PRTICA : TCNICAS DE CONTAGEM

OBJETIVOS:
Determinar a concentrao de clulas de leveduras pelo uso da seguinte tcnica:
Contagem direta ao microscpio (pelo uso da cmara de Neubauer).

1. Concentrao Celular e Contagem de Clulas Viveis de Leveduras pelo Uso da
Cmara de Neubauer


A contagem direta por microscpio, a mais rpida, e levada a efeito com a
contagem de organismos num volume conhecido da cultura. Esta enumerao feita
com o auxlio de lminas espessas, conhecidas como cmaras de contagem. As mais
comuns so as de Petroff-Hausser, Neubauer e as de Helber. estas cmaras apresentam
uma rea reticulada, com pequenos quadrados de superfcie conhecida. Fazendo parte
do conjunto, existe uma lamnula que recobre os pequenos quadrados, de modo que a
altura destes lamnula conhecida.

No nosso experimento, as leveduras sero contadas numa cmara de Neubauer,
que apresenta uma rea dividida em quadrados com 1/400mm
2
; a cmara coberta com
uma lamnula, deixando uma altura de 1/10mm, i.., de cada quadrado lamnula.
Assim sendo o volume que fica acima de cada quadrado de 1/4000 mm
3
.

Esta contagem inclui organismos viveis e mortos, sendo denominada de
contagem total de clulas.

Este mtodo de contagem direta, tem a vantagem de fornecer um resultado
quase imediato, no entanto tem a desvantagem de no se ter a distino entre clulas
vivas e mortas.


Material

- Microrganismo: Cultura de Saccharomyces cervisiae
- Reagentes: Soluo salina fisiolgica (0,85% NaCl)
-Equipamentos:Microscpio tico comum, Cmara de contagem de Neubauer
Bico de Bunsen
- Diversos: Pipeta Pasteur


Procedimento Experimental

- Pipeta 1ml da amostra de suspenso celular para um tubo de ensaio;
- Adicionar 1ml de corante celular (soluo 0,02% de azul de metileno em soluo a
2% de citrato de sdio)
- Homogeneizar e deixar em repouso por 15 minutos
- Adicionar com uma pipeta Pasteur ou similar, uma gota da suspenso da cultura de
levedura sobre a rea reticulada da cmara;
- Ajustar a cmara platina do microscpio;
- Colocar a lamnula sobre a gota. Alternativamente, pode-se colocar primeiro a
lamnula, e deixar-se que a suspenso do microrganismo, que sai da pipeta, escorra
por ao capilar sob a lamnula;
- Esperar cerca de dez minutos, at que o material sedimente;
- Usando a objetiva de 40-45X, contar as leveduras em cerca de 10 quadrados
dispostos em X (ver figura 1).

OBSERVAO

- Na contagem das clulas devem ser desprezados os brotamentos a menos que seu
tamanho seja maior que metade da clula original;

- O nmero de clulas por quadrado deve estar situado entre 20 e 30.

- Caso a concentrao no campo tico seja superior faixa desejada, fazer diluies
da suspenso original e em seguida corar as clulas com a soluo de azul de
metileno;

- As clulas situadas sobre as linhas divisrias esquerda e abaixo dos quadrados, so
contadas como pertencentes quele quadrado.


CLCULO:

Concentrao Celular

- Calcular o nmero de leveduras/mL, contidas em uma suspenso utiliza-se a
seguinte frmula

Concentrao Celular (leveduras/mL) = n x 25000 x diluio

onde n= nmero de clulas dos quadrados


Exemplo:
n = 232

diluio 1:100

Concentrao celular = 232 x 25000 x 100 = 5,8 x 10
8
clulas/mL


VIABILIDADE CELULAR (%) = N
v
x 100
N
t

Onde: N
v
= nmero de clulas vivas,
N
t
= nmero total de clulas (vivas e mortas)


























FIG.1- Cmara de Neubauer





6 1
2
3 / 8
4
5
7
9
10