Fundamentos Prctica de Laboratorio: PRUEBAS BIOQIMICAS

Curso de Microbiologa 2014-1

IDENTIFICACIN MICROBIANA
Se entiende por identificacin microbiana al conjunto de tcnicas y procedimientos que se
aplican para establecer la identidad de un microorganismo.
En el rea clnica es importante identificar el agente causal de la infeccin en un paciente
enfermo para poder tratarlo (al igual que en fitopatologa, veterinaria, etc.). En
investigacin bsica, un determinado microorganismo aislado se debe identificar para
comprobar si se trata de un microorganismo conocido o de uno nuevo para poder
clasificarlo. En la industria de alimentos, donde las normas de control de calidad exige que
la fabricacin de estos alimentos debe realizarse en reas controladas con ausencia de
ciertos microorganismos, los alimentos son sometidos a una serie de controles
microbiolgicos para asegurar la ausencia de microorganismos que puedan causar
infecciones y/o descartar la presencia de toxinas capaces de causar intoxicaciones
alimentarias.
No todos los microorganismos se identifican por las mismas tcnicas, ni con base a un
solo mtodo, sino mediante la combinacin de uno o ms. No obstante, las pruebas
bioqumicas son un mtodo convencional utilizado en microbiologa que permiten llegar a
una identificacin presuntiva de un microorganismo con base en sus caractersticas
metablicas. Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo es capaz
de fermentar azcares, se detecta la presencia de enzimas, la degradacin de
compuestos, la produccin de compuestos coloreados, cambios en caractersticas del
medio, etc. Bacterias fuertemente relacionadas pueden separarse en dos especies
diferentes con base en pruebas bioqumicas.
PRUEBAS BIOQUMICAS

Tabla tomada de Ortiz-Colon, L. Pruebas Bioqumicas. http://avibert.blogspot.com/2012/01/rojo-
de-metilo-y-vogesproskauer-pruebas.html [consultado abril 23 de 2014]
Rojo de metilo (MR)
Esta tcnica permite diferenciar las bacterias del grupo Coliformes de las pertenecientes a
Klebsiella spp y Enterobacter spp. La prueba permite diferenciar la ruta metablica por la
que la bacteria degrada la glucosa. Los microorganismos MR positivos producen una gran
variedad de cidos resultantes de las rutas metablicas de fermentacin de cidos mixtos:
lctico, succnico, actico y frmico. La hidrlisis del cido frmico produce dixido de
carbono e hidrgeno molecular. Se evala la capacidad del microorganismo para producir
y mantener estables cidos producto de la degradacin de la glucosa.





( + )
Vogues- Proskauer
El fundamento de la prueba de Vogues Proskauer es similar a la del rojo de metilo. La
prueba da positiva para bacterias con fermentacin butilen-gliclica. Los compuestos
finales son neutros como el butanonidol y el etanol, producindose acetona como
compuesto intermediario que es detectado agregando KOH y Alfa Naftol.










Simmons (citrato)

Tabla tomada de Ortiz-Colon, L. Pruebas Bioqumicas.
http://avibert.blogspot.com/2012/03/utilizacion-de-citrato-pruebas.html [consultado abril 23 de 2014]
( + )

Determina si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de
carbn. El metabolismo del citrato se lleva a cabo en bacterias que contienen la enzima
citrato permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. La descomposicin del citrato
produce cido oxalacetico, piruvato y dixido de carbono. En CO
2
, en combinacin con
agua y sodio, forma carbonato. La alcalinidad produce el cambio de color de verde a azul
debido al indicador de pH del medio.




Indol
Determina la liberacin de indol al medio bacteriano mediante la adicin del Reactivo de
Kovacs. El indol se genera por la desaminacin reductiva del triptfano por parte de
bacterias poseedoras de la enzima triptofanasa.
( + )



Motilidad
Determina la capacidad de movimiento por parte del microorganismo. El desarrollo de
turbidez hacia los lados de puncin de inoculacin indica motilidad positiva.




( + )
Gelatina

Tabla tomada de Ortiz-Colon, L. Pruebas Bioqumicas.
http://avibert.blogspot.com/2012/04/hidrolisis-de-gelatina-pruebas.html [consultado abril 23 de
2014]
Determina la produccin de la enzima gelatinasa, por la capacidad de degradar la
gelatina, lo cual se hace visible mediante la licuefaccin del medio.






Pruebas de fermentacin de carbohidratos
Determina la presencia de enzimas que permitan la asimilacin del carbohidrato hasta las
vas de fermentacin.
1. Medio de caldo rojo fenol con la adicin de un azcar (glucosa, lactosa, sacarosa)

( + )
( - )
Tabla tomada de Ortiz-Colon, L. Pruebas Bioqumicas.
http://avibert.blogspot.com/2011/11/fermentacion-de-carbohidratos.html [consultado abril 23 de
2014]
Permite observar la fermentacin de carbohidratos como la glucosa, sacarosa o lactosa.
El caldo debe estar a pH 7.4, el color del caldo es naranja-rojizo. Si hay fermentacin del
carbohidrato el color del medio pasa de rojo a amarillo (produccin de cido) y se pueden
observar burbujas de gas en la campana de Durham al interior del medio lquido de
cultivo. Si no hay fermentacin, el caldo mantiene el color naranja-rojizo. La prueba se
basa en la produccin de cidos por fermentacin, tales como el actico, acido frmico,
cido lctico, cido mlico, etc. El rango de pH del indicador rojo de fenol es: 6.8 8.4,
por tanto a pH de 6.8 o menor el medio esta cido y el indicador cambia a color amarillo y
si el pH es de 8.4 o mayor el medio esta bsico y el color se mantiene naranja-rojizo.









2. TSI (triple azcar hierro)

Tabla tomada de Ortiz-Colon, L. Pruebas Bioqumicas.
http://avibert.blogspot.com/2011/11/prueba-de-tres-azucares-y-fe.html [consultado abril 23 de 2014]
Permite observar la fermentacin de la glucosa, la lactosa y la sacarosa y la produccin
de H
2
S. La seccin inclinada del agar o pico de flauta es aerobia y la seccin profunda es
anaerobia. Cuando se fermenta slo glucosa, el cambio de color se da nicamente en el
( + ) ( - )
fondo, pasando de rojo-anaranjado a amarillo; si se fermentan los tres carbohidratos el
color cambia a amarillo en el fondo y en la superficie, adems que ocurre el
desprendimiento de gas por fermentacin. La produccin de H
2
S se manifiesta por el
precipitado negro debido a la reduccin de la sal de hierro presente en el medio.



LIA (lisina hierro agar)
Determina la capacidad enzimtica de un organismo para descarboxilar la lisina y producir
cido sulfrico.
La descarboxilacin de la lisina ocurre en el fondo del tubo y produce un viraje del
indicador prpura de bromocresol. Un medio no inoculado presenta un color prpura
intenso brillante (pH=6.0). Si hay fermentacin de glucosa se produce acidificacin y un
cambio de color del medio a amarillo (pH=5.2). Si es alcalino, el medio es de color purpura
(pH=6.8).
A= Acido
K= Alcalino
N= Neutro
R= Rojo (desaminacin oxidativa)
La produccin de H
2
S se evidencia por la presencia de un precipitado negro debido a las
sales de hierro.




Nitratos

Tabla tomada de Ortiz-Colon, L. Pruebas Bioqumicas.
http://avibert.blogspot.com/2012/11/reduccion-de-nitratos-nitritos-pruebas.html [consultado abril 23
de 2014]
Determina la capacidad de un microorganismo de reducir el nitrato a nitritos o nitrgeno
molecular. La reduccin de nitrato (NO
3
) a nitrito (NO
2
) y a nitrgeno gaseoso (N
2
) se
produce en condiciones de anaerobiosis, en las cuales el microorganismo produce su
oxigeno del nitrato. El oxigeno acta como un aceptor de hidrgeno; es decir, es el protn
y el aceptor final de protones. La mayora de las bacterias aerobias son anaerobias
facultativas y solo pueden reducir los nitratos en ausencia de oxgeno.





Reactivos: Alfa-naftilamina 0.05% y Acido sulfanlico 0.8%
-Positivo: desarrollo de color rosado-rojo luego de agregar los reactivos Griess A y B.
-Negativo: color amarillo luego de agregar los reactivos Griess A y B.


SIM (Sulfuro, Indol, Motilidad)

Determina la produccin de cido sulfhdrico (H
2
S), la presencia de triptofanasas y
motilidad.

Cepas mviles: producen turbidez del medio, que se extiende ms all de la lnea de
siembra.
Cepas inmviles: el crecimiento se observa solamente en la lnea de siembra.
Cepas SH
2
positivas: ennegrecimiento a lo largo de la lnea de siembra o en todo el
medio.
Cepas SH
2
negativas: el medio permanece sin cambio de color.
Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovacs o
de Erlich.
Cepas indol negativas: sin cambio de color.