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Estevia y Glucsidos de Esteviol

Propiedades, tcnicas, usos, exposicin, toxicologa,


efectos farmacolgicos







Prof. Dr. Jan M.C. Geuns
Laboratory of Functional Biology,
Kasteelpark Arenberg 31
B-3001 Leuven, Belgium
Tel.:+32-16 321510 Fax: +32-16321509
e-mail: Jan.Geuns@bio.kuleuven.be





Abreviatura propuesta




El usar SV por esteviol, permite la utilizacin de las siguientes abreviaturas:
SVgly para glicsidos de esteviol; SVglu para glucurnido de esteviol;
SVeq para equivalentes de esteviol; SM para monsido de esteviol ; SVE
para esteviol 19-ster; ST: estevisido, RebA G: Rebaudisido A G; SB
esteviolbisido; DulA: dulcsido A; Rub: rubussido



Tabla de contenidos

Terminologa
Sumario

Parte I. GLICSIDOS DE ESTEVIOL
Captulo 1. Identificacin
1.1 Datos Espectroscpica
1) RMN
2) CL-EM
3) IR
4) UV
1.2 Descripcin de estado fsico
1.3 Dulzura
1.4 Estndares Industriales
Captulo 2. Pureza de los glicsidos de esteviol: especificacin
2.1 Impurezas: naturaleza, porcentaje y mtodos de determinacin
2.2 Caractersticas Microbiolgicas
2.3 Especificaciones qumicas y microbiolgicas propuestas
Captulo 3. Proceso de fabricacin
Captulo 4. Tcnicas vlidas de anlisis
4.1 Glicsidos de esteviol
1) Aislamiento de los estndares de SVgly
2) Coeficientes de Extincin Molar de SVgly y esteviol
3) Curvas de calibracin de SVgly: Linealidad y rango de medidas
4) Medida de SVgly en la presencia de impurezas
5) Lmite de deteccin, lmites de cuantificacin, rangos de medida
6) Certeza o Veracidad
7) Precisin
8) Eleccin de columnas: C18 vs. NH
2

9) Organizacin de una prueba de Round-robin
10) Cmo mejorar el anlisis de SVgly
4.2 Anlisis de Esteviol (SV)
1) Sntesis del Estndar Interno dihidroisiteviol
2) Derivacin de IS y SV













































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Parte II. USO DE TCNICAS VLIDAS

Captulo 5. Extraccin de Hojas de Esteviol
5.1 Anlisis de Glicsidos de Esteviol
5.2 Anlisis de Esteviol
Captulo 6. Control de Calidad de SVgly
6.1 Observaciones generales
6.2 Mtodos
1) Contenido en agua
2) Metales pesados
3) Herbicidas y pesticidas
6.3 Anlisis de SVgly
6.4 Anlisis de Esteviol
Captulo 7. Mtodos de anlisis en alimentos
7.1 Anlisis de bebidas sin alcohol
1) Glicsidos de Esteviol
2) Esteviol
7.2 Anlisis de bebidas alcohlicas
1) Glicsidos de Esteviol
2) Esteviol
7.3 Extraccin de comidas complejas
1) Glicsidos de Esteviol
2) Esteviol
7.4 Sntesis de un Estndar Interno
Captulo 8. Reaccin y destino en los alimentos
8.1 Estabilidad, productos de degradacin o productos de reaccin
8.2 Posibles efectos en nutrientes
Captulo 9. Casos de necesidad y usos propuestos
9.1 Necesidad tecnolgica
1) Uso previsto
2) Beneficio al consumidor
3) Beneficios para la salud
4) Atencin al cliente
5) Impacto por la autorizacin de glicsidos de esteviol en Europa
6) Beneficios sociales
7) Beneficios econmicos e industriales
8) Impacto ambiental
9.2 Cantidad a ser aadida (niveles de uso previstos o mximos niveles
de uso) Residuos en los alimentos
9.3 Eficacia del efecto previsto en el nivel propuesto











































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Captulo 10. Exposicin
10.1 Exposicin humana conocida o anticipada al aditivo propuesto
- Peor caso hipottico: todo el azcar remplazado por SVgly
10.2 Clculos de exposicin
1) Fuentes de exposicin humana
2) Evaluacin de la exposicin alimentaria
3) Evaluacin de grupos de poblacin
4) Niveles de concentracin de los glicsidos de esteviol
5) Escenarios para la evaluacin de la exposicin alimentaria
6) Resultados
7) Caracterizacin de riesgos
Captulo 11. Autorizaciones existentes y evaluaciones
11.1 Autorizacin nacional existente y evaluaciones y/o evaluaciones por
otros rganos

Parte III. DATOS TOXICOLGICO

Estructura general para la evaluacin toxicolgica de aditivos
alimentarios
Protocolos de estudio

Captulo 12. Metabolismo/ Toxicokinesia
12.1 Absorcin
1) Ensayos In vitro
2) Absorcin en animales y voluntarios
3) Conclusiones de los estudios de absorcin
12.2 Metabolismo en los ensayos in vitro
1) Metabolismo por bacterias del colon
2) Metabolismo por bacterias de la soja
12.3 Metabolismo in vivo
1) Animales
2) Voluntarios
3) Comentarios y conclusiones
Captulo 13. Toxicidad: aguda y subcrnica
13.1 Toxicidad aguda
13.2 Toxicidad subaguda
13.3 Conclusin
Captulo 14. Genotoxicidad
14.1 Induccin de mutaciones de genes en bacteria
1) Glicsidos de Esteviol (Estevisido, rebaudisido A)
2) Esteviol











































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14.2 Induccin de mutaciones de genes en clulas mamferas in vitro
1) Glicsidos de Esteviol (estevisido, rebaudisido A)
2) Esteviol
14.3. Induccin de la aberracin cromosmica en clulas mamferas
1) Glicsidos de Esteviol (estevisido, rebaudisido A)
2) Esteviol
Captulo 15. Toxicidad crnica y carcinogenicidad
15.1 Glicsidos de Esteviol (estevisido, rebaudisido A)
15.2 Esteviol
15.3 Conclusin
Captulo 16. Reproduccin y desarrollo de la toxicidad
16.1 Reproduccin
1) Estudios con glicsidos de esteviol
2) Resultados obtenidos con extractos de Estevia cruda
16.2 Toxicidad prenatal desarrollada
16.3 Toxicidad postnatal desarrollada
16.4 Aditivos para frmula infantil: caso especial
Captulo 17. Otros estudios
17.1 Bio-disponibilidad de nutrientes de la dieta
17.2 El estevisido y la caries
17.3 Efectos farmacolgicos
1) Bajada de presin sangunea
2) Efectos en niveles de glucosa en sangre
3) Efectos inmunolgicos
4) Efecto en Ateroesclerosis
5) Alergenicidad: problemas?
6) Glucurnido de esteviol: el principio activo?


PARTE IV. DISCUSIN GENERAL

Cantidad diaria recomendada
Literatura citada






















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Estevia y Glicsidos de Esteviol

Terminologa

Qu se quiere decir con Estevia - extractos crudos - Glicsidos de Esteviol -
Glicsidos de Esteviol modificados?

Estevia: en este libro emplearemos el trmino Stevia rebaudiana (Bertoni) o
simplemente Estevia para referirnos a las plantas o sus hojas secas. Existe
suficiente informacin acerca de la Estevia en el libro de Kinghorn (2002)
Kinghorn, AD (Ed) Stevia, gnero Stevia. Plantas Medicinales y Aromticas-
Perfiles Industriales, vol. 19. Taylor y Francis, London y NY pp 211, ISBN 0-415-
26830-3. El libro da una excelente descripcin general de la botnica,
constituyentes dulces o no dulces, fotoqumica, investigaciones sintticas, mtodos
para mejorar el sabor de los edulcorantes y el uso de edulcorantes en Japn y
Corea. En Europa, se decidi que la Estevia es un Alimento Novel, aunque se
puede comprobar que grandes cantidades de ste han sido importadas y
consumidas en Europa. Este punto se trata ms en detalle en un captulo posterior.

Glicsidos de Esteviol: son edulcorantes purificados de hojas de Estevia. La pureza
de la mezcla (que contiene, en su mayora, de los edulcorantes estevisido y
rebaudisido A) debe ser >95 % sobre una base de peso seco. Rebaudisido A de
alta pureza (>95 %) tambin puede ser encontrado en el mercado. Tiene un mejor
sabor que el estevisido y los dems edulcorantes que aparecern a lo largo de este
libro. En algunos pases, la mezcla de glicsidos de esteviol se denomina
estevisidos. Sin embargo, este trmino es confuso y debe ser evitado ya que el
estevisido es un componente especfico de la mezcla.

Pureza de glicsidos de esteviol. La pureza de los glicsidos de esteviol se define
como la suma de los glicsidos de esteviol presentes (en una mezcla) y expresados
en base a su peso seco.
Una pureza de >95 % quiere decir que la suma de los glicsidos de esteviol
alcanzan por lo menos un 95 % de la muestra seca. El peso seco correcto de una
muestra se obtiene tras secar la muestra hasta un peso constante y se realiza en
recipientes especiales de pesado (ver ms adelante).

Equivalentes del esteviol. Todos los edulcorantes tienen pesos moleculares
distintos, y se degradan hasta esteviol por la accin de las bacterias del colon. Por
tanto, JECFA (Joint Expert Committee for Food Additives, Comit de Expertos de
Aditivos Alimentarios) propuso emplear el trmino equivalentes del esteviol para
fijar una CDR de 0-4 mg de equivalentes de esteviol/kg de peso corporal; por
ejemplo, 10mg de estevisido o 12 mg de rebaudisido A/kg de peso corporal,
respectivamente.

Extractos crudos de Estevia: son los extractos impuros del agua u hojas
alcohlicas. Se venden como jarabes de Estevia. Su color es marrn oscuro.
Siguiendo el BfR (Instituto de Evaluacin de Riesgo) alemn, estos jarabes deben
ser excluidos de una aplicacin Alimentos Nuevos (Novel Food, NF). Esto hace la
situacin ms compleja, ya que estos jarabes pueden no ser considerados como
aditivos alimentarios.

Glicsidos de Esteviol modificados. Los glicsidos de esteviol modificados
enzimticamente son aquellos glicsidos a los que se les aadi unidades
adicionales de azcar por medio de enzimas. El sabor de la mezcla de estos
componentes es muy bueno. Sin embargo, su dulzura solo es 100 veces la de una
solucin del 0.4 % de sacarosa, mientras que los glicsidos de esteviol sin
modificar son unas 250-350 veces ms dulces. Hasta ahora, estos glicsidos de
esteviol modificados no estn incluidos en las autorizaciones para glicsidos de
esteviol. El uso de estos edulcorantes puede llegar a exceder las CDR de 0-4 mg de
equivalentes de esteviol.

Sumario

- A los glicsidos de esteviol se les ha asignado el nmero (E-) 960 por el Codex
Alimentarius.
- En la parte I del libro, se da una descripcin e identificacin detallada de los
diferentes glicsidos de esteviol, incluyendo los datos espectroscpicos, estado
fsico y la dulzura, comparados con un 0.4 % de sacarosa (Captulo 1). La
especificacin de la pureza de los glicsidos de esteviol del 95 % se explica en el
Captulo 2 y un esquema general del proceso de fabricacin se detalla en el
Captulo 3. El Captulo 4 est dedicado las tcnicas vlidas para el anlisis de
glicsidos de esteviol. Esto permite a los inspectores de alimentos controlar la
calidad de los glicsidos de esteviol en el mercado.
Adems, la Industria de la Estevia se beneficiar de estas tcnicas, ya que el
anlisis de los glicsidos de esteviol debe ser preciso. De esta manera, solo estar
disponible en el mercado un producto de calidad. El desarrollo de un estndar
interno (IS) tambin est descrito, lo que posibilitar correcciones de prdidas
durante los procesos de purificacin cuando se llevan a cabo anlisis de alimentos
complejos.
- La Parte II describe el uso de las tcnicas vlidas para la extraccin de hojas
(Captulo 5), el control de calidad de los glicsidos de esteviol (Captulo 6) y el
anlisis de diferentes alimentos, bebidas y comidas complejas (Captulo 7). El
Captulo 8 est dedicado a la reaccin y destino de los glicsidos de esteviol en los
alimentos, mientras que el Captulo 9 trata sobre las necesidades tecnolgicas y los
usos propuestos del edulcorante. En el Captulo 10, la exposicin se calcula
haciendo uso de 2 escenarios: un peor caso (todo el azcar reemplazado) y uno ms
realista de un 30 % de sustitucin del azcar.
- La Parte III expone una encuesta detallada sobre los datos toxicolgicos. Una
gran cantidad de estudios toxicolgicos de glicsidos de esteviol se han llevado a
cabo por diferentes laboratorios en diferentes pases. Casi todos los estudios
confirman la seguridad de los glicsidos de esteviol como aditivo para los
alimentos.

- La absorcin y los estudios del metabolismo (Captulo 11) revelaron que la
absorvancia de glicsidos de esteviol es extremadamente baja. Las enzimas del
tracto digestivo no son capaces de degradar glicsidos de esteviol en esteviol,
tampoco lo es el jugo gstrico. Solamente el grupo de bacterias del colon son
capaces de degradar glicsidos de esteviol en esteviol. Parte del esteviol es
expulsado con las heces, el resto es absorbido por el colon y glucuronado en el
hgado. Los riones filtran el glucurnido de esteviol en la orina y es expulsado.
No existen acumulaciones de derivados en el cuerpo. Adems del glucurnido de
esteviol, ningn otro derivado pudo ser detectado. En la sangre, solo fue detectado
el glucurnido de esteviol, pero no esteviol libre. Sin embargo, el grupo de
investigacin de Miln demostr la presencia de estevisido en sangre, pero las
cantidades fueron muy pequeas para ser cuantificadas.

- Los estudios de toxicidad aguda y crnica revelaron que los glicsidos de esteviol
tienen una toxicidad muy baja. No se observ ninguna toxicidad en las pruebas
crnicas (Captulo 12).

- Los estudios de genotoxicidad (Captulo 13) mostraron que los glicsidos de
esteviol no indujeron mutaciones de genes de las bacterias. Sin embargo, despus
de la activacin metablica, se obsev que metabolitos de esteviol desconocidos
causaron mutaciones en una cepa muy sensitiva de Salmonella typhimurium
TM677, pero no en otras cepas o en otras bacterias. Los glicsidos de esteviol no
indujeron mutaciones en genes de clulas mamferas in vitro. No obstante, despus
de la activacin metablica del esteviol (99 % de pureza), se encontr cierta
mutacin de genes y aberracin cromosmica en los fibroblastos del pulmn de un
hamster chino en concentraciones altas, por encima de los 300 g/mL, sin
embargo, estas jams sern alcanzadas en el plasma ya que las administraciones de
altas dosis, hasta 750 mg diarios, no revelaron trazas de esteviol en la sangre
(lmite de deteccin de derivados del esteviol analizados: 100 pg). Adems, el
metabolismo de los roedores y los humanos es totalmente diferente. En el ensayo
de mutacin de genes (MOLY) no hubo signos de acrecentamiento de la frecuencia
de mutacin por esteviol en el linfoma L5178Y tk+/--3.7.2C del ratn, mientras
que el control positivo mostr la estimulacin esperada. Los glicsidos de esteviol,
as como el esteviol, fueron inactivos en todas las pruebas de aberracin
cromosmica llevadas a cabo.
Debido al resultado positivo de las dos pruebas de genotoxicidad a concentraciones
relativamente altas, el esteviol libre tambin fue testado in vivo en diferentes
modelos de animales. No hubo seales de efectos nocivos. Esto se corresponde
bien con los estudios de metabolismo hechos con voluntarios donde no hubo restos
de esteviol en sangre. Por ello, la conclusin general es que el uso de glicsidos de
esteviol como edulcorante es seguro. En los modelos de animales se demostr que
grandes dosis de glicsidos de esteviol inhiben la formacin de tumores. Sin
embargo, debido a la absorcin extremadamente reducida a nivel intestinal y las
pequeas cantidades requeridas para propsitos edulcorantes, las ventajas de
glicsidos de esteviol orales como agentes quemopreventivos parece ser menos
relevante.

- En los estudios de toxicidad crnica y carcinogenicidad (Captulo 14) con
glicsidos de esteviol y esteviol libre, y usando diferentes modelos de animales, no
se detectaron efectos nocivos.

- No hubo efectos detectables de los glicsidos de esteviol o esteviol en
reproduccin, ni toxicidad en el desarrollo embrionario (Captulo 15). El estudio
realizado por Planas y Ku (1968) llev, en el pasado, a cierta confusin y
controversia en cuanto a temas de fertilidad. Sin embargo, estos resultados fueron
refutados por Shiotsu (1996) quin realiz experimentos ms fiables con muchos
ms animales. Muchos otros autores han descrito la ausencia de efectos de los
glicsidos de esteviol en la reproduccin masculina y femenina. La importancia de
la administracin de nicamente una gran dosis de extracto de Estevia cruda a ratas
jvenes debe ser cuestionada. En este caso, extractos de hojas frescas de Estevia en
cantidades superiores al 50 % del peso del cuerpo fueron administradas
diariamente a ratas jvenes. En muchos estudios sobre la toxicidad en el desarrollo
prenatal, los glicsidos de esteviol y esteviol no hicieron efecto, incluso cuando se
administraron dosis muy elevadas. Tampoco hubo efecto alguno en los estudios de
la toxicidad en el desarrollo postnatal. El uso de los glicsidos de esteviol no est
destinado para frmulas infantiles, frmulas de seguimiento o papillas.

- Muchos estudios del Captulo 16 revelaron que no existen efectos en la
biodisponibilidad de los nutrientes en una dieta. Hay un efecto claramente
beneficioso en el uso de glicsidos de esteviol en cuanto a la formacin de caries,
probablemente debido a la sustitucin de la sacarosa de los alimentos por una
sustancia no cariognica.
Aunque puedan aparecer efectos farmacolgicos al ingerir grandes dosis de
glicsidos de esteviol como la bajada de glucosa en la sangre, la bajada de
hipertensin y la prevencin de ateroesclerosis, estos no ocurrirn cuando se tomen
pequeas dosis de glicsidos de esteviol para propsitos edulcorantes. Para
provocar estos efectos beneficiosos, se deben administrar grandes cantidades (por
ejemplo, 250-500mg tres veces al da, en cpsulas). Los glicsidos de esteviol no
suelen acentuar problemas nutricionales, microbiolgicos, toxicolgicos y/o
alergnicos.

La parte IV es una discusin general.

- La evaluacin de la exposicin a una dieta que contenga glisidos de esteviol
estim que para la mayora de consumidores la CDR (0-4 mg equivalentes de
esteviol/Kg de peso corporal) no se exceda cuando los glicsidos de esteviol se
aadan al rango de alimentos solicitados en la aplicacin. La exposicin estimada
para altos consumidores (nios de 2-6 aos) excedi marginalmente la CDR. Sin
embargo, esta estimacin estaba basada en hiptesis muy conservadoras y cuando
la estimacin de la exposicin alimentaria se llev a cabo mediante niveles de
glicsidos de esteviol ms realistas, se estim que una exposicin alimentaria para
altos consumidores (nios de 2-6 aos) solo alcanzaba el 50 % de la CDR.
Adems, el valor de la CDR es bastante bajo y se deberan considerar valores ms
elevados, como se sugiere en la tabla 42.

- Los estudios toxicolgicos revelan que los glicsidos de esteviol son seguros y
deben ser autorizados como aditivos alimentarios en Europa. No existen
afectaciones en cuanto a salud pblica y seguridad en el uso de glicsidos de
esteviol cuando son empleados como aditivos alimentarios en los niveles mximos
propuestos en la tabla 28. Habr un continuo seguimiento de calidad en el mercado
europeo. Adems el grupo de glicsidos de esteviol no es un aditivo alimentario
novedoso y ya ha sido aprobado en muchos pases y continentes. Se estima que
ms de 150 millones de personas consumen diariamente glicsidos de esteviol
como aditivos o como componentes de hojas secas de Estevia.
- La introduccin de glicsidos de esteviol en el mercado europeo podra tener
muchos beneficios para el consumidor mediante una reduccin de ingesta de
energa, la posibilidad de consumir productos totalmente naturales y seran posibles
las comidas completamente orgnicas. Adems los glicsidos de esteviol son muy
dulces, y solo se necesitan en pequeas cantidades. Los glicsidos de esteviol son
muy estables y pueden ser cocinados y horneados a temperaturas de 200 C sin
llegar a su descomposicin. Son incluso seguros para pacientes de fenilcetonuria
(PKU).

- Tambin habr un impacto beneficioso para toda la UE; como beneficios sociales,
beneficios de salud por medio de la reduccin de costes de cuidado mdico, y por
supuesto habrn grandes beneficios econmicos e industriales. A parte de la
posibilidad de cultivar Estevia en regiones donde se cultiva ya el tabaco, se crearn
nuevos puestos de trabajo en la agronoma europea, en institutos de investigacin y
en la industria alimentaria. Tambin hay un impacto beneficioso en el medio
ambiente, ya que se puede hacer uso de tcnicas sostenibles para el cultivo y
procesamiento de la Estevia. Asimismo, las compaas europeas ganarn
competitividad con respecto a compaas extranjeras al usar y desarrollar productos
derivados de la Estevia, sobretodo ya que los glicsidos de esteviol ya estn
aprobados en un gran nmero de pases.

- En el 23 de mayo del 2007, los Estndares de Alimentos de Australia Nueva
Zelanda (FSANZ) decidieron publicar el borrador de su informe de evaluacin
incluyendo una autorizacin en su pgina web. En este documento, ellos escriben
explcitamente que no esperaron a que JECFA hubiera hecho estudios adicionales
que evaluaran posibles efectos farmacolgicos de los glicsidos de esteviol, ya que
FSANZ consider que la seguridad del uso de glicsidos de esteviol como
edulcorante estaba completamente probada. El Dr. OCalaghan (2006) tambin
concluy que no haba riesgos en el uso de glicsidos de esteviol. Realiz una
revisin de la literatura publicada en efectos farmacolgicos. Como especialista en
hiper- e hipotensin, concluy que no haba ningn riesgo en el empleo de Estevia,
ni si quiera en el caso de hipotensin. FSANZ ha concluido que los glicsidos de
esteviol son bien tolerados y es improbable que aparezcan efectos secundarios en la
presin sangunea, glucosa de la sangre u otros parmetros en sujetos normales,
hipotensos o diabticos en dosis hasta 11mg/kg peso corporal/da (o sobre 4 mg
SVeq/kg peso corporal). La exactitud de la base de datos existente y un nuevo
estudio en humanos proporciona una base para revisar los factores inciertos que
fueron empleados por JECFA para deducir las CDR temporales para glicsidos de
esteviol en 2005. En particular, la evidencia en torno a los efectos farmacolgicos
de los glicsidos de esteviol en la presin sangunea y en la glucosa de la sangre ha
sido reforzada, por lo que el factor de seguridad adicional por incertidumbre
relativa a los efectos en individuos normotensivos o diabticos no es necesaria. Por
ello la CDR de 0-4mg de equivalentes de esteviol/kg peso corporal/da, deducida al
aplicar un factor de seguridad 100x al NOEL de 970 mg/kg peso corporal/da
(equivalente a 383 mg/kg peso corporal/ da esteviol) en un estudio a una rata que
dur 2 aos, ha sido establecida.

- En 2003, La Stevia rebaudiana fue aprobada para su uso como ingrediente activo
y/o excipiente en las listas de medicinas en Australia (FSANZ, 2007). El
estevisido est permitido solo acompaado del uso de la Stevia rebaudiana (y no
est aprobado como ingrediente por s solo). No se han reportado efectos adversos
conocidos por el estevisido a la Administracin Teraputica de Sustancias hasta la
fecha.
Esta importante informacin viene del propio FSANZ.

- A partir de una extensiva revisin de la literatura cientfica, se puede sugerir un
valor para la CDR entre 0 y 10 mg de equivalentes de esteviol/kg peso corporal.
JECFA (2008) recomend una CDR final de 0-4 equivalentes de esteviol (con
factor de seguridad 100x). FSANZ fij un valor de 0-4 mg de equivalentes de
esteviol/kg peso corporal. Finalmente, en diciembre de 2008, la FDA
(Administracin de Alimentos y Frmacos) (EEUU) acept el estado GRAS del
rebaudisido A y, en 2009, la mezcla de glicsidos de esteviol. En septiembre de
2009, las autoridades francesas autorizaron el rebA (con pureza >97 %) como
aditivo de alimentos, excluyendo su uso como edulcorante de mesa. Sin embargo,
en enero de 2010, rebA fue tambin autorizado como un edulcorante de mesa. El
14 de abril del 2010, EFSA public una opinin positiva sobre los glicsidos de
esteviol y el rebaudisido A.

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