- PRESENTE Y FUTURO DE LA PROTEMICA -

Presente y Futuro de la Protemica por Jess Vzquez Cobos

I.- Introduccin a la Protemica
La Protemica es, junto a la Genmica, una de las nuevas tecnologas que ms inters estn
despertando ltimamente. El auge actual de la Protemica se debe a dos razones fundamentales. Por un
lado, los grandes proyectos de secuenciacin de genomas han generado una enorme cantidad de
informacin; en la actualidad se ha secuenciado el genoma completo de alrededor de 90 especies, de las
cuales cinco corresponden a organismos eucariticos, y la tasa de anlisis tiende a superar la treintena
de genomas por ao. La necesidad de descifrar esta ingente cantidad de informacin genmica ha
estimulado considerablemente el estudio directo y a gran escala de los productos codificados por los
genes, es decir, las protenas. De forma paralela se ha estimulado el desarrollo de nuevas herramientas
bioinformticas para analizar y procesar esta informacin.
Por otra parte, en los ltimos aos las tcnicas de anlisis qumico de protenas han experimentado
un desarrollo espectacular. Hasta hace muy poco las herramientas que se disponan para este fin
(principalmente el Anlisis de Aminocidos y la Secuenciacin de Edman) slo permitan el anlisis de
protenas de una forma poco sensible y excesivamente lenta y costosa. El reciente desarrollo de las
llamadas tcnicas de ionizacin suave (MALDI y electrospray) abri el camino al estudio de
macromolculas mediante espectrometra de masas. Estos mtodos de ionizacin, en combinacin con
diversas tcnicas de anlisis de masas (tales como el TOF, el cuadrupolo o la trampa inica) permiten
hoy en da la identificacin y secuenciacin de protenas con unos niveles de rapidez, sensibilidad y
versatilidad sin precedentes. La aparicin de herramientas que por primera vez en la historia de las
biociencias permiten el anlisis sistemtico de los agentes fundamentales de la vida, las protenas, ha
dado lugar al desarrollo de la moderna Protemica.
II.- Concepto de Protemica.
El trmino proteoma se us por primera vez en 1995, para describir el conjunto de protenas que se
expresan a partir de un genoma. El proteoma es un elemento altamente dinmico, cuyos componentes
varan en un organismo, tejido, clula o compartimiento subcelular dados, como consecuencia de
cambios en su entorno, situaciones de estrs, administracin de drogas, efectores o seales bioqumicas
o su estado fisiolgico o patolgico. Estos factores incrementan de forma considerable la complejidad del
proteoma, como consecuencia de la activacin o supresin de la expresin de genes, las alteraciones en
la intrincada pauta de interacciones intracelulares entre las protenas, o los cambios en sus
modificaciones postraduccionales.
Aunque el trmino proteoma se aplica indiscriminadamente a cualquier conjunto de protenas, su
acepcin ms precisa es la que refiere al conjunto de protenas que componen una clula o tipo celular
dado, en unas condiciones determinadas. El proteoma de una clula es la expresin de su fenotipo
caracterstico, y las diferencias entre un tipo celular y otro, o entre un mismo tipo celular en diferentes
situaciones, se pueden, con cierta propiedad, asignar a los cambios que tienen lugar en la expresin y
funcionalidad de sus protenas.
El crecimiento en el nmero de proyectos de investigacin orientados a estudiar proteomas de forma
sistemtica ha dado lugar a la aparicin de un nuevo concepto, Protemica, con el que se trata de
describir la ciencia o conjunto de tecnologas que estudian el proteoma. Algunos autores prefieren definir
la Protemica como la parte de la Genmica Funcional que centra su atencin en el estudio directo de
las protenas.
III.- Tcnicas experimentales en las que se basa la Protemica
Los proyectos de Protemica se basan en el uso sinrgico de una serie de tcnicas, que se suelen
clasificar en tres categoras: i) herramientas para el anlisis global y la separacin de los componentes
del proteoma; ii) herramientas para el anlisis individual de los componentes del proteoma; iii) tcnicas
para el proceso e interpretacin de los datos.
Laboratorio de Protemica, Universidad autonoma de Madrid 28049 Cantoblanco. Madrid. Espaa. Tel.: 91 397 83 64, fax: 91 397 80 87.








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En la primera categora, la herramienta ms empleada es la electroforesis en geles de acrilamida en
presencia de dodecil-sulfato sdico (SDS), que permite la separacin de las protenas de acuerdo a su
peso molecular. Esta tcnica se suele combinar con la separacin previa de las protenas en base a su
punto isoelctrico (isoelectroenfoque); la separacin en funcin de sus propiedades elctricas y su
tamao permite aislar prcticamente todas las protenas de un proteoma en una matriz bidimensional
(electroforesis bidimensional).






Figura 1

Esquema de las tcnicas clsicas en que se basa la
Protemica

Las protenas as separadas pueden ser analizadas directamente mediante espectrometra de masas,
que constituye, en sus mltiples variantes, la herramienta fundamental de la segunda categora. En la
aproximacin ms comn, las protenas se recortan directamente del gel bidimensional donde han sido
aisladas, y se digieren con una proteasa, que produce un conjunto de pptidos (Fig. 1). Estos pptidos se
analizan directamente mediante espectrometra de masas tipo MALDI-TOF (Matrix Asisted Laser
Desorption Ionization-Time of Flight). Esta tcnica es particularmente til para obtener el espectro de
masas del conjunto de pptidos, tambin denominado huella peptdica.
Alternativamente, los pptidos producidos, tras un proceso de eliminacin de contaminantes, se
analizan mediante espectrometra de masas tipo electrospray en combinacin con un triple cuadrupolo o
una trampa inica. Estas tcnicas permiten el anlisis en tiempo real de pptidos individuales presentes
en la mezcla, sin necesidad de separarlos del resto, el cual consiste en la fragmentacin del pptido
(Fig. 1) y la generacin de un espectro de masas, tambin llamado espectro de fragmentacin o
espectro MS/MS.
Las huellas peptdicas son caractersticas de cada una de las protenas, y permiten identificarlas una
a una en la base de datos (Fig. 1), utilizando tcnicas bioinformticas, que constituyen las herramientas
de la tercera categora. De la misma manera, los espectros MS/MS son tambin caractersticos de cada
uno de los pptidos, y permiten su identificacin in silico en la base de datos (Fig. 1). Ninguna de las dos
tcnicas (huella peptdica o fragmentacin) es de aplicabilidad universal, y cada una de ellas tiene sus
ventajas e inconvenientes. Sin embargo, la disponibilidad sinrgica de ambas tcnicas hace de la
espectrometra de masas una formidable herramienta para la identificacin sistemtica de protenas.

IV.- Aplicaciones de la Protemica en el Area de Biociencias.
En este rea, la Protemica se ha aplicado fundamentalmente a tres tipos de estudios:
A.- La microcaracterizacin sistemtica de protenas, con el objetivo de abordar la identificacin a gran
escala de los componentes de un proteoma.
La identificacin a gran escala de los componentes de un proteoma permite la catalogacin de los
mismos y la construccin de bases de datos, que suelen organizarse en base a la imagen del proteoma
que resulta de su separacin mediante electroforesis bidimensional. Estas bases de datos tienen una
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enorme utilidad para los proyectos de investigacin que necesiten un conocimiento detallado de esos
proteomas.
B.- La identificacin de los componentes del proteoma que sufren alteraciones en sus niveles de
expresin a consecuencia de alteraciones fisiopatolgicas o inducidas por agentes externos (Protemica
de Expresin Diferencial). Estos proyectos abordan la identificacin de protenas que sufren alteraciones
en sus niveles de expresin a consecuencia de cambios en su entorno, situaciones de estrs,
administracin de drogas, efectores o seales bioqumicas o su estado fisiolgico o patolgico,
permitiendo as determinar cules son las protenas que intervienen en esos procesos (caracterizacin
del mecanismo molecular; identificacin de dianas farmacolgicas) o identificar protenas cuyos cambios
de expresin resulten caractersticos del proceso (identificacin de marcadores diagnsticos).
Este tipo de estudios puede tambin llevarse a cabo mediante la tecnologa de los chips de DNA
aunque, en la prctica, se trata de dos aproximaciones complementarias. Los niveles de expresin de
mRNA no siempre reflejan adecuadamente el nivel de expresin real de las protenas correspondientes,
por lo que la aproximacin protemica permite obtener resultados ms concluyentes desde un punto de
vista tanto fisiolgico como farmacolgico. Sin embargo, la tecnologa de los chip de DNA permite
concentrar el anlisis en el nivel de expresin de determinados genes, con una sensibilidad superior.
C.- La caracterizacin de las interacciones subcelulares existentes entre la protenas y la determinacin
de los componentes de complejos macromoleculares (Protemica de Mapa Celular).
Estos proyectos pretenden investigar la funcin de las protenas caracterizando las interacciones que
sufren en el interior de la clula. Estos proyectos responden a la nocin cada vez ms extendida de que
las protenas no actan de forma aislada sino a travs de grandes complejos macromoleculares, los
cuales agrupan conjuntos de factores que realizan las diferentes etapas de un mismo proceso celular, de
forma que su proximidad aumenta la eficiencia de cada etapa. Muchas veces, la identificacin de los
componentes de un complejo macromolecular o de los factores que interaccionan con una protena dada
resulta el camino ms rpido para determinar su funcionalidad. Mediante este tipo de proyectos,
aplicados de forma sistemtica, los investigadores pretenden construir un mapa fsico de las
interacciones existentes entre las protenas celulares.
V.- Las nuevas tecnologas
El inters que despierta actualmente la Protemica se traduce en un desarrollo tecnolgico continuo,
que da lugar a aproximaciones novedosas. Desde el punto de vista de la espectrometra de masas, se
estn comenzando a usar nuevos aparatos, que se basan principalmente en la combinacin hbrida de
tcnicas ya conocidas. Por ejemplo, los aparatos basados en la combinacin de un doble cuadrupolo y
un TOF (qQ-TOF) mejoran sensiblemente la resolucin de los espectros de fragmentacin, y la
combinacin de la ionizacin MALDI con el analizador qQ-TOF o la trampa inica permite fragmentar
pptidos directamente una vez obtenida la huella peptdica.
La espectrometra de masas denominada MALDI-TOF/TOF conjuga todas las ventajas de la
espectrometra MALDI-TOF convencional con la capacidad de producir espectros de fragmentacin de
pptidos de forma rpida y robusta. Esta tcnica est comenzando a ser utilizada para la identificacin a
gran escala de protenas.
Otras aproximaciones de la espectrometra de masas se basan en el acoplamiento de un sistema de
cromatografa lquida bidimensional con un analizador de trampa inica o del tipo qQ-TOF. Este
procedimiento, capaz de identificar millares de pptidos en un solo experimento, permite analizar de
forma automtica los componentes de mezclas muy complejas de pptidos, tales como las producidads
por la digestin directa de un proteoma (Fig. 2). Esta tcnica (tambin denominada shotgun proteomics)
se ha aplicado a la identificacin directa de componentes de complejos macromoleculares e incluso al
anlisis de proteomas enteros sin necesidad de separar sus componentes mediante electroforesis.
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Figura 2

Anlisis a gran escala de los componentes de un proteoma mediante
cromatografa bidimensional automatizada. El proteoma completo de
levadura se digiere con tripsina, y los pptidos producidos se
analizan mediante cromatografa de intercambio inico. Eluyendo a
las concentraciones de sal indicadas, se obtienen sucesivas
fracciones de pptidos, las cuales se analizan mediante
cromatografa de fase reversa en tndem con trampa inica. Los
pptidos que van eluyendo de esta columna con un gradiente de fase
orgnica se fragmentan e identifican automticamente en la base de
datos; cada pico de los cromatogramas que se muestran
corresponde aproximadamente a un pptido. En este experimento se
identificaron unas 1500 protenas diferentes.
Otra variante de esta metodologa permite realizar estudios de expresin diferencial de protenas al nivel
de proteoma sin necesidad de realizar electroforesis bidimensional. Esta tcnica (denominada ICAT, por
isotope-coded affinity tag) se basa en el uso de reactivos de protenas en forma de istopos estables,
que permiten determinar la proporcin relativa de los pptidos derivados de los proteomas a comparar
(Fig. 3). Utilizando programas informticos desarrollados para este fin, este procedimiento permite la
identificacin automtica y simultnea de cambios relativos en las concentraciones de protenas y de la
naturaleza de las protenas que experimentan expresin diferencial.

Figura 3
Esquema de la tcnica ICAT. Las protenas procedentes de dos
proteomas distintos se hacen reaccionar con dos istopos
diferentes de un reactivo especfico de cistenas. Los dos
proteomas se mezclan y se digieren conjuntamente con una
proteasa; los pptidos modificados se purifican mediante
cromatografa de afinidad y se analizan mediante cromatografa
lquida en tndem con espectrometra de masas. La proporcin
relativa de pptidos equivalentes en cada uno de los proteomas
se determina a partir de la intensidad relativa de las formas
derivatizadas con cada istopo; los pptidos que muestran
cambios en su intensidad relativa se fragmentan e identifican
automticamente.
Finalmente, estas metodologas, en combinacin con procedimientos de purificacin selectiva por
afinidad, han permitido el anlisis de pptidos modificados, tales como fosfopptidos, a partir de
proteomas completos, lo que ha dado lugar al concepto de fosfoproteoma.
VI.- El Futuro de la Protemica
Una de las razones que explican el creciente inters por la Protemica es el hecho de que muchas
propiedades de las protenas, sobre todo sus interacciones y sus modificaciones postraduccionales, no
pueden, en general, predecirse a partir de la secuencia de DNA. En un proyecto reciente de particular
inters, se ha efectuado un estudio a gran escala de las interacciones entre protenas en levadura, que
ha dado lugar a la construccin de un mapa de interacciones (Fig. 4). La evidente complejidad de este
mapa sugiere que la funcionalidad de las protenas no debe considerarse de forma aislada, sino dentro
de una red global de componentes que interactan mutuamente.
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Figura 4
Mapa de las interacciones existentes entre protenas de
levadura, determinadas de forma experimental mediante
tcnicas de Protemica.
Todava no se han desarrollado herramientas bioinformticas capaces de interpretar el significado de
esta compleja red de interacciones, y, por otra parte, esta metodologa no puede todava aplicarse a
clulas eucariotas, es decir, clulas de los organismos superiores. Sin embargo, este trabajo pionero
sugiere que en un futuro prximo la Protemica nos permitir analizar las propiedades de sistemas
complejos de protenas desde una perspectiva global e integradora. Resultarn apasionantes los
resultados que se deriven de aplicar esta estrategia experimental al estudio de procesos celulares de alta
complejidad, tales como las cascadas de transduccin de seales, la diferenciacin celular, la
degeneracin neuronal, la apoptosis o el cncer.
Una de las asignaturas pendientes de la Protemica es que, en su concepcin actual, no puede
aplicarse de forma efectiva al estudio de especies, como muchos microorganismos o especies de inters
en biotecnologa o tecnologa de alimentos, cuyas protenas no estn suficientemente representadas en
las bases de datos. El desarrollo de nuevos algoritmos informticos capaces de interpretar de forma
inteligente la informacin generada por la espectrometra de masas (interpretacin de novo de
espectros de fragmentacin), permitir en un futuro prximo aplicar la Protemica al estudio de estas
especies.
Estos nuevos desarrollos bioinformticos podran tambin aplicarse al estudio sistemtico de
modificaciones postraduccionales (Fig. 5). Estas tcnicas, en combinacin con los mtodos de
cromatografa lquida bidimensional, podran abrir el camino al estudio de modificaciones
postraduccionales a gran escala y de forma dinmica, y a la manera como stas modulan, desde una
perspectiva global, el control de la inmensa mayora de los procesos celulares.
Figura 5
Caracterizacin de la modificacin postraduccional de un pptido (en
este caso fosforilacin) mediante espectrometra de masas de trampa
inica. El pptido se asla en tiempo real a partir de una mezcla de
pptidos (A) y se somete a fragmentacin (B); el fragmento principal as
obtenido, que corresponde a la cadena polipeptdica que permanece
despus la rotura del grupo fosfato, se vuelve a someter a
fragmentacin (C). Este espectro de fragmentacin se interpreta en
base a la secuencia del pptido, la modificacin producida por el grupo
fosfato y el peso molecular esperado de los fragmentos. En la figura se
muestra que la fosforilacin tiene lugar en el aminocido Serina situado
en posicin 2, que se indica como una s minscula. Esta
interpretacin fue realizada utilizando el programa DeNovoX,
desarrollado en el laboratorio del autor.

Jess Vzquez
Director del Laboratorio de Qumica de Protenas y Protemica
Centro de Biologa Molecular Severo Ochoa (CBM), CSIC-UAM
ISSN 1695-0623
Laboratorio de Protemica, Universidad autonoma de Madrid 28049 Cantoblanco. Madrid. Espaa. Tel.: 91 397 83 64, fax: 91 397 80 87.