UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ

M. en C. Emi l i o Cl ar k e Cr es po
Coordinador de la Academia de Biologa
D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias
Coordinador del Programa de Biologa
Dr. Alejandro Martnez Martnez
e!e del Departamento de Ciencias "umico#Biol$gicas
M.C. %ugo &taines 'rozco
Director del (nstituto de Ciencias Biom)dicas
Aprobados por la Academia de Biologa* +,--
Manual de Pr.cticas Pag. + de ++
/aboratorio de Enzimologa
Dra. 0lorinda im)nez 1ega.
P2AC3(CA 4o. -
PREPARACION DE SOLUCIONES DE CONCENTRACION
DEFINIDA Y SOLUCIONES
AMORTIGUADORAS (BUFFERS)
'bjetivo
El objetivo general de la siguiente practica es el estudiante aprenda a preparar
disoluciones en concentraciones de!inidas en porciento* normalidad* molalidad 5
molaridad.
Materiales
4aCl Probeta Papel encerado
Matraces
volum)tricos
4a'% Pipetas
Placa de agitaci$n 1asos de precipitado
%C/ Balanza Barras magn)ticas 0os!ato de 4a
Procedimiento
(. Disoluciones de concentraci$n en peso
A) Preparaci$n de 6, m/ de una soluci$n de 4aCl al ,.78 9p:v;
< Pesar 4aCl en la balanza
< Disolver los = g de 4aCl en agua destilada 9apro>. ?, m/;
Colocar la disoluci$n de 4aCl en un matr.z volum)trico de 6, m/ 5 a!orar
con agua destilada.
B) Preparaci$n de 6, m/ de una disoluci$n de alcohol etlico al @,8 9v:v;
Manual de Pr.cticas Pag. ? de ++
/aboratorio de Enzimologa
Dra. 0lorinda im)nez 1ega.
< Con base a la concentraci$n del alcohol etlico comercial determinar el
volAmen necesario para tener ?6 m/ de alcohol etlico.
Medir el alcohol en una probeta
< Colocar el alcohol etlico en un matr.z volAmetrico de 6, m/ 5 a!orar con
agua destilada.
((. Disoluciones de Concentraci$n molar
A) Preparaci$n de +,, m/ una disoluci$n de 4a'% - M
Nota: /os .cidos 5 los .lcalis son agentes corrosivos. E>treme precauciones
para su manejo* evite todo el contacto con la piel 5 ojos.
Encontrar el peso molecular de la sustancia.
< Determinar los gramos reBueridos de 4a'% para preparar +,, m/ de 4a'% -
M.
< Pese el 4a'% reBuerido 5 colocaro en un vaso de precipitado de 6,, m/
para su disoluci$n con agua destilada 9apro>. -6, m/;.
< Colocar la disoluci$n en un matraz volAmetrico de +,, m/ 5 a!orar con agua
destilada.
B) Preparaci$n de -,, m/ de una disoluci$n de 4a'% +6 mM a partir de la
disoluci$n de 4a'% - M
Aplicar la !$rmula C- > 1- C C+ > 1+ para calcular los m/ de 4a'% - M
necesarios para preparar -,, m/ de una disoluci$n de 4a'% +6 mM
V1= (C2 x V2)/ C1 DondeD C-C Concentraci$n inicial
1-C 1olumen inicial
C+C Concentraci$n !inal
1+C 1olumen !inal
Manual de Pr.cticas Pag. E de ++
/aboratorio de Enzimologa
Dra. 0lorinda im)nez 1ega.
Medir el volAmen reBuerido de 4a'% - M con una pipeta 5 colocarlos en un
matr.z volAmetrico de -,, m/ 5 a!orar con agua destilada.
(((. Disoluciones de Concentraci$n 4ormal
A) Preparaci$n de %C/ - 4
Conocer la concentraci$n del %C/ concentrado comercial.
Calcular la cantidad de %C/ conc. reBuerido para preparar 6, m/ de %Cl -
4.
Colocar el agua destilada 9apro>. ?, m/; en un vaso de precipitado.
Con cuidado agregar poco a poco la cantidad de %C/ concentrado
reBuerido.
Nota: Siempre se agrega el cido al agua nunca el agua al cido.
Agitar en la placa de agitaci$n
Colocar la disoluci$n en un matr.z volum)trico de 6, m/ 5 a!orar con agua
destilada.
Disoluciones de concentraci$n en peso
A1) Preparaci$n de +,, m/ de amortiguador de !os!atos ,.+ M 9p% @.,; Preparar
las soluciones stock de !os!ato monos$dico 5 !os!ato dis$dico 9,.+ M;D
Disolver +@.F g 9,.+ moles; de !os!ato de sodio monob.sico monohidratado 5
a!orar a un litro con agua destilada 9&oluci$n =;.
Disolver +G.E g 9,.+ moles; de !os!ato de sodio dib.sico 5 a!orar a un litro de
con agua destilada 9soluci$n H;.
Mezclar cantidades necesarias segAn la tabla para preparar +,, m/ de
amortiguador de !os!atos 9,.+ M; p% @.,
Manual de Pr.cticas Pag. 6 de ++
/aboratorio de Enzimologa
Dra. 0lorinda im)nez 1ega.
Cantidades Bue deben mezclarse de las soluciones I=J 5 IHJ para obtener el
p% deseado en el amortiguador de !os!atos.
! "#$%#"&'o
(L '#
)
(L '# Y
6.G 7+., G.,
F., G@.@ -+.?
F.+ G-.6 -7.6
F.E @?.6 +F.6
F.6 FG.6 ?-.6
F.F F+.6 ?@.6
F.G 6-., E7.,
@., ?7., F-.,
@.+ +G., @+.,
@.6 -G., GE..,
n Checar el p% de la disoluci$n resultante 5 ajustar si es necesario.
2esultados
Desarrollar los c.lculos Bue realizaron para preparar las soluciones.
Discusi$n
Bibliogra!a
Manual de Pr.cticas Pag. F de ++
/aboratorio de Enzimologa
Dra. 0lorinda im)nez 1ega.
P2AC3( CA 4o. +
CE432( 0KLAC( M4
'bjetivo
Conocer el !undamento de la centri!ugaci$n como t)cnica b.sica en la
separaci$n 5 separar !racciones de e>tractos biol$gicos variando la 0uerza de
Centri!ugaci$n 920C;.
Materiales 5 2eactivos
3ubos Eppendor! para microcentri!uga re!rigerada de -.6 m/ de capacidad
3ubos c$nicos para centri!uga clnica de -6 m/ de capacidad
3ubos para ultracentri!uga de -, m/ de capacidad
Pipetas de trans!erencia desechables
Material biolgico
E>tracto de %igado de pollo
Procedimiento
Centri!ugaci$n bajo condiciones constantes de muestras de di!erente origen.
1. Descongelar los homogenados obtenidos por di!erentes tratamientos
9mortero* perlas de vidrio* sonicaci$n 5 homogenizador de tejidos
IP'/H32'4J; de higado de pollo.
2. Agitar los homogenizados 5 colocar -.+ m/ de muestra en tubos de
microcentri!uga de -.6 m/ 9preparar un tubo del mismo peso para
eBuilibrar los tubos en la centri!uga;.
3. Colocar los tubos de centri!uga 9previamente marcados; en el rotor de la
microcentri!uga re!rigerada Eppendor! 9cuidando eBuilibrar todos los tubos
correctamente;.
1. Colocar la tapa 5 establecer las condiciones de centri!ugaci$n a -,*,,,
rpm* durante 6 minutos a 6 NC.
Manual de Pr.cticas Pag. @ de ++
/aboratorio de Enzimologa
Dra. 0lorinda im)nez 1ega.
5. (niciar la centri!ugaci$n 5 recuparar el sobrenadante en recipientes limpios
5 desechar el sedimento.
6. Determinar densidad $ptica del sobrenadante a 6G, nm.
Centri!ugaci$n bajo di!erentes condiciones de un e>tracto biol$gico.
1. Colocar ? m/ de e>tracto de higado de pollo en tubos c$nicos para
centri!uga de gabinete Beckman re!rigerada. &iguiendo las
recomendaciones anteriores* centri!ugar esta muestra a ?6,, rpm* -, min 5
6NC.
1. Colocar ? m/ 9-.6 m/ por tubo; de de higado de pollo en tubos 9+; para
microcentri!uga 9Eppendor!;. &iguiendo las recomendaciones anteriores
centri!ugar esta muestra a -6*,,, rpm por -, min a 6NC.
2. Colocar ? m/ de e>tracto de de higado de pollo en tubos para la
ultracentri!uga Beckman re!rigerada. &iguiendo las recomendaciones
anteriores* centri!ugar esta muestra a ?,*,,, rpm* por -, min a 6N.
2. Kna vez centri!ugados los e>tractos de de higado bajo las di!erentes
condiciones* recuperar el sobrenadante de la manera anteriormente
descrita 5 medir su densidad $ptica a 6G, nm utilizando agua destilada
como blanco* para calibrar el espectro!ot$metro.
3. 2eportar los resultados en un cuadro comparativo entre el m)todo de
centri!ugaci$n 5 la densidad $ptica a 6G, nm.
4. Calcular las unidades de 20C gravitacionales alcanzadas para cada caso*
de acuerdo al nomograma Bue se ane>a.
2esultados
Conclusiones
Bibliogra!a
Manual de Pr.cticas Pag. G de ++
/aboratorio de Enzimologa
Dra. 0lorinda im)nez 1ega.
P2AC3( CA 4o. ?
DETERMINACIN DE PROTE*NAS MEDIANTE
LA TECNICA DE BRADFORD
Por medio de la siguiente pr.ctica el alumno ser. capaz de elaborar una curva
de calibraci$n para cuanti!icar la concentraci$n de una protena.
Materiales
R#a+t&,o '# B"a'-o"'
Disolver -,, mg de Coomassie B#Blue L#+6, en 6, m/ de etanol por agitaci$n
con un magneto* cuando este per!ectamente disuelto adicionar -,, m/ de
ac.!os!$rico G68 5 a!orar a un - /t CK(DAD'OOO 9.cido P agua;
0iltrar con papel 9/isto para ser empleado;.
Almacenar a temperatura ambiente.
Agua
AlbAmina
Celdas para luz visible
Procedimiento
E.a/o"a+&01 '# +%",a at"01
-. A partir de una alcuota de protena de apro>imadamente E mg:m/ (C1)2
realizar las diluciones necesarias para tener alcuotas de 6,, u/ con las
siguientes concentraciones 9,.+* ,.E* ,.F* ,.G*-.,* -.+* -.E mg:m/;
Conc
9mg:m/;
C3
Microlitro
s
alcuota E
mg:ml V1
Microlitro
s
agua
1olumen
!inal 6,,
Q/ V3
,.+
,.E
,.F
-.,
-.+
+. Para la cuanti!icaci$n* se realizara* cada determinaci$n por duplicado.
?. Marcar para cada concentraci$n + tubos
Manual de Pr.cticas Pag. 7 de ++
/aboratorio de Enzimologa
Dra. 0lorinda im)nez 1ega.
4. Adicionar -,, Q/ de la protena de cada una de las concentraciones
conocidas
6. (ncluir un par de tubos sin muestra* intercambiar por agua 9ser. el control;
F. Adicionar - m/ de reactivo
@. (ncubar por 6 minutos a temperatura ambiente
G. Determinar absorbancia a 676 nm
9. Lra!icar la concentraci$n de protena 9mg:m/; en el eje = 5 lectura de
absorbancia 9676nm; eje H.
-,. Ktilizando el programa E>cel* realizar una regresi$n lineal de los datos 5
determinar la curva est.ndar para cuanti!icar.
(n!ormaci$n Adicional
1eri!icar Bue el material empleado se encuentre per!ectamente limpio 5a Bue
concentraciones mu5 bajas de detergentes pueden inter!erir en la reacci$n.
S%4ta1+&a4 +o(at&/.#4 +o1 B"a'-o"' 4aCl* MgCl* RCl* 94%E;+&'E* Etanol
S%4ta1+&a4 &1+o(at&/.#4 +o1 B"a'-o"': 3ris + M* Ac. Ac)tico* +#
Mercaptoetanol - M* &acarosa - M* Llicerol 77 8* ED3A ,.- M* 3riton =#-,,
,.- 8* &D& - 8* %emosol ,.- 8
2esultados 5 Discusi$n
Bibliogra!a
Manual de Pr.cticas Pag. -, de ++
/aboratorio de Enzimologa
Dra. 0lorinda im)nez 1ega.
P2AC3(CA 4o. E
ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA
EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES SDS5PAGE
O/6#t&,o
Conocer los principios 5 aplicaciones de la electro!oresis.
Materiales
&oluciones protecas
Marcadores de peso molecular
0uente de poder
C.mara de electro!oresis
Puntas de micropipeta
Papel absorbente
&oluc. Azul de Coomasie 9tinci$n; 9tabla ane>a;
&oluc. PALE#&D& 93abla ane>a;
Procedimiento
Preparacin del gel de corrimiento (1!")
1. /a preparaci$n del gel de separaci$n se e!ectAa de acuerdo a la tabla
ane>a
2. Kna vez polimerizado en el portagel* lavarlo 5 eliminar el e>ceso de agua
usando tiras de papel Shatman.
3. Preparar el gel de concentraci$n 9stacking gel; de acuerdo a la tabla
ane>a.
4. Kna vez llena la c.mara* colocar el peine evitando la !ormaci$n de
burbujas.
Manual de Pr.cticas Pag. -- de ++
/aboratorio de Enzimologa
Dra. 0lorinda im)nez 1ega.
5. Kna vez polimerizado el gel* lavarlo con agua destilada 5 llenarlo con
bu!!er de corrimiento 9running bu!!er;.
6. 2esuspender la bu!!er muestra en proporci$n -DE 9si es necesario agregar
m.s azul de bromo!enol 5 glicerol;.
7. Colocar las muestras 5 marcadores de peso molecular en los carriles
correspondientes.
8. 0ijar las condiciones de corrimiento en F, 1 hasta Bue entre la muestra al
gel de separaci$n* una vez dentro* cambiar a -,,#-+, 1 9+ h; 5 vigilar Bue
las muestras no salgan del gel.
9. Desprender cuidadosamente el gel de los vidrios dividir el gel.
10. 3eTir el gel utilizando Coomassie Blue* de acuerdo al protocolo ane>o.
11. Calcular el peso molecular de las protenas problema.
#eterminacin de la aparente masa molecular de las prote$nas
1. Mida la distancia total del principio al !in del gel de corrido
2. Mida la distancia del origen a cada uno de los est.ndares de peso
molecular
3. Mida la distancia de la protena desconocida 9=;
4. Para cada banda calcula la movilidad relativaD a : total* b : total
Ejemplo a C ,.6cm* total C E.7cm. ,.6:E.7 C ,.-
5. Calcular el logaritmo del peso molecular de cada est.ndar
6. %acer una gra!ica del log pM contra la movilidad relativa de los
est.ndares
1. /ocalizar la movilidad relativa de la protena de la protena desconocida*
e>trapolando el log PM correspondiente 5 calcular el antiligaritmo.
Manual de Pr.cticas Pag. -+ de ++
/aboratorio de Enzimologa
Dra. 0lorinda im)nez 1ega.
2esultados 5 Discusi$n
Bibliogra!a
Manual de Pr.cticas Pag. -? de ++
/aboratorio de Enzimologa
Dra. 0lorinda im)nez 1ega.
A4E='
Preparacin del Gel y Reactivos para la lectro!oresis en Geles de "#"$Poliacrila%ida
&"#"$P'G( &)ae%%li(
'( A+"&.a(&'a7B&4 (89: T2 3;<=:C)
Acrilamida -EF., g
4U4 E., g
Bismetilenacrilamida
6,, m/ de agua destilada. 0iltrar* guardar a EVC en la obscuridad. 1ida
media ?, das.
*( 1;> M T"&45!C.2 ! ?;?
3ris base 6E.E6 g
Agua destilada -6, m/
Ajustar el p% G.G con %Cl -., 4. A!orar a ?,, m/ con agua destilada.
Almacenar a E VC
+( 9;> M T"&45!C.2 ! <;?
3ris base F., g
Agua destilada F, m/
Ajustar el p% F.G con %Cl -., 4. A!orar a -,, m/ con agua destilada 5
almacenar a EVC.
'( -,8 9W:v; &D&
Disolver -, g de &D& en agua destilada* agitar suavemente 5 a!orar a -,,
m/
#( 19: (@7,) P#"4%.-ato '# A(o1&o
-,, mg de sul!ato de amonio. Adicionar - m/ de agua destilada* preparar en el
momento.
'( B%--#" '# +o""&(&#1to (>A)2 3> (M T"&42 1B3 (M G.&+&1a2 1: '# SDS2 !
?;8
3ris base E6., g
Llicina +-F ., g
&D& -6., g
4o incluir el &D& cuando se reBuiera hacer corrimiento bajo condiciones
nativas 9PALE;.
Manual de Pr.cticas Pag. -E de ++
/aboratorio de Enzimologa
Dra. 0lorinda im)nez 1ega.
A!orar a ? / con agua destilada. 4o ajustar el p% con acido o base.
Almacenar a EVC. Calentar a ?@VC antes de usar en caso de precipitaci$n.
G( Sa(.# B%--#"
Agua destilada E.E m/
,.6 M 3ris#%Cl p% F.G -., m/
Llicerol ,.G m/
-, 8 &D& -.F m/ ,.6 9W:v; azul de
bromo!enol en agua ,.+ m/
G., m/
Diluir la muestra por lo menos -DE con el sample bu!!er.
C&i el gel !uese en condiciones desnaturalizantes5 reductoras* se debera
adicionar ,.E m/ al sample bu!!er de beta#mercaptoetanol 5 posteriormente
de diluir -DE habra Bue calentar las muestras a 76 VC por E min. CCuando son
condiciones nativas 9PALE; omitir &D&*
,( P"#a"a+&01 '# PAGE5SDS 19:
Volmenes requeridos para dos placas del sistema Mini-Gel BioRad MR
Lel &eparador 9&eparating; 9-, m/;
Agua destilada E., m/
-.6 M 3ris#%Cl p% G.G +.6 m/
Acrilamida ?.? m/
-, 8 &D& ,.- m/
Persul!ato de amonio -,8 ,.- m/
3emed ,.,,E m/
Lel Concentrador 9&tacking; 9Em/;
Agua destilada +.@ m/
,.6 M 3ris#%Cl p% F.G ,.6 m/
Acrilamida ,.F@ m/
-, 8 &D& ,.,E m/
Persul!ato de amonio ,.-, m/
3emed ,.,,E m/
Manual de Pr.cticas Pag. -6 de ++
/aboratorio de Enzimologa
Dra. 0lorinda im)nez 1ega.
3inci$n de Leles de Poliacrilamida por Coomassie Blue
&oluciones Coomassie
Coomassie Blue#2+6, al ,.- 8
Disolver ,.- g en soluci$n de desteTido* dejar a temperatura ambiente hasta
el siguiente da* agregar el agua. 0iltrar 4&#("# antes de su uso.
&oluci$n A &oluci$n de !ijado : desteTido 9Metanol 6,8* Ac. Ac)tico -,8;
Procedimiento
-. &umergir el gel por -, minutos en soluci$n A.
+. 3eTir con la soluci$n de Coomassie.
?. DesteTir con la soluci$n A hasta Bue se observen las bandas.
4. Enjuagar con agua destilada.
Manual de Pr.cticas Pag. -F de ++
/aboratorio de Enzimologa
Dra. 0lorinda im)nez 1ega.
P2AC3(CA 4o. 6
COMPORTAMIENTO CINDTICO DE LA CATALASA
'bjetivo
Conocer los principios sobre el !uncionamiento de una enzima 5 su actividad
cataltica
Materiales
Mortero
%oja vegetal
0os!ato de potasio
Pero>ido de %idr$geno
Celdas de cuarzo
Espectro!ot$ metro
Procedimiento
1. ColoBue una hoja en el mortero adicionando + m/ de la soluci$n de
!os!ato de potasio ,.- M p% @.E 9!rio;.
+. %omogenizar
?. Centri!uge a -, ,,, > rpm durante 6 minutos
E. 2ecupere la !racci$n sobrenadante
6. (nicie sus mediciones
F. Calibrar con un blanco de 0os!ato de potasio
@. Establecer la cin)tica* bajo las siguientes condicionesD
8. Concentraci$n de sustrato variable 5 enzima constante a.
Concentraci$n de enzima variable 5 sustrato constante
Manual de Pr.cticas
Pag. -@ de ++ /aboratorio de
Enzimologa
Dra. 0lorinda im)nez 1ega.
a;b;
&ustrato Enzima
?@.6 Q/
-,
Q/
@6 Q/ -,
Q/
-,, Q/ -,
Q/
-6, Q/ -,
Q/
&ustrato
Enzima
@6 Q/
-, Q/
@6 Q/ +, Q/
@6 Q/ E, Q/
@6 Q/ G, Q/
9. Para cada uno de
los casos* se
adicionar. un
volumen de
amortiguador de
!os!ato de potasio
constante de G@6 Q/
9. Posteri
ormente se
adicionar.
el sustrato
5 enzima
mezclando
r.pidament
e con
a5uda de
un para!ilm
-,. Determinar su
cin)tica a +E, nm*
2esultados 5 Discusi$n
Bibliogra!a
Manual de Pr.cticas Pag. -G de ++
/aboratorio de Enzimologa
Dra. 0lorinda im)nez 1ega.
P2AC3( CA 4o. F
CRISTALIZACIN DE LISOZIMA
'bjetivo
Conocer los principios para la cristalizaci$n de protenas puras
Materiales
Placas de +E pozos
Plastilina
Cubreobjetos siliconizados
Aire comprimido
1aselina o silic$n en grasa
&oluciones
/izosima +,mM en Acetato de sodio p% E.F
4aCl -+8 en acetato de sodio +, mM
Acetato de sodio +, mM p% E.,* E.F 5 6.,
Procedimiento
1. Con a5uda de una jeringa colocar silicon en el borde de la placa* evitando
derramar material dentro del vaso precipitante.
2. 2ealizar un screening con variaciones de la soluci$n precipitante
conteniendo una concentraci$n de sales de +* E* F* G 5 -,8.
Acetato de
&odio
Acetato de
&odio
Acetato de
&odio
Acetato de
&odio
Acetato de &odio
+,mM p% E., P +,mM p% E., P +,mM p% E., P +,mM p% E., P +,mM p% E., P
4aCl + 8 4aCl E 8 4aCl F 8 4aCl G 8 4aCl -, 8
Acetato de
&odio
Acetato de
&odio
Acetato de
&odio
Acetato de
&odio
Acetato de &odio
+,mM p% E.F P +,mM p% E.F P +,mM p% E.F P +,mM p% E.F P +,mM p% E.F P
Manual de Pr.cticas Pag. -7 de ++
/aboratorio de Enzimologa
Dra. 0lorinda im)nez 1ega.
4aCl + 8 4aCl E 8 4aCl F 8 4aCl G 8 4aCl -, 8
Acetato de
&odio
Acetato de
&odio
Acetato de
&odio
Acetato de
&odio
Acetato de &odio
+,mM p% 6., P +,mM p% 6., P +,mM p% 6., P +,mM p% 6., P +,mM p% 6., P
4aCl + 8 4aCl E 8 4aCl F 8 4aCl G 8 4aCl -, 8
3. Aplicar - m/ de soluci$n precipitante conteniendo las concentraciones
preestablecidas en cada pozo.
?. Colocar el el cubreobjetos limpio ? gotas conteniendo +Q/* +Q/ 5 - Q/ de
la protena 5 adicionar - Q/* - Q/ 5 + Q/ de la soluci$n precipitante.
E. (nvertir el cubreobjeto conteniendo ? gotas de ?Q/ cada una sobre el pozo
de la placa previamente engrasado procurando Bue selle per!ectamente.
5. 2epetir todas las condiciones planeadas en el esBuema.
F. (ncubar a temperatura ambiente 5 vigilar el crecimiento de los cristales por
microscopia.
7. 2eportar sus observaciones
8. Describa en Bue consiste el m)todo de di!racci$n de un cristal por ra5os
=* en el cual usted me describa el seguimiento Bue debera de realizar a
su muestra una vez obtenido el cristal.
2esultados 5 Discusi$n
Bibliogra!a
Manual de Pr.cticas Pag. +, de ++
/aboratorio de Enzimologa
Dra. 0lorinda im)nez 1ega.
P2AC3( CA 4o. @
PURIFICACIN DE LISOZIMA DE !UEVO BASADA EN
EL CAMBIO DE FUERZA INICA EN LOS
AMORTIGUADORES
'bjetivo
El alumno ser. capaz de aplicar los conocimientos b.sicos para la puri!icaci$n
de enzimas con actividad biol$gica.
Materiales
Brad!ord
Llicina#4a'% ,.- M p% -,.,
Llicina#4a'% ,.- M p% -,., P 4aCl ,.6M
Matriz de intercambio cati$nico
Procedimiento
1. &eparar la clara del huevo
+. 0iltrarla a trav)s de tela para !ibra cruda o gasa de poro !ino 9X;
?. /a clara diluirla con +,,m/ de amortiguador Llicina#4a'% ,.- M p% -,.,
E. %omogeneizar bien 5 !iltrar nuevamente para eliminar partculas s$lidas 9X;
5. Pasar esta soluci$n a !lujo lento a trav)s de una columna de intercambio
cati$nico 9-, a +, m/ matriz; previamente eBuilibrada con amortiguador
Llicina#4a'% ,.- M p% -,., 9X;
6. /ave la matriz con amortiguador Llicina#4a'% ,.- M p% -,.,. hasta Bue 5a
no se detecte concentraci$n de protena 9X;
7. /ave la matriz con amortiguador Llicina#4a'% ,.- M p% -,., con 4aCl
,.6M. hasta Bue 5a no se detecte concentraci$n de protena 9X;
8. Determine actividad contra lisozima 5 concentraci$n de protena en todas
las !racciones colectadas.
2esultados 5 Discusi$n
Bibliogra!a
Manual de Pr.cticas Pag. +- de
++ /aboratorio de Enzimologa
Dra. 0lorinda im)nez 1ega.
P2AC3( CA 4o. G
DETERMINACIN DE ACTIVIDAD DE LISOZIMA
'bjetivo
Evaluar la actividad enzim.tica de la lizosima puri!icada en el laboratorio
Materiales
Micrococcus luteus
Amortiguador de !os!atos 6,mM p% F.6
Especto!ot$ metro
Procedimiento
1. En un tubo de ensa5e* adicionar -,,u/ de protena puri!icada
2. Adicionar - m/ de soluci$n de M. /uteus 9,.+6 mg:m/; preparada en
amortiguador de !os!atos
3. (ncubar a ?@VC por - hora
4. Medir absorbancia a 6E, nm
2esultados 5 Discusi$n
Bibliogra!a
Manual de Pr.cticas Pag. ++ de ++
/aboratorio de Enzimologa
Dra. 0lorinda im)nez 1ega.
P2AC3(CA 4o. 7
USO DE LA BIOINFORMTICA PARA EL ANLISIS DE
SECUENCIAS
'bjetivo
Aplicaci$n del uso de las herramientas bioin!orm.ticas accesibles en el (nternet
para el estudio de protenas 5 los genes Bue las codi!ican.
Materiales
&ecuenciasD AA&F6@7,* 4PY,,?--?* "?7G?@* BAA77,@7* 4PY,?66FE
Procedimiento
-. Elija ? secuencias de las proporcionadas
+. BusBue la secuencia Bue le !ue asignada a trav)s de su nAmero de
acceso del banco de datos 4CB(.
?. Asigne identidad a la secuencia.
E. Determine
i. Peso molecular
ii. Punto isoel)ctrico
iii. Contenido de amino.cidos
iv. Mencione en Bue '20 se localiza
v. Describa Bue tipo de estructura secundaria presenta
6. Determine el sitio de corte del p)ptido seTal 9si es Bue se presenta;.
F. &eleccione ? secuencias similares a nivel de protena 5 alinee por Clustal.
i. Calcule el porciento de similitud entre ellas.
ii. Muestre su .rbol !ilogen)tico.
2esultados 5 Discusi$n
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