Regulacin de la replicacin del ADN despus de un choque

trmico por interacciones con la replicacin de protena A-

nucleolina.

El choque trmico inhibe la sntesis de ADN replicativo, pero el mecanismo subyacente
sigue siendo desconocido. Se investigaron los aspectos mecanicistas de esta regulacin
en las clulas del melanoma mediante un virus de simio 40 (SV40)-basado en el ensayo
de replicacin del ADN in vitro. El choque trmico (44 C) produjo una inhibicin
monotnica de la replicacin del ADN celular despus de la exposicin para 5-90 min.
SV40 ADN actividad de replicacin en los extractos de clulas calentadas de manera
similar tambin se redujo despus de 5-30 minutos de exposicin, pero volvi a los
niveles de control despus de cerca de 60 a 90 minutos de exposicin. Esta inhibicin
transitoria de la replicacin del ADN de SV40 fue eliminado por la protena
recombinante de replicacin A (rRPA), lo que sugiere un proceso de regulacin
dirigidos a este factor de la replicacin del ADN clave. La inhibicin de la replicacin del
ADN de SV40 se asoci con un aumento transitorio en la interaccin entre la nucleolina
y el EPR que alcanz un mximo de 20-30 min. Debido a la unin a nucleolina
compromete la capacidad de RPA para apoyar la replicacin del ADN de SV40, se
sugiere que la interaccin observada refleja un mecanismo que permita la replicacin
del ADN se regula despus de choque trmico.
La relevancia de esta interaccin para la regulacin de la replicacin del ADN celular se
indica mediante la translocacin transitoria en clulas calentadas de la nucleolina del
nucleolo en el nucleoplasma con una cintica muy similares a las de la inhibicin de la
replicacin del ADN de SV40 y de la interaccin de RPA-nucleolina. Debido a la
orientacin de RPA por nucleolina en clulas calentadas se produce en un ambiente
que preserva la actividad de varios factores de replicacin de ADN esenciales, procesos
activos pueden contribuir a la inhibicin de la replicacin del ADN en un grado mayor
que se piensa actualmente. Las Interacciones RPA-nucleolina siempre son
representativas de un primer paso en la regulacin de la replicacin del ADN, como la
nucleolina se relocaliza en el nuclolo 1-2 h despus de la exposicin al calor, pero la
replicacin del ADN celular se qued inhibido para un mximo de 8 h. Proponemos que
las funciones nucleolo como un sensor de calor que utiliza la nucleolina como una
molcula de sealizacin para iniciar respuestas inhibitorias equivalentes a un puesto
de control.
La replicacin del ADN est en el centro del ciclo celular eucariota, y su regulacin en
condiciones de estrs, o despus de la exposicin a agentes que daan el ADN, est
bajo el control de las vas intrincadas que slo ahora comienzan a caracterizar. Aunque
los mecanismos que regulan la replicacin del ADN despus de dao en el ADN se
estudian intensamente y una cantidad considerable de informacin ya est disponible
(revisado en ref. 1), los mecanismos que regulan la replicacin del ADN en respuesta a
otros tipos de estrs, tales como el estrs por calor, son mucho menos estudiada y
comprendida. Sin embargo, el estrs por calor compromete gravemente la funcin
celular y la supervivencia, constituye un caso probable en el ciclo de vida de un
organismo, y es una forma de organismos de estrs tuvo que hacer frente a durante la
evolucin.
Est bien documentado que la exposicin de las clulas al calor inhibe fuertemente la
replicacin del ADN, y se piensa que esta inhibicin se basa el aumento de la
sensibilidad al calor de clulas en fase S, en comparacin con las clulas en G1 o G2 (2-
5). La formacin de aberraciones cromosmicas en clulas en fase S con calefaccin a
menudo se considera una consecuencia de los efectos adversos sobre los pasos de la
replicacin del ADN (2), ya que el calor no es eficiente en la induccin de dao en el
ADN directamente (6 -9). De hecho, el calor inhibe varios procesos nucleares asociados
con la replicacin semiconservativa del ADN incluyendo la incorporacin de
precursores radiomarcados en el material insoluble en cido (10, 11), la iniciacin de
nuevos replicones (3, 4, 12, 13), la elongacin del ADN de fibra en el tenedor de
replicacin (5), la sntesis y deposicin de nuevos histonas en la cromatina, y la
reorganizacin de ADN naciente en la cromatina madura (14, 15).Aunque los estudios
anteriores se identifican medidas sensibles al calor de la replicacin del ADN, que
proporcionan una informacin limitada sobre el mecanismo molecular (s) involucrado.
Es posible que la inhibicin observada es una consecuencia pasiva de la inactivacin
inducida por calor de factores de replicacin de ADN, as como de los daos inducidos
en la cromatina por la precipitacin de protena desnaturalizada en la matriz nuclear
(14-18). Alternativamente, sin embargo, algunos de los efectos inhibidores podra ser
la consecuencia de un proceso, equivalente a un puesto de control, que se atasca
activamente la replicacin del ADN para evitar errores graves y facilitar la reparacin,
tanto la forma de radiacin ionizante inhibe la iniciacin replicn mediante la
activacin de la va de la ataxia telangiectasia mutada (1, 19-21).
En un esfuerzo para caracterizar componentes reguladores putativos de la replicacin
del ADN en las clulas expuestas al calor, introdujimos el virus de simio 40 (SV40) 1-
basado en el ensayo de la replicacin del ADN in vitro. En este ensayo, la replicacin de
los plsmidos que portan el origen de SV40 de replicacin del ADN (Ori) se lleva a cabo
in vitro utilizando cualquiera de los extractos crudos citoplasmticos de clulas
humanas, o protenas purificadas a partir de tales extractos (22-26). Slo se requiere
una protena de origen viral, el antgeno tumor grande SV40. El ensayo proporciona un
sistema bien controlado y definido molecularmente para estudiar aspectos de
regulacin de la replicacin del ADN, y permite la separacin de los efectos de
regulacin dirigidas a factores de replicacin de ADN de los efectos del calor sobre el
sustrato de ADN.
Utilizando este ensayo se inform (27) que se prepararon extractos citoplasmticos a
partir de clulas calentadas tena una actividad de replicacin de ADN reducida, en
comparacin con extractos preparados a partir de clulas no calentadas, y que esta
reduccin en la actividad de replicacin de ADN fue causado especficamente por una
inactivacin de la protena de replicacin A (RPA) (28-30). La adicin de RPA
recombinante (rRPA) en estas reacciones invertido completamente la inhibicin.
Debido a que los niveles del EPR fueron similares en los extractos de clulas calentadas
y no calentadas y porque RPA fue relativamente resistentes a la inactivacin de calor
directo, propusimos que la respuesta observada refleja la activacin de un punto de
control que dirige e inactivados RPA. Un papel regulador para RPA en la replicacin del
ADN tambin se ha sugerido en las clulas expuestas a la radiacin ionizante (31-35).
RPA es un componente esencial del metabolismo del ADN eucariota y tiene una
actividad como la principal protena de cadena sencilla DNAenlazante (para revisiones,
vanse las referencias. 36 y 37). Es un heterotrmero compuesto en humanos de 14-
kDa (hRPA3) subunidades de 70 kDa (hRPA1), 29-kDa (hRPA2). Estudios genticos y
bioqumicos sugieren un papel para RPA en las etapas de iniciacin y elongacin de la
replicacin del ADN (36, 37). RPA tambin se requiere para la reparacin por escisin
de nucletidos y la recombinacin de ADN homloga (38-41). RPA2 es fosforilada de
una manera dependiente del ciclo celular y en respuesta al dao del ADN, pero el
significado de regulacin de estas fosforilaciones no se ha establecido (36, 37). RPA
tambin interacta con una variedad de protenas implicadas en el metabolismo del
ADN incluyendo Rad51 (42), Rad52 (43, 44), XPA (45-47), y p53 (48-50). Por ltimo, el
EPR es fosforilada por la ADN-dependiente de la protena quinasa y por ataxia
telangiectasia mutada (51-55). Varias de estas interacciones y modificaciones son
compatibles con una funcin reguladora para RPA en la replicacin del ADN, y con un
papel en las respuestas celulares a dao en el ADN, aunque la evidencia directa todava
falta.Debido a que la fosforilacin significativa de RPA2 no se observ despus de la
exposicin al calor, se especul que si el EPR es un objetivo de los procesos que
regulan la replicacin del ADN, que debe ser modificado por mecanismos distintos de
la fosforilacin (27). Recientemente, se han presentado pruebas de que la interaccin
con la nucleolina, una protena nuclear importante implicado en la biognesis de
ribosomas y diversos otros procesos biolgicos (para revisiones, vanse las referencias.
56 y 57), puede regular las funciones de replicacin de RPA (58).Este sentido, ampliar
nuestros estudios sobre la regulacin de la replicacin del ADN en las clulas expuestas
a choque trmico y preguntamos si los efectos de informes anteriores del calor sobre
la replicacin del ADN in vitro y la inactivacin asociado de RPA (27) se derivan de una
interaccin con la nucleolina. Los resultados demuestran las interacciones
RPAnucleolina perfectamente que correlacionan con actividad in vitro la replicacin
del ADN y sugieren que esta interaccin refleja una etapa temprana de la respuesta
celular al estrs por calor.