o
.$8, debido a que esto permite la epigenesis.
La metilacin del 4$% se produce por las 4$% metilasas "E7asas& y no es el ,nico mtodo silenciador de genes,
sino que tambin se produce por desacetilacin y metilacin de las !istonas. .abe destacar que tambin pueden
suceder otras modificaciones !istnicas, que tendrn distintas funciones de acuerdo al organismo en que ocurran, la
!istona modificada, etc. 4e aqu que exista un cdigo histnico, que relacione la modificacin covalente de cada tipo
de !istona con su funcin regulatoria.
4e !ec!o, la metilacin del 4$% est ntimamente emparentada con la presencia de !eterocromatina, y adems con
la epigenesis, ya que los patrones de metilacin son !eredables y pueden implicar comportamientos gnicos
parecidos y constantes durante el desarrollo, la diferenciacin y la proliferacin celular. La modificacin de estos
patrones por agentes nocivos externos "vricos, por e/emplo& es una de las causas por la que el silenciamiento gnico
controlado fue indispensable en eucariotas.
=.(. 78* en plantas
2no de los blancos ms usuales en donde se observa 78* es en plantas. 4e !ec!o, el proceso me/or estudiado, es
el 78* vegetal. )uede ocurrir por dos mtodos6
a& 2n transcrito de )ol NN o )ol NNN es cortado por la accin de %go=. % l se unir #dr', una #4#), que generar un
fragmento de #$% doble !ebra, que ser fragmentado en si#$%s por 4.L0, y metilado en sus extremos 015L+ por la
enzima +en(. stos si#$%s doble !ebra puede interactuar con !istonas desacetilasas, !istona metilasas y E7asas
para regular la expresin gnica.
b& 2n transcrito de )ol NN o )ol NNN es sustrato de #dr' para !acer un fragmento doble !ebra, y lo corta. ste ser el
sustrato de 4.L0 y +en(, lo que generar los si#$%s doble !ebra, que se unirn a %go= "en una funcin
completamente distinta&, que ser la gua para lo metilacin y desacetilacin.
(. .tros procesos relacionados
3.(. *ilenciamiento gnico como un efecto de posicin
Es el silenciamiento gnico dependiente de posicin. %s, se nota que ciertos genes cercanos a telmeros o
centrmeros estn silenciados y para esto no requieren mecanismos moleculares como los descritos anteriormente.
Esto se debe a que la funcionalidad celular de estas regiones y su importancia en el ciclo celular tiendan a alterar su
estructura cromosmica, lo que tambin afectar a genes cercanos. )untualmente, cerca de estos sectores, la
cromatina est notablemente empaquetada por modificaciones qumicas de las !istonas, y esto silencia a los genes
cercanos inevitablemente.
3.'. Eicro5#$%s
Los micro#$%s, a diferencia de los si#$%s, son endgenos. Estn codificados en genes del genoma de la propia
clula y son utilizados en procesos de control de la expresin puntual de ciertos procesos celulares importantes,
como el desarrollo, la proliferacin celular y su diferenciacin.
Los genes sern transcriptos por la #$% )ol NN, que generar los llamados pri2mi+"A, estructuras de #$% de unos
M< nt en forma de tallo5burbu/a. stos sern escindidos por la endonucleasa 4ros!a, que generar pre2mi+"A, que
se caracterizan por una estructura en forma de tallo burbu/a, donde el tallo no presenta !omologa perfecta, sino que
suele tener nucletidos no apareados en una !ebra, la que usualmente termina de forma protruyente.
44
Los )re5mi#$% saldrn del n,cleo por la e1portina 3, y sern sustrato de 4cr, generando un mi#$% d,plex que
pierde su burbu/a. Luego, se ensamblar al #N*. tal como lo !acan los si#$%s, y se utilizarn tal como stos. *i se
encuentra un m#$% de !omologa perfecta, inducir su ruptura y si se encuentra un m#$% de !omologa imperfecta,
simplemente evitar la progresin traduccional. .ul de estas dos funciones es la que sucede en la clula no solo
depender de la !omologa, sino tambin del organismo del que se trate.
Tema 12: 'ioin!orm-tica
1. "ntroduccin
La bioinform-tica es la utilizacin de !erramientas informticas en la resolucin de problemas biolgicos. .laro que
esta definicin es notablemente amplia y abarcativa. 4e !ec!o, la bioinformtica se utiliza para almacenar
informacin gentica, para buscarla especficamente, para analizarla con detalle y para compararla de acuerdo a la
informacin precisada.
2. 4ases de datos
Las bases de datos bioinformticas almacenan datos biolgicos de diversas ndoles. 4e !ec!o, existen bases de
datos que almacenan informacin sobre genes, secuencias proteicas, estructuras tridimensionales de protenas,
patrones de evolucin proteica, etc. *uelen utilizarse para interrelacionar secuencias conocidas, predecir
interacciones, funciones y evolucin entre protenas, etc.
En la actualidad existen numerosas bases de datos en el mundo, como por e/emplo 8en>anJ "de la $N+, $ational
Nnstitute of +ealt!&, EE>L "European Eolecular >iology Lab 4atabase&, )4> ")rotein 4atabase&, )#L*N7E, etc. *us
reas de incumbencia son notablemente amplias e incluyen desde perfiles taxonmicos, genomas completos,
estructura cristalogrfica de protenas, relacin entre estructuras primarias y terciarias, dominios proteicos, protenas
de funcin u origen especficas, glicoprotenas, etc.
stas se solan comercializar en forma de .4s aunque actualmente se presentan casi exclusivamente en Nnternet, lo
que facilita la utilizacin de los motores de b,squeda.
3. #otores de b5s&ueda
El softKare fundamental utilizado en las bases de datos biolgicas es el motor de b,squeda >last, que no solo
permite b,squedas directas, sino tambin b,squedas comparativas, deteccin de motivos proteicos, e incluso
prediccin de estructuracin de secuencias y generacin de rboles filogenticos. $o obstante, esta amplitud genera
redundancia de resultados, y esto es ms notable a medida que el n,mero de datos almacenados aumenta. 4e
!ec!o, se observa un crecimiento casi exponencial del n,mero de secuencias almacenadas en las bases de datos en
los ,ltimos quince a-os.
% continuacin se presentarn las bases tericas de algunos mtodos predictivos utilizados por >last en la b,squeda
y comparacin de secuencias.
0.(. )rediccin del .arcter +idroptico por el Etodo de cyte y 4oolittle
Es utilizado en la evaluacin y comparacin de los caracteres !idrofbicos e !idroflicos a lo largo de una cadena
polipeptdica, generando una escala terica de hidropat%a. )ara esto, se requiere modelizar un solvente terico ideal
con las mismas cualidades fisicoqumicas que el interior de una protena modelo, y comparar la energa libre de la
cadena lateral del %% en agua y en dic!o solvente. 7ambin se puede utilizar un valor ms emprico, basado en el
porcenta/e de interiorizacin de los residuos laterales de los %% en la estructura terciaria de la protena.
.ualquiera sea el mtodo utilizado, se puede utilizar para predecir la !idropata de secuencias de !asta ((
aminocidos, lo que permite asignar perfiles de exposicin, interaccin o ubicacin de las distintas regiones proteicas.
0.'. )rediccin de estructuras secundarias por el Etodo de .!ou y Wasman
*e basa en la asignacin de un carcter terico a cada aminocido seg,n su capacidad de formar o imposibilitar la
formacin de estructuras secundarias tpicas. %s, se utiliza un rango entre < y ', donde si el valor es mayor a uno, el
aminocido en cuestin es notablemente beneficioso para la estructura secundaria en cuestin, mientras que si es
menor a uno, es obstaculizante. )or e/emplo, el valor terico para la generacin de !lices O del glutmico es (,30
pero el de la glicina es <,30.
*e dice que se podr formar una estructura secundaria determinada cuando existan no menos de = residuos
formadores ") i (& adyacentes, el valor promedio de la regin sea mayor a uno y tambin mayor a la previsin de que
se forme otra estructura secundaria distinta. 7ambin se puede predecir la terminacin de la estructura cuando se
encuentren al menos cuatro aminocidos obstaculizantes contiguos.
0.0. )rediccin de la determinacin antignica por el Etodo de +opp y :oods
*e considera que un determinante antignico de una protena es una regin perteneciente a un mismo sector de la
cadena polipeptdica, completamente externo y que permite la interaccin con protenas de reconocimiento.
8eneralmente constan de seis aminocidos. 4e aqu que buscando en una secuencia la regin de G aminocidos de
mayor promedio de !idrofilicidad, es casi seguro que dic!a secuencia sea un determinante antignico.
4. !lineamiento de secuencias
2na de las utilidades ms comunes de las bases de datos es la de encontrar alineamientos de secuencias proteicas
entre dos o ms cadenas, ya sea de manera global o local.
=.(. %lineamientos simples
*e denomina alineamiento simple a la comparacin de dos secuencias para buscar la me/or ubicacin de stas para
que la !omologa sea mayor. )ara esto, se puede recurrir a la utilizacin de gaps, es decir, !uecos que me/oren el
alineamiento.
45
2sualmente, la comparacin se realiza mediante scores, es decir, Cpunta/esD asignados a un par de aminocidos o
nucletidos de acuerdo a su similitud, siendo altos para la identidad y pudiendo ser menores y ms variables para la
similaridad. 4e !ec!o, se !an construido matrices de sustitucin que da una estimacin de la relacin entre
similaridades fisicoqumicas entre los aminocidos. 7ambin pueden realizarse b,squedas locales de fragmentos de
secuencia. Los resultados obtenidos son todos aquellos que superen un determinado score.
5.!.!. 3atrices de sustitucin <A3 o de 4ayhoff
*e obtuvieron a partir del anlisis filogentico previo de familias de protenas, promediando la sustitucin de
aminocidos por otros, lo que mostr una ntima relacin entre la sustitucin de aminocidos conservada con las
propiedades fisicoqumicas similares de stos. Los scores prefi/ados estn directamente relacionados con las
probabilidades de reemplazado de cada aminocido luego de (G< mutaciones en una secuencia de (<< residuos. $o
es adecuada para la comparacin de secuencias muy diferentes.
5.!.. 3atrices de tipo B'.)83 6o de sustitucin de blo>ues7
Estas no se basan en un modelo evolutivo, sino en la probabilidad de aparicin de aminocidos en regiones
conservadas, comparando la presencia de un aminocido en relacin a su entorno de aminocidos. Esto permite
notar !omologas leves y regionales.
=.'. %lineamientos m,ltiples
*e denomina alineamiento m,ltiple a la comparacin de ms de dos secuencias. *uele utilizarse para obtener
familias de protenas "y por ende, datos filogenticos&, y para medir la relacin entre stas. 7ambin funciona global o
localmente, y posee una serie de algoritmos diferentes que aumentan la efectividad del proceso.
Esto permite, luego de obtener un grupo de secuencias alineadas similares, la comparacin de otras secuencias o
grupos de secuencias con stos, lo que permite obtener una visin general de los requerimientos imprescindibles que
definen a una familia.
(. !lgoritmo de 4asic Local !lignment Searc' Tool 64L!ST7
El algoritmo >last se basa en una unidad fundamental "+*)&. sta se define como dos fragmentos de score mayor al
umbral establecido y cuya longitud responde a un alineamiento de score localmente mximo. )ara obtenerlas,
selecciona diversas Dords del input, es decir, secuencias cortas "de entre 0 y 3 aminocidos& que sern las
secuencias a buscar inicialmente. Luego, al encontrarlas, extenderlas lateralmente de manera bidireccional,
encontrando la longitud de fragmento que permita un score mximo.
La frecuencia esperada de que una secuencia determinada sea azarosamente obtenida, depende del tama-o de la
base de datos, de la longitud de la secuencia, y del grado de probabilidad prefi/ado. Eatemticamente, la frecuencia
esperada de ocurrencia del +*) "E& se puede calcular como
2
ln .
( )
. . .
Q
S
P
Q P
E L n e
Q

= , donde ` es la probabilidad
de que no exista acierto "<,A3, <,AA, <,AAA, etc.& y ) la de que s exista "<,<3, <,<(, <,<<( respectivamente&, L es la
longitud de la secuencia, n el tama-o de la base de datos y * es el score prefi/ado para analizar probabilidades.
+. Sistemtica
4e ms est decir que la bioinformtica representa una !erramienta extremadamente ,til para el estudio de la
diversidad y las relaciones entre organismos "sistemtica&. 4e !ec!o, las !erramientas bioinformticas se utilizan en
la clasificacin, nomenclatura e identificacin de organismos y macromolculas.
G.(. 7ipos de mtodos sistemticos
Los mtodos sistemticos utilizados pueden basarse en algoritmos o en criterios de optimizacin. Los primeros
comparan parmetros puntuales en todos los datos cargados generan o rboles de relaciones, que pueden incluir
distancias y agrupamientos entre datos. Los mtodos basados en criterios de optimizacin, en cambio, generan
distintas relaciones alternativas y asignan un score que les permitirn decidir cul es la me/or. $o es posible utilizar
este mtodo con ms de '< datos.
Los datos utilizados en estas comparaciones incluyen6 a& *itios de restriccin, es decir, la ausencia o presencia de
caracteres en una localizacin especfica, b& %lozimas, donde cada alelo conforma un carcter, y se analiza su
presencia o ausencia, c& 4atos gnicos, poco potentes pero muy confiables, d& 4atos de secuencia, que correlaciona
caracteres y posiciones.
G.'. +omologa
*e define como homolog%a a la similitud debida a la !erencia a partir de un ancestro com,n, pero que se infiere a
partir de la similitud y no en sentido contrario. Es diferente a la homoplasia, que es la similitud debida a la
convergencia o el paralelismo, y es una causa de error com,n en exmenes filogenticos.
4e acuerdo al origen de la !omologa se clasifica en6 a& Lrtologa "proviene de la especiacin&, b& )araloga
"proviene de duplicacin gnica&, c& Yenologa "proviene de transferencia lateral& y d& )lerologa "proviene de
evolucin concertada&. 4e ms est decir que estas comparaciones deben realizarse sobre genes ortlogos.
G.0. Wilogenia y secuencia
Las molculas evolucionan en proporcin directa al tiempo, lo que es notable y medible mediante las diferencias
entre secuencias !omlogas, lo que requiere la aplicacin de tcnicas de alineamiento m,ltiple. Luego se utilizarn
mtodos de inferencia y se revalidarn los resultados estadsticamente.
@.3.!. )ustitucin de nucletidos
*iguiendo los postulados de la Estadstica clsica, la probabilidad de sustituir un nucletido cualquiera por otro es
igual a ( )
4. .
1/ 4 1/ 4.
t
P e

= , donde O "cuyas unidades son (@jtk&, se mide para cada sistema. Este modelo se
denomina de un parmetro o de Iukes y Cantor.
46
cimura desarroll un mtodo alternativo que tiene en cuenta dos parmetros, la probabilidad de cambio y las
diferencias entre las probabilidades de que el cambio se una transicin o una transversin. %s, asegura que
( )
( )
( )
2. . 4. .
1/ 4 1/ 4. 1/ 2.
t t
P e e
+
= + para una transicin y ( )
4. .
1/ 4 1/ 4.
t
P e

= para una transversin, donde
O es un parmetro transicional y Q, uno transversional.
G.=. .riterios de comparacin
*on dos6 a& Exima parsimonia "se basa en preferir el rbol que representa menor cantidad de cambios evolutivos& y
b& Exima verosimilitud "se basa en preferir el rbol que maximice la probabilidad de !aber producido las secuencias
actuales ba/o un modelo de evolucin previamente propuesto&.
Tema 13: Tcnica aplicada en el etudio de la
trancripcin
1. "ntroduccin
La regulacin transcripcional es la ms importante dentro de las regulaciones celulares de la expresin gnica. 4e
a! que el estudio de diversos parmetros puntuales de los fenmenos transcripcionales es bsico para el estudio de
la regulacin de la expresin gnica.
2. Estudio de la *elocidad de transcripcin
El mtodo ms simple y directo para medir velocidades de transcripcin es exponer las clulas durante un perodo de
tiempo breve "unos 3 minutos& a un precursor de #$% marcado y luego determinar la cantidad de #$% nuclear
formado por medio de su !ibridacin con 4$% clonado. $o es ,til en animales, sino que suele aplicarse en clulas de
cultivo.
El mtodo ms utilizado, en cambio, es el an-lisis de las cadenas nacientes o run2on. ste consiste en aislar n,cleos
de clulas y la incorporacin directa de ribonuclesidos trifosfato radiactivo, que sern agregados en las cadenas de
#$% nacientes para obtener #$% muy marcado. Luego de un corto periodo de incubacin, se medir la radiactividad
total, y se agregar al medio c4$% del gen en estudio, que !ibridar con los #$%s complementarios sintetizados.
)osteriormente, se separarn los !bridos doble !ebra, de los #$% monocatenarios, y se medir la radiacin
generada por los primeros. El cociente entre la radiacin de ste y la total da la velocidad de transcripcin relativa del
gen en estudio con respecto a todos los genes expresados por la clula en un momento determinado.
3. Determinacin del sitio de inicio de la transcripcin
La aplicacin de las transcripciones nacientes in vivo tambin sirve en el mapeo aproximado del sitio de inicio de la
transcripcin. *upongamos un gen que posee una determinada cantidad de fragmentos de restriccin. El sitio de
iniciacin de la transcripcin quedar en uno de estos fragmentos, y probablemente el sitio de terminacin, en otro.
Earcando brevemente con alg,n precursor radiactivo, todo #$% que se est procesando a partir de dic!o gen estar
marcado. *e lisarn las clulas y se asla el #$% correspondiente al gen por unin a una sonda de c4$% del gen en
cuestin. )osteriormente, se centrifugarn los #$%s aislados en un gradiente de sedimentacin, y se los separar por
tama-o. Luego, se !ibridarn estos #$% con distintos fragmentos del gen de 4$% cortados con la enzima de
restriccin que genera un patrn de restriccin conocido. El fragmento que contiene al sitio de inicio de la
transcripcin !ibridar con todos las muestras ya que todas contienen complementariedad con ste. *e podrn
aplicar tcnicas ms precisas para conocer el sitio de inicio de la transcripcin dentro del fragmento en cuestin.
$tese que este mtodo tambin permite identificar el fragmento que contiene al sitio de terminacin de la
transcripcin.
)ara determinar el sitio preciso de iniciacin de la unidad de transcripcin, se puede utilizar un mtodo alternativo.
*e incuban distintos fragmentos de restriccin del gen que poseen al sitio de inicio "generados con distintas enzimas
de restriccin& con un extracto nuclear de clulas +eLa y precursores marcados. La transcripcin de cada fragmento
comienza en el sitio de inicio y la polimerasa se CescurrirD luego de !aber llegado a su fin. Las transcripciones
resultantes se someten a electroforesis en gel, obteniendo las longitudes de los transcriptos, lo que ubica con
precisin el sitio de inicio. Este mtodo se conoce como run2off. 4e ms est decir que si se cuenta con la posibilidad
de secuenciar los fragmentos utilizados y las transcripciones, el resultado es ms directo y sencillo.
Ltros mtodos relacionados, permiten !acer ms eficaz la secuenciacin, evitando gastos y duraciones
antieconmicas. )or e/emplo, si se cuenta con una sonda de 4$% complementario al m#$%, sta podr !ibridar al
fragmento, y utilizando una endonucleasa *( "especfica para regiones monocatenarias&, sta slo dar como
producto un fragmento doble !ebra correspondiente a la regin de !ibridacin y que podr desnaturalizarse para
separar el fragmento de c4$%, y secuenciarlo. 7ambin se puede !acer esto partiendo de un cebador
complementario peque-o "de unos '< nt& que se extender mediante la transcriptasa reversa. )or otra parte, la
longitud de este fragmento de c4$% es igual a la distancia entre el sitio de unin de la sonda o el cebador y el
extremo 31, lo que tambin permite conocerlo si se conoce la secuencia.
4. "denti/icacin de regiones promotoras
=.(. Ndentificacin de en!ancers
)ara esto, se elaboran plsmidos provistos del gen en cuestin con un fragmento upstream al inicio de transcripcin
de ste, y otros sin l. *e transfectan a clulas en cultivo que normalmente no expresan el gen en cuestin. Luego, se
aislar el #$% mediante la proteccin contra nucleasa "se !ibrida con un c4$% que lo proteger de la accin de la
47
endonucleasa *(&. El aislado se tratar con una sonda marcada del gen en cuestin, se tratar con endonucleasa *(
para eliminar las regiones monocatenarias, y se correr en una electroforesis en gel, lo que permitir ver no solo el
tama-o de la regin bicatenaria, sino las diferencias de expresin por el revelado mediante autorradiografa.
=.'. 4eterminacin de la actividad de factores de transcripcin
El sistema de anlisis requiere dos plsmidos, uno que contenga al gen codificador del presunto factor de
transcripcin y el otro que contiene un gen reportero y un sitio de unin para ste. %mbos plsmidos son introducidos
de manera simultnea en clulas !usped carentes del gen codificador del presunto regulador y del gen reportero. 4e
acuerdo al nivel de expresin de ste "medido por los m#$%s sintetizados, o la protena codificada&, se puede
concluir acerca de la funcin como activador o represor.
=.0. Localizacin de secuencias de control de la transcripcin upstream
5.3.!. <or degradacin sucesi*a
)ara !acerlo, se clona en un plsmido un fragmento de 4$% que contiene una regin upstream relativamente
extensa de un gen en estudio. El plsmido se torna lineal por digestin de una enzima de restriccin que corta en el
extremo 31 del fragmento que se est analizando. El 4$% linealizado se digiere con una exonucleasa durante
periodos diferentes, de manera que de cada extremo se eliminen segmentos de longitudes cada vez mayores. 7ras la
adicin de un adaptador especfico para otra enzima de restriccin, se separar el fragmento de la secuencia
regulatoria, y se lo ligar en un nuevo vector que porta el gen reportero.
Luego, se transformarn clulas de #. coli con un plsmido de tama-o especfico y se observa la expresin del gen
reportero. .uando el tratamiento elimin regiones regulatorias prescindibles se ver una disminucin de la expresin,
y cuando elimina regiones imprescindibles, la anular.
5.3.. <or scanning linker
2na regin de 4$% eucariota que sustenta un alto nivel de expresin de un gen se clona en un vector plasmdico.
4esde un extremo de la regin analizada !acia el otro, se introducen mutaciones rastreadoras de ligadores que se
superponen entre s, y son producto de la mezcla irregular de la secuencia de nucletidos en un corto segmento del
4$%. Los plsmidos mutantes se transfectan separadamente a clulas de cultiva y se analiza la actividad de un
producto reportero. .uando las mutaciones afectan a una regin de control se puede observar una disminucin de la
expresin del gen reportero.
(. )omposicin en dominios de una protena
)ara determinar las regiones de un gen que codifica para una determinada actividad proteica, fundamentalmente
para el estudio de factores de transcripcin, se realiz mediante la utilizacin de organismos mutantes, carentes del
factor de transcripcin en s.
Luego, se clonar el gen que codifica para el factor regulatorio en distintos plsmidos que se incorporarn a las
clulas mutantes. Estos genes se irn degradando progresivamente desde un extremo y el otro, lo que permitir
analiza qu regiones son imprescindibles para la actividad del factor y cules para su unin a la regin promotora del
gen.
+. Estudio de reacciones de splicing in *itro
)ara esto se puede incubar un extracto nuclear de clulas +eLa con un #$% radiomarcado que contiene segmentos
de dos exones de m#$% de una protena determinada, separados por un intrn. 7ras la incubacin durante periodos
diversos, el #$% se purifica y se somete a electroforesis y autorradiografa /unto con marcadores de #$%. Esto
permite observar los patrones de splicing, generalmente observando bandas correspondientes a los exones
separados, al intrn de forma lineal y al intrn en forma de lazo "que migra ms lentamente&. 7ambin se observarn
productos aberrantes.
Tema 14: .rotemica
1. "ntroduccin
La protemica es el estudio del proteoma, es decir, el con/unto de protenas existentes en un tipo especfico de clula
en una condicin fisiolgica determinada. Nnvolucra la separacin, identificacin y caracterizacin de todas las
protenas presentes en una muestra de te/ido "o colonia& en un determinado momento fisiolgico de inters. Esto
muestra lo puntual de la temporalidad de los proteomas. 2na clula posee un genoma invariable en el tiempo, pero su
proteoma vara de acuerdo a las condiciones que soporta. *e nota que la correlacin entre el proteoma y el
transcriptoma es pobre, debido a las tasas distintas de degradacin de los #$%, y las modificaciones
posttraduccionales de las protenas, lo que permite aumentar la cantidad de protenas presentes, comparada con la
esperada de acuerdo a la de m#$%.
2. T,cnicas aplicadas en la protemica
Las tcnicas de protemica fundamentales se basan en mtodos separativos. stos permitirn comparar dos
estados de una muestra en estudio, e identificar las variaciones presentes, pudiendo purificar las protenas en
cuestin a partir de stas, para su posterior caracterizacin.
7odo anlisis de una muestra para obtener su proteoma, sigue ciertos pasos6
a& )reparacin de la muestra, lo que incluye su prefraccionamiento y solubilizacin en un medio determinado.
b& *eparacin de las protenas, usualmente por '45)%8E
c& 9isualizacin de las protenas, mediante tincin con .oomassie >lue, colorantes de plata, tinturas fluorescentes,
etc.
d& %nlisis de los patrones de separacin, para notar diferencias y abundancia
e& Ndentificacin proteica, de protenas especficas, mediante espectrometra de masa, inmunoreconocimientos, etc.
48
f& .aracterizacin proteica, por la interpretacin de los datos obtenidos, o la comparacin con bases de datos
'.(. Electroforesis en gel de poliacrilamida en dos dimensiones "'45)%8E&
*e basa en una doble separacin de un extracto de protenas, ya sea por punto isoelctrico "mediante un
isoelectroenfoque& y por tama-o "mediante un *4*5)%8E usual&. Esto generar un diagrama de manc!as fcilmente
comparable entre dos extractos distintos, que no solo da informacin cualitativa de presencia o ausencia de
protenas, sino tambin informacin semicuantitativa sobre los niveles de expresin de cada protena.
)ara esto, primero se realizar el isoelectroenfoque en una matriz de anfolitos semislidos que genera un gradiente
de p+ tras someterse a un campo elctrico. Esta matriz, luego de que se corra la muestra a su travs, se coloca
!orizontalmente en la regin superior de un gel de poliacrilamida@*4* especial para '45)%8E, y se separarn luego
por tama-o.
'.'. E%L4N57LW
Es el mtodo ms utilizado en la identificacin proteica. *e basa en la purificacin de una protena determinada a
partir del gel de poliacrilamida del '45)%8E, su digestin proteica a fragmentos relativamente peque-os, y la
determinacin de la identidad de stos mediante espectrometra de masas. )ara esto, se deben separar previamente
los fragmentos por tama-o "lo que requiere la actividad de una columna cromatogrfica adecuada& y llegar a un
detector apropiado. *i ste posee la sensibilidad suficiente, se puede determinar la composicin en aminocidos del
fragmento, y un softKare, que cuente con todas las secuencias, podr regenerar la secuencia.
)or lo general, la muestra compuesta por varios fragmentos peptdicos se deposita en un soporte que permitir su
irradiacin por un lser que los ionizar y permitir que se separen de la matriz lquida, y sern desviados por un
campo elctrico y magntico de manera proporcional a su tama-o. 8eneralmente, luego de la ionizacin y
vaporizacin, se requiere que los pptidos ionizados atraviesen una grilla de apertura variable que seleccionar
aquellos de tama-o adecuado para ser detectados. Los patrones de picos obtenidos pueden ser comparados con
otros existentes para determinar qu protena es la separada, o permiten una caracterizacin de la misma. )ara este
cometido es especialmente ,til la posibilidad de fragmentacin de la muestra.


Tema 15: 'ae moleculare de la e/ali0acin
celular
1. "ntroduccin
$inguna clula vive aislada, y su supervivencia depende de una red comple/a de comunicaciones intercelulares que
coordina el crecimiento, la diferenciacin y el metabolismo de las m,ltiples clulas en te/idos y rganos. Las clulas
de grupos peque-os a menudo se comunican a travs del contacto intercelular directo, mientras que en el caso de los
c,mulos celulares ms grandes y comple/os, se utilizan molculas se?al extracelulares, sintetizadas y liberadas por
ciertas clulas y que solo producirn una respuesta especfica en sus clulas blanco con receptores proteicos para
stas. Las molculas se-al pueden difundir a travs de los te/idos o ser transportados por la sangre.
Este tipo de se-alizacin se encuentra presente en casi todos los procesos celulares de vital importancia para los
organismos, como ser la adaptacin a cambios en el medio ambiente, la accin de gradientes de morfgenos, la
diferenciacin celular regulada espacialmente, el control recproco de las clulas, la atraccin de miembros del sexo
opuesto, etc.
)or lo general, la comunicacin mediante se-ales extracelulares presenta seis pasos6 la sntesis de la se-al, su
liberacin, su transporte, la deteccin por el receptor, el cambio metablico o funcional "que puede darse por accin
de enzimas metablicas, factores de transcripcin o protenas del citoesqueleto& y la eliminacin de la se-al.
(.(. 7ipos de se-ales
En las se-ales endocrinas, las molculas se-al u hormonas, act,an sobre una clula ob/etivo distante del sitio de
sntesis y son transportadas por el torrente sanguneo. En las se-ales par-crinas, las clulas ob/etivo son cercanas a
las productoras, y el transporte se da en el medio extracelular "un tipo especial de se-ales parcrinas son las
neurcrinas&. En las se-ales autcrinas, las clulas responden a sustancias que liberan por s mismas, tanto sobre el
mismo tipo de clulas como sobre la misma clula que las libera. En las se-ales e1crinas, las se-ales se liberan a
regiones topolgicamente externas "como por e/emplo el lumen intestinal& y se unen a receptores en clulas distantes
e incluso de otros organismos.
(.'. #eceptores
Las molculas se-al act,an como ligando que se fi/a a un sitio del receptor. Esta unin produce un cambio de
conformacin en ste que inicia una secuencia de reacciones generadoras de una respuesta celular especfica a los
receptores y al sistema de transmisin interna de la se-al. Las clulas respondern de modo muy variable frente a un
solo ligando. %s, toda protena receptora se caracteriza por su especificidad de unin con un ligando y el comple/o
posee especificidad de efector, es decir, media una respuesta especfica.
El ligando no parece tener funcin alguna, salvo la de fi/arse al receptor, ya que ni se metaboliza a productos ,tiles,
ni es intermediario de ning,n proceso celular, adems de no funcionar como enzima.
!..!. +eceptores de superficie
Los receptores de superficie celular interact,an con ligandos !idrosolubles. Existen cuatro tipos principales6
a& #eceptores acoplados a protena 8. La fi/acin del ligando activa una prote%na C que a su vez regula una enzima
que genera un segundo mensa/ero especfico o modula un canal inico.
b& #eceptores de canales inicos. La fi/acin del ligando cambia la conformacin, lo que permite que iones
especficos fluyan a travs de l y esto altera el potencial elctrico a travs de la membrana.
49
c& #eceptores ligados a tirosina quinasa. La fi/acin del ligando estimula la formacin de un receptor dimrico que
interact,a con una tirosina quinasa proteica del citosol y la activa.
d& #eceptores con actividad enzimtica intrnseca. La fi/acin del ligando activa esta funcin. *uelen llamarse
receptores de tirosina quinasa, porque autofosforilan restos en su propio dominio citoslico.
!... )egundos mensa,eros
La unin de ligandos a diversos receptores de superficie celular causa un incremento o una disminucin rpido de las
concentraciones de las molculas se-al intracelulares denominadas segundos mensa,eros. stas son de ba/o peso
molecular y con niveles de sntesis y degradacin muy rpidos. *u concentracin intracelular altera la actividad de
una o ms enzimas o protenas no enzimticas.
!..3. .tras prote%nas
%dems de los receptores de superficie celular y los segundos mensa/eros, varios tipos de protenas conservadas
intervienen en las vas de transduccin de se-ales estimuladas por se-ales extracelulares.
a& 87)asas interruptoras. 2nen 87) "y estn en un estado activo& luego de una se-al externa, pero luego de un
tiempo determinado volvern a su estado inactivo por !idrlisis de ste. Existen dos clases principales, las prote%nas
C trimricas y las prote%nas +as, en las que una de las diferencias principales es la interaccin directa o indirecta,
respectivamente, con las protenas que regulan.
b& )roten quinasas. *on los efectores de los cambios intracelulares. La actividad quinasa puede presentarse tanto en
el citosol como en los receptores asociados a membrana. *u actividad tambin suele regularse por fosforilacin.
c& )rotenas adaptadoras. Estabilizan funcionalmente los comple/os multiproteicos, y no tienen actividad cataltica
directa, pero permiten la interconexin de diversos mecanismos regulatorios diversos.
(.0. 9as de se-ales
4istintos miembros de una clase particular de receptores transducen se-ales a travs de vas muy conservadas. Las
principales vas de se-alizacin estudiadas son6
a& 9a 8).# "mediante receptores acoplados a protena 8&, que usualmente utiliza segundos mensa/eros que
activan quinasas dependientes de stos, las encargadas de iniciar la cascada de fosforilacin. stas acabarn
fosforilando y activando otras protenas funcionales de la clula.
b& 9a #7c "mediante receptores de tirosina quinasa&, que suelen activar protenas del tipo #as para que fosforilen a
miembros del grupo de protenas E%) que desencadenarn la respuesta celular.
c& 9a .c "mediante citoquinas quinasas&, que suelen utilizar miembros de las protenas citoslicas X%) y fosforilan
factores de transcripcin del tipo *7%7.
d& 9a receptores 7W8Q, de accionar similar a la va .c, pero especfica para factores de transcripcin de tipo *mad.
e& 9a receptores +! o :nt, que constan de receptores transmembrana que permitirn la separacin de comple/os
citoslicos en protenas funcionales, la mayora de ellas, factores de transcripcin.
f& 9a receptores $otc!, que pueden interaccionar con otros, de otras clulas, lo que induce la separacin de un
dominio citoslico del mismo receptor que participar en la regulacin transcripcional.
2. %eceptores acoplados a protena 2
'.(. #eceptores
7odos los receptores acoplados a protena 8 contienen siete regiones que atraviesan la membrana, con su
segmento amino terminal sobre la cara exoplasmtica, y su extremo carboxilo terminal sobre la cara citoslica. El
efector ms com,n de este tipo de receptores es la adenilciclasa que sintetiza el segundo mensa/ero c%E).
Las comparaciones de las estructuras moleculares y la actividad de distintos anlogos de los ligandos indican que la
cadena lateral que contiene el grupo amino determina la afinidad del ligando con el receptor. La concentracin
mnima necesaria de ligando para la elevacin a la mitad del mximo de c%E) es igual a la c4.
*e piensa que todos los 8).# atraviesan las membranas siete veces y tienen estructuras similares, aunque las
secuencias de aminocidos parecen ser bastante diferentes. Esto facilita la especificidad de ligando y efector.
8eneralmente, no existen ms de cinco restos que participen en la fi/acin del ligando y se encuentran en algunas de
las [ !lices de la protena lo que lleva a pensar que la unin del ligando induce el desplazamiento entre s de varias
de las !lices que permitir la modificacin de la conformacin de un asa proteica citoslica que conecta las !lices 3
y G. Esto induce la unin a la protena 8 de manera altamente especfica.
'.'. )rotena 8* trimrica
La protena 8 estimulante es la que est en contacto con la adenilciclasa y la activa para generar c%E) a partir de
%7) "es una enzima transmembrana que posee dos dominios catalticos en la cara citoslica, capaces de fi/ar %7)&.
Las protenas 8 poseen tres subunidades, denominadas O, Q y R, y funcionan como 87)asas interruptoras que
alternan entre estados activos y otros inactivos. .uando no !ay ligando unido al receptor, la subunidad O se fi/a a
84) y forma un comple/o con las otras subunidades. La unin del ligando cambia la conformacin por lo que se une
87) a la protena trimrica, y la subunidad O se separa del comple/o QR que se unir a la adenilciclasa para activarla,
durante muy poco tiempo "el tiempo de !idrlisis del 87)&, para volver a formar el trmero inicial.
.abe destacar que un solo comple/o receptor produce la conversin de !asta cien molculas de protena 8 inactivas
en la forma activa.
La transmisin intracelular exitosa de una se-al tambin requiere que el efecto finalice con rapidez una vez que
disminuye la concentracin de !ormona circulante. Esto est dado por la rapidez de !idrlisis del 87) que solo
permitir que la actividad de la adenilciclasa se mantenga elevada slo si la se-al sigue estando unida al receptor.
..!. #structura
4os superficies de la subunidad O son las que interact,an con la subunidad Q, una regin amino terminal cercana a la
superficie de membrana y dos regiones adyacentes denominadas interruptores N y NN. La fi/acin del ligando al receptor
!ace que las !lices transmembrana se deslicen una respecto de la otra, por lo que aparecen sitios de unin en las
extensiones citoslicas de stas para la protena 8 trimrica acoplada. *on los dominios terminales "en ambos
50
extremos& los que interact,an con el receptor, formando una superficie continua con los lpidos anclados en los
extremos de O.
2na vez unido el 87), la subunidad O sufre cambios extensos en tres regiones interruptoras, fundamentalmente N y
NN, lo que altera la unin OQ, y permite la separacin y ale/amiento. La subunidad O unida a 87) es esencial para la
interaccin con adenilciclasa, que, se cree, estabiliza el sitio de fi/acin a %7).
'.0. %denilciclasa
La adenilciclasa es una protena transmembrana de paso m,ltiple con dos grandes asas citoslicas que contienen
los dominios catalticos.
La versatilidad de las protenas 8 permite que distintos comple/os receptores modulen la actividad de la misma
protena efectora. 7odos estos se unirn a la misma protena 8*. Esto permite una regulacin ms fina de los niveles
de c%E) dependiendo de la accin de diversas se-ales activadoras y represoras. Los receptores de stas ,ltimas
interaccin con la protena 8N que contiene subunidades Q y R iguales a 8* pero una subunidad O diferente, que unida
a 87) in!ibe a la adenilciclasa.
*i bien la conformacin general del interruptor NN y de las asas son similares en las subunidades O de 8* y 8N, excepto
en dos regiones que se encuentran en la misma posicin cuando estn unidas a 84) pero difieren al unirse a 87),
permitiendo el comple/o con la adenilciclasa en 8* e impidindolo en 8N, aunque se cree que se unir a 8N por otro
sitio que disminuir la afinidad del %7) por el sitio activo.
'.=. Wosfodiesterasa
La c%E) fosfodiesterasa es la enzima que cataliza la !idrlisis de c%E) en %E), lo que evita la estimulacin
!ormonal. *u actividad est ntimamente regulada y uno de sus reguladores fundamentales es el calcio citoslico.
.abe destacar que tambin puede eliminarse c%E) del citosol por su expulsin al medio extracelular.
'.3. Ltras protenas 8
Existe una gran variedad de protenas 8. Euc!as estn implicadas en el control de la concentracin intracelular de
segundos mensa/eros "como c%E), c8E) o calcio& aunque tambin existen otras que permiten generar respuestas
por despolarizacin "mediante ingreso de potasio&.
3. %eceptores de tirosina &uinasa
Los #7cs son el segundo tipo ms frecuente de receptores de superficie celular. *us ligandos son !ormonas
proteicas o pptidos solubles y ligados a membrana, e incluyen a varios factores de crecimiento y a la insulina. La
fi/acin estimula la actividad tirosina quinasa. Es com,n encontrar una transmisin de la se-al de fosforilacin a una
protena 87)asa interruptora denominada #as, que act,a como intermediaria en diversas vas de se-alizacin.
0.(. %ctivacin del receptor
7odos los #7c estn compuestos por un dominio extracelular, una ,nica !lice O transmembrana !idrfoba y un
dominio citoslico que incluye una regin con actividad de tirosina quinasa. La fi/acin del ligando induce la
dimerizacin de la mayora de los #7c, lo que permite la fosforilacin recproca de la regin de actividad quinasa de
cada monmero, primero en el labio de fosforilacin cercano al sitio cataltico9 lo que facilita la unin de %7), y luego
en el resto de las tirosinas del receptor. Esto permite el acoplamiento de otras protenas necesarias en la va, que
contienen dominios *+' y que acoplan los receptores activados a otros componentes de la va pero no tienen
propiedades de se-al intrnsecas.
En algunos casos, las subunidades de los #7c estn unidos por enlaces covalentes y se presentan como oligmeros
incluso en ausencia de ligando, aunque ste induce la autofosforilacin por cambio de conformacin.
0.'. )rotenas #as
Las protenas #as son 87)asas interruptoras, pero que a diferencia de la subunidad O de las protenas 8, no se
asocia directamente con el receptor activado, sino que es acelerada por una protena denominada factor de
intercambio de nucletidos de guanina "8EW& que se fi/a al comple/o #as584) y disocia el 84), permitiendo la unin
de 87), liberando a 8EW. La !idrlisis del 87) tambin requiere una protena activadora, 8%), lo que aumenta el
tiempo de vida media del comple/o #as587).
Las protenas #as son peque-as "con unos ([< %%& y su estructura tridimensional es similar al dominio 87)asa de
la subunidad O de las protenas 8, las cuales tambin poseen dominios de actividad similar a la de 8%). %mbas
pertenecen a una familia denominada superfamilia de C0<asas, que parecen provenir de un origen com,n y
funcionan en el control celular.
0.0. )rotenas adaptadoras
La interaccin entre #as y los #7c se da mediante protenas intermediarias, 8#>' y *os. 8#>' posee dos sectores
diferenciados de interaccin, un dominio *+' especfico para fosfotirosinas, y dos dominos *+0 que se fi/an a *os.
sta es una 8EW que activa a #as, solo si est unida a 8#>'. La activacin del receptor produce la relocalizacin de
*os para que se acerque al sustrato, y desin!ibe su actividad. Esto produce la modificacin de las regiones
interruptoras N y NN de #as, permitiendo que difunda el 84).
El dominio *+' "por dominio de homolog%a con )rc& se fi/a a una serie de aminocidos que rodea un resto de
fosfotirosina. Los dominios se diferencias entre s por la secuencia de aminocidos que utiliza para unirse
especficamente a la regin circundante de la fosfotirosina. Los #7c activos tambin pueden reclutar molculas se-al
por un dominio diferente denominado fi,ador de tirosina ")7>&, en la que intervienen fundamentalmente los
aminocidos en posicin 53 a 5M a partir de la fosfotirosina.
Los dominios *+0 contienen unos 335[< aminocidos y presentan una variabilidad de secuencia interesante. *e
unen de manera selectiva a secuencias ricas en prolina de *os "y otras protenas&, ya que estos permiten generar
una conformacin extendida y accesible, y adems posibilitan su insercin en ciertos CbolsillosD de fi/acin del dominio
*+0.
4. 8as de la #!P &uinasa
51
7odos los #7c ligados a #as en mamferos parecen usar una va de transduccin de se-ales muy conservada por la
cual la #as activada induce una cascada de quinasas que culmina con la activacin de la E%) quinasa, una
serina@treonina quinasa capaz de translocarse !asta el n,cleo y que fosforila una gran cantidad de protenas, entre
ellas, factores de transcripcin. *u especificidad de respuesta es a,n desconocida.
La #as activada se fi/a al dominio amino terminal de #af, otra serina@treonina quinasa, que fosforilar a EEc
"tambin *@7 quinasa&, y sta fosforilar a E%), la encargada de fosforilar muc!as protenas diferentes. %dems
existen ciertas protenas comple/antes, como (=5050 o csr. La primera se une a #af inactiva, y se separar al unirse
sta con #as587), defosforilando ciertas serinas de #af lo que activa su actividad quinasa. La activacin posterior de
#af requiere csr que contienen sitios de unin para #af, (=5050, EEc y E%).
El sitio cataltico de la forma inactiva de E%) est bloqueado por un segmento de aminocidos, el labio de
fosforilacin. La unin de EEc desestabiliza la estructura del labio y produce la exposicin de una tirosina esencial.
4espus de la fosforilacin de esta tirosina, EEc fosforila una treonina vecina. 7anto la serina como la treonina
fosforiladas interact,an con aminocidos adicionales, por lo que confieren una conformacin alterada a la regin del
labio, que a su vez permite la fi/acin de %7) en el sitio cataltico. La fosfotirosina tambin desempe-a un papel
importante en la interaccin con otras protenas. %ctualmente se cree que todos los miembros de la va de la E%)
quinasa estn unidos a un soporte proteico sin actividad cataltica "*te3&.
%ntes de ingresar al n,cleo, la E%) quinasa debe dimerizar para poder ser reconocida e importada por el comple/o
del poro nuclear y cumplir sus funciones regulatorias.
=.(. 2tilizacin de la E%) quinasa
*i bien las levaduras y otros eucariotas unicelulares carecen de #7c, utilizan la va de la E%) quinasa mediante
otros receptores anlogos e incluso mediante protena 8. Nncluso en mamferos y otros eucariotas, existen otras
protenas con funciones equivalentes a las E%) quinasas, como las X$c y las p0M, aunque se las considera
miembros de la superfamilia de las 3A< >uinasas. La activacin de todas se da por la fosforilacin de restos
anlogos del labio de fosforilacin. %dems se caracterizan por poseer una secuencia conservada 75Y5d en su
dominio cataltico que permite su regulacin por fosforilacin.
Las de tipo E#c o EEc funcionan fundamentalmente en la proliferacin ya que se activan por factores de
crecimiento. Las de tipo X$c y las de tipo p0M funcionan fundamentalmente en respuesta al stress, como en s!ocJ
osmticos, radiacin 29 o inflamacin.

(. Protenas &uinasas dependientes de segundos mensa9eros
Las protenas 8 suelen ser las responsables de la activacin de las !erramientas proteicas de sntesis de segundos
mensa/eros, tal como el %E) cclico por la adenilciclasa, o la liberacin de calcio. La accin de stos se debe a
ciertas mayoritariamente protenas quinasas dependientes de ellos.
3.(. )rotena quinasa dependiente de %E) cclico ")c%&
El %E) cclico puede activar directamente ciertos tipos de canales inicos, pero la mayor parte de las clulas
animales lo utilizan solo para activar la prote%na >uinasa dependiente de %E)c, o )c%. sta, claro est, posee
diferentes sustratos en los diferentes tipos celulares.
En su estado inactivo, la )c% es un comple/o formado por dos subunidades catalticas y dos subunidades
reguladoras. La unin del c%E) a las reguladoras altera su conformacin y permiten su disociacin del comple/o,
permitiendo la funcin de las catalticas. %dems las subunidades reguladoras anclan al comple/o en la membrana o
el citoesqueleto por interaccin con otras protenas de ancla/e.
La accin variada del c%E) permite su utilizacin tanto en respuestas metablicas rpidas "por fosforilacin de
enzimas presentes& o lentas "por regulacin de la sntesis de los componentes&. %s, la )c% puede fosforilar a ciertos
factores de transcripcin "como la prote%na de unin a C+#9 o C+#B& que se unirn al elemento de respuesta a
cA3<9 o C+# en el 4$% nuclear, y sern activados por estimuladores especficos "como la prote%na de unin a
C+#B o CB<&.
Los efectos del %E) cclico son transitorios, y esto se logra mediante la accin de protenas que defosforilan los
productos de fosforilacin de la )c%. stas son las fosfoprote%nas fosfatasas de tipo N, NN%, NN> y NN.. La ))N es la ms
usual y defosforila las protenas fosforiladas por )c%, entre ellas .#E>. La ))NN% es ms general y suele participar
incluso en vas de regulacin con otras *@7 quinasas. La ))NN> o calcineurina se activa por calcio.
3.'. )rotena quinasa dependiente de calcio ")c.&
Euc!os receptores asociados a protena 8 activarn a una enzima unida a la membrana, la fosfolipasa C2J9
mediante la accin de una protena 8q. sta act,a sobre un fosfolpido de inositol, el fosfatidilinositol5=,35bifosfato, un
componente poco abundante de la capa interna de la membrana plasmtica. ste se escindir en diacilglicerol 64AC7
y en inositol !959A2trifosfato "(<37.
El N)0 es una peque-e molcula !idrosoluble que difundir por el citosol !asta el retculo endoplasmtico y abrir los
canales de calcio. *e degradar mediante defosforilacin o fosforilacin. El 4%8, en cambio, permanece en la
membrana plasmtica y activa a la )c. /unto con la fosfatidilserina y el calcio liberado por el N)0. )c. podr a!ora
fosforilar protenas diana.
.abe destacar que el calcio tambin regula actividades celulares independientemente de su activacin de la )c..
.iertas protenas como las calmodulinas se unen a calcio y permiten la regulacin de la actividad de las Ca32
>uinasas, que poseen otras funciones celulares regulatorias.
+. .tras se:ales
% pesar de que la mayora de las se-ales extracelulares estn mediadas por molculas !idroflicas que se unen a
receptores situados en la superficie, sino que algunas molculas se-al son suficientemente !idrofbicas y@o peque-as
para atravesar fcilmente la membrana de la clulas diana, regulando directamente la actividad de una protena
intracelular.
52
G.(. El xido ntrico
2n e/emplo importante es el 1ido n%trico 6".7 un gas que act,a como se-al en animales y plantas, por e/emplo, en
la regulacin de la contraccin de la musculatura lisa. Es la acetilcolina la que act,a como se-al extracelular para la
sntesis de $L a partir de arginina, mediante la accin de la )c.. ste puede difundir a travs de las membranas. Es
rpidamente degradado a nitratos y nitritos, pero puede e/ercer una accin regulatoria en clulas vecinas donde se
une a tomos de !ierro del sitio activo de la guanidilciclasa citoslica, que genera c8E) y generar un efecto rpido
ya que ser rpidamente degradado por la fosfodiesterasa.
G.'. El monxido de carbono
El mon1ido de carbono ".L& es otro gas que se utiliza como se-al intracelular y tambin estimula la guanilato
ciclasa, actuando en la in!ibicin de procesos apoptticos, inflamatorios trombticos o proliferativos. Es liberado en la
biodegradacin del grupo !emo en el bazo.
.abe destacar que el .L tambin participa en otras regulaciones de proteccin de te/ido, en las vas de la E%)
quinasa. Esto es as porque favorece la utilizacin de la va p0M, frente a la X$c "participante en la respuesta
inflamatoria& y la de EEc "participante en la respuesta proliferativa&. %dems la va p0M suele poseer actividades
in!ibitorias de la apoptosis y de la inflamacin por s misma.
Tema 1": 'ae moleculare de la
carcino#nei
1. El cncer
El cncer es una enfermedad que se debe a fallas en los mecanismos que controlan el crecimiento y la proliferacin
celular. Las tasas de nacimiento y muerte celular determinan el tama-o corporal adulto y la velocidad de crecimiento
para alcanzar ese tama-o. En algunos te/idos adultos, la proliferacin celular tiene lugar como una renovacin
constante de los te/idos "clulas epiteliales, glbulos blancos, etc.&, sin embargo, las clulas en muc!os te/idos
adultos no suelen proliferar excepto en los procesos de curacin.
Las prdidas de regulacin celular que originan cncer se deben a da-os genticos, fundamentalmente en dos tipos
de genes6 los protooncogenes y los genes supresores de tumores. Los primeros son activados para volverse
oncogenes muy activos en la promocin del crecimiento, promovido por la expresin gentica incrementada o un
producto !iperactivo. Los segundos, en cambio, restringen el crecimiento por lo que si se da-an e produce un
crecimiento inapropiado.
El cncer suele ser el resultado de mutaciones que aparecen en el curso de la vida durante una exposicin a los
carcingenos, que incluyen ciertos qumicos y radiacin ultravioleta. Las mutaciones que lo causan ocurren
principalmente en las clulas somticas, aunque algunas mutaciones !ereditarias de la lnea germinal incrementan la
probabilidad de que el cncer aparezca, lo que !ace notar que el cncer es una interaccin de gentica y medio
ambiente. %,n si el da-o gentico tiene lugar slo en una clula somtica, la divisin lo transmitir a las clulas !i/as.
Es poco com,n que mutaciones de un ,nico gen conduzcan a la aparicin de cncer, ya que ms a menudo una
serie de mutaciones en m,ltiples genes crea un tipo celular que prolifera de modo prolgresivo ms rpidamente,
escapa a las restricciones normales del crecimiento y genera una oportunidad para mutaciones adicionales. El clon
de clulas crece y forma un tumor.
% veces, las clulas del tumor primario migran !acia nuevos sitios "met-stasis& donde producen tumores secundarios
que tienen ms alto impacto sobre la salud. La invasin de nuevos te/idos no es aleatoria y depende de la naturaleza
de la clula y del te/ido invadido. La metstasis de facilita si las clulas tumorales producen factores de crecimiento y
de angiognesis "crecimiento de vasos sanguneos&. Las clulas deformables, mviles, invasivas y que se agregan
son las ms peligrosas. Los te/idos atacados son ms vulnerables si producen factores de crecimiento.
*e cree que la aparicin del cncer despus de la edad reproductiva puede ser una de las razones por las que las
restricciones evolutivas no !ayan desarrollado otras formas para suprimirlo.
2. ),lulas tumorales
Las clulas tumorales adquieren un impulso para proliferar que no requiere una se-al inductora externa, ni responde
a las que restringen la divisin celular o la apoptosis. *uelen cambiar su ad!esin a las clulas circundantes o a la
matriz extracelular y se sueltan para dividirse ms rpidamente. )ara alcanzar cierto tama-o, los tumores deben
obtener irrigacin sangunea y suelen lograrla mediante la se-alizacin que induce el crecimiento de vasos.
'.(. Eetstasis
Los tumores aparecen con frecuencia, generalmente localizados y de tama-o peque-o, llamndose benignos, cuyas
clulas se aseme/an a las normales y pueden funcionar como ellas. Las molculas de ad!esin mantienen las clulas
tumorales localizadas en los te/idos donde se originaron y estn delimitadas por una cpsula fibrosa lo que lo
convierte en un blanco fcil para ciruga. *olo representarn un problema mdico grave si por su tama-o interfieren
en las funciones normales o secretan cantidades excesivas de sustancias con actividad biolgica.
Las clulas que componen un tumor maligno crecen y se dividen ms rpidamente que las normales sin morir en el
tiempo previsto o invaden te/idos cercanos sin un cambio significativo en su velocidad de proliferacin. .uando estos
tumores progresan, las clulas ingresan en el sistema circulatorio y establecen reas secundarias de proliferacin.
Las clulas cancerosas son menos diferenciadas, poseen una mayor relacin n,cleo@citoplasma, un ms grande
n,cleo y una menor especializacin que las clulas normales. %dems presentan una relacin comple/a con la matriz
extracelular y la lmina basal, ya que deben degradarla para penetrarla y efectuar la metstasis6 muc!as clulas
tumorales secretan una protena que convierte el plasmingeno en una proteasa activa denominada plasmina, que
53
contribuye a la digestin de la lmina basal, adems de sufrir modificaciones funcionales y estructurales "por e/emplo,
en su citoesqueleto&.
'.'. Lrgenes celulares del cncer
..!. C-ncer y clulas madre
)ara que la mayora de las mutaciones oncognicas induzcan cncer se deben producir en clulas en divisin, por lo
que las clulas que los inician no son las diferenciadas sino sus clulas precursoras, las clulas madre. stas son las
,nicas en las que las mutaciones oncognicas en su 4$% pueden acumularse y transformarlas por ,ltimo en clulas
cancerosas.
... Clasificacin del c-ncer
Los tumores se clasifican en carcinomas, sarcomas o leucemias. Los primeros derivan del endo o el ectodermo, los
segundos del mesodermo y las terceras de clulas individuales de la sangre "por lo que son un tipo especial de
sarcomas&. Los linfomas son cnceres que se originan en los ganglios linfticos y en los te/idos del sistema
inmunolgico.
..3. Angiognesis
En ausencia de suministro de sangre, un tumor puede crecer para formar una masa de no ms de un milln de
clulas, que ocupara una esfera de unos dos milmetros de dimetro. La mayora de los tumores inducen la
formacin de nuevos vasos sanguneos que invaden el tumor y lo alimentan en un proceso denominado
angiognesis. Esto requiere la degradacin de la lmina basal, la migracin de las clulas endoteliales !acia el tumor,
su divisin y la generacin de una nueva membrana basal alrededor de los vasos recin elongados.
La angiognesis se produce por la actividad de los factores inducibles por hipo1ia 6H(=7 que median la respuesta
transcripcional a !ipoxias localizadas en te/idos normales y transformados. Estos factores tambin parecen participar
en el crecimiento tumoral.
'.0. Eodelo de las incidencias m,ltiples
.ualquier gen que codifica una protena capaz de transforma clulas cultivadas o inducir cncer en animales se
denomina oncogn. El gen celular normal que da origen a un oncogn se denomina protooncogn.
*e !a propuesto un modelo, denominado Cde incidencias m,ltiplesD que asegura que los cnceres evolutivos surgen
por un proceso de seleccin clonal similar a la seleccin natural en una poblacin, es decir, una mutacin en una
clula puede darle una leve venta/a de crecimiento, lo que la favorece, y la !ace dominar sobre otras, !asta que en su
propio seno sur/a otra mutacin ms conveniente.
La evidencia ms convincente en este sentido se presenta en el cncer de colon, que evoluciona a travs de
diferentes etapas morfolgicas bien caracterizadas y cuyas clulas pueden aislarse permitiendo identificar las
mutaciones que se producen en cada una. %s se comprob que el primer paso involucraba la prdida de un gen Apc
"un supresor de tumor recesivo&, dando origen a la formacin de plipos en los que se sobre expresa un factor de
trancripcin Eyc que induce la transicin desde 8( a *. Ltra mutacin, en el gen ras, forma un adenoma de mayor
tama-o, mientras que la prdida de un gen desconocido y la inactivacin del gen pA3 conduce a la aparicin del
cncer maligno.
3. 4ases gen,ticas del cncer
.asi todos los tumores !umanos tienen mutaciones inactivadoras en los genes que usualmente act,an en diversos
puntos clave del ciclo celular para detener la progresin de una clula a travs del ciclo celular si un paso previo se
efectu de modo incorrecto o si se da- el 4$%.
0.(. Eutaciones con ganancia de funcin
4e los numerosos oncogenes conocidos, casi todos derivan de genes celulares normales "sus protooncogenes&
cuyos productos promueven la proliferacin celular. Esto se da por la estimulacin descontrolada del crecimiento, por
ser protenas antiapoptticas, etc. La conversin o activacin de un protooncogn a un oncogn involucra una
mutacin con ganancia de funcin que puede darse por cuatro mecanismos6
a& Eutaciones puntuales
b& 7ranslocacin cromosmica que genera dos genes para codificar una protena quimrica de actividad constitutiva.
c& 7ranslocacin cromosmica que ubica un gen regulador del crecimiento ba/o el control de un promotor diferente
d& %mplificacin de un protooncogn, por existir en repeticiones en tndem o en minicromosomas satlites.
2n oncogn formado por los primeros dos mecanismos codifica una oncoprotena que difiere de la normal, mientras
que los otros dos mecanismos amplifican la produccin de una protena com,n aumentando su actividad. Estas
mutaciones son dominantes ya que aunque ocurran en un solo alelo, son suficientemente fuertes como para modificar
el fenotipo celular.
3.!.!. Kirus causantes de c-ncer
2n virus puede causar cncer. Los que lo !acen poseen el gen *2src, un oncogn derivado de un protooncogn
usual, el c2src. Este oncogn induce tumores en cuestin de das.
$o obstante, la mayora de los retrovirus oncognicos son de accin lenta, ya que producen cncer integrndose al
4$% cerca de un protooncogen celular y activando su expresin. Las secuencias de repeticiones terminales larga
pueden actuar como un promotor. Esto explica su accin lenta6 la integracin es aleatoria y se requieren nuevas
mutaciones para la alteracin del fenotipo.
0.'. Eutaciones con prdida de funcin
Los genes supresores de tumores codifican protenas que de una u otra forma in!iben la proliferacin celular. Las
mutaciones con prdida de funcin en uno o ms de estos contribuyen al desarrollo de muc!os cnceres. *e
reconocen cinco clases de protenas de este tipo6
a& )rotenas reguladoras o in!ibidoras de la progresin por un estado del ciclo celular
b& #eceptores o transductores de se-ales que in!iben la proliferacin celular
c& )rotenas de control de puntos clave
54
d& )rotenas que estimulan la apoptosis
e& Enzimas que participan en la reparacin del 4$%
%mbos alelos de un gen supresor de tumores deben perderse o inactivarse para estimular el desarrollo tumoral, por
lo que se dice que son genticamente recesivas. Ltro mecanismo para inactivar los genes supresores de tumores es
la metilacin de residuos de citosina en el promotor u otros elementos de control.
0.0. Eutaciones !ereditarias de riesgo
Las personas con mutaciones !ereditarias en los genes supresores de tumores tienen una predisposicin para
ciertos cnceres, y suelen !eredar una mutacin de la lnea germinal en un alelo del gen, por lo que una mutacin
somtica del segundo alelo facilita la progresin tumoral.
)or e/emplo, la mutacin !ereditaria en un alelo %). aumenta notablemente las probabilidades de obtener un cncer
de colon, al igual que las mu/eres que !eredan un alelo mutante del gen B+CA! y su probabilidad de desarrollar
cncer de mama.
Esto indica que el cncer es recesivo y la prdida de !eterocigosidad es un prerrequisito para la aparicin del cncer.
2n mecanismo para que ocurra comprende la no disyuncin de los cromosomas, aunque tambin puede surgir por
recombinacin o la delecin de la copia normal. Los cnceres !ereditarios representan un (<B de los cnceres
!umanos.
0.=. 8enes de la estabilidad
*on los responsables del mantenimiento de la integridad del 4$% y de su reparacin, que act,an frente a errores de
replicacin o ante la accin de mutgenos. %mbos alelos deben estar alterados para que contribuyan al cncer, y esto
tambin genera una !erencia de la predisposicin a desarrollar la enfermedad.
4. .rgenes gen,ticos de algunos cnceres comunes
%unque la oncognesis puede surgir de genes que codifican molculas de se-alizacin promotoras del crecimiento,
esto sucede rara vez.
=.(. #eceptores de superficie
*u mutacin suele estar asociada a varios tipos de cncer. )or e/emplo, una mutacin puntual en un #7c normal
genera un receptor continuamente dimrico, o puede eliminarse su parte extracelular lo que lo mantiene
constitutivamente activo, o quizs se genera una gran cantidad de receptores lo que !ace que las clulas respondan
en presencia de concentraciones muy ba/as de ligando.
=.'. )rotenas transductoras
Euc!as protenas de vas regulatorias pueden sobreexpresarse constitutivamente permitiendo una proliferacin
descontrolada. % continuacin se citan algunos e/emplos reales6
a& .omponentes de la va #as. *e !an observado mutaciones en #as que reduce su actividad 87)asa y la mantiene
en el estado activo unido a 87). 7ambin se encontraron #af quinasas activas de manera constitutiva, o la protena
.rJ similar a 8#>' que genera agregados proteicos sin necesidad de activacin del receptor. 7ambin se !an
observado mutaciones recesivas con prdidas de funcin de 8%).
b& `uinasa *rc. Es una quinasa citoslica activa constitutivamente, lo que activa una serie de vas de se-alizacin
intracelulares. *uele suceder por prdida de tirosinas regulatorias que deben ser defosforiladas para activar la
actividad quinasa.
=.0. Wactores de transcripcin
Las protenas codificadas por todos los oncogenes producen finalmente cambios en la expresin gnica. $o es
sorprendente que muc!os oncogenes codifiquen factores de transcripcin. *e !a visto que algunas protenas "o
m#$%s& de estos factores !an mutado perdiendo una regin regulatoria que induca su degradacin citoslica, lo que
aumenta la transcripcin del factor en niveles incontrolados.
=.=. )rotenas intervinientes en el ciclo celular
2na vez que una clula progresa ms all del punto de restriccin se ve irreversiblemente obligada a entrar en la fase
*. Las ciclinas de tipo 4, las .4c y la protena #b son elementos del sistema de control que regulan este pasa/e. Los
niveles elevados de ciclina 4( se encuentran en muc!os cnceres !umanos, por e/emplo, por translocacin de su
gen !acia el control de un promotor ms activo. 7ambin se !an visto mutaciones con prdida de funcin de p(G "por
delecin de su gen o metilacin de su promotor& lo que evita que se in!iba la actividad del comple/o ciclina 45.4c
=@G. )or otro lado, la inactivacin de #b causa efectos similares.
=.3. )rotena p30
La protena p30 es un sensor esencial para la regulacin del punto de control que detiene clulas con 4$% da-ado
en 8(. 7odas las mutaciones p30 eliminan la capacidad de unirse a secuencias especficas de 4$% y activar la
expresin gnica. Est presente en niveles muy ba/os en las clulas normales por su extrema inestabilidad y su
rpida degradacin. El da-o del 4$% por radiacin gamma o por otros factores causantes de estrs activan %7E, una
quinasa que fosforila y estabiliza el p30, lo que aumenta su concentracin. El p30 activa la expresin de p! cuyo
producto proteico se unir e in!ibir los comple/os de ciclina5.4c de 8(.
)or otra parte, p'( y otras dos protenas inducidas por la p30 in!iben el comple/o ciclina >5.4c( necesario para
entrar en la mitosis !aciendo que las clulas se detengan en 8'. %dems, p30 reprime la expresin de los genes que
codifican la ciclina > y la topoisomerasa NN tambin necesarias para la transicin !acia la mitosis.
La forma activa de p30 es un tetrmero de cuatro subunidades idnticas. 2na mutacin puntual con sentido errneo
en uno de los dos alelos de pA3 en una clula puede anular casi toda la actividad de p30, por lo que act,a como una
mutacin dominante.
En condiciones de estrs, la quinasa %7E fosforila y activa a .!J', una quinasa de la fosfatasa .dc'3% que la
marca para ser degradada. .dc'3% elimina el fosfato in!ibidor en .4c', un prerrequisito para que las clulas entren
en fase *, por lo que sus niveles disminuidos bloquean la progresin !acia la fase *.
55
La actividad de p30 suele mantenerse en niveles ba/os por Edm', una protena que la marca para ser ubiquitinada
posteriormente. *in embargo, el gen 3dm es activado por p30 y est amplificado en muc!os sarcomas, lo que
disminuye el nivel de p30.
La actividad de p30 tambin est in!ibida por una protena de algunos virus. .abe recordar que el p30 tambin est
presente en la produccin de protenas proapoptticas y enzimas de reparacin del 4$%.
Los tumores causados por la prdida de p30 son difciles de tratar que la apoptosis no puede inducirse y la
efectividad de los tratamientos quimioteraputicos y radioteraputicos est notablemente disminuida.
=.G. 8enes apoptticos
*i las clulas no se mueren cuando debieran y contin,an proliferando, se puede formar un tumor por acumulacin
lenta de las mismas. La mayora de las clulas que presentan este comportamiento poseen translocaciones
cromosmicas que activan un gen denominado bcl que bloquea la apoptosis, de a! que su sobreexpresin evite la
apoptosis normal. Ltros genes, como el <0#" y pA3, estimulan la apoptosis y se comportan como supresores de
tumores.
=.[. %neuploida
La mayora de las clulas tumorales son aneuploides, es decir, presentan un n,mero aberrante de cromosomas.
Esto se debe a que el punto de control de ensambla/e del !uso es no funcional, como tantos otros.
(. )arcingenos 1 reparacin del da:o
La mayora de las clulas cancerosas carecen de uno o ms sistemas de reparacin del 4$% lo que explicara la
gran cantidad de mutaciones que acumulan. Es a,n, algunos mecanismos de reparacin introducen por s mismos
errores en la secuencia nucleotdica.
7odos los carcingenos son mutgenos. Este efecto es proporcional a su capacidad para transformar clulas e
inducir cncer. Existen dos tipos de carcingenos6
a& Los de accin directa, reactivos electrfilos que reaccionan con nitrgeno y oxgeno en el 4$% lo que modifica las
bases de ste, como el 4E*.
b& Los de accin indirecta, que son compuestos no reactivos insolubles enagua que son cancergenos luego dela
introduccin de centros electrfilos. %lgunas enzimas !epticas suelen !acerlo para solubilizarlos y permitir su
excrecin, convirtiendo en carcingenos incluso a molculas inofensivas.
4e !ec!o, el benzopireno del !umo del cigarrillo es carcingeno debido a la actividad de estas enzimas, afectando
fundamentalmente al gen pA3.
3.(. 7elmeros y cncer
El acortamiento extenso de telmero es detectado como un tipo de da-o del 4$%, con la consecuente estabilizacin
y activacin de p30. La mayora de las clulas tumorales superan este destino expresando telomerasa, lo que es
esencial para la inmortalidad. Es un blanco importante de nuevas drogas.
+. 4iologa #olecular 1 .ncologa m,dica
G.(. Earcadores tumorales
2n marcador tumoral es una sustancia que puede descubrirse en cantidades mayores que las normales en la
sangre, orina o te/idos de pacientes con un tipo determinado de cncer. *on producidos por el propio tumor o por el
cuerpo como respuesta a ste. *in embargo, su determinacin no es suficiente para el diagnstico debido a que
puede elevarse en otras condiciones aleatorias, e incluso puede no elevarse en personas con cncer. Esto limita su
espectro de utilizacin.
%lgunos marcadores tumorales comunes son6
#arcador tumoral Tumor indicado
%ntgeno prosttico especfico "*)%& 4e prstata
Wosfatasa cida prosttica 4e prstata
.% ('3 4e ovario
%ntgeno carcinoembrionario .olorectal metastsico
.% (350 4e seno "avanzado&
Enolasa neurono especfica $euroblastoma, carcinoma de pulmn, melanoma y cnceres urogenitales.
Nntegrina Q( 4e seno
%ntgeno especfico epitelial 4e seno y de pncreas
*ca( Nntestintal, !eptico y pancretico
Los marcadores tumorales se descubren fundamentalmente mediante microarrays de 4$%, donde se puede
comparar la expresin de todos los genes de una clula de un te/ido normal y uno canceroso. %s se nota
rpidamente la sobreexpresin de ciertos genes en te/ido canceroso que puede servir como identificacin de la
existencia y el tipo de tumor. $o obstante, es bastante costoso, por lo que se ve reemplazado por #75).#.
)or otra parte, algunas tcnicas protemicas tambin son utilizadas com,nmente. )or e/emplo, el E%L4N57LW o los
microarreglos inmunoqumicos. $o obstante, estas tcnicas son costosas y aplicables fundamentalmente luego del
periodo de investigacin.
G.'. 7erapia gnica
La promesa ms importante en el tratamiento y la cura del cncer es la terapia gnica. sta es la introduccin de
genes normales en clulas que contienen genes defectivos para reconstituir un producto proteico perdido o alterado,
lo que corregir el fenotipo deficiente. Es inocua para la descendencia y puede realizarse de dos maneras6
56
a& Nn vivo, mediante vectores virales que transportan el gen deseado e CinfectanD a las clulas blanco. Es claro que el
virus est atenuado para evitar su recombinacin.
b& Ex vivo, mediante la insercin gnica fuera del cuerpo seguida por su retorno. Esto facilita las tcnicas utilizadas
para la transfeccin del gen, como ser electroporacin, utilizacin de liposomas, biolstica, cromosomas artificiales,
etc.
G.0. 8enes suicidas
*e basa en la derivacin de un gen exgeno a las clulas tumorales ya avanzadas, donde sintetizar una enzima
determinada. )osteriormente, se administrar una prodroga inerte para las clulas normales, pero que puede ser
convertida a la droga activa y citotxica en las clulas tumorales de manera de matarlas.
%ctualmente se utiliza en la transformacin del ganciclovir "un nuclesido similar a guanosina con un az,car acclico
que se activa generando el trifosfato, lo que detendr la replicacin& en una droga citotxica que es ,til en la muerte
de clulas tumorales y cuya eficiencia es mayor por el efecto bystander, donde el sistema inmune elimina adems las
clulas normales cercanas a las tumorales muertas para erradicar completamente el tumor. Es muy aplicada en
casos de infecciones con virus carcingenos
G.=. 7erapia antisentido
*e basan en el agregado de ciertas macromolculas de secuencia conocida que se unan irreversible y
especficamente a otras "com,nmente m#$%, pero tambin puede aplicarse sobre 4$% o protenas& e in!ibir su
actividad. El mecanismo de interferencia es muy variado y amplio, desde detener al ribosoma como activar #$%sas.
Encontrando un mtodo de insercin eficaz de estas molculas antisentido a las clulas tumorales, se podr tratar
fcilmente el desarrollo de cnceres por in!ibicin de ciertos productos esenciales para su actividad que son
especficos de las clulas tumorales.
57
Parte II
Parte II
Herramientas
Terico-Prcticas de
Tcnicas Usuales
utilizadas en la
Biologa Molecular
58
Tema 1: 1n0ima de retriccin
1. 2eneralidades
%ntes de (A[<, no exista ning,n mtodo para cortar molculas de 4$% en puntos discretos y reproducibles. .on los
que se contaba, eran no especficos "por e/emplo, por endonucleasas& o generaban fragmentos muy peque-os "por
e/emplo, los mtodos qumicos&. *lo la ruptura mecnica poda ser medianamente controlada, generando
fragmentos inespecficos de unos 0<< pares de bases. 4urante la dcada de (AG<, varios bilogos estudiaron los
fenmenos de restriccin del !usped sobre material gentico exgeno, lo que culmin con el descubrimiento de
ciertas endonucleasas de restriccin de #. coli, que reconoca secuencias determinadas y cortaba al 4$% en
fragmentos grandes. *in embargo, sta cortaba al 4$% al azar a una distancia relativamente grande del sitio de
reconocimiento. #ecin a mediados de (A[< se pudo aislar una enzima de H. influen$ae que reconoca una
secuencia particular del 4$% doble !ebra, y la cortaba especficamente en ella, dando fragmentos reproducibles y
discretos.
Es all que esto representa un obstculo a la !ora de recombinar 4$% exgeno en clulas bacterianas, abri un
captulo importante en la biotecnologa al permitir la manipulacin de molculas de 4$%.
2. Sistemas de modi/icacin 1 restriccin
Las bacterias poseen sistemas de restriccin que les permiten monitorear el origen del 4$% que ingresa en ellas, y
destruirlo si es reconocido como exgeno. Las enzimas que realizan esta tarea, reconocen secuencias especficas
del 4$% y lo rompen en fragmentos, en sitios especficos o aleatoriamente.
.uando una bacteria es inyectada con 4$% exgeno, ya sea porque lo toma del medio, o porque es introducido por
un bacterifago, detecta las secuencias especficas, y una endonucleasa de restriccin lo degrada en fragmentos
peque-os que pueden ser sustratos de endonucleasas inespecficas capaces de degradarlos completamente. La
bacteria !usped debe proteger su propio 4$% de este sistema, por lo que modifica su propio 4$% mediante la
metilacin de ciertas bases en algunas secuencias cortas y puntuales, fundamentalmente, las de reconocimiento por
el sistema de restriccin. 4e aqu vemos que los sistemas de modificacin5restriccin son necesariamente
coordinados. .abe destacar que la restriccin no es absoluta. Existe cierta probabilidad "<,<<<(& de que el 4$%
exgeno modifique el 4$% del !usped.
'.(. 7ipos
.!.!. 0ipo (
Wue el primero en ser caracterizado. La enzima activa consiste en dos subunidades de restriccin, dos metilasas y
una de reconocimiento "hsd)&. *e denomina sistema hsd+, y su actividad metilasa "hsd3& act,a sobre adeninas,
mediante la utilizacin de %7) y *5adenosilmetionina. Las secuencias reconocidas, generalmente son extensas y no
presentan simetra, mientras que el corte se realiza unos mil pares de bases ale/ados del sitio de reconocimiento. $o
obstante, como la metilacin se lleva acabo por el mismo comple/o enzimtico que cataliza el corte, el 4$% podra ser
metilado antes de ser cortado. Esto representa un notable obstculo para utilizarlas en manipulacin gnica.
.!.. 0ipo (((
)oseen un comportamiento similar a las del tipo N, aunque reconocen secuencias simtricas y cortan a unos '3 pares
de bases de distancia. )or otra parte, tambin se notan las actividades metilasas y nucleasas en el mismo comple/o
enzimtico. ste, en cambio, slo contiene una subunidad de restriccin y una de modificacin.
Los sistemas de metilacin que se utilizan, puede ser tanto el hsd3 como otros, entre los que encontramos al
sistema dam "que metila adeninas en secuencias 8%7.& o el sistema dcm "que metila la segunda citosina en
..%"7&88&.
.!.3. 0ipo ((
*on las ms ,tiles en modificacin gentica. En primer lugar, el sistema de restriccin y el de modificacin se
encuentran en distintas enzimas, por lo que se puede cortar el 4$% sin modificarlo. En segundo lugar, la actividad de
restriccin no requiere %7) o *5adenosilmetionina "aunque s requieren magnesio& lo que facilita su uso in Kitro.
%dems, reconocen secuencias definidas y simtricas, que sern cortadas, en muc!os casos, de forma escalonada.
%dems del tipo NN, existe el tipo NNs con las mismas caractersticas que las del tipo NN, pero que no cortan en la
secuencia de reconocimiento, lo que tambin las vuelve in,tiles.
'.'. 2tilizacin prctica
Las enzimas de restriccin de tipo NN cortan el 4$% !idrolizando el enlace fosfodister. Esto generar un extremo 01,
con un !idroxilo terminal, y uno 31 con un fosfato terminal. Las enzimas de restriccin "e.r.& se podrn clasificar
dependiendo del tipo de corte que realizan. %lgunas de ellas generan extremos romos "flush ends& mientras que
otras, extremos co!esivos "sticky ends&. )or lo general, las enzimas que de/an extremos co!esivos, de/an e1tremos AB
protruding, es decir, la cola mas larga de cada extremo, es la que acaba en el 315). %mbos tipos de e.r. pueden
usarse en manipulacin gentica. *in embargo, se prefiere traba/ar con los fragmentos de extremos co!esivos, ya
que stos tienen dos venta/as, en primer lugar permiten la !ibridacin complementaria, lo que permite una unin
especfica, mientras que en segundo lugar, los enlaces dbiles entre las bases complementarias otorgan mayor
fuerza de unin al !brido lo que lo estabiliza para ser ligado covalentemente.
El descubrimiento de un gran n,mero de sistemas de restriccin y modificacin, requiri una nomenclatura uniforme.
%ctualmente se utiliza el sistema de *mit! y $at!ans, que se basa en que a& La especie de la que deriva, se identifica
como una serie de tres letras, la primera del gnero y las dos primeras de la especie, lo que se escribe en cursiva, b&
*i se obtiene a partir de una cepa en particular, tambin debe identificarse, pero sin escribirla en cursiva, c& *i existe
ms de un sistema de restriccin5modificacin en esa cepa, se identificar con n,meros romanos.
59
La mayora de las e.r. reconocen secuencias de entre cuatro y oc!o nucletidos que son palndromos. 2sualmente,
se escribe la secuencia de reconocimiento de una sola !ebra, en direccin 3101. .uando la e.r. realiza el corte, los
fragmentos generados podrn asociarse entre s, o podrn asociarse consigo mismos para generar un fragmento
circular "particularmente, si son co!esivos&.
*e !an encontrado ms de 0<<< enzimas de restriccin, cada una con una secuencia consenso distinta. %lgunas
presentan la misma secuencia de reconocimiento y sitio de corte que otras, se denominan isoes>ui$meros, mientras
que si poseen la misma secuencia de reconocimiento pero cortan en un punto distinto, sern neoes>ui$meros.
La actividad nucleoltica de las e.r. depende en gran medida del p+ y la fuerza inica del medio. 2sualmente, se
utilizan buffers que mantengan el p+ levemente alcalino "[,G aproximadamente, con 7ris5+.l&, ptimo para la mayora
de las e.r. *in embargo, la fuerza inica es un parmetro de mayor variabilidad, encontrando e.r. de ba/a, media y alta
fuerza inica, la cual se regula con concentraciones mayores o menores de cloruro de sodio. %lgunas e.r. presentan
acti*idad star, es decir, una variabilidad de la especificidad de su sitio de reconocimiento por las condiciones de
incubacin "p+, fuerza inica, concentracin de magnesio, concentracin de enzima, otros solventes, etc&.
3. En$imas de restriccin 1 manipulacin bacteriana
*i 4$% extra-o es introducido dentro de #. coli, ser atacado por su sistema de restriccin. )or esto, es usual
emplear una cepa de #. coli deficiente en su sistema de restriccin, #. coli c('. *i adems, esta cepa es proficiente
en su sistema de modificacin, el 4$% exgeno incorporado ser modificado y podr propagarse a la descendencia.
)or otra parte, ciertas cepas poseen sistemas de restriccin que reconocen secuencias metiladas en sitios
especficos. *i no se eliminan, tambin sern problemticas, incluso con material genmico que proviene de otras
bacterias o plantas. 7anto el sistema de restriccin, como el de modificacin, como el de restriccin5modificacin para
secuencias metiladas de #. coli se encuentran contenidos en un sitio de unas catorce mil bases conocido como
regin de control de inmigracin, que puede ser defectuoso por mutaciones puntuales.
Las enzimas de restriccin tambin sirven para identificar microorganismos y para mapear algunas secuencias. 2n
fragmento relativamente grande de 4$% va a dar un patrn de fragmentos especfico si se lo trata con la misma
enzima de restriccin. )or otra parte, tratando a un fragmento con dos e.r. distintas, se puede mapear en parte la
secuencia, y encontrar la ubicacin y la distancia relativa entre sus secuencias consenso.
0.(. 4$% quimrico y manipulacin gentica
La utilizacin de e.r. de tipo NN que de/an extremos co!esivos, se vio notablemente aumentada al comenzar a pensar
en la posibilidad de generar 4$% quimrico, es decir, unir fragmentos in 9itro de 4$% de distinto origen cortados con
la misma enzima de restriccin lo que permitir su unin especfica.
)ara que esto suceda, se necesita alg,n mtodo de ligacin de las cadenas de 4$% rotas6 la accin de la 4$%
ligasa. )ara extremos co!esivos, se pueden utilizar la 05 4"A ligasa, dependiente de %7), que adenilar el extremo
fosfato libre para permitir el ataque nucleoflico del ox!idrilo, o la #. coli 4"A ligasa, dependiente de $%4+, con
similar mecanismo de activacin. *in embargo, para extremos romos solo se utiliza la 7= 4$% ligasa.
La temperatura ptima para la ligacin es 0[H, pero a esa temperatura, los enlaces dbiles entre los extremos
co!esivos son inestables, por lo que se observa una gran cantidad de errores. )or eso, se realiza entre = y (3H.,
temperatura a la que se presenta la mayor eficacia velocidad5precisin. )ara extremos romos, en cambio, se utilizar
la temperatura ptima y una gran concentracin de enzima.
7ambin se puede ligar el 4$% mediante la 4$% topoisomerasa "rpida, y exclusivamente en pares %;7&, y la #$%
ligasa, permitiendo generar !bridos #$%54$%.
Tema 2: 1n0ima utili0ada en la manipulacin de
#ene
1. Polimerasas
(.(. )olimerasas ubicuas
Las polimerasas son las enzimas que catalizan la polimerizacin de nucletidos para generar una molcula de cido
nucleico. )or lo tanto, estn involucradas en una gran cantidad de procesos celulares, como la replicacin del 4$%,
su reparacin, su recombinacin, la transcripcin, etc.
7oda 4$% polimerasa requiere un extremo 015L+ libre para proseguir con la polimerizacin de nucletidos. % esta
actividad se le denomina AB3B polimerasa y es dependiente de la complementariedad de bases. %dems, toda
polimerasa posee la actividad 3BAB e1onucleasa que degrada 4$% desde un extremo 015L+ libre, fundamentalmente
cuando el ,ltimo nucletido incorporado fue incorrecto. %lgunas, a su vez, poseen la actividad AB3B e1onucleasa que
degrada 4$% desde una mella, puntualmente a partir de su extremo 31 libre, lo que se utiliza para reemplazar los
cebadores de #$% con 4$%.
7oda 4$% polimerasa puede cometer errores, ya sea la incorporacin de nucletidos inapropiadamente apareados,
o la ruptura del marco de lectura "por agregado de un nucletido de ms, o la eliminacin de uno&. )or otra parte,
existen mecanismos de aumento de la precisin de la polimerizacin, llevados a cabo por actividades exonucleasas
que sirven de proofreading, en direccin inversa a la sntesis de 4$%.
2na de las polimerasas ms utilizadas es la 4$% polimerasa N de #. coli compuesta por dos subunidades, la
peque-a con actividad 3101 exonucleasa y la grande "o de clenoK& que polimeriza y realiza el proofreading. sta
,ltima es la que muestra la mayor versatilidad de uso, ya que se puede manipular para eliminar extremos romos,
agregar nucletidos marcados radioactivamente para visualizarlos por autorradiografa, sintetizar segundas cadenas,
o !acer random priming.
60
El random priming es una tcnica por la cual se incuban 4$% de simple !ebra con oligonucletidos sintetizados al
azar, adems de una mezcla de nucletidos trisfosfato radiactivos y no radiactivos. El fragmento de clenoK podr
extender los oligonucletidos que se unan aleatoriamente al 4$%, generando fragmentos de !asta '<< nucletidos
marcados radiactivamente.
7ambin se utiliza para la nick translation, reemplazando un sector de un fragmento de 4$% nicJeado con
nucletidos marcados, ya sea radiactivamente, como por anticuerpos o colorantes.
(.'. 7= 4$% polimerasa
La polimerasa 7= de #. coli posee un uso bastante importante en la manipulacin gentica. Es all que no se
diferencia notablemente del fragmento de clenoK tpico de cualquier )ol N, sus actividades polimerasa y exonucleasa
pueden controlarse externamente seg,n las concentraciones de d$7) en el medio.
*e utiliza para eliminar extremos co!esivos, transformndolos en romos, para marcar extremos 01 y para
replacement synthesis. *e denomina as a una marcacin extensiva generada al incubar el fragmento de 4$% sin
d$7)1s, lo que activa su actividad exonucleasa 0131, degradando los extremos 01 "!asta un =<B&, y al agregar
d$7)s marcados, se extendern !asta que termine el molde.
(.0. 7[ 4$% polimerasa
Es una polimerasa de #. coli con una elevada procesividad, lo que la transforma en ideal para sintetizar fragmentos
largos. )or otra parte, se !an modificado genticamente para eliminar su actividad exonucleasa 0131 "sin afectar su
actividad polimerasa& para utilizarla en la incorporacin de anlogos a nucletidos ,tiles en mtodos de ingeniera
gentica, como nucletidos dideoxigenados, o marcados. Estas polimerasas son las )e>uenase.
(.=. )olimerasas termoestables
La aparicin de la reaccin en cadena de la polimerasa, requiri la purificacin de polimerasas que pudiesen soportar
y ser activas a altas temperaturas, para que los ciclos de desnaturalizacin5polimerizacin sean ms rpidos y
efectivos. %s, se aislaron algunas polimerasas de organismos termoresistentes, como el 0hermus a>uaticus,
<yrococcus furiosus o 0hermococcus litoralis. %s se pudieron aislar polimerasas como la 7aq, la )fu y la 7li
respectivamente.
La 7aq es la ms utilizada, ya que es muy fcil de purificar. )olimeriza ptimamente a M<H, mientras que un descenso
de la temperatura la inactiva en un gran nivel. 2n gran inconveniente es su carencia de actividad proofreading, lo que
eleva notablemente su tasa de error. 4e a! que se usen cada vez ms la )fu y la 7li, tambin termoestables y con
actividad exonucleasa, adems de que puedan soportar temperaturas a,n mayores a la ptima durante un tiempo
considerable.
(.3. )olimerasas independientes de molde
.iertas polimerasas permiten el alargamiento de las dobles !ebras sin necesidad de un molde para que esto suceda.
2na de ellas, la transferasa terminal tiene un uso bastante com,n en manipulacin gentica, y que permite agregar
una cadena de un mismo d$7) dependiendo del catin divalente con el que se enriquezca el medio. sta cataliza el
agregado sin molde sobre un extremo 015L+ libre "si es protruyente, me/or&. La velocidad de agregado de nucletidos
suele ser ba/a, pero permite generar extremos co!esivos fcilmente, incluso en muestras que no los posean de
manera natural.
(.G. 4$% polimerasas dependientes de #$%
.iertos retrovirus poseen genomas de #$%, pero requieren 4$% para cumplir sus funciones biosintticas
fundamentales, adems de utilizarlo en su ciclo infectivo. )ara esto utilizan ciertas 4$% polimerasas que utilizan #$%
como molde, que se conocen como transcriptasas re*ersas.
*e utilizan varias, denominadas seg,n su origen, tales como la %E9 "del virus de la mioblastosis aviar& o la EEL9
"del virus de la leucemia murina de Eoloney&. )or lo general, necesitan un primer que se sintetiza aleatoriamente
como un oligo de poli7. .abe destacar que las transcriptasas reversas poseen actividad 4$% polimerasa, pero es de
velocidad y procesividad ba/a, y carece de su actividad correctora de pruebas. )or otra parte, en ciertas condiciones
especiales, puede actuar como una #$%sa +.
*e utiliza en ).#s especiales, que parten de #$% "particularmente, de m#$%& lo que permitir amplificar cadenas
de 4$% copia sin intrones para clonar en un plsmido.
(.[. #$% polimerasas
*e utiliza una gran variedad de #$% polimerasas. El principal inconveniente recae sobre el !ec!o de que los
transcriptos de ms de 3<< bases y por la ba/a especificidad que pueden presentar con los promotores, lo que
disminuye la velocidad y la procesividad de la sntesis.
4e a! que se usen polimerasas obtenidas a partir de fagos "7[, 70, *)G, etc& que reconocen especficamente un
promotor distinto "de unas '< pb&, son muy procesivas, rpidas "ms de diez veces que la usual de #. coli& y muy
eficaces. $o obstante, esto requiere la comercializacin de plsmidos especficos que contienen el promotor
especfico, como ser el p>luescript.
*e necesita sintetizar artificialmente #$% porque muc!as sondas ,tiles en mtodos biotecnolgicos son de este tipo
de cido nucleico? adems, es necesario en el estudio de la trancriptmica del genoma, y adems, muc!os vectores
son ,tiles en la expresin de genes para estudiar los productos proteicos que genera "los *ectores de e1presin&.
)or otro lado, existen ciertas #$% polimerasas que no dependen de 4$% para cumplir sus funciones, sino que no
requieren molde, y agregan nucletidos en el extremo 015L+ dependiendo de la concentracin de $7) en el medio.
2na de ellas, la poliA polimerasa, agrega una cola de poli"%& lo que permitir sintetizar c4$% a partir de su producto,
utilizando un oligonucletido artificial de poli7. %dems si el %7) utilizado para este proceso est marcado de alguna
manera, tambin permitir el seguimiento del producto.
2. .tras en$imas
'.(. Wosfatasas alcalinas
61
*e !a notado una gran incidencia de errores en el clonado de algunas bacterias mediante plsmidos sintetizados in
9itro. Esto sucede porque el corte de stos con enzimas de restriccin permite la dimerizacin del mismo, o el cierre
espontneo nuevamente sin capacidad de unir el inserto en su interior.
)ara evitar esto, se utilizan las fosfatasas alcalinas, provenientes de bacterias ">%)& o de intestinos de ternero ".N)&,
que catalizan la eliminacin del 315) de un plsmido linealizado por una e.r., lo que evita que se circularice o dimerice.
.uando un inserto "cortado por la misma e.r.& est presente en el medio, sus fosfatos podrn ser utilizados por las
ligasas para cerrar el plsmido, quedando una mella en cada !ebra de 4$% que luego ser sellada en la bacteria
!usped.
'.'. 7= polinucletido quinasa
Es una enzima reversible que cataliza la transferencia de fosfatos R entre el %7) y un polinucletido, puntualmente
sobre su ox!idrilo 31.
*e utiliza para el marca/e de polinucletidos desfosforilados en esta posicin "necesarios para el agregado de linJers
o adaptadores&, y para el marca/e de extremos 31 con fosfatos radioactivos. )ara cumplir esta ,ltima, se requerir un
tratamiento inicial en ausencia de %7) y gran concentracin de %4) "actividad de intercambio&, y luego uno con %7)
marcado en R "acti*idad forDard&.

3. ucleasas
0.(. Exonucleasas
2na e1onucleasa es una enzima que cataliza la eliminacin de nucletidos de un polinucletido de %4$, desde
alguno de sus extremos.
Existen exonucleasas que act,an sobre cadenas simples "Exo9NN& o sobre cadena doble. 4entro de estas ,ltimas, las
ms usadas son6
a& l5Exo, que !idroliza los extremos 315) de una cadena de doble !ebra de 4$%. 4e esta manera, generar un
extremo 315L+ capaz de extenderse con la transferasa terminal. 7ambin se utiliza la gen[, pero es menos procesiva.
b& ExoNNN, que !idroliza extremos 015L+ de una cadena de doble !ebra de 4$%. $o es muy utilizada en la actualidad
debido a su ba/a procesividad, y a su dependencia con la naturaleza de las bases a degradar.
0.'. Endonucleasas
2na endonucleasa es una enzima que cataliza el corte de un polinucletido de %4$, pero en una posicin interna.
Entre las ms utilizadas encontramos a6
a& *(, que act,a sobre cadena simple, por lo que sirve para remover fragmentos de cadena simple. Esto es necesario
al necesitar extremos romos, al poseer 4$% con !orquillas o en mtodos de anlisis puntuales.
b& >al0(, degrada el 4$% de cadena simple lineal en donde detecte mellas, y degrada el 4$% de cadena simple
circular, donde detecte simples !ebras.
c& Eung >ean, es similar a *(, ,til fundamentalmente en extremos protruyentes 31 "y no en 01& ya que es ms fcil de
controlar. 8enera mellas en regiones ricas en %;7.
d& 4$%sa N, requiere cationes divalentes y su actividad depende de stos. *i se agrega magnesio al medio, mella en
4$% duplex, mientras que si se agrega manganeso, lo corta.
e& Eicrococcal, degrada inespecficamente cidos nucleicos, tanto 4$% como #$%, tanto doble como simple !ebra.
0.0. #ibonucleasas
*e utilizan cuando es necesario eliminar el #$% del medio, ya que puede funcionar como una interferencia. Existen
dos tipos fundamentales, las del tipo + "que es especfica para d,plex #$%54$%& y las del tipo % "que degrada todo
tipo de #$% en el medio&. La primera se utilizar en la sntesis de c4$% "para eliminar el #$% inicial& mientras que la
segunda, en la purificacin de preparaciones de 4$%.
Tema 3: 2ectore de 3lonado
1. 8ectores de clonado
2n paso fundamental en la modificacin gentica de clulas para permitir que se puedan obtener productos de
ingeniera gentica, es la introduccin del 4$% modificado a las clulas !usped. )ara !acer esto, se utilizan ciertas
molculas de 4$% ms simples y peque-as, denominadas genricamente *ectores de clonado, que pueden provenir
de plsmidos o de fagos. En el primer caso, el material gentico se encuentra libre y sin proteccin extra, mientras
que en el segundo, existe una cpsula proteica que lo rodea y protege.
2. Plsmidos
2n plsmido es una molcula de 4$% circular de cadena doble "aunque no siempre, tal como en el caso de
)treptomyces&, que puede estar cerrado covalentemente en ambas cadenas "..., o co*alently closed circles7 o solo
en una "L), o open circles&, usualmente presentando los primeros superenrrollamiento. Estn muy distribuidos entre
los procariotas, y poseen un tama-o que vara desde los (<
=
!asta los (<
M
daltons. Euc!os de ellos son utilizados por
las bacterias para transferir y almacenar informacin gentica que es capaz de generar fenotipos apreciables en el
organismo. %quellos cuya funcin todava no se conoce, se denominan pl-smidos cr%pticos.
'.(. .lasificacin
Los plsmidos pueden agruparse en dos tipos6 con/ugativos y no con/ugativos. Los pl-smidos con,ugati*os poseen
un set de genes de transferencia "los genes tra& que promueve la con/ugacin bacteriana, y suelen presentarse en
n,mero en las clulas entre uno y tres, pudiendo este ser variable "en los plsmidos con/ugativos rela,ados& o ser fi/o
"en los plsmidos con/ugativos rigurosos&? por otra parte, suelen tener un peso molecular elevado. Los pl-smidos no
con,ugati*os no pueden con/ugarse con el material gentico bacteriano, y suelen presentarse en un gran n,mero de
copias por clula y con un ba/o peso molecular.
62
'.'. *itios de replicacin
Los plsmidos codifican para pocas protenas requeridas para su propia replicacin "a veces, incluso para una sola&
y generalmente stas se encuentran codificadas cerca del origen ori, por lo que el material gentico exgeno puede
incorporarse en el resto del plsmido y la replicacin no se ver afectada. Los plsmidos cuyo ori deriva de plsmidos
de #. coli poseen un rango de husped "!ost range& restringido a bacterias entricas. Ltros plsmidos, los
promiscuos, poseen un rango de !usped ms amplio, pudiendo llegar a las bacterias 8ram negativas o incluso
cualquier tipo de bacteria. Esto exigi la posibilidad de stos para sintetizar todas las protenas que requieren para su
actividad, y adems que la maquinaria traductora de cualquier especie pueda utilizarse con este fin.
'.0. Elementos !abituales en plsmidos
Los plsmidos de mayor utilizacin en biologa molecular poseen ciertas caractersticas estructurales fundamentales,
entre ellas6
a& 2n replicador, es decir, un segmento de 4$% que contiene al origen de replicacin y los genes que codificarn
protenas que necesitar el plsmido para su replicacin en el !usped.
b& 2n marcador, es decir, uno o ms genes que codifiquen para productos que otorguen al !usped la capacidad de
desarrollar una caracterstica fenotpica que permita distinguirlo de los que no posean el plsmido. 2no de los ms
utilizados es la resistencia a antibiticos, fundamentalmente la ampicilina, por el gen amp+.
c& 2n sitio de m&ltiple clonado9 )3C o polilinker, una regin que contiene una serie de secuencias especficas
reconocidas por enzimas de restriccin y permitir el cortado del plsmido para insertar 4$% exgeno.
'.=. $,mero de copias de un plsmido
Est determinado por la regulacin del inicio de la replicacin del mismo. Existen dos mecanismos principales para
controlarla6 la regulacin por #$% antisentido, y la regulacin por unin de protenas esenciales a iterones.
La mayora utiliza el primer mecanismo, en el que se ve un cebador para la replicacin de 4$% de 333
ribonucletidos "llamado +"A ((&, que solo ser ,til si es cortado por una #$asa + de/ando un 015L+ libre. 2na
molcula peque-a de #$% "el +"A ( de (<M bases& puede comple/arse con #$% NN lo que impide su escisin. El
control de la concentracin de #$% N se da simplemente por dilucin del mismo en el medio, cuando la clula
!usped crece.
2na protena codificada por el plsmido "la prote%na #op& mantiene el n,mero de copias estable al estabilizar el
dmero #$% N@#$% NN, por lo que la in!ibicin se ve a ba/as concentraciones de #$% N.
'.3. Estabilidad segregativa
La prdida de plsmidos debida a su particin defectuosa se denomina inestabilidad segregati*a. Los plsmidos
naturales son estables gracias a genes par que aseguran su mantenimiento en cada divisin celular,
fundamentalmente si estn en ba/o n,mero de copias. $o obstante, se nota que la carencia de los genes par se !ace
notar en el caso de condiciones externas de stress.
'.G. Nncompatibilidad entre plsmidos
4os plsmidos son incompatibles cuando no pueden coexistir en la misma clula a pesar de que no !aya presin de
seleccin. Existen distintas incompatibilidades, que causan que dos plsmidos sean finalmente incompatibles. Esto
permite organizar a los plsmidos en grupos mutuamente incompatibles entre s, que dependen de cada especie
bacteriana.
La incompatibilidad se genera por compartir el mismo mecanismo de control de la replicacin, es decir, por poseer el
mismo #$% NN, la misma regin par o por ser defectuosos en su sistema de segregacin.
'.[. Lpern Lac
2na caracterstica usualmente observada en los vectores plasmdicos de clonacin es la modificacin de la actividad
del opern Lac. En una bacteria en su estado natural, el opern Lac codifica para tres enzimas ,tiles en el
metabolismo de la lactosa6 la J2galactosidasa "lac Z& que !idroliza el enlace entre la glucosa y la galactosa, la lactosa
permeasa "lac L& que permite el ingreso del disacrido al citosol, la lactosa transacetilasa "lac A& y un in!ibidor de la
transcripcin de los tres genes, lac (. ste sintetiza un factor de transcripcin que realizar su funcin in!ibitoria si no
est unido a un efector, la alolactosa "o anlogos&. 4e esta manera, la alolactosa u otras molculas relacionadas
funcionan como inductores de la expresin de este set de protenas.
El opern Lac puede utilizarse en biologa molecular, ya que el polilinJer se suele situar en el medio del gen lacZB que
codifica para la subunidad O de la Q5galactosidasa. *lo cuando la subunidad O se une a la subunidad \, la enzima
podr ser funcional, y esto suceder si el vector plasmdico no es cortado, o si es religado sin incorporar ning,n
inserto de 4$% en su interior.
)ara detectar la actividad de la enzima, se utilizan dos compuestos orgnicos similares a la lactosa6 el N)78 "o
isopropiltiogalactsido&, un anlogo a la alolactosa que puede funcionar como inductor, y el Y5gal "o 35bromo5=5cloro5
05indolil galactopiransido&, un anlogo a la lactosa que puede servir como sustrato de la Q5galactosidasa,
degradndose por sta en galactosa y azul de indol capaz de dimerizar y generar un precipitado azul que ti-e a toda
la clula !usped. 4e esta manera, las colonias azules provienen de clulas que fueron transformadas por el
plsmido pero ste no incorpor 4$% exgeno.
3. ;ago lambda
El bacterifago l es un virus de #. coli, muy estudiado, y ampliamente utilizado como vector. *u 4$% es una
molcula lineal de doble !ebra de unas =M.3<< pares de bases, cuya secuencia se conoce perfectamente, y con
protuberancias de (' nucletidos simple !ebra en los extremos 31. stos pueden circularizarse al infectar una clula
bacteriana, y se denominan genricamente sitios cos.
0.(. Eaterial gentico
*u 4$% puede dividirse en tres regiones6
a& #egin estructural, que ocupa un =<B, y se encarga de sintetizar las protenas que conformarn la cabeza y la
cola del fago.
63
b& #egin reemplazable, que ocupa el 0<B central, y tiene funciones de recombinacin del 4$% del fago con el 4$%
bacteriano. $o es imprescindible por lo que puede reemplazarse fcilmente por un gen manipulado genticamente
para transformar a la bacteria !usped.
c& #egin ltica, que ocupa el 0< B final, y concentra los genes necesarios para el ciclo infeccioso del fago, que
tambin ser ,til en la transformacin bacteriana. Entre ellos, los sitios $, cro, L, ) y `.
0.'. .iclo infeccioso
El ciclo infeccioso del fago puede dividirse en6
a& Ciclo l%tico, cuando el 4$% del fago es introducido en el interior bacteriano, ste puede religarse en los sitios cos, y
replicarse. 2na de las molculas !i/as podr escindirse en sus sitios cos, y ser empaquetada dentro de un nuevo fago
para infectar otras bacterias.
b& Ciclo lisognico, el 4$% circular del fago "ya dentro del citosol bacteriano&, podr reconocer un sitio !omlogo en el
material gentico del !usped para integrarse a ste y permitir su replicacin continua siguiendo el ciclo celular de la
bacteria.
0.0. 2so como vector
El 4$% del fago lambda posee muc!as secuencias de reconocimiento por enzimas de restriccin, lo que lo vuelve
in,til como vector. *in embargo, se !an producido derivados de l que tienen !asta una secuencia de reconocimiento
por molcula de 4$%, lo que permite la insercin de 4$% exgeno, o poseen dos que permite el reemplazo de la
regin reemplazable del mismo. En cualquiera de los dos casos, la cantidad final de material gentico debe oscilar
entre el [MB y el (<3B de la cantidad usual del mismo, por lo que el segundo camino es el ms utilizado.
4e esta manera, se aprovec!a el ciclo ltico del fago en las bacterias que infecta para propagar el 4$%
recombinante. 8racias a esto, se !an desarrollado y me/orado las caractersticas del fago lambda para extender su
utilizacin en otras tcnicas de ingeniera gentica.
Entre las me/oras efectuadas, se pudo aumentar el tama-o del 4$% exgeno incorporado, cambiar la regin del
polilinJer para aumentar la cantidad de enzimas de restriccin ,tiles, generar mtodos de seleccin para bacterias
transfectadas positivamente, expresar genes eucariotas, etc. %ctualmente se !an conseguido algunos vectores que
pueden incorporar !asta '0 Jpb "por e/emplo, el EE>L0 y EE>L=&, y se !a me/orado el empaquetamiento
espontneo de los vectores in 9itro, lo que permite aumentar notablemente la capacidad de almacenamiento de 4$%.
)or otra parte, tambin se estudia la posibilidad de utilizar vectores del fago l como vectores de expresin.
La gran venta/a de los vectores de fago recae sobre su eficacia de transfeccin. La transformacin bacteriana por
vectores plasmdicos puede tener una eficacia de !asta el (B en condiciones ptimas. En cambio, la transfeccin por
fagos puede llegar a un (<<B de eficacia. 4e aqu que se utilice cuando !ay poco material de partida, o para
almacenar c4$%.
0.=. Wagos filamentosos
.iertos colifagos "fagos cuyo blanco es #. coli& son filamentosos, ya que poseen una molcula de 4$% circular pero
de simple !ebra, y tambin son utilizados como vectores de clonacin. *u material gentico es de aproximadamente
unos G3<< pares de bases "con una gran !omologa entre los distintos tipos de molculas observadas&. Nnfectan a
bacterias entricas, ingresando en ellas por su W pilus. $o obstante, la replicacin del fago no genera lisis del
!usped, sino que excretan partculas de virus capaces de infectar otras "!asta (<<< por clula por generacin&.
.uando el 4$% ingresa a la clula, se convierte en una forma replicativa de doble cadena que generar copias de
4$% de simple !ebra capaces de infectar a nuevas clulas.
%lgunas de las venta/as de su uso recaen sobre la posibilidad de obtener 4$% simple !ebra rpidamente, la
dependencia de la cpside con el 4$% que encierra o la facilidad de detectar la orientacin de los insertos. %lgunos
de los fagos filamentosos ms usados son E(0, f( y fd.
3.5.!. =agmidos
Las venta/as de un fago filamentoso pueden utilizarse dentro de un vector plasmdico. *e !an desarrollado plsmidos
que contienen una secuencia intergnica del fago filamentoso f(, por lo que de acuerdo a los inductores del medio,
pueden expresarlo como 4$% de simple !ebra, con una replicacin muy eficaz. Estos !bridos se denominan
fagmidos, y uno de los ms conocidos es el Bluescript.
ste a su vez, posee los genes que codifican la #$% polimerasa del fago 70 y 7[ por lo que tambin permite la
replicacin de los genes incorporados exgenamente, adems de permitir la seleccin por Lpern Lac y el sistema
de blancas@azules.
0.3. .smidos
Las regiones del 4$% del fago l que son necesarias para su circularizacin y empaquetamiento son muc!o menos
que las mantenidas al reemplazar la regin reemplazable del mismo. *i solo se mantienen los sitos cos, y los sitios de
empaquetamiento, y se agrega un inserto que posea un origen de replicacin ori, un polilinJer y un gen de seleccin
"como el de resistencia a ampicilina&, el empaquetamiento in 9itro de los fagos permitir utilizar este 4$% como
propio e infectar a las bacterias con la eficacia de transfeccin usual. 4e esta manera, se pueden introducir
fragmentos de restriccin muc!o ms grandes "de !asta =3 Jpb&, pero que al infectar bacterias se ciclarn como un
plsmido y funcionarn como tal, ya que se !a eliminado la regin ltica del 4$% del fago.
% estos vectores de fago que darn origen a plsmidos luego de la transfeccin de la bacteria !usped, se los
denomina csmidos y son los vectores de clonado "no eucariotas& que aceptan mayor cantidad de material gentico.
7ambin se !an !ec!o vectores eucariotas, mediante cromosomas artificiales de le*adura que permiten incluir !asta
'<<< Jpb, y cromosomas artificiales de bacterias que permiten incluir !asta 0<< Jpb. stos se utilizan para almacenar
clones de un organismo, con el fin de la identificacin de los mismos, es decir, para crear bibliotecas genmicas.
Tema 4: Tran!ormacin y ,eleccin
64
1. "ntroduccin
La gran mayora de las tcnicas de manipulacin gentica requieren incorporar material gentico exgeno a otros
organismos, ya sean de la misma especie o de especies completamente distintas. 2no de los grandes protagonistas
en este sentido es #. coli, una bacteria 8ram negativa que forma parte de la flora intestinal en mamferos.
4e !ec!o, la cepa ms utilizada de #. coli es la cepa c(', seleccionada artificialmente debido a que no es patgena
"es incapaz de colonizar el intestino !umano debido a sus mutaciones que afectan a la estructura del antgeno L de
su lipopolisacrido&, se duplica rpidamente "en condiciones ptimas, cada veinte minutos& y se puede cultivar
fcilmente.
*u material gentico est compactado en un cromosoma ,nico, en una estructura compacta denominada nucleoide y
posee unos =<<< genes que representan ms de =3<< Jpb. Esta cepa es la ms utilizada en la incorporacin de
material gentico, ya que posee mutada una serie de genes que imposibilitaran esta prctica en cepas salva/es,
como por e/emplo, la eliminacin del sistema de recombinacin.
Las primeras experiencias de transformacin, ms all de !aber sido en pleno desconocimiento de sus limitaciones,
fueron claves para el desarrollo de la biologa molecular actual. En (A'M 8riffit! descubri el factor transformante,
gracias a experimentos bsicos. %isl dos tipos de colonias de 4iplococcus pneumoniae, uno no virulento "#NN& y uno
virulento "*NNN&. %l inyectar los no virulentos a un ratn, este no muere, aunque stos se desarrollan en su organismo.
%l inyectar los virulentos, claramente, el ratn muere.
*in embargo, si se inactiva la cepa *NNN por calor, el ratn no muere, ya que stos no se desarrollan en su organismo.
)or otro lado, si se mezcla el caldo de cultivo conteniendo la cepa *NNN muerta por calor con #NN vivos y viables, el
ratn morir y de su organismo se aslan bacterias virulentas y vivas. Esto indic que existe algo en el interior celular
que puede CtransformarD cepas no virulentas en virulentas. Luego, tratando el caldo de cultivo con distintas enzimas
lticas sobre macromolculas biolgicas "az,cares, lpidos, #$%, protenas, 4$%, etc&, se observ que la ,nica que
tena esta funcin transformante era el 4$%.
2. Trans/ormacin
ste fue uno de los primeros experimentos de transformacin, es decir, de captacin de 4$% desnudo libre del
medio. Euc!as de ellas, como las de la experiencia de 8riffit!, sufren transformacin natural, siguiendo un estado de
competencia, en el que su fisiologa se modifica para ser ms accesible al material gentico externo, aumentando as
su pool de genes y creando nuevas combinaciones de stos lo que les permite obtener nuevas capacidades de
adaptacin al medio en el que se encuentran. El estado de competencia tambin es inducible, ya que se genera tanto
por una realidad gentica "los genes com& como por una realidad circunstancial, por lo que a/ustando las condiciones
de vida de las bacterias, se puede lograr que stas sean ms accesibles.
*e notan tama-as diferencias entre los mecanismos de transformacin de bacterias 8ram positivas y bacterias 8ram
negativas. Las primeras solo permiten el ingreso de 4$% de cadena simple, degradando la otra azarosamente, si el
4$% del medio se encuentra en forma de doble !ebra. Las bacterias 8ram negativas, en cambio, poseen una mayor
variabilidad de mtodo, aunque la mayora permiten el ingreso del 4$% doble !ebra, pero una de ellas se degrada en
el espacio periplasmtico.
'.(. 7ransformacin qumica
La transformacin puede inducirse artificialmente. .omo la transformacin de #. coli es un paso esencial en muc!os
experimentos de clonado, se desea que la eficiencia de la transformacin sea lo ms grande posible. *e !a
encontrado que las clulas de #. coli y los plsmidos de 4$% interact,an productivamente en un ambiente con iones
calcio y ba/a temperatura, seguido de un s!ocJ trmico "este paso es evitable, pero me/ora la eficiencia del proceso&.
Ltros factores, como la inclusin de iones metlicos "calcio, manganeso, bario, cobalto, etc&, tambin parecen
estimularlo, al igual que ciertos solventes orgnicos, y ciertos reactivos especiales, como 4E*L y 477.
*e parte de un cultivo de #. coli en fase exponencial e incubado a <H., suele agregarse .a.l !asta alcanzar una
concentracin de 3< mE y se las mantiene en fro durante un tiempo considerable "por lo menos media !ora&. Luego,
se adicionar el 4$% plasmdico en ba/a cantidad "se pretende que las clulas se encuentren en exceso con respecto
al plsmido, para evitar el ingreso de ms de uno a cada clula&, y la incubacin en fro sigue durante un tiempo.
Luego, se debe realizar un s!ocJ trmico "generalmente de no ms de 3 minutos a ='H& y se reincubarn a 0[H por
una !ora, para generar la reactivacin metablica, y permitir la expresin de los genes contenidos en el plsmido
incorporado "entre ellos, el marcador de seleccin&, sin ning,n episodio de recombinacin !omloga. Winalmente, las
clulas son sembradas en un medio selectivo.
El cloruro de calcio parece afectar a la pared celular y podra ser el responsable de la unin del 4$% a la superficie
celular. El fro rigidiza la estructura llevndola a un estado Ccuasi5cristalinoD permitiendo el ingreso del 4$%, y el
s!ocJ trmico lo obliga a ingresar mediante la rela/acin de la membrana, si no lo !aba !ec!o !asta entonces. *e
cree que el ingreso sucede por un transportador, el comple,o de polihidro1ibutirato2polifosfato2calcio. .abe destacar
que los 4$% de mayor tama-o suelen mostrar una menor eficiencia de transformacin que los peque-os. )or otra
parte, si el 4$% transformante es lineal, la clula !usped debe ser mutante en las endonucleasas "#ec>.4 y *bc>&.
'.'. Electroporacin
)ulsos de alto volta/e pueden inducir a las membranas plasmticas a fundirse y generar microporos momentneos
que permiten el ingreso de 4$% exgeno si la solucin de suspensin es rica en ste. Euc!os factores influyen en la
eficiencia de electroporacin, como temperatura, volta/e, resistencia, capacitancia, forma topolgica del 4$% y la
realidad fisiolgica de la clula !usped "que no solo puede ser una bacteria, sino tambin clulas animales o
vegetales&.
Es importante que previamente a la aplicacin de la corriente elctrica despolarizante, se deben lavar varias veces a
las clulas para eliminar los iones del medio, que en otro caso podran lisarla por la elevada energa elctrica que
obtienen al aplicarse el campo.
'.0. >iobalstica
65
En (AM[ se desarroll un mtodo alternativo de transformacin de plantas "a!ora aplicable a clulas animales,
bacterianas e incluso organelas& denominado biobal%stica que se basa en el uso de un revlver capaz de acelerar
peque-as partculas metlicas "de unos ' _m de dimetro& dentro de clulas vegetales a una velocidad suficiente
para atravesar su entorno "paredes celulares, cpsulas, citosol, etc&, que ronda los A< Jm@!. *e desarrollaron diversos
tipos de revlveres y partculas. )or e/emplo, se utilizan revlveres de vaco, de descarga elctrica, de gas
comprimido, etc. y se utilizan microproyectiles de oro, tungsteno, paladio, platino, iridio, etc. stas forman comple/os
con el 4$% y lo liberan al entrar en contacto con el interior celular. %dems, requieren una elevada densidad "para
penetrar medios viscosos&, ser inertes, y ser peque-as "para causar poco da-o&.
'.=. Eficiencia de transformacin
La transformacin puede evaluarse mediante un parmetro conocido como eficiencia de transformacin, definido
como el n,mero de 2W. por microgramo de 4$% utilizado. .abe destacar que si se realizan diluciones y se toman
alcuotas de las mismas para sembrar en placas, se debe calcular la cantidad de 2W. que se obtendran con la
cantidad de 4$% original, o la cantidad de 4$% presente en la alcuota sembrada.
El mtodo qumico de transformacin posee eficiencias de transformacin de entre (<
G
y (<
M
2W.@_g 4$%.
.onsiderando el n,mero usual de bacterias en una siembra estndar, y con esta eficiencia, solo el ('B de las
bacterias se vuelven competentes, y se pierde ms del AAB del plsmido en el medio.
En cambio, la electroporacin posee eficiencias de !asta (<
(<
, lo que indica que pueden !acerse competentes ms
del A<B de las bacterias, y utilizar !asta el (<B de los plsmidos en la transformacin. )or otra parte, el tama-o del
4$% afecta en menor medida a la electroporacin, lo que permite utilizar este mtodo si se cuenta con 4$% grande.
3. Trans/ormacin gen,tica de plantas
La primera expresin de genes forneos en plantas se realiz exitosamente a principios de los a-os oc!enta.
%ctualmente, se manipulan rutinariamente ms de (<< plantas por ingeniera gentica.
La importancia de la generacin de plantas transgnicas "plantas que !an sufrido la incorporacin de un gen
exgeno no sexualmente& recae en que las plantas poseen tiempos y ciclos de crecimiento muy lentos comparados
con el dinamismo requerido por la investigacin cientfico. )or esto, el cruzamiento sexual "que a su vez genera
barreras de transferencia gnica& puede ser reemplazado, disminuyendo la duracin del tratamiento, y permitiendo
que el background gentico "las caractersticas favorables de las plantas, ya sea por su propia naturaleza o por
ingeniera gentica previa& se mantenga, y no se pierda cada vez que se agrega una nueva caracterstica.
.iertas clulas vegetales son totipotentes, como por e/emplo, las de la corteza o las de distintos meristemas, y se
pueden extraer de las yemas, las races, las yemas axilares o de las semillas en germinacin. .uando se colocan en
un medio de cultivo adecuado "estril y ba/o asepsia&, stas pueden crecer, generando un te/ido indiferenciado y
amorfo denominado callo. 2na vez generado, el callo puede ser propagado indefinidamente por subdivisin, siempre
y cuando sea nutrido con !ormonas, sales, vitaminas, metales, aminas orgnicas, inositol, etc.
.uando un callo se transfiere a un medio lquido y es agitado, la masa de clulas se rompe y genera una suspensin
de clulas aisladas y otros agregados ms voluminosos. Esta suspensin tambin puede ser mantenida pero suele
poseer una gran tasa de mutacin. Las clulas ,tiles para la manipulacin gentica son los protoplastos, clulas
vegetales sin su pared de celulosa, eliminada por celulasas y enzimas degradantes de pectina "que rompern los
agregados celulares&, luego separados por centrifugacin y almacenados en un medio isotnico. En unos 3 das,
poseern una nueva pared celular y seguirn su desarrollo usual.
Luego, mediante un tratamiento !ormonal preciso y dependiente de cada planta, se puede inducir la organognesis,
lo que generar una plntula capaz de ser plantada y crecida en condiciones normales.
La transformacin de plantas permite generar nuevas especies vegetales mediante la alteracin de sus
caractersticas propias, el agregado de otras presentes en otras plantas u otros organismos, o mediante el
silenciamiento de genes residentes. %ctualmente, la transformacin de plantas se fundamenta en el aumento de su
resistencia "tanto a plagas como a !erbicidas y stress&, al aumento de su productividad "por me/oramiento de la
fotosntesis, retardo de la maduracin, etc&, al cambio de su realidad nutricional o la produccin de productos
industriales a gran escala.
0.(. 7ransformacin mediada por %grobacterium
La bacteria 8ram negativa Agrobacterium tumefaciens genera tumores vegetales en plantas dicotiledneas o
gimnospermas al introducirse en !eridas de su te/ido epidrmico, dndole la capacidad a las clulas vegetales de
reproducirse ilimitadamente, generando una estructura callosa cuyas propiedades pueden observarse incluso
cultivadas en un medio de cultivo y en ausencia de la bacteria en s. %dems se nota la sntesis de opinas y
nopalinas, que podrn ser utilizados como fuentes de carbono y nitrgeno por la misma clula o por otras. sta
respuesta es inducida por la bacteria y no es propia de la planta, y se nota que cada cepa bacteriana activa la sntesis
de distintos tipos de opinas y nopalinas, siendo esto una caracterstica de cada una.
*e notaba entonces que exista alg,n Cfactor transformanteD que la bacteria inclua en las clulas vegetales. Esto fue
comprobado al determinar que ciertas cepas de A. tumefasciens generaban plsmidos de !asta '03 Jbp que le
permitan a las clulas vegetales ser virulentas y usar y sintetizas opinas o nopalinas. Estos plsmidos fueron
llamados pl-smidos inductores de tumores o 0i plasmids.
$o se encuentra ste plsmido en las clulas vegetales luego de !aber sido transformadas naturalmente, sino que
una regin "de unos '0 Jpb, generalmente llamada 754$%, pudiendo estar presente en varias copias& se !aya
integrado en el genoma nuclear en posiciones azarosas. 4e ms est decir que este segmento es el que incluye los
genes de sntesis de opina "en 754$% doble !ebra& y nopalina "en 754$% simple !ebra&, y de virulencia, pero estos
no son requeridos para el mecanismo de recombinacin, por lo que pueden ser reemplazados por otros. *uelen verse
en varias copias a lo largo del genoma y estn flanqueados por regiones CbordeD de !asta '3 pb que parecen estar
involucradas en su inclusin en el genoma vegetal y estn notablemente conservadas.
3.!.!. Cenes re>ueridos para la transferencia
66
Los genes responsables de la transferencia del 754$% se localizan en una parte separada del plsmido 7i
denominada la regin *ir que codifica para unos '3 genes de funciones variables. 4os de los genes de sta "*irA y
*irC7 se expresan constitutivamente en un ba/o nivel, y controlan la activacin de los restantes. 9ir% es una quinasa
que expande la membrana celular bacteriana y permite el ingreso de ciertos compuestos fenlicos producidos por las
clulas vegetales de te/idos !eridos, lo que inducir la quimiotaxis y la fosforilacin de 9ir8 "generando un sistema de
dos componentes& y sta es un factor de transcripcin de los otros genes *ir. stos formarn un pilus con/ugativo "por
9ir>, un pilus de tipo N9 con (( tipos de protenas como %7)asas 5=, ((, 4=5, peptidoglucanasas 5(5 o protenas
estructurales 5', 3, G y [5& que permitir el paso del plsmido a la clula vegetal. La transferencia de 4$% se inicia por
una endonucleasa formado por 9ir4( y 9ir4', que introducirn nicJs en una !ebra de ste, o fragmentarn ambas en
las regiones borde, quedando unida la segunda al 754$%. Las protenas 9ir.(' y 9ir.' activan este proceso. Luego,
9irE' cubrir el fragmento y a la protena y ser transferido por el pilus !acia el interior de la clula vegetal, donde
interactuar con protenas de ad!esin a 9irE' "de la familia 9N)& y con otras de ad!esin a 9ir4' "de la familia #ac o
.yp&. stas permitirn el ingreso al n,cleo "ya que 9ir4' y 9irE' tienen se-ales de localizacin nuclear&, y la
integracin azarosa al genoma.
.abe destacar que para que todo el proceso suceda, deben existir sistemas de reconocimiento y ad!esin clula5
clula, generalmente mediados por sistemas de ad!esinas "genes att, ch*A y ch*B&, activada a p+ 353,M y
temperatura de 'GH.
3.!.. 0ipos de transformacin
La transformacin de plantas puede ser6
a& Estable, si el transgen se integra permanentemente al genoma vegetal, lo que permite la !erencia de la
caracterstica incorporada en la progenie.
b& 7ransitoria, si el transgen solo es expresado en la primera generacin. Es utilizado en screenings de actividad y
viabilidad de transformaciones.
3.!.3. Kectores 0i
Los vectores 7i usuales poseen elementos comunes. 2no de ellos son las regiones codificantes para !ormonas
vegetales como auxinas "genes tms&, citoquininas "genes tmr&, agropina, etc que permitiran el crecimiento en forma
de callo de las clulas vegetales, adems de otras regiones moduladoras de la actividad de stas. 7ambin
encontramos los genes que generarn opina. 7ambin poseen promotores eucariotas y sitios de poliadenilacin,
sorprendentemente, lo que explica por qu el plsmido puede duplicarse en el interior de la planta.
El uso de vectores 7i en la transformacin de plantas requiere que este sea un disarmed *ector, es decir, que no
posea sus caractersticas oncogenticas, ya que si no inducira la generacin de tumores amorfos in,tiles.
#eemplazando el 754$% "pero no las border se>uences& por otro, permite que las clulas vegetales lo expresen y no
sean cancerosas. .abe destacar que este proceso elimina la supervivencia sin !ormonas vegetales.
2sualmente, se utilizan Cvectores desarmadosD que !an sufrido el reemplazo de su 754$% pero mantienen el gen
nos que sintetizar nopalina, lo que se utiliza como un fenotipo observable y utilizado para seguir el proceso. 7ambin
se !an desarrollado otros con genes que codifican para producir resistencia a ciertos antibiticos o !erbicidas.
%dems de esto, todos los promotores deben poseer ciertas caractersticas necesarias para su funcionamiento, a
saber6
a& )romotores. Existen distintos tipos de promotores. %lgunos son constituti*os, es decir, se expresan en cualquier
lugar de la planta y de manera basal, tales como el .aE9 "el del virus del mosaico del coliflor&, el 2bi( "el de la
ubiquitina de maz, ,til en monocotiledneas&, etc. 7ambin pueden encontrarse promotores inducibles, por factores
ambientales o qumicos, y otros que solo actuarn en ciertos te/idos especficos.
b& *e-ales de poliadenilacin en el extremo 01
c& Earcadores de seleccin o genes reporteros eliminables. *e suelen utilizar genes que codifican para enzimas que
permiten el crecimiento en presencia de un sustrato particular.
d& Lrigen de replicacin para la amplificacin en #. coli.
e& )olilinJers
3.!.5. 0ipos de *ectores
Existen dos tipos de vectores6
a& Los vectores cointegrados. Los vectores desarmados usuales son muy grandes, poco mane/ables in vitro y no
posee sitios de restriccin. )ara solucionarlo, se clona el 754$% en un *ector intermedio en #. coli. Luego se mezclan
la cepa de #. coli con el vector intermedio, una con un Cvector !elperD y una de A. tumefasciens con el plsmido 7i. La
con/ugacin entre las dos cepas de #. coli permite que los dos plsmidos puedan ser transportados a la de A.
tumefasciens fcilmente, donde se producir recombinacin !omloga entre el plsmido 7i y el vector intermedio,
generando el vector cointegrado de gran tama-o. Esto incrementa su efectividad si !ay secuencias !omlogas entre
ambos vectores.
b& Los vectores binarios. Los genes *ir de los plsmidos 7i pueden actuar sobre cualquier secuencia de 754$% "con
los bordes derec!o e izquierdo& presentes en la clula, por lo que ellos y el vector desarmado con 754$% pueden
incorporarse en distintos plsmidos. El 754$% puede ser clonado en #. coli, en un plsmido peque-o llamado mini20i
o micro20i, que podrn incorporarse a A. tumefasciens, mientras que los genes *ir podrn catalizar la incorporacin
de stos al genoma vegetal, tal como lo !acen con cualquier otro 754$% que se encuentre presente en la clula
bacteriana. 4e esta manera, se desarrollaron plsmidos micro57i con las secuencias borde que flanquean el gen de la
subunidad O de la Q5galactosidasa, en donde se !a generado un polilinJer, por lo que pueden clonarse rpidamente
para incorporar un gen cualquiera.
0.'. Ltros mtodos de transformacin
%dems de la transformacin biolgica de clulas vegetales mediante A. tumefasciens, tambin existen otros
mtodos para realizarlo. % saber6
a& Electroporacin, que se aplica sobre protoplastos, pero posee ba/a reproducibilidad
67
b& >iobalstica, ,til en te/idos intactos.
c& Eicroinyeccin de 4$%
d& Eediante vectores virales, como el virus del mosaico del tabaco
e& )or transformacin qumica, con polietilenglicol o cloruro de calcio, solo aplicable en protoplastos
f& )or lser
g& )or ultrasonido
4. Trans/erencia g,nica a c,lulas animales
Las tcnicas de transferencia gnica estn disponibles para la introduccin de 4$% en muc!os tipos de clulas
diferentes, ya sea para estudiar la funcin de los genes, como su regulacin, o para expresarlos y obtener protenas
recombinantes. Las clulas animales son las ms venta/osas a la !ora de generar protenas recombinantes porque
realizan modificaciones post5traduccionales, lo que las vuelve indispensables en la sntesis de anticuerpos,
!ormonas, etc. %ctualmente las dos lneas ms intensas en investigacin se basan en la modificacin gentica de
clulas de mamfero y de clulas de insecto, focalizando en las terapias gnicas capaces de transformar clulas
animales in vivo, ,tiles en terapias gnicas.
.abe destacar que la mayora de las clulas animales estn restringidas a su desarrollo potencial, y no pueden
generar animales o te/idos transgnicos, excepto en el caso de clulas madres embrionarias.
=.(. Estrategias de transformacin
Existen tres mecanismos fundamentales6 el directo, por el cual el 4$% exgeno se introduce fsicamente a la clula,
ya sea por microinyecciones o por biolstica? la transfeccin, es decir, la CpersuasinD fsica o qumica a la clula para
que incorpore espontneamente 4$% de sus alrededores y la transduccin, o la incorporacin del 4$% en un virus.
=.'. 7ransfeccin
5..!. 3todo de la coprecipitacin 4"A2fosfato de calcio
En este mtodo, el 4$% coprecipita con fosfato de calcio en estructuras pseudocristalinas de rigidez suficiente como
para penetrar en la membrana plasmtica y se luego internalizada por la clula. 7ambin se cree que la
coprecipitacin induce la endocitosis de los grnulos formados. *olo es aplicable a clulas creciendo en capas, y no a
clulas creciendo en suspensin. La estabilidad de las clulas transformadas es ba/a. 7ambin se nota cierta
toxicidad en el precipitado que lo !ace in,til en ciertos casos.
5... .tras transfecciones >u%micas
*e !an desarrollado otros mtodos basados en modificaciones qumicas del medio para lograr la transformacin,
entre ellos6
a& 4ietilamino etil5dextrano, un carbo!idrato policatinico soluble que promueve las interacciones entre el 4$% y la
maquinaria endocittica de la clula. *e !a me/orado su eficiencia mediante tratamientos posteriores, como s!ocJs
osmticos o la exposicin a cloroquinona.
b& )olybrene, un detergente policatinico que me/ora la estabilidad del mtodo.
5..3. 'iposomas
*e trata de empaquetar 4$% dentro de una vescula de fosfolpidos que interactuar con la membrana celular de la
clula blanco. Es un mtodo muy comple/o, pero permite el ingreso de 4$% de gran tama-o. %ctualmente se utiliza
una mezcla de lpidos catinicos y neutrales que forman comple/os estables con el 4$%, lo que permite una
interaccin buena con la membrana plasmtica. %l mtodo se lo denomina lipofeccin y es elegido en clulas de difcil
transfeccin, con grandes eficiencias.
5..5. #lectroporacin
Es ,til si se buscan las intensidades y las duraciones del pulso elctrico que me/or se adapten al tipo de clula diana.
.uando esto sucede, es un mtodo reproducible, ms all que sea costoso y que su espectro de aplicacin sea
peque-o. 7ambin se !an ensayado electroporaciones con lser.
5..A. 0ransformacin con 4"A no replicati*o
7oda transfeccin ocurre en dos etapas, una de Ctransfeccin propiamente dic!aD, donde el 4$% es incorporado a la
clula, y una de CintegracinD donde el 4$% se incorpora al genoma. En la mayora de los casos, el 4$% se mantiene
en el n,cleo sin integrarse al genoma, por lo que luego de algunas divisiones celulares, es diluido y degradado, por lo
que la transfeccin se denomina transitoria. *i esto no sucede, la transfeccin se dice estable, y generar un nuevo
locus que ser !eredado por los descendientes. La seleccin de las clulas transfectadas correctamente suele
!acerse mediante marcadores de seleccin dominantes, es decir, mediante la incorporacin de genes que le otorgan
a la clula, una caracterstica totalmente nueva, como la resistencia a neomicina, una nueva va metablica, una
protena que induce la apoptosis celular ba/o ciertas condiciones, etc.
=.0. 9ectores plasmdicos
La transfeccin estable puede ser conseguida usando diversas fuentes de 4$%, por e/emplo 4$% plasmdico y 4$%
genmico. *in embargo, la utilizacin de plsmidos confiere ciertas venta/as a los mtodos6
a& *on ms fciles de subclonar, manipular y purificar tanto a ellos como a las protenas recombinantes que
producirn.
b& )ueden incorporar ciertos elementos para dirigir la expresin del transgen, cualquiera sea este. )or e/emplo, los
plsmidos p*9 y p#*9 son muy ,tiles en clulas animales como vectores de expresin.
c& La inclusin en ellos de un marcador de seleccin es ms sencilla que la cotransformacin con varios genes al
mismo tiempo
d& %lgunos pueden contener orgenes de replicacin capaces de mantenerse como replicones epismicos
independientes.
5.3.!. 0ransformacin con *ectores replicati*os
La transfeccin transitoria puede ser llevada a cabo utilizando vectores replicativos que contienen orgenes de
replicacin derivados de ciertos virus de la familia del poliomavirus. Estos virus causan infecciones lticas, lo que
68
permite la replicacin en gran cantidad de los genes de inters. *u genoma posee dos regiones, una regin 7 y una
regin t. La primera es imprescindible para su funcionamiento, ya que codifica para una 4$% polimerasa capaz de
replicar el genoma viral, mientras que la regin t es prescindible y puede ser reemplazada por el gen de inters.
2n gran avance en este sentido se present con el descubrimiento de las clulas .L*, provenientes de te/idos
renales de mono. stas poseen integrado a su genoma, el gen que codifica para la polimerasa 7, por lo que podrn
replicar cualquier plsmido que contenga el origen de replicacin ori*9=<. $o obstante, luego de un corto tiempo, las
clulas .L* mueren por la replicacin masiva del vector, aunque la expresin proteica generada por la
transformacin de una sola de estas clulas es suficiente para el uso !abitual del mtodo. %lgo similar ocurri con las
clulas EL)5M que presentan el gen que codifica para la polimerasa del virus del polioma murino, lo que permite la
infeccin con plsmidos que contengan su origen de replicacin. %ctualmente se comercializan plsmidos "como el
pc4$% (.(@%mp& que no solo poseen los orgenes de replicacin para ambos tipos de virus, sino tambin un
marcador de seleccin por resistencia a la ampicilina.
2na transfeccin estable puede lograrse mediante un vector recombinante que se mantendr como un replicn
episomal. stas pueden lograrse mediante virus que causen infecciones latentes, donde el genoma viral se mantiene
en el interior celular en un n,mero de copias ba/o o moderado, sin interferir en el crecimiento de su clula diana, tal
como sucede con el virus >c o el virus de Epstein5>arr. *on venta/osos porque el 4$% no requiere integrarse al
genoma para estabilizarse, por lo que la eficiencia del mtodo es similar a la de las transfecciones transitorias.
5.3.. 0ransformacin con *ectores no replicati*os
*e pueden lograr transformaciones estables, introduciendo el transgen en un plsmido sin origen de replicacin pero
que permita su integracin al genoma de manera azarosa. Nncorporar el promotor de su propio gen, pero su
expresin quedar condicionada a la regin donde se incorpore. *e !an desarrollado ciertos vectores que llevan a
cabo recombinacin !omloga para insertarse en el genoma, lo que induce a la eliminacin de ciertas regiones de
ste, pudiendo eliminarse o inactivarse ciertos genes propios de la clula blanco, generando un mutante knock2out.
5.3.3. #lementos t%picos de un *ector de e1presin
La mayora de los vectores de expresin poseen6
a& 2n promotor potente "por e/emplo, el del citomegalovirus !umano& y constitutivo.
b& Lrgenes de replicacin para varios !uspedes, como #. coli, virus *9=<, virus del polioma, etc.
c& 2n sitio de m,ltiple clonado
d& 2n marcador de resistencia
e& Nntrones. *e !a demostrado que los intrones suelen incrementar la expresin gnica, fundamentalmente en
animales.
f& *e-ales de poliadenilacin. *on requeridas para incorporar la cola de poli"%& en el extremo 01 del transcripto.
=.=. 7ransduccin
En este proceso, el gen es empaquetado dentro de un virus, que es adsorbido por la superficie celular y puede
ingresar en ella, permitiendo la replicacin masiva de su material gentico e incluso su expresin a niveles
impensados. Esto permite la transformacin de clulas en animales vivos. *e !an desarrollado mtodos de
transduccin utilizando retrovirus, adenovirus, !erpesvirus y vectores de virus adenoasociados. El gen en estudio
reemplaza un sector no esencial del genoma viral o se agrega por corte y ligacin o por recombinacin !omloga.
2n e/emplo muy utilizado, es el de los baculo*irus, virus que infectan a artrpodos, particularmente insectos. stos
generan vesculas proteicas denominados cuerpos nucleares de oclusin formados por polihedrina, expresada en
altos niveles. #eemplazando el gen que codifica para esta por otro de inters, se conseguir una expresin enorme
de ste. *e utilizan el %cE$)9 "virus de la poli!edrosis nuclear m,ltiple de Autographa california& para expresin
proteica, y el >m$)9 "virus de la poli!edrosis nuclear de Bomby1 mori& para expresin proteica en gusanos de seda
vivos.
(. 2enes reporteros
Los genes reporteros no confieren una propiedad que permite a las clulas transformadas a sobrevivir ba/o ciertas
condiciones, sino que codifican un producto que puede ser detectado por ensayos simples y econmicos. .uando
estn controlados ba/o promotores constitutivos potentes, los genes reporteros son usados usualmente como
marcadores para confirmar la transformacin, ya sea estable o transitoria, y adems permite medir la eficiencia de
transformacin, ya que la actividad de stos genes es cuantitativa.
%dems, la adicin de stos a productos usuales de expresin gnica en una clula permite que puedan
diferenciarse ciertos productos de otros, y seguir su ubicacin tanto celular como tisular. En el caso de protenas, se
utilizan fusiones secuencia5gen reportero, donde los transcriptos del gen en estudio poseern desde su sntesis, una
secuencia que codifica para una protena reportera, que quedar fusionada a la de estudio luego de traducirse. )or
e/emplo,
a& El gen lacZ que codifica para la Q5galactosidasa, que puede generar un producto amarillo al tratarse con un
reactivo adecuado, obviamente incoloro, el L)78.
b& El gen luc que codifica para una luciferasa, que genera luminiscencia ba/o tratamiento con su sustrato "la luciferina&
c& El gen gfp que codifica para la 8reen Wluorescent )rotein, que fluorece espontneamente ba/o irradiacin 29
d& El gen cat que codifica para la cloranfenicol acetiltransferasa, capaz de transferir acetilos "previamente marcados&
al cloranfenicol, y ste luego puede separarse cromatogrficamente y cuantificarse.
e& El gen gus que codifica para la Q5glucuronidasa9 que reacciona con anlogos a la glucosa que generarn productos
coloreados.
Tema 5: 1trate#ia de clonado
69
1. "ntroduccin
.ualquier procedimiento de clonado en clulas posee cuatro partes esenciales6
a& 8enerar el fragmento de 4$% para clonar
b& 2na reaccin de insercin del fragmento en el vector elegido
c& 2n medio de introducir el vector recombinante dentro de la clula !usped donde se replicar
d& 2n mtodo de seleccin de las clulas !uspedes que adquieren el recombinante
*i se conoce exactamente el fragmento que uno est clonando, estamos frente a una estrategia de subclonado,
donde un fragmento de restriccin en particular se aisla de un vector y se inserta en otro. *in embargo, tambin
debemos considerar al caso de obtener el fragmento de 4$% desde una fuente comple/a, como el genoma !umano,
lo que requerir tambin una tcnica de screening para encontrar y seleccionar la secuencia buscada y no otras.
Existen dos estrategias principales para aislar secuencias de fuentes comple/as6
a& 4ividir el 4$% en fragmentos mane/ables y clonar todos en una biblioteca de 4"A genmico, que luego podr
sufrir una b,squeda mediante sondas marcadas, para encontrar el clon de inters.
b& %mplificar selectivamente la secuencia blanco usando la reaccin en cadena de la polimerasa, y luego clonar este
fragmento individual.
2. "denti/icacin de clones espec/icos en bibliotecas
)ara detectar un clon especfico entre una mezcla comple/as de otros, se debe recurrir a la !ibridizacin de
secuencias, el mtodo ms especfico y sencillo. )or e/emplo6
a& >asarse en la secuencia de protena. *i se quiere detectar un gen que codifica para una protena determinada, se
puede digerir sta con proteasas, secuenciar algunos fragmentos mediante el mtodo de Edman, y seleccionar una
secuencia de seis o siete aminocidos cuya variabilidad de secuencias de nucletidos sea poco degenerada. Luego,
se sintetiza artificialmente una sonda complementaria "que puede contener inosina& marcada radioactivamente o con
un compuesto fluorescente. .abe destacar que debe evitarse la degeneracin en el extremo 01 del primer ya que un
mismatc! en esta posicin impide la extensin.
b& *e puede realizar algo similar, si se conoce un gen !omlogo en un organismo relacionado, y que est
secuenciado. )robablemente, la unin no sea exactamente complementaria pero es suficiente para identificarlo con
respecto a otros.
c& *i el gen buscado codifica para alg,n producto, se puede !acer una biblioteca en alg,n vector con promotores de
expresin. %s, si el gen queda en fase, se podr obtener el producto y detectar mediante anticuerpos.
d& *i el gen buscado codifica para una protena cuya carencia es fenotpicamente observable o seleccionable, se
puede aplicar la complementacin funcional. +aciendo una librera de 4$% genmico de un organismo salva/e, se
puede obtener un gran n,mero de plsmidos con sectores de 4$% al azar. Luego, se transforman las cepas
auxtrofas del organismo mutante con stos "previa seleccin de los plsmidos candidatos probables& y se
seleccionan los organismos que no presentan la auxotrofa "observable fenotpicamente&. *e asla el plsmido que
contienen estos organismos, y se identifica el clon que corrige el defecto, es decir, el de la protena buscada.
e& *i no se cuenta con un !usped mutante en la expresin de ciertas protenas, el mtodo anterior no puede ser
utilizado. .iertos genes pueden codificar para protenas que generan una caracterstica fenotpica simple y
observable. 4e esta manera, transformando organismos carentes naturalmente de este gen con plsmidos de una
zona del genoma que se cree que posee este gen, podr seleccionarlos de acuerdo a si presentan o no la
caracterstica fenotpica estudiada, y luego aislar el plsmido que contiene. % este mtodo se lo denomina ganancia
de funcin.
f& *e pueden introducir transposones "que generan mutaciones donde se insertan& y seleccionar a los organismos
que presentan mutaciones en el fenotipo estudiado. .omo se conoce la secuencia del transposon, se puede usar
como sonda para aislar el gen mutado.
g& 2tilizando secuencias de c4$% obtenidas mediante bases de datos.
!& *e puede utilizar la tcnica de chromosome Dalking. Esta se basa en la identificacin de ciertos genes ligados al
de inters, debido a que estn cerca en el cromosoma. 4e esta manera, se genera una sonda que puede unirse a
ciertos fragmentos de 4$% contenidos en una biblioteca de 4$% genmico. *e selecciona uno de estos y se genera
una sonda que !ibride en otro sector del mismo. Luego, con esta sonda se vuelve a buscar coincidencias en la
biblioteca, para encontrar otros plsmidos, y el proceso se contin,a repetidas veces. *ecuenciando los fragmentos
obtenidos en cada determinacin, se vern solapamientos entre estos, que pueden ubicarse continuamente para
generar la secuencia del sector alrededor del gen.
i& El chromosome Dalking es in,til para genomas muy grandes. En estos casos, se circulariza ste mediante el corte
con enzimas de restriccin de corte infrecuente, y accin posterior de la ligasa. %s, se podrn acercar regiones muy
distantes del cromosoma, y aplicar el c!romosome KalJing sin problemas. % esta tcnica se la denomina
chromosome ,umping.
3. Problemas usuales en la manipulacin gen,tica
Las tcnicas usuales de corte y unin de fragmentos de 4$% utilizados en el clonado, as tambin como aquellas de
expresin de protenas en vectores para tal fin, suelen presentar ciertos inconvenientes en casos particulares. %qu se
muestran algunas tcnicas de aplicacin general para problemas generales6
a& Extremos no compatibles. En ciertas ocasiones, el tratamiento de los fragmentos a clonar genera extremos
incompatibles con el proceso general. )or e/emplo, en los que uno o ambos extremos son romos, y la astringencia del
proceso no es suficientemente grande como para beneficiar la inclusin de un fragmento en un vector. En estos
casos, se usan los adaptadores, oligonucletidos de doble !ebra comerciales, que codifican para el sitio de restriccin
de alguna enzima com,n, y poseen un fosfato 31 terminal en cada !ebra para permitir la ligacin. 4e este modo,
tratando a los fragmentos con una solucin de adaptador y una ligasa se puede obtener una secuencia compuesta
70
por el inserto a clonar, flanqueada por una cadena relativamente corta de adaptadores. Luego, tratndola con la
enzima de restriccin ,til "seg,n el adaptador& se pueden generar los extremos co!esivos ,tiles.
b& Extremos da-ados u !eterogneos. En ciertos casos, los extremos del fragmento pudieron da-arse en el
tratamiento, o no ser iguales, y por lo tanto, ser in,til si se busca cortar al vector con una sola enzima de restriccin.
En estos casos, se pueden presentar dos casos6
5 Extremo co!esivo en extremo 31. )ara esto se utiliza el fragmento de clenoK de la 4$% polimerasa N, que carece
de actividad exonucleasa 31501, lo que permite sintetizar la !ebra complementaria al extremo co!esivo, convirtindolo
en romo.
5 Extremo co!esivo en extremo 01. *e utiliza la 7= 4$% polimerasa en exceso de d$7)1s, lo que permite que degrade
el extremo simple !ebra sin da-ar el doble !ebra.
%mbos procesos generarn un inserto con extremos romos que podrn tratarse como en a&.
c& .arencia de sitios de restriccin ,tiles cerca del gen de inters. )ara esto suelen introducirse sitios de restriccin
por ).#. )ara esto, se construyen primers que en sus extremos 31 posean un sitio de restriccin seguido por el
primer propiamente dic!o y complementario al gen de inters. 4e esta manera, al realizar la ).# se generarn
insertos que incorporaron tal sitio en sus extremos y se pueden cortar fcilmente con la enzima de restriccin elegida.
d& 2na solucin alternativa al problema presentado anteriormente es la amplificacin por 7aq5).#, ya que la 7aq
polimerasa puede agregar una adenosina sticJy en los extremos 31 de las !ebras del inserto amplificado. 2sando un
vector de clonacin con una timina desapareada en los extremos 01 "como el p8EE57 o el p57opo&, se aumenta la
efectividad del clonado.
e& #eligacin del plsmido. Euc!os plsmidos, fundamentalmente los ms peque-os, tienen una gran tendencia a
religarse, ya sea cuando son cortados por una sola enzima de restriccin o poseen extremos romos. )ara evitarlo, se
utiliza la fosfatasa alcalina, que elimina el fosfato en posicin 31 y evita la religacin. .uando se une el inserto "que si
posee fosfatos capaces de generar un enlace fosfodister&, quedan dos mellas, capaces de ser eliminadas luego.
f& >a/os niveles de expresin gnica. )robablemente, el vector de expresin posea un promotor dbil en las
condiciones de tratamiento. Los promotores ms fuertes suelen ser el pLac, el p7ac "regulado por N)78&, el p7[, el
plL y el p7rp "regulado por triptfano&.
g& >a/os niveles de sntesis de protenas. %dems del promotor, los vectores de expresin tambin requieren de otras
secuencias necesarias para el procesamiento correcto, como terminadores de la transcripcin, sitios de unin a
ribosomas "secuencias de *!ine54algarno upstream al codn de iniciacin, y separadas de ste por una secuencia
rica en %7 y de tama-o constante, no mayor a (< pb&, entre otros.
!& >a/os niveles de actividad de protenas. $o solo basta con sintetizar la protena para que esta sea activa, tambin
se requieren otros elementos, como grupos prostticos, modificaciones posttraduccionales, o protelisis dirigidas que
son necesarias para su funcionamiento. %dems, muc!as no son solubles en el citosol de organismos distintos al que
la origina naturalmente, o incluso su expresin es txica para la bacteria genticamente modificada.
i& 4ificultad de purificacin de la protena. )ara esto, se suelen utilizar vectores de expresin que la sintetizan
fusionadas a ciertas secuencias de aminocidos capaces de separarlas especficamente en cromatografas de
afinidad. 7ambin poseen un sitio de reconocimiento de proteasas para permitir la eliminacin del fragmento
fusionado luego de purificadas. )or e/emplo6
5 )rotenas fusionadas a glutatin5*5transferasa "8*7&, mediante vectores p8EY. )oseen un promotor 7ac inducible
por N)78. )oseen un sitio de reconocimiento para una proteasa sitio5especfica, el factor Ya. *on purificadas en
columnas cromatogrficas de agarosa unida a glutatin, y se eluyen mediante soluciones de glutatin libre.
5 )rotenas fusionadas a cola de !istidina, mediante vectores p`E. )oseen un promotor de fago 73 tambin inducible
por N)78. %dems se notan secuencias incrementadoras de la traduccin "#>*&. Las protenas son purificadas en
columnas cromatogrficas con resinas de nquel y eluidas por una solucin de imidazol.
/& Expresin no controlada. )or lo general, la expresin descontrolada de una protena genera la lisis celular debido a
la acumulacin de sta y al disparo de se-ales de apoptosis. )or esto, la mayora de los vectores de expresin
contienen sistemas de control de expresin, que suelen estar inducidos por qumicos de concentracin regulable
artificialmente. 2no de ellos se ve en los plsmidos del sistema pE7, que dar origen a protenas fusionadas a colas
de !istidina.
El genoma de #. coli posee un sitio "llamado 4E0& donde se encuentra el gen que codifica para la #$% polimerasa
7[, ba/o el control de un promotor regulado por el operon lac. %s, posee un sitio de unin a LacN "un represor&, que se
unir siempre y cuando no detecte lactosa en el medio, generando #$% polimerasa 7[ solo a niveles basales,
capaces de ser controlados por la lisozima 7[ propia de la clula.
El plsmido pE7 tambin posee un sitio codificante para LacN, y su promotor 7[ posee un sitio de unin a LacN que
reprime la expresin del gen insertado en l. 4e esta manera, colocando N)78 en el medio "un anlogo a la lactosa&
ste se unir al LacN y lo separar de su sitio de unin, no solo activando la expresin de la polimerasa 7[, sino
tambin permitiendo que esta exprese al gen clonado en el vector.
Tema ": ,eparacin e identi!icacin de prote)na
1. Separacin de protenas
*upongamos que contenemos un extracto celular que contiene una gran variedad de protenas, y debemos
separarlas para identificar las ,tiles, y luego purificarlas para analizar su actividad o estructura. Esto se realiza
mediante un sistema de tcnicas que se basan en mtodos electroforticos. stos se basan en la separacin de
molculas en un campo elctrico, debido a su movilidad relativa en una matriz porosa que les opone resistencia de
acuerdo fundamentalmente a su tama-o relativo con el de los poros.
71
*in embargo, esta tcnica !a sufrido numerosas modificaciones metodolgicas para ser aplicada, para !acerla ms
,til a diversas b,squedas y necesidades de purificacin y separacin.
El mtodo ms simple es la electroforesis nati*a, en la que la mezcla de protenas se corre sobre una matriz de
acrilamida5bisacrilamida, movindose !acia uno u otro polo de acuerdo a su carga neta, y a distintas velocidades de
acuerdo a su tama-o y conformacin. $o obstante, este mtodo es poco utilizado, ya que la gran cantidad de factores
que influyen sobre la movilidad, lo !ace in,til para el anlisis y la comparacin.
*uele utilizarse el mtodo de 'aemmli, en la que se agrega a la mezcla, *4* "dodecil sulfato de sodio&, un
detergente aninico que desnaturaliza a las protenas y se une a stas dando una relacin carga@masa similar, por lo
que las independiza de su carga nativa y su conformacin, corriendo ms las ms peque-as debido a un simple
efecto de tamiz molecular por la matriz porosa. 7ambin se pueden incorporar algunos reductores de puentes
disulfuro como ditiotreitol o Q5mercaptoetanol.
Los geles utilizados estn formados por acrilamida, que ba/o agentes que generen radicales libres "como el 7EEE4
o el %)*& puede reaccionar entre s formando polmeros lineales. *i adems se agrega bisacrilamida, que posee dos
sitios de unin a acrilamida en la misma molcula, se pueden generar entrecruzamientos en forma de red que
permitirn la formacin de poros. La concentracin relativa entre ambos es la que determina el grado de
entrecruzamiento.
)or otra parte, suelen !acerse geles formados por dos sectores, uno de concentracin superior, de ba/a
concentracin de acrilamida, y que sirve en la generacin de bandas finas de protena para evitar la dispersin de
esta en el gel, y uno de separacin de mayor concentracin de acrilamida, y mayor p+ "M,M en vez de G,M&, que
separar a las protenas.
Luego de separadas, las protenas deben visualizarse mediante la tincin especfica con colorantes. Los ms
utilizados son el %zul de .oomassie y la plata, siendo el primero menos peligroso y el segundo ms sensible "detecta
!asta ' nanogramos de protena&.
2. <estern blotting
Luego de separar a las protenas, debemos identificarlas. )ara esto, se inmovilizan las protenas en una membrana
de nitrocelulosa o polivinil difluoruro ")94W&, mediante capilaridad "se ponen en contacto el gel con la membrana, y
se coloca buffer ba/o el gel y papel absorbente empaquetado sobre la membrana, lo que inducir el movimiento
proteico !acia arriba y su atrapamiento por la membrana&. 4espus de inmovilizadas, se bloquea la membrana con
otras protenas "como alb,mina o casena& y se lava la membrana con un anticuerpo que reconoce especficamente a
la protena buscada. Luego, se trata con un segundo anticuerpo que reconoce al primero y est unido covalentemente
a una protena especfica "usualmente fosfatasa alcalina o peroxidasa de rabanito& que pueda generar alguna
caracterstica observable "color, quimioluminiscencia, unin a ligando, radiactividad, etc& para visualizar la posicin de
la protena buscada.
% esta tcnica se la conoce como Western blotting.
Tema %: .3R 4 5 'ae metodol#ica
1. "ntroduccin
La ).# o reaccin en cadena de la polimerasa es un mtodo selectivo, especfico, sensible y sobre todo rpido para
amplificar secuencias "relativamente cortas& de cidos nucleicos in *itro. En la ).# !abitual, ambas !ebras del 4$%
de inters se replican en cada uno de los ciclos, mediante la accin de una 4$% polimerasa termorresistente que
utiliza dos oligonucletidos distintos que funcionan como cebadores, y desoxirribonucletidos trifosfatos "o d$7)1s&
como sustratos, funcionando en un medio buffer adecuado.
Esta tcnica produce cantidades muy grandes del fragmento de doble !ebra del 4$% delimitado por los extremos 31
delos primers utilizados. *e dice que el sustrato de la 4$% polimerasa es el primer apareado y con un extremo 01
!idroxilo libre.
2. %e&uerimientos bsicos
La ).# requiere algunos elementos bsicos para poder ser llevada a cabo6
a& 2n molde de 4$% o #$%, ya sea doble o simple !ebra
b& ' oligonucletidos que sirvan como cebadores, por lo que deben ser complementarios a las regiones 31 del
fragmento a amplificar.
c& 4$% polimerasa resistente a altas temperaturas, y todos los cofactores necesarios para lograr su mayor velocidad
en las condiciones de traba/o, puntualmente cationes magnesio
d& d$7)1s en concentraciones equimolares
e& >uffer de reaccin que mantenga el p+ ptimo para la actividad enzimtica
f& %gua de alta calidad y estril, para evitar la presencia de enzimas degradativas o sustancias in!ibidoras
g& .ationes monovalentes para la estabilizacin de los cidos nucleicos
!& .iertos cosolventes que estabilizan la enzima e influencian su procesividad y la 7m del 4$%.
3. )iclos de P)%
La reaccin en cadena se debe a las modificaciones en la temperatura del sistema, que activan ciertos procesos,
mientras que desactivan otros. %s, notamos tres procesos en cada ciclo6
a& La desnaturalizacin del 4$%, se da por tratamiento de la mezcla aproximadamente a A=H durante un minuto.
72
b& El annealing de los cebadores, que requiere una temperatura tal que permita al apareamiento, pero con suficiente
especificidad para no generar productos anmalos. *uele realizarse a una temperatura que ronda los 3<H por =3
segundos.
c& La extensin de los primers mediante la actividad de la polimerasa termoresistente, que se lleva a cabo durante '
minutos a ['H.
)or lo general se realizan unos '3503 ciclos que adems cuentan con6
d& Etapa de desnaturalizacin previa, fundamentalmente si el material de partida es muy comple/o, como 4$%
genmico. *uele tratarse unos (< minutos a la temperatura de desnaturalizacin antes de comenzar con los ciclos
!abituales. Es innecesaria para plsmidos.
e& 7iempos rampa, entre cada proceso, que se prefieren los ms rpido posibles. 4ependen del equipo utilizado y de
la temperatura inicial.
f& Etapa final, luego de terminar el ,ltimo ciclo, que dura unos 3 minutos a ['H, lo que permite la renaturalizacin de
todos los fragmentos. *i no se !iciera, y se ba/ara bruscamente la temperatura, los fragmentos no se renaturalizaran
y seran inservibles. %dems de este modo, la polimerasa genera extremos romos en todos los fragmentos.
0.(. Etapa de desnaturalizacin
La etapa de desnaturalizacin depende fundamentalmente del molde de 4$%. *u temperatura y duracin dependen
de la capacidad de separacin de las dos !ebras del 4$% molde, es decir de su longitud y de su fortaleza de unin,
por lo que se requerir mayor temperatura y@o duracin de tratamiento si el molde es ms largo o posee ms
proporcin de pares 8..
2na cuestin a tener en cuenta en este sentido es la vida media de la 4$% polimerasa. Es all que esta es
termoestable, suelen desnaturalizarse a temperaturas cercanas a la ebullicin del agua. )or e/emplo, la 0a>
polimerasa soporta unas ' !oras a A0H, pero menos de 3 minutos a AMH. 4e este modo, suele agregarse la polimerasa
luego de una etapa de desnaturalizacin previa que permita la separacin ex!austiva de ambas !ebras.
Ltro mtodo normalmente utilizado es el Hot start en el que se excluye un reactivo de la mezcla de reaccin !asta
que la reaccin llega a A=H para evitar la inespecificidad que pudiera causar el anillado inespecfico o la elongacin a
ba/as temperaturas "la polimerasa es poco activa a temperatura ambiente, pero aun as posee una actividad basal
que puede representar una fuente de error&. )ara esto se aplicaron diversos mtodos, por e/emplo, la utilizacin de
una fina capa de parafina entre la mezcla de reaccin y la solucin de uno de los componentes, que se fundir a la
temperatura de desnaturalizacin permitiendo la mezcla, o el uso de anticuerpos anti57aq termoselectivos que in!iben
a la polimerasa excepto a temperaturas de desnaturalizacin.
7ambin suele diferenciarse la temperatura de desnaturalizacin en los primeros ciclos, para asegurarse una
correcta desnaturalizacin del material de partida.
0.'. Etapa de annealing
La etapa del annealing de los cebadores al 4$% molde es uno de los principales blancos a la !ora de modificar los
parmetros de las ).#s para aumentar su eficacia. Esto es as, porque a temperaturas ba/as, se nota una mayor
proporcin de uniones cebadores5molde, pero que en la mayora de los casos es inespecfica, mientras que a
temperaturas altas, la cantidad de uniones es menor, pero me/ora notablemente la especificidad del proceso.
$o existe una temperatura de annealing constante para cualquier tipo de 4$%. sta depende ntimamente del nivel
de especificidad buscado, del tama-o del 4$% de origen, de la composicin de las bases del molde, de la
concentracin de los primers, etc.
Es en esta etapa donde la cintica del proceso /uega un papel ms importante. Las distintas variables que afectan al
annealing, se pueden observar en un parmetro cuantitativo, la temperatura de fusin "o 7m&. sta se define como la
temperatura a la cual la mitad de los oligonucletidos estn !ibridados con el molde, por lo que mientras ms difcil
sea esta unin, ms grande ser la 7m. .abe destacar que a medida que se aumenta la temperatura de annealing, la
cantidad de productos obtenidos tambin disminuye ya que aumenta la astringencia del proceso.
$ormalmente, la temperatura de annealing se encuentra en un rango que va desde los 03H a los G3H, y es aplicada
entre medio y dos minutos. 4e acuerdo a los resultados obtenidos, se buscar me/orar la especificidad "aumentando
la temperatura o disminuyendo el tiempo de annealing, lo que no afecta demasiado a la productividad del proceso&.
*e !an desarrollado numerosas frmulas empricas para determinar la me/or temperatura de annealing, siendo una
de las ms utilizadas la de :allace, donde 7a ; 'H . "%]7& ] =H "8].5Y&, donde Y es el n,mero de malos
apareamientos entre el molde y el cebador. Esta ecuacin es solo ,til a sistemas con concentraciones salinas de ( E,
por lo que se pueden utilizar otras ms comple/as. .abe destacar que en cualquier caso, el apareamiento del
nucletido en el extremo 01 debe ser perfecto, ya que si esto no sucede, la efectividad de la extensin disminuye
notablemente.
0.0. Etapa de extensin
La temperatura de la etapa de extensin suele ser la temperatura ptima para la actividad de la polimerasa. El
parmetro que puede modificarse en este caso, es el tiempo de tratamiento dependiendo de la longitud del fragmento
a extender, de su concentracin y de su naturaleza. 7ambin es necesario modificar las condiciones del medio de
reaccin para optimizar la actividad de la polimerasa, controlando su p+, su fuerza inica y la concentracin de
cofactores y cosolventes que requiere. )or e/emplo, la 7aq polimerasa puede alcanzar una velocidad de !asta (<<<
bases por minuto, si se controlan los parmetros antes descritos.
4. Proceso de ampli/icacin
La ).# se caracteriza por ser altamente especfica, es decir, amplifica la regin contenida entre los extremos 31 de
ambos cebadores utilizados en el proceso. Esto sucede por la propia naturaleza del proceso de amplificacin.
En el primer ciclo, se unir un cebador a cada !ebra del 4$% previamente separada, y se proceder a la copia de
stas !asta que se eleve la temperatura para comenzar el segundo ciclo. .omo resultado, se contar con dos !ebras
73
molde originales de 4$%, y dos !i/as, con un extremo determinado por el cebador, y el otro azaroso dependiente del
momento de detencin de la extensin.
En el segundo ciclo, se volvern a unir primers en el 4$% genmico pero tambin se unirn otros en las dos !ebras
!i/as. %s, luego de acabado el ciclo, se contar con las dos !ebras originales, cuatro !ebras !i/as con un extremo
cebador, y el otro indefinido, y dos fragmentos delimitados por ambos primers, es decir, dos fragmentos ,tiles.
da en el tercer ciclo, stos darn origen a fragmentos ,tiles mientras que otros nuevos sern generados de las
!ebras originales. Eatemticamente, podemos obtener una expresin que relacione el n,mero de productos de
longitud esperada con el n,mero de ciclos "n&. )ara stos, se obtendrn $ ; $<.'
n
productos, entre los cuales !ay $ ;
$<.'.n productos secundarios "es decir, delimitados solo por un cebador&, por lo que existirn $ ; $<."'
n
5'.n&
molculas de productos. 4e este modo, para 0< ciclos, se obtendrn (<[0[=([G= productos por cada molcula inicial
de 4$% en el medio.
(. ;ases de la P)%
Los ciclos de una ).# !abitual pueden dividirse en cuatro grupos distintos6
a& La Wase Nnicial, comprende los primeros cinco ciclos, y suele !acerse a ba/a temperatura de annealing, y alto
tiempo de desnaturalizacin. Esto se orienta a una buena eficacia de desnaturalizacin y una !ibridacin poco
especfica pero que produce una gran !eterogeneidad de productos, que sern luego seleccionados mediante las
fases siguientes.
b& La Wase 7emprana, comprende los siguientes cinco ciclos y se utilizan las temperaturas y tiempos usuales del
proceso. *e nota un ba/o aumento de la concentracin de producto debido a que el scanning de los moldes por los
primers es lento debido a su ba/a concentracin.
c& La Wase Nntermedia, comprende los siguientes (35'< ciclos y es donde se nota el mayor crecimiento de la
concentracin de producto, ya que la relacin de concentraciones entre primers y !ebras molde se !ace cada vez
menor, adems aumenta la proporcin de copias replicadas frente a las de molde.
d& La Wase )lateau, se nota en los ,ltimos ciclos, y se alcanza al acumularse el producto "!asta <,05(,< nm&, lo que
genera el anillado complementario de ste e impidiendo la unin de los primers. %dems, la cantidad de primers y de
enzima activa tambin disminuye, ya que los primeros son utilizados o degradados y la segunda se inactiva a medida
que avanza al proceso. 7ambin se nota un aumento en la concentracin de pirofosfato, lo que puede in!ibir al
proceso.
Tema &: .3R 44 5 .rotocolo de .3R
1. )omponentes esenciales
La primera eleccin inteligente a la !ora de crear un protocolo de ).# es la seleccin de sus componentes
esenciales.
(.(. 4$% polimerasa
En las primeras ).# se utilizaban 4$% polimerasas usuales obtenidas de procariotas o eucariotas, como las 4$%
)ol N "su fragmento de clenoK&, NN, NNN, S o P. *in embargo, deban reponerse luego de cada ciclo ya que eran
inactivadas por calor. 2n salto impresionante en la aplicacin de la tcnica se dio cuando se aislaron las 4$%
polimerasas termoestables de arqueas. stas tienen temperaturas ptimas elevadas "entre [<H y M<H&, pero lo ms
importante es que resisten temperaturas de !asta (<<H sin perder actividad.
*e !an comercializado un gran n,mero de stas, de acuerdo al organismo del cual provienen. La ms com,n "y
econmica& es la 7aq polimerasa, proveniente de 0hermus a>uaticus, que cumple las condiciones de estabilidad,
pero que posee una ba/a fidelidad, ya que incorpora un nucletido errneo, en promedio, cada (<<<< nucletidos
agregados, lo que representa una elevada tasa de error. $o obstante, una de las mayores causas de la aplicacin de
la 7aq polimerasa es su actividad transferasa terminal, es decir, su capacidad de agregar una adenina al extremo 01,
lo que permite la utilizacin de vectores de clonado con una 7 en el extremo 31, como el )58EE7.
*i la tasa de error o la estabilidad de la 7aq polimerasa no son suficientes, existen otras opciones, como la )Ko
polimerasa "de <yrococcus Doesei& que es estable por ms de dos !oras a (<<H o la 4eep9ent que no pierde
estabilidad a A3H. )or otro lado, tanto la )fu "de <yrococcus furiosus& como la )fx polimerasas poseen fidelidades
altsimas debido a su actividad 01531 exonucleasa, al igual que 4eep9ent.
2n parmetro importante a modificar es la actividad de enzima necesaria para llevar a cabo la ).#. Lo ms com,n
es usar entre (,3 y ' 2 de enzima. 7ambin es muy importante controlar la cantidad de magnesio y d$7)s en el
medio, lo que afecta considerablemente la fidelidad del proceso. )or e/emplo, para la 7aq polimerasa, no se debe
usar ms de (,3 mE de magnesio, ni de 3< mE de cloruro de potasio.
(.'. .ebadores
Los cebadores ideales para utilizar en reacciones de ).# no deben pasar los 0< pb, ni ser ms peque-os que (3 pb,
con una proporcin 8.@%7 equilibrada, y con distribucin purina5pirimidina !omognea.
*u secuencia tambin debe ser ob/eto de control, ya que !ay que evitar la formacin de estructuras secundarias en
el primer "evitar palndromos o segmentos de polipurinas y polipirimidinas&. %dems, se suelen buscar primers que
posean varios pares 8. cerca del extremo 01 lo que aumenta la fuerza de unin.
*e deben agregar en exceso, en cantidad suficiente para no funcionar como reactivos limitantes en el transcurso de
la ).#, lo que se consigue generalmente con concentraciones entre <,( y ( _E.
2n dato importante es que los dos cebadores agregados a una ).# deben poseer similares 7m, ya que si no es as,
uno de ellos generar uniones poco especficas "si la temperatura es muy ba/a& o se unir poco "si la temperatura es
muy alta&. )ara estimar su 7m puede usarse la frmula de :allace y debe existir un I7m no mayor a 3H.
74
*e pueden agregar secuencias no complementarias en los extremos 31 "no en los 01& que pueden servir para
procesos posteriores en el mtodo.
(.0. Eolde
El molde para la ).# puede ser 4$% o #$%, de simple o doble !ebra. Es all que su conformacin topolgica
afecta la efectividad del proceso "generalmente el 4$% circular y enrollado es menor efectivo&, los efectos que causa
son leves con respecto a otros factores.
*e puede amplificar a partir de una sola copia de molde, pero usualmente se usan varias. $o obstante, las masas
varan de acuerdo al tipo de fuente, ya que un mismo n,mero de copias para 4$% plasmdico o de 4$% genmico,
incrementa en un factor de (<
G
la masa de 4$% necesaria para contenerlas.
7ambin es notablemente importante la pureza del molde, ya que las impurezas ms peque-as suelen ser muy
influyentes a la !ora de amplificar por ).#. $o solo las impurezas biolgicas, sino tambin las impurezas qumicas,
como quelantes "E47%, trietanolamina, etc&, detergentes, fenoles, porfirinas, coagulantes, etc.
La mayor influencia del molde se da sobre la cantidad de ciclos necesarios para la ).#. *i el molde de partida es
grande, se requiere un gran n,mero de ciclos para obtener una cantidad determinada de productos, que a veces
puede llegar a ser inviable para el proceso.
(.=. .oncentracin de magnesio
El magnesio es un reactivo fundamental en la eficacia de las ).#, ya que afecta una gran variedad de fenmenos
replicativos. El magnesio se une a d$7)1s y estabiliza a los polinucletidos. 4e a! que no sea sorprendente que
estabilice la unin del primer al molde, y al 4$% doble !ebra producido en la replicacin. %dems es un cofactor de la
7aq polimerasa "y de la mayora de las otras& y tambin afecta su fidelidad.
%ltas concentraciones de magnesio aumentan la productividad de la polimerasa, por lo que aumentan el rendimiento
general del proceso. *in embargo, tambin estabilizan las dobles cadenas, incluso si no estn bien apareadas, por lo
que en altas concentraciones puede favorecer la formacin de artefactos y evitan la disociacin del 4$% de doble
!ebra en el proceso de desnaturalizacin, lo que disminuye la fidelidad del proceso.
4e aqu vemos que un control puntual de la concentracin de magnesio es fundamental para conseguir buenos
resultados. 2sualmente se coloca en concentracin no mayor a (< mE, generalmente en concentraciones de ',3 mE.
4eben exceder del total de la concentracin de d$7)1s del medio en <,350 mE.
*i se nota una disminucin de la especificidad, es conveniente disminuir la concentracin de magnesio, y se realizar
lo contrario si se quiere aumentar la eficiencia del proceso.
(.3. d$7)1s
Los d$7)1s deben incorporarse en una concentracin total de entre '< y '<< _E, lo que representa una cantidad
mayor a la cm de la polimerasa para con ellos "(3 _E&. %dems, deben incorporarse en concentraciones iguales, ya
que si no pueden ser incorporados preferencialmente los que estn en mayor concentracin. *i la ).# consta de
muc!os ciclos, es necesario titular la concentracin de d$7)1s luego de varios de estos, ya que !ay que verificar que
no se agotaron en el proceso.
*e puede modificar su concentracin siguiendo el mismo pensamiento que para el magnesio, es decir,
disminuyndola para aumentar la especificidad, o aumentndola para aumentar la eficiencia. *in embargo, !ay que
tener en cuenta que la concentracin de magnesio deber ba/arse en proporciones equimolares, para que no !aya un
exceso de ste que afecte a la eficiencia de la reaccin. %ntes de proceder a la modificacin de la cantidad de d$7)1s
es preferible modificar la concentracin de cebadores.
Los d$7)1s se preparan en soluciones stocJ a p+ [ que no soportan ms de ' meses de guardado.
(.G. $,mero de ciclos
El n,mero de ciclos depende fundamentalmente del tama-o del molde utilizado. El efecto )lateau aumenta las
amplificaciones inespecficas, por lo que aumentar el n,mero de ciclos no incrementa la especificidad del proceso
general. 4e a! que es importante conocer cul es la cantidad ptima para determinada muestra de 4$%. *i se busca
aumentar la eficiencia es ms conveniente incrementar la duracin de cada paso.
*i se nota una prdida en la especificidad del proceso, es una buena idea probar con menos ciclos, ya que puede
deberse al efecto )lateau.
(.[. .ontaminacin y ruptura
Es muy com,n contaminar las mezclas de reaccin con el material de partida o con otro material biolgico
contaminante en las !erramientas de traba/o. )or otra parte, la mayora de los materiales utilizados en la preparacin
de la mezcla de reaccin para la ).# son termosensibles y frgiles, por lo que deben mantenerse en !ielo y agitarse
suavemente si !ay necesidad de !acerlo.
2. #odi/icacin de parmetros
4istintos parmetros del proceso pueden ser modificados para aumentar la eficacia del proceso6
a& 7emperatura de annealing. % medida que es ms elevada, ms especfico es el annealing. )uede determinarse
calculando el 7m e incrementndolo en (<5('H. Lo me/or es realizar una optimizacin de la temperatura de annealing.
Esto se logra realizando ).#s a distintas temperaturas comenzando a 3H menos que la 7m e incrementando entre '
y 3H por vez.
b& 7iempo de annealing. %l reducir los tiempos de annealing se aumenta la especificidad sin sufrir disminucin de la
productividad.
c& Etodo 7ouc!54oKn, se basa en la disminucin gradual de la temperatura de annealing, comenzando a (3H por
sobre la 7m, y acabando en 3H por deba/o de sta. *uele usarse con 4$% genmico.
d& .apa de aceite. En muc!as ocasiones, fundamentalmente en termocicladores antiguos o que no calientan
!omogneamente el tubo, suele incorporarse una capa de aceite sobre la mezcla de reaccin. sta evita que la
evaporacin de la muestra, y la condensacin de otras sustancias voltiles sobre ella. 4e esta manera, previene la
contaminacin cruzada y me/ora el equilibrio trmico en el interior del tubo. *e debe evitar incluir el aceite en las
75
electroforesis, y que dificulta la corrida del 4$% por lo que puede eliminarse mediante cloroformo, o limpiando las
pipetas luego de usarlas.
3. Protocolo modelo
8ariable %ango usual )antidad usual ;uente usual
9olumen de reaccin (< b (<< _L 3< _L 5
d$7)1s '< b =<< _E (<< _E 3 mE
Eg.l' <,3 b (< mE ',3 mE 3< mE
4$% polimerasa ( b 0 2 ',3 2 3 2@_L
.ebadores '< b (<<< pmol@mL "[3 b 0<< ng@mL& Exceso "(<< pmol@mL& (< _E
4$% molde genmico <,( b ( ng@mL <,3 ng@mL 5
4$% molde plasmdico ( b (< pg@mL ' pg@mL 5
>uffer [5M M "(x& 5
*ales y aditivos "detergentes, etc& 5 5 5
%gua Eilli` .sp .sp 5
7emperatura de 4esnaturalizacin A<5A3H A=H 5
7emperatura de %nnealing 035[<H *eg,n 7a
7emperatura de Extensin ['H ['H
4uracin de la 4esnaturalizacin ( minuto ( minuto 5
4uracin del %nnealing ( minuto ( minuto 5
4uracin de la Extensin ( Jpb@minuto ( Jpb@minuto
4esnaturalizacin inicial 35(< minutos 3 minutos
Extensin final =5G minutos = minutos
Tema (: .3R 444 5 Aplicacione de la .3R
1. )lonado
La ).# posee una gran aplicacin en distintas tcnicas de clonado. 4e !ec!o, su versatilidad permite su aplicacin
tanto en clonados direccionales como no direccionales.
(.(. .lonado no direccional
El clonado no direccional se da cuando el inserto a introducir en un vector, podr !acerlo en dos orientaciones
distintas, siendo una de ellas in,til para la expresin. En este caso, se pueden utilizar ciertas polimerasas especiales,
que faciliten el clonado.
a& La 7aq polimerasa posee una actividad desoxinucleotidil transferasa terminal que agrega residuos de adenosina en
el extremo 01 de los fragmentos que sintetiza. stos pueden clonarse fcilmente en vectores con extremos de timina
terminal en 31, como el 7L)L 7%, o la lnea p8EE57.
b& La )fu polimerasa amplifica los fragmentos de/ando extremos romos y con mayor fidelidad que la 7aq polimerasa.
stos pueden insertarse en vectores con extremos romos como el hero >lunt 7L)L.
.abe destacar que el tratamiento de los fragmentos producidos por una polimerasa con la otra, en condiciones
ptimas, puede transformarlos, es decir, agregar o quitar la 3157.
!.!.!. Kectores 0.<.
Los vectores 7L)L se caracterizan por ser cortados mediante la topoisomerasa N del virus Kaccinia que reconoce la
secuencia ...77mn%, ligndose a la 7 terminal mediante una de sus tirosinas. 4e esta manera, cuando detecta un
fragmento de 4$% que se clonar en este tipo de vector, cataliza el ataque del !idroxilo libre a ste grupo tirosilo,
catalizando la ligacin automtica y liberndose. Existen vectores 7L)L con timinas terminales "7L)L 7%& y con
extremos romos "hero >lunt 7L)L&.
(.'. .lonado direccional
El clonado direccional se da cuando se corta un fragmento con dos enzimas de restriccin distintas, al igual que el
vector de clonado, por lo que la orientacin en la que ste puede unirse es ,nica.
)ara !acerlo, suelen agregarse sitios de restriccin en los oligonucletidos utilizados para realizar la ).#. stos no
pueden ser agregados en el extremo 01 del primer, ya que ste debe estar perfectamente complementado para que la
extensin pueda tener lugar. )or otra parte, colocarlos en el extremo 31 tampoco es ,til, ya que las enzimas de
restriccin requieren una cantidad de nucletidos previos a la secuencia de reconocimiento para unirse fuertemente a
sta.
)ara calcular la temperatura de annealing en estos casos, debemos diferenciar los primeros ciclos de los ,ltimos. En
los primeros, la regin de !ibridacin es solo la complementaria, que no incluye a la regin de restriccin agregada.
76
En los segundos, ser la secuencia completa. )or esto, la temperatura de annealing es distinta, y es ,til variarla entre
una y otra en el proceso.
2. !mpli/icacin de secuencias desconocidas
.uando no se conoce la secuencia de un gen, pero se conoce la protena que codifica, se pueden fabricar
oligonucletidos degenerados basndose en la secuencia de aminocidos y el cdigo gentico. 2no de los
inconvenientes que se puede presentar en este caso, es el clculo de la temperatura de annealing, ya que no se
conoce realmente la secuencia de !ibridacin. El mtodo usual es calcular una temperatura de annealing
considerando que todos los nucletidos desconocidos son % o 71s, y otra considerndolos . o 81s. Luego, se podr
utiliza una temperatura constante intermedia, o un gradiente incremental comenzando en la ms ba/a y finalizando en
la ms alta.
3. "ntroduccin de mutaciones
*i se genera un oligonucletido perfectamente complementario con una regin de un gen, excepto en algunas pocas
posiciones intermedias, los productos de ).# que generar poseern mutaciones en estas posiciones, ya que
presentarn el nucletido complementario al del primer. 4e esta manera, es fcil introducir mutaciones puntuales en
genes en estudio.
4. .btencin de mol,culas recombinantes
*upongamos un fragmento de 4$% que puede ser amplificado por ).# mediante los primers % y >. %!ora,
supongamos otro fragmento distinto que puede ser amplificado usando los primers . y 4.
*i construimos un oligonucletido compuesto por la unin del > y el ., se podra usar como cebador tanto para la
amplificacin de uno de los fragmentos de 4$% como para el otro, y en ambos, generar una regin complementaria
entre ellos correspondiente a la complementaria a los primers > y .. *i luego de la amplificacin de ambos
fragmentos, se desnaturalizan y se ponen en contacto, ambos quedarn unidos por esta regin, y todava podrn
sufrir la unin de los primers % y 4 en sus extremos. #ealizando una nueva amplificacin con estos dos primers, se
obtendr un fragmento correspondiente a la fusin entre los otros dos, que pudieron !aber provenido de orgenes
completamente diferentes, es decir, molculas recombinantes.
(. P)% alelo espec/ica
*irve para la determinacin de alelos en una muestra comple/a, o para la amplificacin selectiva de un alelo entre
varios. *e sintetizan oligonucletidos exactamente iguales, que solo varen en su nucletido 01 terminal, y que ste
sea complementario a un nucletido variante entre ambos alelos. 4e este modo, no existir amplificacin en el alelo
que sufra un mismatc! con el primer, lo que permitir diferenciarlos "tratando distintas alcuotas de la mezcla con
diferentes primers& o amplificar selectivamente uno "tratando la mezcla con el complementario al alelo buscado&.
+. P)% anidada
2na ).# anidada se utiliza cuando se quiere me/orar la especificidad de una amplificacin por ).#. )or e/emplo,
cuando se quiere amplificar un gen pero no se cuenta con primers lo suficientemente especficos como para unirse
solo flanquendolo a l en el material de partida, sino que reconocen varios sitios.
)ara esto se realizan dos ).# seguidas, la primera utilizando primers que generen un fragmento relativamente
grande que contenga al gen de inters, y luego, se tratan estos con los primers flanqueantes del gen. 4e esta
manera, nos aseguramos que stos solo van a !ibridar cerca de ste, y no en otros sitios del genoma.
-. %!)E P)%
*irve para obtener la secuencia de los extremos 01 y 31 de un transcripto de #$% para poder utilizarla en el dise-o de
primers capaces de amplificar el gen por ).#. )ara !acerlo, se requiere conocer una corta secuencia del interior del
transcripto.
*i se quiere conocer el extremo 01, solo basta utilizar una cola de poli"7& que se !ibridar a la cola de poli"%& del
transcripto, y podr generar un c4$% ,til mediante transcriptasa reversa. )ara conocer el extremo 31, se utilizar la
secuencia interna y la transcriptasa reversa. Esto generar un c4$% al que se le puede agregar una cola de poli"8&
para utilizar luego un primer de poli".&.
=. Primer e0tensin
*irve para conocer la secuencia 31 terminal de un fragmento de cido nucleico, ya sea 4$% o #$%. *e utiliza un
primer interno radioactivo y la transcriptasa reversa como en la #%.E ).#. *e obtendr un c4$% marcado
radiactivamente que puede ser secuenciado mediante el mtodo de *anger.
>. %T?P)%
La #75).# sirve para obtener copias de un transcripto de #$% en c4$% y amplificarlo selectivamente. )ara
realizarla, se debe extraer el #$% de la clula diana, separarlo del resto de los componentes celulares y purificarlo.
Luego, se debe realizar la transcripcin reversa.
)ara este se puede contar con un primer especfico para el #$% buscado, o se puede retrotranscribir todos los #$%
presentes "con un oligo de poli"d7&, u oligonucletidos random generalmente de G nucletidos&. En el caso de optar
por la segunda estrategia, se deber luego utilizar alg,n mtodo para seleccionar el c4$% deseado entre el pool de
copias.
77
Luego de terminar la secuencia de retrotranscripcin, se debe eliminar el #$% del medio siempre y cuando ste
pueda significar una interferencia para el proceso. )or ,ltimo, se lleva a cabo el paso final de la reaccin, la
amplificacin del c4$% generado mediante ).# utilizando los primers especficos.
A.(. Extraccin de #$%
El #$% debe extraerse de la muestra comple/a como primer paso, ya que es necesario evitar la amplificacin
interferente de 4$% que pudiese estar presente en la muestra. )ara esto se debe6
a& )roteger el #$% de la muestra de su digestin por #$%sas, lo que se consigue evitando la incorporacin de
nuevas #$%sas del medio "es decir, evitando la contaminacin de la muestra con material biolgico& e inactivando las
presentes con reactivos especficos como el tiocianato de guanidinio.
b& Eliminar el 4$% y el #$% contaminante. El 4$% y ciertos tipos de #$% "generalmente los r#$% y los t#$%& son
interferentes en el desarrollo de la #75).#. *e !an desarrollado ciertos mtodos para eliminarlos o separarlos
selectivamente. )or e/emplo, el desarrollo de cromatografas de afinidad en el que se une covalentemente una cola
de poli57 a la fase estacionaria, lo que permite la unin selectiva de m#$%. $o obstante, este mtodo es
notablemente antieconmico, y muestra una gran dependencia con la longitud de la cola de poli5% del transcripto.
7ambin existen mtodos fisicoqumicos de separacin, como extracciones "con cido y fenol5cloroformo&,
precipitaciones "con cloruro de litio& y sedimentaciones "con cloruro de cesio&, adems de otros mtodos ms
agresivos como la accin de 4$%sas "de difcil inactivacin posterior&.
Ltra forma de eliminar la interferencia del 4$% se puede llevar a cabo en eucariotas de los cuales se conocen las
secuencias de los m#$% buscados y el 4$% que le da origen. 4ise-ando primers que complementen la regin de
unin entre exones en el m#$%, se evitar la amplificacin del 4$%, ya que el primer no tendr una
complementariedad completa en su extremo 01, ya que en este sitio encontrar un intrn.
1@. Estudio de la e0presin g,nica
Existen diversas metodologas aplicables en el estudio y el seguimiento de la expresin gnica.
(<.(. Ensayo de proteccin frente a la nucleasa
Este ensayo tiene como ob/etivo proteger al m#$% buscado para el anlisis de la accin de una #$%sa inespecfica.
El primer paso es la !ibridizacin de ste con una sonda radiactiva antisentido, es decir, perfectamente
complementaria a l. Luego, se realizar la digestin con #$%sa, selectiva para #$% de simple !ebra, y se
precipitarn los cidos nucleicos sobrantes luego de extraerlos en fenol5clorofomo. *embrndolo en geles de agarosa
se puede observar la variacin de concentracin del gen estudiado mediante revelado con radiografa.
(<.'. $ort!ern blotting
*e basa en la separacin del #$% por tama-o mediante electroforesis en gel, su transferencia a una membrana
porosa, y el tratamiento de sta con una solucin de sondas especficas al m#$% buscado marcadas de alguna
manera. Luego, lavando y revelando la membrana, se pueden visualizar las posiciones y las intensidades de las
bandas buscadas.
(<.0. +ibridacin in situ
*e basa en la fi/acin de organismos o te/idos enteros para luego tratarlos con una sonda marcada complementaria
al producto gnico buscado. Lbservndolo luego mediante alguna tcnica microscpica adecuada, o separando las
clulas "en el caso de organismos unicelulares& mediante citometra de flu/o, se puede seguir la expresin gnica.
(<.=. #75).#
7ambin se pueden aplicar tcnicas de #75).# para amplificar y cuantificar la cantidad de m#$% presente en una
muestra. Es la tcnica ms sensible, ya que permite la deteccin de !asta una sola copia de #$% en la muestra. $o
obstante, no permite la separacin por tama-o "como s lo !ace el $ort!ern blotting, tambin ,til en el estudio de
splicing alternativo& ni la localizacin tisular o intracelular "como s lo !ace la !ibridacin in situ&.
Tema 1+: 1$traccin de -cido nucleico
1. E0traccin de cidos nucleicos
(.(. Nmportancia
La mayora de los estudios y las tcnicas investigativas de la >iologa Eolecular se basan en el estudio de los cidos
nucleicos, ya sea el 4$% o el #$% celular. 4e a! que la extraccin de stos y su separacin de otros elementos
celulares contaminantes, como protenas o restos estructurales, sea imprescindible para el desarrollo y la aplicacin
de la disciplina.
Entre las tcnicas !abituales que utilizan 4$%, encontramos el *out!ern blot, la ).#, las tcnicas de clonacin, etc.
Entre las que utilizan #$%, se !allan el $ort!ern blot, la #75).#, los microarrays, las tcnicas de traduccin in vitro,
etc.
(.'. 7cnica
La extraccin de cidos nucleicos abarca su separacin, purificacin y mantenimiento, es decir, no solo encontrar
formas para eliminar los otros componentes celulares del medio, sino tambin evitar la fragmentacin mecnica o
biolgica. 4e a! que la mayora de las tcnicas descritas a continuacin se aplican rpidamente y en fro, y adems
evitando arrastrar solventes o sales que afectan la actividad enzimtica posterior.
.ualquier mtodo de extraccin y purificacin requiere la ruptura celular, la desnaturalizacin de protenas
"especialmente de las nucleasas& y la purificacin de los cidos nucleicos deseados del resto.
2. Detalles de la t,cnica
'.(. )reparacin de extractos celulares
78
Es la ruptura de las clulas para liberar su contenido, puntualmente los cidos nucleicos. *e suele realizar mediante
una combinacin de mtodos fsicos y qumicos. Entre los mtodos fsicos o mecnicos, encontramos6
a& Eortereado
b& *onicacin
c& )rensa de Wrenc!
Entre los mtodos qumicos, se encuentran6
a& La destruccin de la pared celular con lisozima, E47% "para bacterias&, liticasa "para levaduras&, celulasa, etc.
b& La destruccin de la membrana celular con detergentes, como *4* o .7%> "bromuro de !exadeciltrimetilamonio&,
con distinta fortaleza dependiendo del tipo de membranas que deben destruirse y el grado de destruccin que se
busca.
'.'. *eparacin de los cidos nucleicos
La separacin de los cidos nucleicos es el paso ms sensible e importante de la tcnica. Luego de un paso de
centrifugacin para remover el pellet compuesto por los restos celulares slidos, se procede a los tratamientos
desnaturalizantes de protenas para permitir su separacin posterior.
La desnaturalizacin proteica no solo permite su prdida de solubilidad lo que facilitar las tareas separativas "libera
el 4$% unido a ellas, y permite una me/or accin de proteasas&, sino que tambin permite la prdida de actividad
biolgica de ciertas protenas indeseables como nucleasas. )ara esto, se utilizan agentes desnaturalizantes, como
detergentes inicos "*4*, .7%>, etc.&, caotrpicos "urea, cloruro de guanidinio, etc.&, reductores "477, Q5
mercaptoetanol, etc.&, etc.
)osteriormente, y luego de un posible paso de tratamiento con proteasas "como la proteinasa c&, se procede a la
separacin propiamente dic!a. *e !an usado diversos mtodos para !acerlo, entre los que encontramos6
a& Extraccin orgnica. La polaridad del 4$% lo insolubiliza en solventes apolares, y es ms eficiente cuando se usan
mezclas binarias de solventes apolares "usualmente fenol@cloroformo (6(&. 7ambin suele utilizarse una extraccin
final con cloroformo "y alco!ol isoamlico, un antiespumante& para eliminar el fenol.
b& *alting out. *e utiliza fundamentalmente el cloruro de sodio ya que es el ms eliminable.
c& )recipitacin con alco!ol. La precipitacin con alco!ol "y sales& permite la precipitacin del 4$%, ya que los
cationes neutralizan las cargas negativas de los fosfatos, y permiten la agregacin del 4$% insoluble en alco!ol. )ara
esto, se utilizan el etanol y@o el isopropanol en fro. El isopropanol es me/or precipitante del 4$% y las sales "lo que
obligar a un lavado ms ex!austivo& pero es ms difcil de eliminar, aunque se requiere menos volumen y no se
requiere fro para que funcione. El etanol, en cambio, es requerido en mayor cantidad y en fro, pero es ms ,til para
molculas de 4$% peque-as o diluidas.
)osteriormente a la precipitacin, el 4$% se lava con etanol fro al [<B, lo que solubiliza las sales y no el 4$%.
7ambin suele agregarse glucgeno, que precipita /unto al 4$% arrastrando 4$% diluido, y que no interfiere en el
tratamiento posterior del cido nucleico. El almacenamiento del 4$% se !ace en un buffer ligeramente bsico "para
evitar la depurinacin y la accin de las 4$%sas&, con E47% "para quelar los iones magnesio& y preferiblemente a
5'<H sin descongelar la muestra muc!as veces.
d& 2nin selectiva a soportes slidos. *e !an desarrollado slicas o resinas de intercambio aninico especficas para
cidos nucleicos "las slicas son utilizadas con sales caotrpicas que evita la unin de protenas y se eluyen con
agua& que permiten su separacin rpida, posiblemente automtica y que no precipita el 4$% ni lidia con solventes
orgnicos.
'.0. *eparacin de 4$% plasmdico
El 4$% plasmdico puede identificarse y separarse del genmico debido a6
a& *u tama-o, siempre y cuando el 4$% genmico no est roto ex!austivamente. *e logra suavizando las tcnicas
disruptivas, lo que permite que el 4$% genmico sea arrastrado !acia el pellet por los restos celulares.
b& *u conformacin, ya que los plsmidos son circulares, lo que permite que luego de desnaturalizarse "usualmente
mediante el lisgeno ((9 !idrxido de sodio y *4*& y renaturalizarse "mediante el lisgeno (((, acetato de potasio&, solo
sean los plsmidos los 4$% doble !ebra y puedan separarse por centrifugacin al no decantar.
3. Puri/icacin de %!
Las tcnicas utilizadas anteriormente se basan en la extraccin del 4$%, el ob/etivo ms com,n. $o obstante,
tambin puede requerirse purificar #$%, lo que conlleva a un desafo mayor debido a su menor tama-o, y a su gran
variedad, ya que el m#$% slo representa un (53B del total celular.
0.(. Las ribonucleasas
Las ribonucleasas son enzimas que degradan #$% inespecficamente. Es un contaminante com,n, pero difcil de
eliminar, ya que incluso soporta temperaturas mayores a ('<H. 4e a! que las tcnicas suelen llevarse a cabo
evitando el contacto con te/ido animal, esterilizando cada vez que sea posible, y lavando el material no descartable
con perxido de !idrgeno o !idrxido de sodio. *uele utilizarse tambin un inactivador de las ribonucleasas, el
dietilpirocarbonato "4E).& pero es carcinognico.
0.'. )urificacin de #$% total
$o existen grandes diferencias entre las tcnicas de separacin de 4$% y #$%, solo el agregado o la remocin de
ciertos pasos que elevan la especificidad. *e utilizan dos mtodos de purificacin distintos6
a& )or solventes orgnicos. *e utiliza fenol -cido, que adems del fenol posee como desnaturalizante al cloruro de
guanidinio, lo que desnaturaliza la mayora de las protenas y cidos nucleicos grandes, entre ellos, las ribonucleasas
y el 4$%. *e extrae con cloroformo y se contin,a tal como si fuera la tcnica estndar. Es un mtodo econmico.
b& )or soportes slidos. *e utilizan columnas especficas para 4$% que se lavan con solventes alco!licos que
elimina los contaminantes, 4$%sas, etc. La elucin final es con agua. *on costosos.
3..!. Aislamiento de m+"A
79
*i se quiere separar solo el #$% mensa/ero de una muestra celular se recurre a matrices cromatogrficas que posee
unidas colas de poli"7&. 4e ms est decir que es una tcnica slo aplicable a muestras provenientes de clulas
eucariotas.
0.0. #esuspensin y almacenamiento
La resuspensin del #$% separado suele ser ms complicada que la del 4$%, ya que el medio debe estar libre de
#$%sas, el p+ debe mantenerse constantemente cido "entre G y [& y deben incorporarse agentes quelantes. Esto
est relacionado con la degradacin automtica del #$% a p+ bsicos lo que es catalizado por iones divalentes.
El almacenamiento debe ser a ba/a temperatura, entre 5'<H y 5M<H dependiendo del tiempo que debe almacenarse.
)ara perodos muy prolongados, conviene precipitarlo con acetato de amonio y etanol, y almacenarlo a 5M<H
4. )uanti/icacin de cidos nucleicos
=.(. )ureza y concentracin
%mbas son evaluadas mediante absorbancia 29. Los nucletidos absorben a 'G< nm, pero se notan interferencias
con las protenas "sus residuos aromticos absorben a 'M< nm& y el fenol "absorben a '0< nm&. 4e a! que para
evaluar la pureza de una muestra se utilice el cociente entre la absorbancia a 'G< nm y a '0< nm "o 'M< nm&,
esperando razones entre (,M y '. % valores ms peque-os, la muestra se ve impurificada por fenol o protenas,
respectivamente. 4e !ec!o, generalmente se resta a cada absorbancia utilizada la absorbancia de la muestra a 0'<
nm, lo que representa la turbidez de la misma independiente de su composicin.
)or otra parte, si se sabe que la muestra contiene una especie de cido nucleico pura "4$% doble !ebra, 4$%
simple !ebra, #$%, etc.&, se puede relacionar el valor de la absorbancia a 'G< nm con su concentracin, siendo 3<
_g@mL en el primer caso, 00 _g@mL en el segundo y =< _g@mL en el ,ltimo. Esto es aplicable en un rango entre <,( y (
2%, y en muestras estabilizadas mediante buffers alcalinos de ba/a fuerza inica.
=.'. Nntegridad
La integridad de los cidos nucleicos se estudia mediante geles de agarosa o poliacrilamida. Esto tambin sirve para
estimar la concentracin de 4$% en base a la intensidad de la banda de peso ms cercano de un estndar de
concentracin conocida. .laro que la cuantificacin se sobreestimar si la muestra est contaminada con #$%.
*uele estimarse la integridad de una muestra de #$% total mediante la relacin de intensidad de las bandas de r#$%
'M* y (M* que debe ser aproximadamente ' a (.
Tema 11: 1lectro!orei de -cido nucleico
1. "ntroduccin
La electroforesis de cidos nucleicos permite la separacin de molculas de 4$% o #$% en base a su tama-o o
conformacin al ser sometidas a un campo elctrico, debido a que poseen una carga constante por unidad de masa
otorgada por sus grupos fosfato. Los geles entonces act,an simplemente como tamices moleculares. Luego, las
molculas son observadas por la tincin con colorantes de diversa sensibilidad, y pueden extraerse del gel de manera
preparati*a.
2. Electro/oresis de cidos nucleicos en geles de agarosa
La agarosa es un !eteropolisacrido natural compuesto fundamentalmente por una unidad repetitiva dimrica de
galactosa y 0,G5an!idrogalactosa, una en conformacin 4 y la otra en conformacin L.
Los geles de agarosa suelen correrse !orizontalmente.
Los factores que determinan la velocidad de migracin del 4$% en geles de
agarosa son6
a& 7ama-o molecular del 4$%. La velocidad de migracin es inversamente
proporcional al logaritmo decimal del tama-o del 4$% en pares de bases.
b& .oncentracin de agarosa. *e demuestra que la disminucin de la
movilidad electrofortica en el gel "con respecto a su movilidad en libertad&
se relaciona exponencialmente con la concentracin de agarosa del mismo.
c& .onformacin del 4$%. Eolculas del mismo tama-o pueden migrar a diferentes velocidades dependiendo de su
conformacin espacial, generalmente movindose ms mientras ms enrollado est.
d& 9olta/e aplicado. % volta/es ba/os, la velocidad de migracin de fragmentos lineales de 4$% es proporcional al
volta/e aplicado. )or esto, mientras ms alto es el volta/e, ms peque-o es el rango de separacin del mtodo.
La electroforesis en geles de agarosa suele realizarse en buffers que no solo controlan el p+ del medio sino que
tambin controlan su fuerza inica. Es necesaria una fuerza inica intermedia, ya que a valores muy ba/os, la
conductividad es muy ba/a como para que la migracin tenga una velocidad ,til. En cambio, fuerzas inicas muy altas
generan conductividades tan altas que producen calor suficiente como para fundir el gel.
)or otra parte, se pueden realizar con los colorantes intercalantes directamente agregados al gel, pero eso retrasa
levemente la movilidad electrofortica debido al aumento de tama-o y rigidez de la molcula.
'.(. Electroforesis de campo pulstil ")W8E&
*e !an desarrollado nuevas tcnicas en la que los pulsos de campo elctrico aplicados al gel cambian de direccin y
orientacin, lo que obliga a las molculas de 4$% a reorientarse luego de cada pulso a lo largo del nuevo e/e. Esto
representa una nueva variable, ya que el tama-o de la molcula influye en el tiempo de reorientacin6 molculas ms
peque-as se reordenan ms rpido que otras ms grandes, por lo que puede moverse ms fcilmente. )uede
aplicarse para separar molculas de 4$% mayores a G<<< Jb, lo que ampla su utilizacin en genomas bacterianos o
cromosomas eucariotas.
80
3. Electro/oresis de cidos nucleicos en geles de poliacrilamida
La acrilamida es una sustancia orgnica sinttica simple, y, como lo dice su nombre, es una amida acrlica. La
bisacrilamida, en cambio, se compone de dos acrilamidas unidas por un puente metileno entre sus grupos amida. El
doble enlace permite la polimerizacin mediante ataques nucleoflicos, y la bisacrilamida permite la ramificacin de la
red. %s, regulando la proporcin entre acrilamida y bisacrilamida, se pueden obtener CporosD moleculares ms o
menos grandes. )ara iniciar la reaccin en cadena se utilizan reactivos radicalarios como persulfato de amonio y
tetrametiletilendiamina "7EEE4&.
*e utiliza para separar fragmentos peque-os de cido nucleico, separndolos incluso por diferencias de un solo
nucletido. )or otra parte, pueden alo/ar mayores cantidades de 4$% que los geles de agarosa lo que permite una
separacin muc!o ms resoluta, y una recuperacin de 4$% muc!o ms puro.
0.(. .lasificacin
Los geles de poliacrilamida se clasifican en6
a& $o desnaturalizantes, que se aplican en la separacin y purificacin de fragmentos de 4$% doble !ebra, y donde
se sigue cumpliendo la relacin inversa entre la velocidad de migracin y el logaritmo decimal del tama-o del
fragmento. Es la preferida en experiencias preparativas.
b& 4esnaturalizantes, que se aplican en la separacin y purificacin de fragmentos de 4$% simple !ebra. La
caracterstica se la brinda la polimerizacin en presencia de urea o formamida, y muestran una independencia de
migracin con respecto a la secuencia "lo que no se ve en el otro tipo&. *e usan en anlisis de productos de
secuenciacin.
4. !plicacin de los m,todos
Las muestras se siembran en un buffer que contiene glicerol o sacarosa para brindarle densidad y evitar la
disolucin en el buffer de corrida. %dems, contiene colorantes que permiten monitorear el progreso de la corrida
electrofortica, usualmente azul de bromofenol "que migra como 4$% lineal de 3<< pb& y xilen cyanol "que migra
como 4$% lineal de 3 Jb&.
La visualizacin de los cidos nucleicos se realiza mediante colorantes intercalantes como el bromuro de etidio o el
*ybr safe, que fluorescen a 3A< nm. .abe destacar que suelen in!ibir la polimerizacin de la acrilamida.
.abe destacar que los geles para electroforesis de #$% suelen contener agentes desnaturalizantes adicionales
"como el formalde!do, el glioxal o el 4E*L& que impiden la generacin de estructuras secundarias.
Tema 12: Tcnica de 6ibridacin molecular
1. Aibridacin molecular
La !ibridacin entre dos !ebras complementarias de cido nucleico le/os est de ser una realidad de poca aplicacin
prctica. Euc!as tcnicas de !ibridacin !an surgido y sirven en la identificacin y amplificacin de secuencias
especficas.
(.(. Wactores que afectan a la estabilidad de la !ibridacin
Existen diversos factores que estabilizan dos molculas de cidos nucleicos complementarias apareadas6
a& La proporcin 8., ya que la fortaleza de este enlace es notablemente superior a la del par %7
b& El grado de complementariedad
c& El largo de las !ebras
d& La concentracin de sal. %ltas concentraciones de cationes reducen la repulsin electrosttica entre fosfatos de los
cidos nucleicos.
e& 7emperatura y p+. Los p+1s bsicos suelen favorecer la repulsin electrosttica entre las !ebras por ionizacin de
los grupos fosfato
f& .oncentracin de desnaturalizantes.
(.'. %plicaciones en la >iologa Eolecular
La !ibridacin permite detectar y aislar molculas de cidos nucleicos especficas en una mezcla comple/a, lo que las
!ace especficas, selectivas y sensibles. La primera de las tcnicas desarrolladas fue el )outhern blot sobre
molculas de 4$%, pero luego se extendi a #$% con el "orthern blot.
2. Sout'ern blot
La tcnica de *out!ern blot conlleva varios pasos6
a& 4igestin del 4$% con enzimas de restriccin. *uelen estandarizarse las masas de 4$% utilizadas de acuerdo a su
origen. $o se suele utilizar ms de ( _g de 4$% si es plasmdico, o ms de (< _g si es genmico.
b& Electroforesis en gel adecuado
c& 7ratamiento cido del gel con cido clor!drico <,' $ para depurinizar lo que permite una transferencia uniforme
d& 7ratamiento del gel con una solucin desnaturalizante "$aL+ <,3 E& que permite un buen apareamiento posterior
con la sonda
e& $eutralizante "buffer 7ris <,3 E&
f& 7ransferencia a una membrana. sta puede ser de6 N& $itrocelulosa, que une menos a los cidos nucleicos y es
ms frgil, o NN& $ylon, que tiene carga positiva pero genera una mayor inespecificidad de fondo. La transferencia
puede !acerse mediante capilaridad "en un buffer **. con citrato de sodio, en contacto con un papel de filtro? tcnica
bastante lenta& o por electrotransferencia ",til para geles de poliacrilamida, a temperatura controlada, y un volta/e de
=< 9&.
g& 7incin del gel con bromuro de etidio para evaluar la transferencia
!& Lavado de la membrana con el buffer **.
81
i& Wi/acin de los cidos nucleicos, por !orneado al vaco "en nitrocelulosa, a M<H& o por luz 29 "en nylon&
/& >loqueo de la membrana mediante una solucin que contiene 4$% de esperma de salmn, buffer **., formamida,
fosfato, *4*, etc. durante ms de 0 !oras. .on esto se bloquea la regin de la membrana que no contiene 4$%, para
que la sonda no se quede unida a sta y de falsos positivos.
J& +ibridacin de la sonda durante ms de G !oras. La solucin de !ibridacin es similar a la de bloqueo, pero
adems contiene a la sonda y sulfato de dextrn que aumenta la velocidad y el grado de !ibridacin. La astringencia
"especificidad de deteccin por !ibridacin& puede controlarse mediante la temperatura "elevada& y la ba/a
concentracin de sales. *uele utilizarse la ecuacin de 7m para sondas6 7m ; M(H ] (G,GH log j%
]
k ] <,=H "B 8.& b <,GH
"B formamida& b G<<H@longitud del !brido b (,3H "B mismatc!es&.
l& Lavados de la membrana. .on astringencia creciente, a menor concentracin de **. y mayor temperatura cada
uno "!asta llegar a la de !ibridacin&
m& #evelado. 4epende de cmo fue marcada la sonda. *i fue marcada con tomos radiactivos deber ser revelada
por autorradiografa. 7ambin puede !aber sido unida a biotina por lo que ser revelada mediante avidina con/ugada
a una enzima detectable como la fosfatasa alcalina "quimiolumiscente con $>7)@>.N)& o la peroxidasa de rabanito
"coloreada con 4%>@perxido de !idrgeno&. La sonda tambin puede con/ugarse a digoxigenina, por lo que se
revelar con anticuerpo para esta con/ugado a una de las enzimas anteriores.
3. ort'ern blot
El $ort!ern blot es una de las tcnicas de >iologa Eolecular ms aplicadas, ya que permite determinar el tama-o y
la cantidad de molculas de #$% intactas en una muestra, lo que es muy valioso en estudios de la expresin gnica.
*u desarrollo es muy similar al del *out!ern blot, aunque el #$% debe separarse en geles desnaturalizantes, lo que
evita los pasos de desnaturalizacin posterior. 7ampoco ser necesaria el corte con enzimas de restriccin, debido al
menor tama-o de los #$%.
)ara que un $ort!ern blot pueda ser utilizado en la comparacin de intensidades "es decir, en forma
semicuantitativa& debe agregarse una sonda especfica para un gen !ouseJeeping que demuestre la !omogeneidad
en las muestras sembradas.
4. Sondas
Las sondas utilizadas com,nmente en las tcnicas de !ibridacin provienen de una gran variedad de orgenes. 7anto
de 4$% doble !ebra obtenido, por e/emplo, de fragmentos de restriccin de alguna biblioteca, como de 4$% simple
!ebra generado por #75).#, o sondas de #$% o incluso sintticas. 2na de las caractersticas fundamentales e
importantes de stas es que deben estar marcadas de alg,n modo.
=.(. Earca/e de sondas
5.!.!. )ondas radiacti*as
*uelen marcarse mediante nucletidos que contienen fsforo isotpico "de peso 0'&. 7ambin pueden marcarse con
azufre503 o tritio, pero in!iben la accin de algunas enzimas requerida para la sntesis de la sonda y su emisin es
bastante dbil como para ser detectada por mtodos autorradiogrficos.
El marca/e puede realizarse mediante6
a& 7ranslacin de la mella6 se da por la accin de la 4$%sa N "que genera una mella al azar& y la 4$% )ol N de #. coli
que la trasladar reemplazando los nucletidos por otros marcados. Es un mtodo rpido, fcil y barato. La marca es
uniforme y de alta actividad. $o obstante, se debe estandarizar el mtodo.
b& #andom priming. *e utilizan fragmentos cortos al azar como cebadores para la actividad polimerasa del fragmento
de clenoK en presencia de d$7)s marcados radiactivamente. 8enera sondas muc!o ms marcadas que el mtodo
anterior.
c& Earcacin en el extremo 01. )uede !acerse mediante el uso de enzimas de restriccin que de/an extremos
protruyentes en 31 y se los rellena con el fragmento de clenoK y d$7)s marcados. 7ambin puede utilizarse la
terminal transferasa que adiciona nucletidos al extremo 01 sin molde.
d& Earcacin en el extremo 31. )uede !acerse mediante la 7= polinucletido quinasa, que cataliza la fosforilacin del
extremo 31 del 4$% previamente CfosfataseadoD a partir de un d$7). *i ste d$7) est marcado en su fosfato5R, el
marcado es inmediato.
.ualquiera sea el mtodo utilizado, luego se deber separar la sonda de los precursores marcados no incorporados
"mediante cromatografa de exclusin molecular o precipitacin con etanol& y medir la incorporacin de la marca
mediante un contador de centello. )or ,ltimo, las sondas se calientan para desnaturalizarse.
5.!.. )ondas marcadas con biotina o digo1igenina
*e unen d$7)s a biotina o digoxigenina y se incorporan a las sondas de la misma manera que en el caso de los
d$7)s radiactivos.
Tema 13: Marcadore moleculare
1. #arcadores gen,ticos
La definicin de un marcador gentico es absolutamente funcional y se relaciona con un carcter o elemento de
cualquier naturaleza que permita indicar la presencia de un gen determinado.
2n carcter, para ser marcador gentico, debe cumplir ciertas condiciones bsicas. 4ebe !eredarse de manera
mendeliana y codominante, ya que es necesario que se manifieste sin importar las relaciones de dominancia. 4e
!ec!o, tambin deber presentar alto polimorfismo, ya que se necesita una variedad importante de alelos incluso en
otras especies. *u expresin no debe modificarse por cambios ambientales y su identificacin debe ser sencilla, y en
lo posible, extensiva a distintas fases y estadios del desarrollo.
82
.abe destacar que los cambios observables que permiten el seguimiento del marcador no deben ser ,nicamente
fenotpicos importantes sino que basta con el cambio en un solo nucletido de un m#$% para que el marcador sea
,til siempre y cuando se cuente con una tcnica de determinacin sensible del cambio.
Los marcadores genticos pueden variar, entonces, desde marcadores morfolgicos, bioqumicos o moleculares
"llamados as a los que estn basados en el genoma del individuo&. 4entro de los marcadores morfolgicos, ms all
de sus obvias venta/as, encontramos algunas limitaciones como su ba/o n,mero, su ba/o nivel de polimorfismo, su
carencia de !erencia mendeliana, la ausencia de codominancia, su expresin slo en etapas adultas, etc. )or otra
parte, los marcadores bioqumicos suelen ser isoenzimas que poseen la misma actividad biolgica pero secuencias
de aminocidos levemente diferentes lo que permite diferenciarlas mediante su carga neta "por electroforesis no
desnaturalizante&, ya que provienen de distintos genes codificantes, distintos estados allicos, estructuras
cuaternarias alternativas o estn presentes en distintas ubicaciones subcelulares.
2. #arcadores moleculares
)odemos definir a un marcador molecular "o Cfenotipo molecularD& como a un segmento de 4$% cuya !erencia se
puede rastrear utilizando tcnicas de >iologa Eolecular, y no es necesariamente un gen codificante o regulatorio.
*u funcin es simplemente la de se-alar la ubicacin de genes "no necesariamente conocidos& que se ubiquen
cercanos a ellos debido a una !erencia con/unta. Es decir, es una tcnica de alta aplicabilidad en el reconocimiento
de personas, ya que permite evidenciar fcilmente las variaciones genmicas entre individuos, lo que tambin permite
su aplicacin en la filogenia.
Existen tres grupos de tcnicas para generar marcadores moleculares6 !ibridizacin molecular, ).# y la mezcla de
ambas. 4entro de las tcnicas basadas en la !ibridizacin, encontramos la #WL) y la 9$7#, mientras que en las
basadas en ).#, la ms importante es la #%)4.
3. Polimor/ismo de la longitud de los /ragmentos de restriccin 6%;LP7
Esta tcnica aprovec!a la venta/a de los cortes generados por enzimas de restriccin en sitios al azar del 4$%. *i los
cromosomas son !omlogos, los cortes sucedern en sitios CequivalentesD, y si existe alguna mutacin silenciosa en
las secuencias de stos, pueden perderse modificando el patrn de corte incluso sin producir un cambio fenotpico
observable. 4e a! que el estudio de la cantidad y la longitud de los fragmentos generados sea ,til para el
seguimiento de la evolucin genmica.
Las regiones m,ltiples de una regin que present estas modificaciones constituyen un #WL), y pueden analizarse
mediante la accin de enzimas de corte y sondas de 4$%, al estilo de un *out!ern blot. )or e/emplo, supongamos un
#WL) constituido por el caso ms simple, un alelo ( con un nucletido capaz de originar un sitio de restriccin, y un
alelo ' con este sitio mutado. *i se cuenta con una sonda de 4$% que incluya internamente al sitio de restriccin,
sta podr unirse a tres tipos de fragmento de distinta longitud, uno largo correspondiente al alelo ', y dos cortos
correspondientes a los dos fragmentos presentes en el alelo (. 4e esta manera, realizando un *out!ern blot sobre el
material gentico cortado con la enzima de restriccin en cuestin, se podrn diferenciar organismos !eterocigotas
"presentarn 0 bandas&, !omocigotas del alelo ( "presentarn ' bandas& y !omocigotas del alelo ' "presentar ( sola
banda&. 7odos los genes que estn cerca de este sistema de mutacin del sitio de restriccin pueden ser seguidos
mediante el sistema, incluso ser ms ,til, si cada alelo posee un alelo de otro gen cercano distinto, lo que permitir
observar la dotacin allica de la descendencia unvocamente relacionada a la dotacin allica del marcador #WL).
La tcnica original de los #WL)s se basaba en un *out!ern blot del 4$% genmico de los organismos utilizados con
distintas y numerosas sondas, de manera estandarizada, lo que permita obtener un patrn de bandas caracterstico.
La comparacin entre stos permite reconocer parentescos e igualdades entre los organismos.
0.(. Eapeo cromosmico
El conocimiento de la estructura genmica de los cromosomas fue progresiva y cada vez ms ex!austiva a medida
que pasaron los a-os. Los primeros intentos de conocerla se basaron en tcnicas de !ibridacin especfica para
ciertos genes ya conocidos "a partir de sus productos&, lo que permiti ubicarlos en un sitio determinado. Luego, el
mapeo cromosmico permiti un posicionamiento relativo entre los genes con distintos marcadores moleculares, lo
que permiti que la ubicacin relativa entre genes sea ms precisa. )osteriormente, se utiliz el mapeo por
restriccin, ubicando a los genes relativamente a los sitios de restriccin de enzimas de restriccin de corte
infrecuente. Los ,ltimos avances en el tema, permitieron el mapeo fsico, mediante la generacin de fragmentos
clonados y su estudio por separado para luego generar patrones de superposicin y alineamiento. El proceso termin
en la secuenciacin ex!austiva del genoma.
0.'. $,mero variable de repeticiones en tndem "9$7#&
*e basa en regiones del 4$% constituidas por repeticiones de una corta secuencia de 4$% estructural, debido
generalmente a un CresbaleD de la 4$% polimerasa a la !ora de replicar el genoma, lo que se acumula lentamente de
generacin en generacin. Esto es puntualmente importante para organismos !eterocigotas, ya que la probabilidad
de que el n,mero de repeticiones en estas regiones sea el mismo en ambos alelos, es muy ba/a. El locus podr ser
utilizado claramente para mapeo, mediante sondas de distinta longitud, o incluso mediante ).# y electroforesis de
sus productos.
4. D! polimr/ico ampli/icado al a$ar 6%!DP7
*e basa en la utilizacin de ).# sobre el 4$% genmico incorporando cebadores sintticos cortos de secuencia
arbitraria, lo que permitir la amplificacin de 4$% solo si se unen a regiones del 4$% a una distancia menor a 0 Jpb
y en orientacin opuesta. La probabilidad de que esto ocurra, suele ser ba/a pero no lo suficiente como para no dar
resultados "utilizando oligonucletidos de entre (< y (3 pb&. Esta tcnica no requiere informacin previa del 4$%, y
permite la comparacin de las bandas obtenidas en distintas personas para analizar igualdades, aunque no para
estudiar filogenia o relaciones de parentesco.
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$tese que esta tcnica no diferencia entre alelos, ya que en un organismo !eterocigota, si uno de los alelos no es
amplificado porque, por e/emplo, posee mutado el sitio de complementariedad del oligonucletido, la amplificacin se
realizar igual debida al otro alelo y dar positivo el ensayo.
$o obstante, es una tcnica bastante utilizada en el estudio gentico de poblaciones y en la filogenia entre especies,
ya que mide la modificacin estructural grosera de los cromosomas. Es ms sencillo y rpido que el #WL), generando
resultados ms ntidos y resolutos. %dems es una fuente importante de generacin de sondas para #WL)s en
regiones de diferenciacin.
Tema 14: 'iblioteca
1. "ntroduccin
El anlisis molecular del 4$% !a sido posible mediante el clonado de fragmentos de ste a diversos vectores. El
estudio del genoma total y el descubrimiento del funcionamiento y la composicin de ste no pueden realizarse
mediante el estudio proteico, sino que requiri alguna tcnica de clonacin inespecfica para permitir la determinacin
posterior de la identidad de cada gen o secuencia.
2na biblioteca es una coleccin de molculas de 4$% clonadas en un vector adecuado que derivan de fragmentos
de un genoma entero "en este caso sera una biblioteca genmica& o de c4$% obtenidos de todos los m#$% de la
clula "en este caso, sera una biblioteca de c4"A&.
2. 4ibliotecas genmicas
*e !an usado en una gran variedad de aplicaciones, desde secuenciacin, !asta clonado de genes desconocidos
para evaluar su expresin y funcionamiento. 7oda biblioteca debe ser6
a& #epresentativa. 4ebe contener a todo el genoma y repetido ms de cinco veces para asegurar una buena
probabilidad de encontrar el gen de manera estable y clonable. Las secuencias deben solaparse para permitir una
reconstruccin de regiones.
b& Wcil de analizar.
c& Wcil de utilizar, fundamentalmente presentando facilidad de extraccin y transferencia de genes a otros medios.
d& 4e tama-o mane/able
e& Wcil de construir
f& Wcil de amplificar
'.(. 7ratamiento cuantitativo
El tama-o mnimo de una biblioteca no depende del n,mero de vectores que la componen, sino del n,mero
necesario de clones independientes que contengan secuencias distintas. Llamando " a este n,mero, podemos
relacionarlo con la probabilidad deseada de encontrar el clon deseado, el tama-o del inserto "N& y el tama-o del
genoma total "8&. %s
( ) ln 1
ln 1
P
N
I
G

.
La cantidad de vectores que se encuentran por unidad de volumen de una biblioteca se denomina t%tulo de esta, y se
expresa en unidades formadoras de colonia o de placas de lisis por _L de muestra. Esto solo da una idea de la
cantidad de clulas con que se cuenta, pero no de la representatividad de la muestra en s.
'.'. 9ectores
Las bibliotecas genmicas se almacenan en determinados vectores construidos a partir de plsmidos y bacterifagos
naturales. stos deben ser estables, replicarse correctamente y de manera eficaz, permitir la extraccin de los
fragmentos clonados mediante enzimas de restriccin, y posee marcadores de seleccin para seleccionar a las
clulas transformadas.
Los plsmidos no son los vectores ms utilizados, ya que ms all de su sencillez de uso y manipulacin, no
soportan insertos mayores a los (< Jpb. )or otro lado, los fagos derivados del bacterifago lambda soporta insertos
de !asta '3 Jpb, mientras que otros vectores ms comple/os como los csmidos, los cromosomas artificiales de
bacterias, los derivados de levaduras o los vectores derivados del bacterifago )( soportan muc!o mayores tama-os
de inserto "3<, 0<<, (<<< y (<< Jpb respectivamente&.
'.0. .onstruccin
La construccin de una biblioteca genmica conlleva ciertos pasos, entre ellos6
a& La digestin parcial del 4$% genmico con enzimas de restriccin. El tipo de enzima utilizado depende del tama-o
del inserto que se quiera generar. Eientras ms grande sea el tama-o del inserto buscado, menos frecuente debe ser
el corte por la enzima, por lo que generalmente se prefieren las que tienen secuencias de restriccin de seis u oc!o
nucletidos.
b& Wraccionamiento en electroforesis en gel, o en electroforesis de campo pulstil "para fragmentos grandes&
c& Ligacin al vector y transformacin. *uele utilizarse empaquetamiento in *itro para insertos grandes, y
electroporacin para los no tan grandes. Los plsmidos y los vectores derivados del fago l ya casi no tienen utilidad
prctica.
.3.!. Construccin de una biblioteca con fagos M como *ectores
)ara construir una biblioteca usando fagos l, se mezcla un cultivo de #. coli con una muestra de fagos comercial. *e
de/a un tiempo para la infeccin celular, y luego se adiciona un gel de agar soft fundido y enriquecido con nutrientes.
Luego se vuelca sobre una placa de agar slido y se lo cultiva a 0[H, observando al da siguiente la aparicin de
placas de lisis, cada una producida por un fago. .ada placa de lisis, tericamente, es producida por un fago, que se
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replicar en las clulas y se liberar al medio para infectar a las restantes. Luego, los fagos se pueden recuperar
lavando superficialmente la placa con una solucin especial y se conservan indefinidamente.
.3.. Construccin de una biblioteca con csmidos
2n csmido es una molcula de 4$% circular que combina un origen de replicacin, sitios .os y sitios de
recombinacin. 4e a! que puedan soportar insertos grandes en sus sitios de m,ltiple clonado, y ser adentrados en
un fago por sus sitios .os de manera lineal. Luego, la infeccin de las clulas blanco "ms eficiente que la
transformacin& permitir transferirlo a sta, y expresar algunas propiedades, como la resistencia a antibiticos.
.3.3. Construccin de una biblioteca con cromosomas artificiales de le*adura
Los cromosomas artificiales de levadura son muy similares a los csmidos, ya que adems del origen y el *E.,
tambin cuentan con regiones 7EL que sern las reconocidas por las levaduras para iniciar la interiorizacin, y con un
centrmero. %dems, cuentan con un marcador de seleccin que usualmente es alguna enzima que permite la
sntesis de 7rp o uracilo, lo que permite la seleccin por auxotrofa.
Es un proceso bastante tedioso y la purificacin de los cromosomas requiere de tcnicas comple/as, como
electroforesis de campo pulstil. %dems las levaduras crecen lentamente, y los insertos son inestables, lo que
disminuye la eficacia del mtodo.
.3.5. Construccin de una biblioteca con cromosomas artificiales bacterianos
Es un mtodo ms estable, de cantidad de copia controlada "una por clula&, con vectores de tama-o mane/able y
utilizacin posible. *in embargo, suele presentar dificultades a la !ora de transformar bacterias, carecer de sistemas
de seleccin y mostrar limitaciones de tama-o poco controlables o presabidas.
.3.A. Construccin de una biblioteca con *ectores deri*ados del bacterifago <!
Es de aplicacin similar a los bacterifagos l pero con limitaciones de tama-o muc!o menores. *uelen incorporar un
sistema de seleccin denominado C*ac>NND, que se basa en la expresin de las clulas no recombinantes de una
protena txica a partir de sacarosa. 7ambin presentan un replicn inducible. Euestran una elevada estabilidad, la
posibilidad de replicacin, control de cantidad de copias y sistemas de seleccin.
#,todo B!) 4!) P!)
Etodo de transformacin 4irecta sobre los esferoplastos Electroporacin Electroporacin
*eleccin )or sistema ro/o@blanco )or sistema azul@blanco *ac>NN
*eleccin para vectores %uxotrofa .loranfenicol canamicina
Enzimas de restriccin utilizadas #co+( Hind((( 3bo(
'.=. )creening
)ara detectar qu clulas portan vectores con el gen de inters se utilizan sondas, ya sean de c4$%, de fragmentos
genmicos o de oligonucletidos sintticos. .laro que no podrn utilizarse anticuerpos "no existe expresin proteica&,
oligonucletidos degenerados "generan muc!os falsos positivos& o protenas de unin al 4$% "tambin lo !acen&.
3. 4ibliotecas de cD!
Las bibliotecas de c4$% !an estado siendo usadas muc!o ms com,nmente que las de 4$% genmico ya que son
ms sencillas y especficas, y vieron una explosin de uso luego del desarrollo de las tcnicas de ).#. %dems, son
un buen mtodo para estudiar la expresin gnica y son un paso previo imprescindible en la construccin de
microarrays.
)or otra parte, permite la utilizacin de vectores ms peque-os que en las bibliotecas genmicas ya que los insertos
son de menor longitud. %s como suceda con las bibliotecas genmicas, se puede predecir el n,mero necesario de
recombinantes independientes necesarios en una muestra para encontrar un clon con una probabilidad prefi/ada ), la
que es dependiente de la representatividad del m#$% en el total de la clula "#&, as
( )
( )
ln 1
ln 1
P
N
R

. *i no se
conociese la representatividad, se usa la estndar, <,<'B.
0.(. .reacin
Los vectores ms utilizados en este tipo de bibliotecas son los derivados del fago l, al que se adicionarn los
fragmentos luego de la sntesis de c4$%. )ara sta, se aislar el m#$% de la clula en estudio, se desnaturalizar e
!ibridar con un primer de poli"7&, que permitir la accin de la transcriptasa reversa. Luego, la 4$% )ol N y la #$%sa
+ eliminarn el #$% y permitirn la copia de la otra !ebra del 4$%, generando c4$% de extremos romos a los que se
le adicionarn adaptadores para poder ser ligados al vector adecuado.
Ltra opcin es la de utilizar la transferasa terminal para generar colas de poli".& en los 4$% simple !ebra luego de la
accin de la transcriptasa reversa, capaces de utilizar primers de poli"8& para extender el fragmento mediante la
accin del fragmento de clenoK. Este ,ltimo mtodo permite utilizar primers con sitios de restriccin distintos "uno
para el poli"7& y otro para el poli"8&& que permita un clonado direccionado.
0.'. )creening
)ara determinar las clulas que contienen a los genes de inters, se utiliza un mtodo de screening basado en la
transferencia de clulas o fagos a membranas especiales, su fi/acin desnaturalizante "que destruye las estructuras
externas obstaculizantes& y la unin de la sonda utilizada, marcada. Luego, revelando por autorradiografa la
membrana, se pueden obtener los sitios buscados.
Las sondas utilizadas son muc!o menos estrictas que en el caso de bibliotecas genmicas, como por e/emplo c4$%
de organismos relacionados, oligonucletidos sintticos "a partir de protenas conocidas& de unos '3 Jpb, etc.
0.0. >ibliotecas de expresin
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Las bibliotecas de expresin se construyen con fagos especiales anlogos a los plsmidos de expresin, que
permiten la induccin de la expresin del gen que portan mediante alguna sustancia agregada externamente, como
N)78. %s cada fago queda recubierto de la protena que expresa, lo que permite un screening de los filtros
generados simplemente mediante el uso de anticuerpos "incluso !eterlogos& contra sta.
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10 %io&9nesis de :r&anelas ' -ire$$iona*iento de )rote.nas 38
11 5ilen$ia*iento G9ni$o 41
12 %ioin4or*Ati$a 44
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14 )rote,*i$a 48
15 %ases #ole$ulares de la 5eGali<a$i,n Celular 48
16 %ases #ole$ulares de la Car$ino&9nesis 52
)arte 00> !erra*ientas De,ri$o-)rA$ti$as de D9$ni$as Hsuales de la %iolo&.a #ole$ular57
1 (n<i*as de ;estri$$i,n 58
2 (n<i*as utili<adas en la #anipula$i,n de Genes 59
3 @e$tores de Clonado 61
4 Drans4or*a$i,n ' 5ele$$i,n 63
5 (strate&ias de Clonado 68
6 5epara$i,n e 0denti4i$a$i,n de )rote.nas 70
7 )C; 0 I %ases #etodol,&i$as 71
8 )C; 00 I )roto$olos de )C; 73
9 )C; 000 I 8pli$a$iones de la )C; 75
10 (=tra$$i,n de A$idos nu$lei$os 77
11 (le$tro4oresis de A$idos nu$lei$os 79
12 D9$ni$as de !i7rida$i,n #ole$ular 80
13 #ar$adores #ole$ulares 81
14 %i7liote$as 82
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Jndi$e 85
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