La cromatografa

Es un mtodo fsico de separacin para la caracterizacin de mezclas complejas, la

cual tiene aplicacin en todas las ramas de la ciencia. Es un conjunto de tcnicas basadas en
el principio de retencin selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de
una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.
Diferencias sutiles en el coeficiente de particin de los compuestos da como resultado una
retencin diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separacin efectiva en
funcin de los tiempos de retencin de cada componente de la mezcla.
La cromatografa de gases
Es una tcnica cromatogrfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la
cabeza de una columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase
mvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos de cromatografa, la fase mvil no
interacta con las molculas del analito; su nica funcin es la de transportar el analito a
travs de la columna.
Existen dos tipos de cromatografa de gases (GC): la cromatografa gas-slido (GSC)
y la cromatografa gas-lquido (GLC), siendo esta ltima la que se utiliza ms ampliamente,
y que se puede llamar simplemente cromatografa de gases (GC). En la GSC la fase
estacionaria es slida y la retencin de los analitos en ella se produce mediante el proceso
de adsorcin. Precisamente este proceso de adsorcin, que no es lineal, es el que ha
provocado que este tipo de cromatografa tenga aplicacin limitada, ya que la retencin del
analito sobre la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elucin con colas. Su
nica aplicacin es la separacin de especies gaseosas de bajo peso molecular. La GLC
utiliza como fase estacionaria molculas de lquido inmovilizadas sobre la superficie de un
slido inerte.
Cromatgrafo de gases
Equipo que permite la separacin de compuestos orgnicos voltiles, con detector de
ionizacin de llama (FID, "Flame Ionization Detector") y detector de conductividad trmica
(TCD, "Thermical Conductivity Detector"). El equipo dispone de un muestreador
automtico con 82 muestras. La medida de las muestras no puede ser superior a 2 ml.
Teoras dl proceso cromatogrfico
La principal es la teora de las placas tericas (theoretical plates theory), la cual plantea que
una columna cromatogrfica est constituida por una serie de placas contenidas en la fase
estacionaria. Supone como constante el volumen de la fase estacionaria en cada placa; que
el volumen de fase mvil entre placas es constante; que las dos fases estn en equilibrio en
cada placa, y que el valor de coeficiente de distribucin es constante e independiente de la
concentracin del soluto.
Desventaja: adems de que se basa en muchas suposiciones, la principal desventaja es la
falta de conexin entre la eficiencia de la columna y las propiedades fisicoqumicas de la
partcula.3
La ecuacin de esta teora1:
N=16(tr/w)2
N= nmero de placas tericas, adimensional
tr= tiempo de retencin de un compuesto, minutos
w= ancho del pico a media altura, minutos
La teora cintica considera el comportamiento en un proceso cromatogrfico en funcin de
los factores cinticos que intervienen: Variaciones en las velocidades de flujo, debido a las
diferentes rutas que puede tomar el analito durante su migracin a travs del empaque.
Difusin axial o longitudinal del soluto en la fase mvil.
Resistencia a la transferencia de masas entre la fase mvil y la fase estacionaria.
La ecuacin de Van Deemter1: HETP o H=A+B/u+Cu
HETP o h= altura equivalente a una placa terica, milmetros.
u= L/ tr aire promedio de la velocidad lineal, cm/seg
A= 2dp difusin aparente
B= 2Dm coeficiente del trmino debido a la difusin molecular
C= (8/)(k/[1+ k] 2)(df/Ds) coeficiente del trmino debido a la resistencia a la
transferencia de masas
En la teora para las columnas capilares se considera que la difusin aparente no contribuye
de manera apreciable al ensanchamiento de los picos en este tipo de columnas. El
coeficiente relacionado con la difusin molecular tiene un valor de uno debido a que la
distancia que recorre la partcula es igual a la longitud de la columna. El trmino
relacionado con la transferencia de masas viene dado en funcin del dimetro de la
columna, pues en este tipo de columna es ms importante que el tamao de partcula de
relleno.
La ecuacin de esta teora es un caso particular de la ecuacin de la teora cintica, en este
caso se omite el trmino A pues su valor es despreciable; se relacionan las magnitudes que
caracterizan la geometra del soporte y el trmino C se presenta de manera distinta pues en
este tipo de columna es ms importante la fase mvil que el tamao de partcula.4
Circulacin del gas portador
La ley de Darcy1 correlaciona la velocidad lineal de un gas que circula por una columna
con el gradiente de presin.
u= - (k/) (dP/ dz)
u= velocidad lineal en un punto de la columna
z=distancia a la entrada de la columna
= viscosidad del gas
dP= gradiente de presin de un elemento
dz= longitud de columna
k=constante de permeabilidad.
Las respectivas integraciones de la ecuacin permiten obtener una que relaciona el valor de
la presin con la posicin de la columna, otra que indica la velocidad media, la
compresibilidad o factor de obstruccin
Inyector
Un inyector es un dispositivo utilizado para bombear fluidos utilizando el efecto
Venturi. Utiliza un fluido a alta presin que sale por una boquilla a alta velocidad y baja
presin convirtiendo su energa potencial en energa cintica. En esta zona de baja presin
se mezcla con el fluido que se quiere bombear y le imparte energa cintica (velocidad). A
continuacin ambos fluidos mezclados entran por otra boquilla donde la energa cintica
vuelve a convertirse en potencial, disminuyendo la velocidad y aumentando la presin. El
fluido bombeado puede ser o lquido o gaseoso y, en algunos casos puede llevar slidos en
suspensin. En todos los casos el fluido propulsor y el bombeado salen totalmente
mezclados a la salida del inyector. Una de las aplicaciones ms frecuentes del inyector es
en la Inyeccin de combustible en los motores termodinmicos.
Sistema de inyeccin de muestra
La inyeccin de muestra es un apartado crtico, ya que se debe inyectar una cantidad
adecuada, y debe introducirse de tal forma (como un "tapn de vapor") que sea rpida para
evitar el ensanchamiento de las bandas de salida; este efecto se da con cantidades elevadas
de analito. El mtodo ms utilizado emplea una microjeringa (de capacidades de varios
microlitros) para introducir el analito en una cmara de vaporizacin instantnea. Esta
cmara est a 50 C por encima del punto de ebullicin del componente menos voltil, y
est sellada por una junta de goma de silicona septa o septum.
Inyector de muestra para un GC






Si es necesaria una reproducibilidad del tamao de muestra inyectado se puede usar una
vlvula de seis vas o vlvula de inyeccin, donde la cantidad a inyectar es constante y
determinada por el tamao del bucle de dicha vlvula.
Las columnas
Columnas de relleno
Las columnas de relleno o empacadas consisten en unos tubos de vidrio, metal (inerte a ser
posible como el acero inoxidable, nquel, cobre o aluminio) o tefln, de longitud de 2 a 3
metros y un dimetro interno de unos pocos milmetros, tpicamente de 2 a 4. El interior se
rellena con un material slido, finamente dividido para tener una mxima superficie de
interaccin y recubierto con una capa de espesores entre 50 nm y 1 m. Para que puedan
introducirse en el horno, se enrollan convenientemente.
El material de relleno ideal consiste en pequeas partculas, esfricas y uniformes, con una
buena resistencia mecnica, para tener una mxima superficie donde interaccionar la fase
estacionaria y el analito. La superficie especfica mnima ha de ser de 1 m/g. Como todos
los componentes de columnas para GC, debe ser inerte a altas temperaturas (~400 C) y
humectarse uniformemente con la fase lquida estacionaria durante el proceso de
fabricacin. El material preferido actualmente (2005) es la tierra de diatomeas natural,
debido a su tamao de poro natural. Estas especies, ya extinguidas, utilizaban un sistema
de difusin molecular para tomar nutrientes del medio y expulsar sus residuos. Por tanto,
debido a que el sistema de absorcin superficial del analito y la fase estacionaria es
parecido, son materiales especialmente tiles.
El tamao es crtico a la hora de darse el proceso de interaccin del analito, y a menores
tamaos la eficacia de la columna es mejor. Pero existe el problema de la presin necesaria
para hacer circular un caudal estable de gas portador por la columna, ya que dicha presin
es inversamente proporcional al cuadrado del dimetro de dichas partculas. As, el tamao
mnimo para usar presiones mximas de 50 psi es de 250 a 149 m.
Columnas capilares
Las columnas capilares son de dos tipos bsicos: las de pared recubierta (WCOT) y las de
soporte recubierto (SCOT). Las WCOT son simplemente tubos capilares donde la pared
interna se ha recubierto con una finsima capa de fase estacionaria. Las columnas SCOT
tienen en su parte interna una fina capa de material absorbente como el empleado en las
columnas de relleno (tierra de diatomeas) donde se ha adherido la fase estacionaria. Las
ventajas de las SCOT frente a las WCOT es la mayor capacidad de carga de esta ltima, ya
que en su fabricacin se emplean mayores cantidades de fase estacionaria, al ser la
superficie de intercambio mayor. Por orden de eficacia, en primer lugar estn las WCOT,
luego las SCOT y por ltimo las columnas de relleno.
Las columnas WCOT se fabrican a partir de slice fundida, conocidas como columnas
tubulares abiertas de slice fundida o FSOT. Estas columnas se fabrican a partir de slice
especialmente pura, sin apenas contenido de xidos metlicos. Debido a la fragilidad
inherente a este material, en el mismo proceso de obtencin del tubo se recubre con una
capa de poliimida, de esta forma la columna puede enrollarse con un dimetro de unos
pocos centmetros. Estas columnas, con propiedades como baja reactividad, resistencia
fsica y flexibilidad, han sustituido a las WCOT clsicas.
Las columnas FSOT tienen dimetros internos variables, entre 250 y 320 m (para
columnas normales) y 150-200 m para columnas de alta resolucin. Estas ltimas
requieren menor cantidad de analito y un detector ms sensible, al eluir menor cantidad de
gas. Existen asimismo columnas macrocapilares con dimetros de hasta 530 m, que
admiten cantidades de analito comparables a las de relleno pero con mejores prestaciones.
En estas columnas existe un problema debido a la absorcin del analito sobre la superficie
de la slice fundida, adsorcin debida a la presencia de grupos silanol (Si-OH), los cuales
interaccionan fuertemente con molculas polares orgnicas. Este inconveniente se suele
solventar inactivando la superficie por sililacin con dimetilclorosilano (DMCS). La
absorcin debida a los xidos metlicos se ve paliada en gran parte por la elevada pureza de
la slice empleada.
La fase estacionaria
Las propiedades necesarias para una fase estacionaria lquida inmovilizada son:
1. Caractersticas de reparto (factor de capacidad ' y factor de selectividad )
adecuados al analito.
2. Baja volatilidad, el punto de ebullicin de la fase estacionaria debe ser al menos
100 C mayor que la mxima temperatura alcanzada en el horno.
3. Baja reactividad.
4. Estabilidad trmica, para evitar su descomposicin durante la elucin.
Existen como mucho una docena de disolventes con estas caractersticas. Para elegir uno,
debe tenerse en cuenta la polaridad del analito, ya que a mayor polaridad del analito, mayor
polaridad deber tener la fase estacionaria. Algunas fases estacionarias utilizadas
actualmente (2005) son:
Polidimetilsiloxano, fase no polar de uso general para hidrocarburos, aromticos,
polinucleares, drogas, esteroides y PCB.
Poli(fenilmetildifenil)siloxano (10% fenilo), para steres metlicos de cidos
grasos, alcaloides, drogas y compuestos halogenados.
Poli(fenilmetil)siloxano (50% fenilo), para drogas, esteroides, pesticidas y glicoles.
Poli(trifluoropropildimetil)siloxano, para aromticos clorados, nitroaromticos,
bencenos alquilsustituidos.
Polietilenglicol,sirve para compuestos polares, tambin para compuestos
como glicoles, alcoholes, teres, aceites esenciales.
Poli(dicianoalildimetil)siloxano, para cidos grasos poliinsaturados, cidos libres
y alcoholes.
Generalmente, en columnas comerciales, la fase estacionaria se presenta enlazada y
entrecruzada para impedir su prdida durante las operaciones de elucin o lavado. De esta
forma se obtiene una monocapa adherida qumicamente a la superficie de la columna. La
reaccin implicada suele ser la adicin de un perxido al lquido a fijar, inicindose una
reaccin por radicales libres que tiene como resultado la formacin de un enlace carbono-
carbono que adems incrementa su estabilidad trmica. Otra forma es la irradiacin
con rayos gamma.
Otro tipo de fase estacionaria son las quirales, lo cual permite resolver
mezclas enantiomricas. Este tipo de fases suelen ser aminocidos quirales o algn
derivado adaptado al trabajo en columna.
El grosor de la pelcula vara entre 0,1 y 5 m; el grosor depende de la volatilidad del
analito. As, un analito muy voltil requerir una capa gruesa para aumentar el tiempo de
interaccin y separar ms efectivamente los diferentes componentes de la mezcla. Para
columnas tpicas (dimetros internos de 0,25 o 0,32 mm) se emplean grosores de 0,25 m,
y en las columnas macrocapilares el grosor sube hasta 1 m. El grosor mximo suele ser de
8 m
Gas portador[editar]

El gas portador cumple bsicamente dos propsitos: Transportar los componentes de la
muestra, y crear una matriz adecuada para el detector. Un gas portador debe reunir ciertas
condiciones:
-Debe ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como con la fase
estacionaria)
-Debe ser capaz de minimizar la difusin gaseosa
-Fcilmente disponible y puro
-Econmico
-Adecuado al detector a utilizar...
El gas portador
Debe ser un gas inerte, para prevenir su reaccin con el analito o la columna. Generalmente
se emplean gases como el helio, argn, nitrgeno, hidrgeno o dixido de carbono, y la
eleccin de este gas en ocasiones depende del tipo de detector empleado. El almacenaje del
gas puede ser en balas normales o empleando un generador, especialmente en el caso del
nitrgeno y del hidrgeno. Luego tenemos un sistema de manmetros y reguladores de
flujo para garantizar un flujo estable y un sistema de deshidratacin del gas, como puede
ser un tamiz molecular.
Generalmente la regulacin de la presin se hace a dos niveles: un primer manmetro se
sita a la salida de la bala o generador del gas y el otro a la entrada del cromatgrafo, donde
se regula el flujo. Las presiones de entrada varan entre 10 y 25 psi, lo que da lugar a
caudales de 25 a 150 mL/min en columnas de relleno y de 1 a 25 mL/min en columnas
capilares. Para comprobar el caudal se puede utilizar un rotmetro o un simple medidor de
pompas de jabn, el cual da una medida muy exacta del caudal volumtrico que entra a la
columna.
La pureza de los gases es sumamente importante, se requieren niveles 4.5 o mayores es
decir 99.995 % de pureza. Sin embargo, debido al cuidado que se debe tener con la fase
activa de la columna, se hace completamente necesario la instalacin de trampas a la
entrada del Gas carrier, estas trampas obviamente tienen una capacidad limitada, pero son
importantsimas al momento de usar el Cromatografo. Estas trampas evitan el ingreso de
Hidrocarburos, agua, CO entre otros.
El detector
Es la parte del cromatgrafo que se encarga de determinar cundo ha salido el
analito por el final de la columna.
Las caractersticas de un detector ideal son:
Sensibilidad: Es necesario que pueda determinar con precisin cundo sale analito y
cuando sale slo el gas portador. Tienen sensibilidades entre 10-8 y 10-15 g/s de analito.
Respuesta lineal al analito con un rango de varios rdenes de magnitud.
Tiempo de respuesta corto, independiente del caudal de salida.
Intervalo de temperatura de trabajo amplio, por ejemplo desde temperatura ambiente
hasta unos 350-400 C, temperaturas tpicas trabajo.
Estabilidad y reproducibilidad, es decir, a cantidades iguales de analito debe dar salidas
de seal iguales.
Alta fiabilidad y manejo sencillo, o a prueba de operadores inexpertos.
Respuesta semejante para todos los analitos, o
Respuesta selectiva y altamente predecible para un reducido nmero de analitos.


Algunos tipos de detectores:

Detector de ionizacin de llama (FID, Flame Ionization Detector).
Detector de conductividad trmica (TCD, Thermical Conductivity Detector).
Detector termoinico (TID, ThermoIonic Detector).
Detector de captura de electrones (ECD, Electrn-Capture Detector).
Detector de emisin atmica (AED, Atomic Emission Detector).

























Anlisis Cualitativo
Un anlisis cromatogrfico puede dar una amplia informacin cualitativa si se escoge
el sistema de deteccin adecuado para determinar y evaluar los analitos separados, as si se
utiliza un detector que permita obtener un espectro de cada compuesto separado y a su vez
contenga una base de datos que pueda realizar su comparacin con una biblioteca de
espectros se podra, de una forma muy precisa, establecer la identidad de los componentes
de una muestra, de hecho esto se logra fcilmente con cromatgrafos que contienen sistema
de deteccin como el Infrarrojo (IR), el de Resonancia Magntica Nuclear (RMN) o el
espectrmetro de Masas (MS). Sin embargo, estos sistemas son muy costosos, es por ello
que la mayora de los laboratorios cuentan con cromatografos con sistemas de deteccin
sencillos como el detector de ionizacin a la llama (siglas en ingles, FID) o el detector de
conductividad trmica (siglas en ingles (TCD) en el caso de cromatografa de gases o
detectores de absorbancia o ndice de refraccin para los casos de cromatografa de
lquidos. La nica informacin cualitativa que pueden ofrecer estos sistemas es el tiempo de
retencin del analito, el cual, solo puede ser usada controlando bien las condiciones
cromatogrficas como: flujo, temperatura, tipo de fase estacionaria en el caso de gases o
composicin qumica de la fase mvil adems de las otras variables mencionadas
anteriormente para el caso de cromatografa de liquida, adems de que se debe tener
conocimiento de los posibles compuestos de la muestra y una amplia variedad de patrones
para realizar comparaciones. Sin embargo, se puede dar el caso que dos compuestos tengan
el mismo tiempo de retencin, lo que imposibilita su identificacin. Por supuesto que, a
partir de cromatogramas obtenidos con diferentes fases mviles (para cromatografa
liquida) y estacionarias y a diversas temperaturas de elusin (para cromatografa gaseosa),
se puede obtener datos adicionales.

Anlisis Cuantitativo
El uso de la cromatografa se ha extendido en todo el mundo, en las ultimas cuatro
dcadas, no solo por su capacidad de separar compuestos sino porque se puede realizar un
anlisis cuantitativo de las especies proporcionadas. En la cromatografa en columna, el
anlisis cuantitativo se basa en la comparacin de la altura, o del rea, del pico del analito
con la de uno o ms patrones inyectados bajo las mismas condiciones cromatogrficas. El
uso de una u otro termino depender de las caractersticas de la banda obtenida, aunque en
la actualidad con el uso de sistemas de integracin de rea computarizados, la precisin es
muy alta para el calculo de rea, sin embargo siempre es importante conocer las otras
herramientas a utilizar para calcular el rea de una banda y en que momento es mejor usar
altura en vez de rea por si llega a faltar el sistema computarizado. Para lograr un anlisis
cuantitativo de los componentes separados de una muestra existe una gran variedad de
mtodos de anlisis entre los que se pueden mencionar:
1. Calibracin absoluta 2. Mtodo del estndar interno.
3. Normalizacin de rea (con y sin factor de respuesta)
Cada mtodo tiene sus ventajas y desventajas.









Trminos empleados en cromatografa

Analito es la substancia que se va a separar durante la cromatografa.
Cromatografa analtica se emplea para determinar la existencia y posiblemente
tambin la concentracin de un analito en una muestra.
Fase enlazada es una fase estacionaria que se une de forma covalente a las partculas
de soporte o a las paredes internas de la columa.
Cromatograma es el resultado grfico de la cromatografa. En el caso de separacin
ptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se corresponden a los
componentes de la mezcla separada.
Cromatograma con picos no resueltos (separados) Cromatograma con dos picos
resueltos
En el eje X se representa el tiempo de retencin, y en el eje Y una seal (obtenida,
por ejemplo, a partir de un espectrofotmetro, un espectrmetro de masas o cualquier otro
de los diversos detectores) correspondiente a la respuesta creada por los diferentes analitos
existentes en la muestra. En el caso de un sistema ptimo, la seal es proporcional a la
concentracin del analito especfico separado.
Cromatgrafo es el equipo que permite una separacin sofisticada. Por ejemplo, un
cromatgrafo de gases o un cromatgrafo de lquidos.
Cromatografa es el mtodo fsico de separacin en el cual los componentes que se
van a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria (fase
estacionaria) mientras la otra (la fase mvil) se mueve en una direccin definida.
Eluyente es la fase mvil que atraviesa la columna.
Serie eluotrpica es una lista de disolventes clasificados segn su poder de dilucin.
Fase inmovilizada es una fase estacionaria que est inmovilizada sobre partculas de
soporte, o en la pared interior del tubo contenedor o columna.

Cromatograma correspondiente a una cromatografa liquida en fase reversa para
compuestos fenlicos
Fase mvil es la fase que se mueve en una direccin definida. Puede ser un lquido
(cromatografa de lquidos o CEC). un gas (cromatografa de gases) o un fluido supercrtico
(cromatografa de fluidos supercrticos). La fase mvil consiste en la muestra que est
siendo separada/analizada y el disolvente, que se mueven por el interior de la columna. En
el caso de la cromatografa lquida de alta resolucin, HPLC, la fase mvil es un disolvente
no-polar como el hexano (fase normal) o bien algn disolvente polar (cromatografa de fase
reversa) y la muestra que va a ser separada.. La fase mvil se mueve a travs de la columna
de cromatografa (fase estacionaria) de forma que la muestra interacciona con la fase
estacionaria y se separa.
Cromatografa preparativa se usa para purificar suficiente cantidad de sustancia para
un uso posterior, ms que para anlisis.
Tiempo de retencin es el tiempo caracterstico que tarda un analito particular en
pasar a travs del sistema (desde la columna de entrada hasta el detector) bajo las
condiciones fijadas. Vase tambin: ndice de retencin de Kovats
Muestra es la materia que va a ser analizada en la cromatografa. Puede consistir en
un simple componente o una mezcla de varios. Cuando la mezcla es tratada en el curso del
anlisis, la fase o fases que contienen los analitos de inters es llamada igualmente muestra
mientras el resto de sustancias cuya separacin no resulta de inters es llamada residuo.
Soluto es cada uno de los componentes de la muestra que va a ser separado.
Disolvente es toda sustancia capaz de solubilizar a otra,y especialmente la fase
lquidamvil en cromatografa de lquidos.
Fase estacionaria es la sustancia que est fija en una posicin en el procedimiento de
la cromatografa. Un ejemplo es la capa de silica en la cromatografa en capa fina.