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Este documento proporciona instrucciones detalladas para la recolección, transporte, conservación y procesamiento de muestras para estudios parasitológicos. Describe los métodos recomendados por la OMS para estudios coproparasitológicos, incluyendo la recolección de muestras fecales seriadas, su preservación y transporte. También cubre métodos especiales para Enterobius vermicularis y Taenia spp, así como la recolección de fluidos y tejidos para estudios adicionales.
Este documento proporciona instrucciones detalladas para la recolección, transporte, conservación y procesamiento de muestras para estudios parasitológicos. Describe los métodos recomendados por la OMS para estudios coproparasitológicos, incluyendo la recolección de muestras fecales seriadas, su preservación y transporte. También cubre métodos especiales para Enterobius vermicularis y Taenia spp, así como la recolección de fluidos y tejidos para estudios adicionales.
Este documento proporciona instrucciones detalladas para la recolección, transporte, conservación y procesamiento de muestras para estudios parasitológicos. Describe los métodos recomendados por la OMS para estudios coproparasitológicos, incluyendo la recolección de muestras fecales seriadas, su preservación y transporte. También cubre métodos especiales para Enterobius vermicularis y Taenia spp, así como la recolección de fluidos y tejidos para estudios adicionales.
RECOLECCION, TRANSPORTE, CONSERVACION Y PROCESAMIENTO
DE MUESTRAS PARA ESTUDIOS PARASITOLOGICOS
(REFERIRSE A LA GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS PARA LOS METODOS DE CONCENTRACION DE MATERIA FECAL)
La correcta obtencin de muestras es un prerrequisito fundamental para arribar a un diagnstico adecuado. Para tal fin, deben considerarse los factores que contribuyen al diagnstico presuntivo de las parasitosis, la preparacin fsica y emocional del paciente para la toma de las muestras, los procedimientos requeridos para su obtencin, transporte y preservacin y, finalmente, su procesamiento e identificacin del agente etiolgico.
I. ENTEROPARSITOS En el caso de la toma de muestra para diagnstico de enteroparasitosis se deben considerar cuatro abordajes posibles: la obtencin de materia fecal, la obtencin de muestras perianales, la obtencin de biopsias y la obtencin de suero o plasma (esto ltimo aplica slo al diagnstico serolgico de amebosis extraintestinal). Para una mejor orientacin con respecto a los posibles agentes etiolgicos responsables de la infeccin intestinal se requiere la elaboracin de una ficha tipo. con antecedentes epidemiolgicos y clnicos, accesible al laboratorio de diagnstico parasitolgico. Esta ficha debe incluir precisiones sobre los siguientes datos: 1. Nombre y apellido. Edad. Sexo. 2. Lugar de nacimiento. Residencia actual. Residencias anteriores. Viajes. 3. Ocupacin laboral. 4. Motivo de la consulta. 5. Sistemas de provisin de agua, de eliminacin de excretas y de gestin de residuos en el domicilio. Piso de tierra o material. 6. Hbitos (preparacin y consumo de alimentos, geofagia, contacto con el suelo, lavado de manos, etc.). 7. Presencia de animales domsticos y de vectores mecnicos. 8. Familiares/convivientes/contactos con parasitosis actuales o pasadas. 9. Medicacin especfica administrada actualmente o en forma reciente. 10. Sntomas dominantes (digestivos, prurito, respiratorios, etc.). 11. Evidencias de parasitosis ( antecedente de expulsin de parsitos). 12. Antecedentes de desnutricin e inmunodepresin. 1 . Preparacin del paciente El paciente debe someterse a una preparacin correcta, mnima e indispensable para evitar exmenes falsamente negativos o positivos. Por eso se recomienda evitar, por lo menos tres das antes y durante la recoleccin de las muestras, la administracin oral o rectal de medicamentos que: i. Sean empleados como medio de contraste radiolgico (P.ej., compuestos baritados). ii. Alteren el trnsito intestinal (P.ej., carbn vegetal, sales de bismuto, laxantes) iii. Aumenten el contenido lipdico de la materia fecal (P.ej., vaselina lquida) Asimismo, se recomienda suspender, por lo menos tres das antes y durante la recoleccin de las muestras, la ingestin de alimentos que produzcan abundante residuo no digerible, tales como: i. Fibras vegetales (P.ej., legumbres, frutos de cutcula gruesa) ii. Granos (P.ej., frutas con semillas abundantes y pequeas, tales como la frutilla u otros frutos del bosque). iii. Polen. 2 . Recoleccin, preservacin y transporte de las muestras habituales 2.1 Mtodo recomendado por la OMS para estudios coproparasitolgicos 2.1.1 Recoleccin Se debe recolectar la materia fecal recin emitida en un frasco con fijador en forma seriada (las muestras nicas tienen una sensibilidad de alrededor del 60%). En casos de que las deposiciones sean formes o blandas se recomienda recolectar 3 muestras en das alternos en un lapso de 7 das, siempre de aquellas zonas ms llamativas. En aquellos pacientes con diarrea aguda se recomiendan tomar 3 muestras seriadas, y aquellos con diarrea crnica 6 muestras alternas en un lapso de 12 das. Las materias fecales tienen que ser homogeneizadas por el paciente con una esptula o elemento similar. En todos los casos la cantidad de muestra a recoger ser de una cucharita del tamao de las de t. En caso de emitir heces mucosanguinolentas se recomienda enviarlas en fresco (sin fijador) al laboratorio inmediatamente despus de emitidas o conservarlas a 4 C y enviarlas dentro de las 24hs. Si se observan estructuras similares a parsitos adultos, se deben recoger en frascos con agua o fijador y remitirlas al laboratorio. 2.1.2 Preservacin Los fijadores habitualmente empleados para la preservacin de muestras coproparasitolgicas incluyen: formol al 5% en agua o solucin fisiolgica; alcohol polivinlico, PVA; fenol-alcohol-formol, PAF; acetato de sodio-cido actico-formol. SAF o; merthiolate-iodo-formol, MIF) en una proporcin de 1 parte de heces por cada 3 partes de fijador (aproximadamente el volumen final no debe exceder la mitad del volumen del fijador). No debe estar mezclado con orina u otro lquido. 2.1.3 Transporte Las muestras fijadas pueden ser transportadas y permanecer utilizables para el diagnstico por meses a temperatura ambiente o refrigeradas a 4 C. Se recomienda dividir la muestra y recogerla por un lado en Formol 5% y por el otro en PVA y/o SAF, debido a que estos fijadores presentan ventajas y desventajas complementarias. El formol preserva mejor morfologa de huevos de helmintos y larvas; PVA y SAF son en general ms adecuados para realizar coloraciones permanentes de trofozotos y quistes de protozoarios. El formol, fijador habitual empleado en el diagnstico coproparasitolgico, tiene la ventaja adicional de desodorizar las muestras.
2.2 Examen de heces seriado de 6 muestras con tcnica de Deschiens En un frasco de boca ancha con solucin de formol al 5% se recolecta una muestra (una cucharadita) de materia fecal por da, de las porciones que llamen ms la atencin (con moco, pus, sangre, etc.), hasta completar las 6 muestras. No es necesario que sean en das consecutivos. Ventajas del mtodo: i. El formol desodoriza y fija el material. ii. Puede enviarse a distancia. iii. Al ser seriado pone a cubierto las fases negativas de protozoarios (descargas cclicas de quistes). Desventajas del mtodo: i. El formol no preserva los trofozotos de protozoarios (en este caso puede reemplazarse por PVA).
2.3 Examen de heces frescas: tcnica de Neghme Se recolecta una sola muestra de materia fecal en solucin fisiolgica; debe remitirse rpidamente al laboratorio y procesarse en el da (observacin inmediata o fijacin para ulterior observacin). Ventajas: Se pueden reconocer las formas vegetativas de los protozoarios. Desventajas: No es seriado.
2.4 Mtodos especiales de diagnstico-Enterobius vermicularis y Taenia spp 2.4.1 Mtodo de Graham-Garaguso para E.vermicularis 2.4.1.1 Preparacin del enfermo En todos los casos debe evitarse: i. El aseo de la regin anal y perianal antes de la realizacin de la obtencin de la muestra; esto reduce la sensibilidad del mtodo. ii. El uso de talcos, aceites o cremas en la regin afectada durante el perodo que abarque la recoleccin de las muestras. 2.4.1.2 Recoleccin, preservacin y transporte de la muestra. Se entregan 6 portaobjetos con cinta adhesiva de celofn adherido a estos, y 6 esptulas bajalenguas. El mtodo que se describe es adecuado para el diagnstico de enterobiosis en nios. Se deben tomar 6 muestras seriadas por las maanas sin previa higiene del margen anal, de la siguiente manera: i. Despegar la cinta adhesiva del portaobjetos y enrollarla en la esptula bajalenguas. La faz adhesiva debe quedar expuesta hacia afuera. El paciente en decbito ventral, debe separar los glteos. ii. Se debe aplicar repetidamente la faz adhesiva en la regin anal y perianal. iii. Pegar la cinta adhesiva sobre el portaobjetos, a modo de cubreobjetos. En adultos se recomienda reemplazar el procedimiento previo por el que se describe a continuacin, para el cual se entregan al paciente 5 gasas dobladas de 5x5 cm, aproximadamente, y un frasco de formol al 5%. Las muestras se toman seriadamente durante 5 das: i. El paciente en decbito ventral, debe separar los glteos. ii. Pasar la gasa, previamente humedecida en agua o solucin fisiolgica, por el ano y la regin perianal en forma repetida. iii. Colocar todas las gasas en el mismo frasco de formol. Debe tenerse en cuenta que los huevos de E. vermicularis son altamente infecciosos, por lo que deben extremarse las precauciones de higiene durante y despus de la toma de muestra.
2.4.2 Recoleccin y preservacin de progltides y adultos de nematodes Ante la sospecha de infeccin por adultos de nematodes y de progltides de cestodes intestinales del gnero Taenia debe proveerse al paciente un frasco con formalina o solucin salina. No deben emplearse fijadores como el etanol (frecuentemente empleado en estos casos), ya que opacan la cutcula y dificultan la identificacin de la especie. Eventualmente, el paciente puede emplear agua corriente. Si se emplea agua o solucin salina la muestra debe ser refrigerada y enviarse sin demora al laboratorio. Debe tenerse en cuenta que el mantenimiento de adultos de nematodes o progltides en solucin fisiolgica preserva la viabilidad de los huevos, siendo altamente infecciosos para el humano en el caso de T. solium, H. nana y E. vermicularis.
3 . Recoleccin, transporte y procesamiento de muestras para estudios especiales 3.1 Recoleccin de fluidos y tejidos De acuerdo al cuadro clnico y al diagnstico presuntivo, las formas evolutivas de los parsitos intestinales pueden ser investigadas en: i. Lquido duodenal. ii. Biopsias de intestino delgado o colon obtenidas mediante endoscopa. iii. Esputo. iv. Filtrado de materia fecal. La obtencin de estas muestras, complementarias a los estudios habituales, requiere la intervencin del mdico especialista, generalmente un gastroenterlogo. Se reservan para situaciones clnicas particulares (P.ej., coproparasitolgicos negativos en pacientes con sospecha fundada de giardiosis, amebosis, estrongiloidosis). En el caso de aspirados de lquido duodenal o esputo, estos deben colocarse en un tubo de vidrio o plstico transparente, limpio y seco. La cantidad de la muestra es de 2-5 ml y deber transportarse de modo inmediato al laboratorio o, en su defecto, refrigerarse a 4 C por un tiempo no mayor a las 4 horas. Las biopsias se recogern en solucin fisiolgica o paraformaldehdo al 4% para su ulterior preparacin histolgica con fines de microscopa de campo claro, fluorescencia o electrnica.
3.2 Mtodo de la cpsula de Beal o Enterotest Consiste en hacerle tragar al paciente una cpsula con gelatina unida a una cuerda de nylon. La cpsula llega al duodeno y despus se la retira y se observa el material mucoso duodenal. Se emplea para identificar trofozotos de Giardia intestinalis y larvas de Strongyloides stercoralis.
3.3 Recoleccin de material y deteccin de antgenos y/o cidos nucleicos en materia fecal (recomendaciones del CDC) 3.3.1 Deteccin de antgenos de protozoarios en materia fecal: Por regla general deben consultarse las condiciones de recoleccin y preservacin sugeridas por el fabricante del equipo que se emplear para el diagnstico (materia fecal fresca, fijada o congelada). La deteccin de coproantgenos parasitarios se realiza tanto mediante ELISA como por inmunocromatografa. Antgenos particulados (p.ej., quistes de protozoarios intestinales) pueden detectarse mediante inmunofluorescencia directa. Se desaconseja el uso de PVA y los mtodos de concentracin, en el caso de deteccin de antgenos de Giardia intestinalis mediante ELISA. 3.3.2 Deteccin de cidos nucleicos: Las muestras deben recogerse en ausencia de fijadores y enviarse refrigeradas o congeladas (hielo seco). Como alternativa, las muestras se pueden mezclar en proporcin 1:1 con dicromato de potasio o etanol absoluto y enviarse refrigeradas. Para protozoarios intestinales, se recomienda previamente hacer tinciones y examinarlas microscpicamente; en caso de identificar al parsito por morfologa, la PCR no se realiza. Es necesario realizar la extraccin del ADN de la muestra de materia fecal previo a la realizacin de la PCR.
II. PARSITOS DE SANGRE Y TEJIDOS Ficha tipo: Nombre y apellido. Edad. Lugar de nacimiento. Residencia actual y anteriores Tipo de vivienda y caractersticas de los alrededores. Viajes recientes. Animales domsticos. Personas parasitadas en la vivienda (si es nio, es de especial inters conocer los antecedentes maternos). Ingesta de carnes mal cocidas. Origen del agua. Reconocimiento de vectores y su presencia en el domicilio o alrededores. Fecha de comienzo de la enfermedad y diagnstico clnico presuntivo.
Preparacin del paciente Para la preparacin del enfermo que va a ser investigado, ante la sospecha de infeccin de parsitos de sangre y tejidos. deben cumplirse las normas generales de higiene y antisepsia relativas a la obtencin de muestras de sangre y biopsias. Sin embargo, se justifican algunas precisiones: En el caso de muestras de sangre para serologa se aplica el requisito de un ayuno mnimo para evitar el exceso de lpidos que pudieran interferir en los mtodos de inmunodiagnstico. Sin embargo, este requisito no es necesario si se obtuviera la muestra de sangre para realizar un diagnstico directo (P.ej., para tripanosomosis americana, malaria o filariosis). En el caso de biopsias cutneas o transcuneas, la piel debe ser adecuadamente lavada con agua y jabn y desinfectada con iodo-povidona o etanol 70 %, antes de realizar el procedimiento quirrgico (o aspirado en el caso de biopsia de mdula sea o ganglios linfticos).
1 . Recoleccin, preservacin y transporte de las muestras 1.1 Sangre 1.1.1 Recoleccin 1.1.1.1 Puncin digital Limpiar del pulpejo del dedo medio (mano izquierda si el paciente es diestro o viceversa), con alcohol 70%, dejar evaporar y punzar el pulpejo con lanceta o aguja estril (de preferencia en la cara lateral del dedo). En casos peditricos se puede emplear el mismo procedimiento para punzar el taln 1.1.1.2 Puncin venosa Se recogen dos muestras, una sin anticoagulante para estudios serolgicos y otra con anticoagulante en condiciones estriles, esta ltima muestra se emplear para realizar estudios de diagnstico directo (inocular medios de cultivo o animales), y realizar el examen microscpico en fresco con o sin previa concentracin. Las muestras para la determinacin directa de un hemoparsito debern ser remitidas al laboratorio de manera inmediata, a temperatura ambiente (22-25 C). Los materiales necesarios incluyen: Agujas y jeringas descartables estriles, algodn, alcohol, capilares heparinizados, tubos de ensayo, heparina, portaobjetos y cubreobjetos, plastilina, centrfuga para microcapilares y/o centrfuga clnica.
1.1.2 Procesamiento En el caso de investigacin de la muestra en fresco, sta debe ser estudiada de modo inmediato para limitar la prdida de sensibilidad, debido a la muerte de parsitos. Por el contrario, las muestras fijadas y coloreadas pueden ser enviadas con tiempo al laboratorio de referencia para su evaluacin. 1.1.2.1 Gota fresca (si se sospecha una tripanosomosis o filariosis) Colocar una gota entre porta y cubre-objeto y revisar microscpicamente el preparado recorrindolo totalmente en guarda griega. Si la muestra no se observara de manera inmediata, conviene recoger sangre con heparina u otro anticoagulante en un tubo y preparar la gota fresca en el momento de realizar la observacin. El reconocimiento de los parsitos se basa en su morfologa y movimientos. Los preparados deben ser observados nicamente con objetivos secos (4x-10x-40x). La sensibilidad es baja porque la muestra no est concentrada. 1.1.2.2 Extendidos o frotis (para tripanosomosis, filariosis, paludismo y babesiosis) Sobre un extremo de un portaobjeto seco, previamente desengrasado con una mezcla de alcohol-acetona, se coloca una pequea gota de sangre. La misma se extiende, ayudndose con un segundo portaobjeto que se colocar por delante, pero contactando la gota de sangre en un ngulo de 45 aproximadamente y que servir para deslizarla formando una fina pelcula. Dejar secar y transportar al laboratorio para su fijacin y tincin con colorantes adecuados (May-Grnwald-Giemsa o Wright-Giemsa). Al igual que la gota fresca, esta tcnica tiene baja sensibilidad. Sin embargo, permite visualizar detalles morfolgicos de los parsitos y ser mantenida como registro permanente. 1.1.2.3 Gota gruesa (para tripanosomosis, filariosis y paludismo) Colocar sobre el centro del porta una gota de sangre bastante grande; sobre ella se agregarn 1 a 3 ms, segn el espesor de las gotas que se extraigan. Con el ngulo de otro portaobjetos efectuar sobre las gotas un movimiento espiral desde el centro hacia la periferia raspando la superficie del portaobjeto. Extender la superficie de las gotas durante uno a dos minutos. De esta manera se desfibrinar la sangre y se extender la gota con un dimetro de 2 a 2,5 cm. Dejar secar y enviar al laboratorio para su tincin con Giemsa diludo sin fijacin previa. Es una tcnica de sensibilidad mayor que las anteriores, pero tiene peor definicin de las estructuras parasitarias. 1.1.2.4 Microhematocrito Tomar sangre del pulpejo del dedo (o del taln) y cargar varios capilares heparinizados (en general se emplean seis microcapilares por paciente). Sellar un extremo con plastilina o calor y centrifugar a 1500-2500 rpm por 5 minutos. Si no se puede proceder a centrifugar inmediatamente, conviene tomar una muestra de sangre heparinizada en tubo y preparar con ella los microhematocritos en el momento de procesarlos. Luego de centrifugado se obtienen 3 fases: plasma, leucocitos y eritrocitos. Los tripomastigotes sedimentan junto con los leucocitos. Se observa microscpicamente la fase leucocitaria entre portaobjetos y cubreobjetos. Es la tcnica de eleccin para el diagnstico directo de transmisin congnita de enfermedad de Chagas. Tiene una sensibilidad de 90-95% en la infeccin aguda. 1.1.2.5 Xenodiagnstico (se utiliza para T. cruzi) Se emplean 40 ninfas de T. infestans de tercer estadio, con ayuno previo de 15 das, repartidas en 4 cajas (10 insectos por caja). Las cajas se cubren con una gasa bien fijada y se colocan simultneamente durante 30 min. en antebrazos y/o muslos del paciente. Se investigar el contenido intestinal de los insectos durante un lapso de 45-60 das. Este mtodo slo es usado en casos especiales en los centros de referencia, pues es laborioso y caro, pero su sensibilidad es cercana al 100% en la fase aguda de la infeccin. 1.1.2.6 Deteccin de antgenos en sangre mediante inmunocromatografa Se emplea para identificar gnero y especie de Plasmodium (P. vivax y P. falciparum). Sangre obtenida por puncin digital es lisada en solucin hipotnica, liberando antgenos parasitarios. Los antgenos reaccionan en fase lquida con anticuerpos especficos marcados con oro coloidal. Los complejos inmunes migran en una tira de papel (o dentro de un cassette) y se unen a anticuerpos especficos de captura, unidos covalentemente a la tira de papel. La reaccin es positiva si se observan bandas coloreadas, aparte de la correspondiente al control positivo. 1.1.2.7 QBC (Quantitative buffy coat o mtodo de naranja de acridina) Es una tcnica para detectar infeccin por Plasmodium y Babesia en muestras de sangre. La sangre se recoge en un tubo capilar con sus paredes internas recubiertas del fluorocromo naranja de acridina. Este fluorocromo se intercala en el ADN. Luego de centrifugar el capilar en una microcentrfuga, se observan los parsitos fluorescentes en los eritrocitos que se concentran debajo de la interfase leucocitaria, empleando un microscopio provisto de luz UV. Esta prueba tiene como ventajas ser ms rpida y ms sensible que la gota gruesa.
1.2 Tejidos slidos 1.2.1 Recoleccin 1.2.1.1 Obtencin por puncin con agujas finas Esta tcnica se utiliza habitualmente para el diagnstico de leishmaniosis visceral, para la cual se obtiene muestras por puncin-aspiracin generalmente de mdula sea (esternn o cresta ilaca) y excepcionalmente de bazo, ganglios o hgado. 1.2.1.2 Mediante acto quirrgico a partir de rganos Se pueden obtener muestras de todo tipo de rganos (pulmn, ganglios, hgado, bazo, piel, tejido celular subcutneo, etc), dependiendo del parsito sospechado.
1.2.2 Procesamiento 1.2.2.1 Frotis Con los aspirados de mdula sea, ganglio o bazo se pueden realizar extendidos. En estos es posible identificar Leishmania donovani mediante microscopa de campo claro, con los colorantes habituales para hematologa, o microscopa de fluorescencia, empleando anticuerpos conjugados con fluorocromos. 1.2.2.2 Improntas El material obtenido mediante ciruga (p.ej., ganglios, bazo, hgado) puede emplearse para realizar improntas. Luego de obtener la pieza, se elimina la sangre superficial por aposicin sobre papel de filtro. Las improntas se tien con colorantes habituales para hematologa. 1.2.2.3 Cortes histolgicos Para microscopia ptica (de campo claro o de fluorescencia) o electrnica. Actualmente, algunos laboratorios tambin realizan tcnicas de biologa molecular sobre el material de biopsia (PCR e hibridizacin in situ), pero su empleo an no est normatizado.