1608 Z. Jansen construye un microscopio con dos lentes
convergentes. 1611 Kepler sugiere la manera de fabricar un microscopio compuesto. 1665 Hooke utiliza un microscopio compuesto para estudiar cortes de corcho y describe los pequeos poros en forma de caja a los que l llam "clulas". Publica su libro Micrographia 1674 Leeuwenhoek informa su descubrimiento de protozoarios. Observar bacterias por primera vez 9 aos despus. 1683 Leeuwenhoek observa bacterias por primera vez. 1828 W. Nicol desarrolla la microscopa con luz polarizada. 1833 Brown publica sus observaciones microscpicas de orqudeas y describe claramente el ncleo de la clula. 1849 J. Quekett publica un tratado prctico sobre el uso del microscopio. 1838 Schleiden y Schwann proponen la teora de la clula y declaran que la clula nucleada es la unidad estructural y funcional en plantas y animales. 1857 Kolliker describe las mitocondrias en clulas del msculo. 1876 Abb analiza los efectos de la difraccin en la formacin de la imagen en el microscopio y muestra cmo perfeccionar el diseo del microscopio. 1879 Flemming describe con gran claridad el comportamiento de los cromosomas durante la mitosis en clulas animales. 1881 Retzius describe gran nmero de tejidos animales con un detalle que no ha sido superado por ningn otro microscopista de luz. En las siguientes dos dcadas l, Cajal y otros histlogos desarrollan nuevos mtodos de tincin y ponen los fundamentos de la anatoma microscpica. 1882 Koch usa tinte de anilina para teir microorganismos e identifica las bacterias que causan la tuberculosis y el clera. En las siguientes dos dcadas, otros bacterilogos, como Klebs y Pasteur identificarn a los agentes causativos de muchas otras enfermedades examinando preparaciones teidas bajo el microscopio. 1886 Zeiss fabrica una serie de lentes, diseo de Abb que permiten al microscopista resolver estructuras en los lmites tericos de la luz visible. 1898 Golgi ve y describe por primera vez el aparato de Golgi tiendo clulas con nitrato de plata. 1908 Khler y Siedentopf desarrollan el microscopio de fluorescencia. 1924 Lacassagne y colaboradores desarrollan el primer mtodo autoradiogrfico para localizar polonium radiactivo en espcimenes biolgicos. 1930 Lebedeff disea y construye el primer microscopio de interferencia. 1932 Zernike inventa el microscopio de contraste de fases. 1937 Ernst Ruska y Max Knoll, fsicos alemanes, construyen el primer microscopio electrnico. 1941 Coombs usa anticuerpos acoplados a tintes fluorescentes para estudiar antgenos celulares. 1952 Nomarski inventa y patenta el sistema de contraste de interferencia diferencial para el microscopio de luz. 1981 Aparece el microscopio de efecto tnel (MET).
El Microscopio
Hay dos grandes problemas que dificultan la observacin de las microestruturas biolgicas: las pequeas dimensiones de las clulas y de sus organelas y su transparencia a la luz visible, lo cual tiene como consecuencia inmediata la falta de contraste entre las diferentes estructuras y entre estas y el propio medio que las rodea. Para superar el primer problema, se construyeron y se perfeccionaron instrumentos capaces de aumentar significativamente las imgenes, revelando los pormenores de las estructuras (microscopios); para resolver el segundo problema, se desarrollaron tcnicas, fundamentalmente del tipo de las tinciones, que permitan aumentar el contraste entre las diferentes estructuras y entre ellas y su entorno, hacindolas claramente visibles y diferenciables. (Nuno G. Dias)
Microscopio, del griego: "mikro" = pequeo y "scope" = mirar (para mirar cosas pequeas) Un microscopio es un instrumento ptico compuesto de varias lentes que sirve para observar objetos muy pequeos. En el microscopio electrnico, los rayos luminosos del microscopio convencional son reemplazados por un haz de electrones (el aumento puede alcanzar en este caso hasta 100 veces el del microscopio convencional). Aunque la existencia de criaturas demasiado pequeas para ser vistas con el ojo haba sido sospechada desde tiempo atrs, su descubrimiento real est ligado a la invencin del microscopio. La primera persona que vio los microorganismos con algn detalle fue el constructor de microscopios aficionado Antoni van Leeuwenhoek (1632- 1723); este holands us microscopios simples construidos por l mismo (se dedicaba a pulir lentes para fabricar sus microscopios que, como mucho, alcanzaran unos 300 aumentos). En 1677 escribe una carta a la Philosophical Transactions of the Royal Society of London en la que comunicaba sus recientes observaciones con los microscopios de su fabricacin. Desde ese momento, el microscopio ptico se ha transformado en uno de los medios ms importantes para el diagnstico de las infecciones. Aun hoy, a pesar del nfasis en los mtodos rpidos de diagnstico, muchos de los cuales requieren instrumentos complicados o reactivos inmunolgicos, la simple observacin visual de la muestra clnica obtenida de un paciente es la forma ms rpida y especfica de apoyar el diagnstico clnico realizado por el mdico. Muchos agentes infecciosos pueden ser identificados en forma fiable con slo unas pocas coloraciones y un microscopio bsico. La coloracin de Gram an es el mtodo individual mas eficiente y econmico para el diagnstico rpido y precoz de una infeccin bacteriana. Por definicin, toda la informacin y los conocimientos relacionados con el microscopio son piedra angular en el estudio de la microbiologa. (imagen superior: El primer microscopio de Leeuwenhoek)
El microscopio ptico compuesto
El microscopio compuesto, que se ha hecho de uso general a partir de mediados del siglo XIX y que fue de importancia crucial para la evolucin de la microbiologa como ciencia, es todava, con ciertas variaciones, el principal apoyo de la investigacin microbiolgica rutinaria. Este tipo de microscopio est formado bsicamente por una parte mecnica y una parte ptica y es capaz de conseguir aumentos considerablemente mayores que el microscopio construido con una sola lente. Este ltimo, llamado microscopio simple, se usa principalmente en el formato de lupa. Los elementos mecnicos bsicos son el pie (7), que es el soporte del microscopio, la columna (3), en la que se apoyan las restantes piezas, el tubo, que es el elemento de unin entre el ocular y el revlver (pieza giratoria que soporta los objetivos), la platina, sobre la que se apoya la preparacin a observar, y los tornillos Micromtrico y Macromtrico que se utilizan para enfocar la preparacin (el primero es de pequeo recorrido, para movimientos de pequea amplitud, y el segundo de largo recorrido, para movimientos de gran amplitud. En cuanto a la parte ptica, un microscopio compuesto tiene dos lentes o sistemas de lentes: el objetivo (4), situado cerca del objeto que se observa, proyecta una imagen ampliada del objeto observado en direccin al ocular (1), que est colocado cerca del ojo y acta, a modo de lupa, ampliando la imagen que produce el objetivo, y el condensador (5), cuya misin es concentrar la luz sobre la preparacin y permitir manipular su intensidad. La ampliacin total aportada por el conjunto objetivo-ocular es igual al producto de multiplicar la capacidad de aumento del objetivo por la del ocular; as: la mayor parte de los microscopios usados en microbiologa tienen oculares de diez aumentos (abreviadamente, x10) y objetivos de aumentos diversos, habitualmente x10 (aumento total, x100), x40 (total, x400), y x90 x100 (objetivos de inmersin en aceite; x900 x1000 total). Las lentes de menor aumento se utilizan para rastrear la preparacin buscando objetos de inters, el objetivo de 40 aumentos permite la observacin detallada de los microorganismos grandes tales como algas, protozoos y hongos, y los objetivos de 90 100 aumentos se emplean para ver las bacterias y los pequeos microorganismos eucariotas. Adems del aumento, una propiedad importante de un microscopio es su poder resolutivo. Este es la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos; y por tanto, cuanto mayor sea el poder resolutivo, mayor ser la definicin con que podremos observar un objeto. Los microscopios de gran poder resolutivo son especialmente buenos para ver pequeas estructuras. El poder resolutivo de un microscopio compuesto depende de la longitud de onda utilizada y de una propiedad ptica de la lente conocida como apertura numrica. Como la longitud de onda habitualmente est fijada, la resolucin de un objeto es funcin de la apertura numrica; cuanto mayor sea la apertura, el objeto resuelto ser ms pequeo. Hay una correspondencia aproximada entre el aumento de un objetivo y su apertura numrica, de tal modo que las lentes con mayores aumentos habitualmente tendrn mayores aperturas numricas. (El valor de la apertura est marcado al lado de la lente) El sistema de iluminacin de un microscopio es tambin de considerable importancia, especialmente cuando se utilizan grandes aumentos. La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparacin para que la imagen se traslade de forma adecuada al objetivo y llegue con la mayor calidad posible al ojo del observador a travs del ocular. En los microscopios antiguos, la fuente de luz era externa, y se utilizaba un espejo, situado en el propio microscopio, para reflejar esa luz externa hacia la preparacin y los objetivos. Actualmente se utiliza un sistema de lentes, incorporado al propio microscopio, llamado condensador (5). Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de la luz y elegirse una posicin que consiga el foco preciso. El condensador tiene tambin un diafragma iris, que controla el dimetro del crculo de luz que pasa por el sistema. Lo que se busca con este diafragma iris no es controlar la intensidad de la luz que alcanza el objeto, sino asegurar que la luz que pasa por el sistema condensador ocupe justamente el objetivo. Si el diafragma iris es demasiado grande, parte de la luz pasar no slo al objetivo sino tambin alrededor de l, y no se utilizar. Si la luz es demasiado brillante, no deber reducirse alterando la posicin del condensador o del diafragma iris sino usando filtros de neutralizacin, o disminuyendo el voltaje de la lmpara. Nunca se insistir lo suficiente en que el ajuste apropiado de la luz es crucial para la buena microscopa, especialmente a los mayores aumentos. Los tornillos macro/micromtrico (2) estn engarzados con la platina que soporta las muestras por medio de un mecanismo de cremallera y se utilizan para subir y bajar dicha platina (acercarla o alejarla del objetivo) con el fin de enfocar la imagen que se forma en el ocular. El tornillo macromtrico maneja un engranaje de paso largo, diseado para efectuar movimientos de gran amplitud y largo recorrido, mientras el tornillo micromtrico controla un engranaje de paso corto, especial para movimientos de pequea amplitud y pequeo recorrido y se utiliza para el enfoque fino de la imagen.
Mi croscop a Gal er a de i mgenes > Mi croscop a pt i ca
Staphylococcus aureus
Streptococcus beta hemoltico
Escherichia coli
Clostridium perfringens
Mycobacterium tuberculosis
Strepcococcus pneumoniae
Salmonella typhi
Aspergillus nidulans
Aspergillus niger
Candida albicans
Brucella abortus
Bordetella pertussis
Clostridium tetani
Haemophylus ducreyi
Mycoplasma pneumoniae
Leptospira spp.
Mucor circenelloides
Microscopio electrnico
Para estudiar la estructura interna de los procariotas es esencial el uso del microscopio electrnico. En este microscopio se utilizan electrones en vez de rayos de luz, y como lentes funcionan unos electroimanes. Cuando los electrones pasan a travs de la preparacin algunos son difractados creando entonces una imagen que se hace visible en una pantalla sensible a los electrones. La longitud de onda de la radiacin de los electrones es mucho ms pequea que la de la luz visible y, como el poder resolutivo de un microscopio es inversamente proporcional a la longitud de onda utilizada, la resolucin obtenida con el microscopio electrnico es mucho mayor que la conseguida con el microscopio ptico. Mientras que con el microscopio ptico ordinario o el de contraste de fases las estructuras ms pequeas que pueden observarse tienen unos 0,2 m, con el microscopio electrnico pueden verse fcilmente objetos de 0,001 m. Con el microscopio electrnico es posible ver muchas sustancias incluso de tamao molecular. Sin embargo, a causa de la naturaleza de este instrumento slo pueden examinarse objetos muy delgados: si se est interesado en ver estructuras internas, incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada directamente. Por consiguiente, para preparar muestras para el microscopio electrnico se necesitan tcnicas especiales de cortes ultrafinos. Para seccionar las clulas primero deben ser fijadas y deshidratadas, realizndose habitualmente esto ltimo transfiriendo las clulas a un disolvente orgnico. Despus de la deshidratacin, la muestra es incluida en plstico y en este plstico se cortan secciones finas utilizando un ultramicrtomo, por lo general equipado con una cuchilla de diamante. Una sola clula bacteriana, por ejemplo, puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas, que son examinadas despus individualmente con el microscopio electrnico. Para obtener suficiente contraste, las preparaciones se tratan con colorantes especiales de la microscopia electrnica, tales como cido smico, permanganato, uranio, lantano o plomo. Estos materiales estn compuestos por tomos de elevado peso molecular y, por ello, dispersan bien los electrones. Las estructuras celulares teidas con uno de esos materiales presentan un contraste muy aumentado y; por tanto, se ven mejor. Otro modo de conseguir contraste con el microscopio electrnico es la tincin negativa. Se aplica el mismo principio que en la tincin negativa del microscopio ptico. Se utiliza una sustancia que no penetra la estructura pero que dispersa los electrones. Una de las tinciones negativas ms comnmente utilizadas en la microscopia electrnica se realiza con cido fosfovolfrmico (fosfotngstico). Para examinar las superficies celulares pueden prepararse rplicas de carbono evaporando sobre la superficie de las clulas una fina capa de carbono que se adapta a los contornos de la superficie celular y que cuando es desprendida resulta suficientemente delgada para poder observarse directamente al microscopio electrnico. Otra tcnica de la microscopa electrnica recientemente desarrollada es la de criocorrosin que evita la formacin de artefactos al eliminar la fijacin qumica y la inclusin. La muestra que va a examinarse es congelada sin tratamiento qumico, y el bloque congelado se corta con una cuchilla de diamante, de tal modo que se eliminan porciones de las superficies de las clulas. Se hacen y se examinan entonces rplicas en carbono de esas superficies, pudindose observar estructuras superficiales o internas de las clulas. La mayora de las estructuras celulares vistas en secciones ultrafinas de preparaciones fijadas qumicamente se ven tambin en material congelado, lo que sugiere que esas estructuras no son artefactos.
Mi croscop a Gal er a de i mgenes > Mi croscop a el ectr ni ca
Staphylococcus aureus
Streptococcus beta hemoltico
Escherichia coli
Clostridium perfringens
Mycobacterium tuberculosis
Strepcococcus pneumoniae
Salmonella typhi
Aspergillus niger
Candida albicans
Brucella abortus
Bordetella pertussis
Clostridium tetani
Mycoplasma
Leptospira spp. Haemophylus ducreyi pneumoniae
Pseudomona aeruginosa
Klebsiella pneumoniae
Otros microscopios
El microscopio de contraste de fases: Hace posible visualizar fcilmente pequeas clulas incluso sin teir. Las clulas tienen un ndice de refraccin distinto del medio que las rodea, y esta diferencia puede utilizarse para crear una imagen de mucho mayor contraste que el que puede obtenerse con el microscopio ptico normal. La microscopia de contraste de fases hace posible observar clulas en estado vivo ms fcilmente, ayudndonos as a evitar la creacin de condiciones artificiales tales como las introducidas por la tincin (aparicin de artefactos que interfieren con la correcta visin y alteracin de las estructuras naturales de las clula). En muchos laboratorios de bacteriologa, el microscopio de contraste de fases ha reemplazado prcticamente el microscopio ptico comn como instrumento de investigacin. Esta tcnica se basa en el hecho de que las diferentes estructuras celulares introducen pequeas variaciones de fase en las radiaciones, retrasndolas ligeramente, siendo estos retrasos diferentes segn el tipo de estructura. Con este microscopio, el bajo contraste existente se refuerza por medio de un sistema ptico especial, que transforma las diferencias de fase, que no son captadas por el ojo humano, en diferencias de amplitud (intensidad luminosa), que s son detectables.
El microscopio de campo oscuro: Se le llama tambin ultramicroscopio y es un microscopio ptico ordinario cuyo sistema condensador ha sido modificado para dirigir la luz a la preparacin desde los lados, de tal modo que slo la luz difractada por la preparacin pasa al ocular y se hace visible. A causa de esta disposicin, la muestra aparece iluminada sobre un fondo oscuro. La microscopa de campo oscuro hace posible la observacin en estado vivo de partculas y clulas que de otra manera estaran por debajo de los lmites de resolucin del microscopio ptico, aunque resulten visibles pocos detalles estructurales. La microscopia de campo oscuro ha sido ampliamente usada en el estudio de pequeas clulas mviles tales como Treponema pallidum, la espiroqueta causante de la sfilis, que es invisible con la microscopa ptica ordinaria.
El microscopio de fluorescencia: Algunos colorantes denominados fluorocromos tienen la propiedad de ser excitados (pasar a un nivel superior de energa) cuando absorben luz ultravioleta (luz de longitud de onda corta). A medida que las molculas excitadas regresan a su estado normal liberan el exceso de energa en forma de luz visible de mayor longitud de onda que la radiacin excitante. Esta propiedad se denomina fluorescencia. Se han desarrollado mtodos microscpicos modernos que aprovechan la mayor deteccin que posibilita este sistema. Este tipo de microscopios lleva una fuente luminosa que emite radiaciones ultra-violeta, en el lmite del espectro visible, que atraviesan el material de la preparacin de de la misma forma en que lo hace un microscopio ptico comn. Las lentes suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiacin ultra-violeta. A continuacin del objetivo lleva unos filtros que retienen la radiacin ultra-violeta, que es peligrosa para el ojo humano, dejando pasar solamente la radiacin visible, que no es peligrosa. Hoy da se utiliza mucho un microscopio de fluorescencia en el cual la luz es emitida desde arriba del preparado (epifluorescencia). Un filtro deja pasar luz de la longitud de onda deseada para excitar al fluorocromo y un filtro barrera en el objetivo protege al ojo del observador de la radiacin fluorescente. Los objetos fluorescentes aparecen brillantemente iluminados contra un fondo oscuro, segn el color del colorante usad El microscopio invertido: En el laboratorio de virologa se utiliza muchsimo el microscopio invertido que no es ms que una variante del microscopio convencional que, tal y como indica su nombre, tiene invertida la posicin normal de los objetivos, que estn, en el revlver, por debajo de la platina, mientras que la luz de la fuente de iluminacin, a travs del condensador y del diafragma, llega desde encima de la platina, lo que facilita cierto tipo de trabajos como el control del estado de las monocapas celulares cuando se trabaja con botellas o tubos de cultivo