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PRACTICA N 3
TINCION GRAM
I. OBJETIVOS
Recordar el manejo del microscopio ptico para la observacin de bacterias
(importancia del objetivo de inmersin)
Utilizar la tcnica de tincin diferencial con el colorante cristal violeta y safranina
Observar las diferentes formas de la estructura microbiolgica, obtenidas en el en
aislamiento de microorganismos.
Conocer y manejar las unidades de medida de las clulas y establecer comparaciones
entre tamaos de procariotas y de eucariotas
II. FUNDAMENTO TEORICO
2.1. Tincin
Es el proceso por el cual las molculas de un color ante se adsorben a una superficie.
El uso de colorantes permite cambiar el color de las clulas de los microorganismos y
poder realizar la observacin en microscopio ptico.
Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual
se encuentran suspendidas y no pueden observar se claramente sin algn tratamiento
previo.
De acuerdo a la reaccin que ocurre, existen diferentes tipos de tincin:
2.1.1. Tincin simple
El colorante utilizado sirve solo para denotar la morfologa celular.
2.1.2. Tincin diferencial
El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre clulas bacterianas
o entre partes de una misma clula. Estas tcnicas utilizan ms de un
colorante o bien ciertos reactivos complementarios para la tincin.
Ejemplos: Tincin de Gram, Tincin de Ziehl-Neelsen , etc.
2.2. Colorantes
Los colorantes ms utilizados: azul de metileno, cristal violeta, safranina, son catinicos y
se combinan fuertemente con componentes celulares cargados negativamente, como los
cidos nucleicos y los polisacaridos cidos (las envueltas externas de los microorganismos
estn por lo general cargadas negativamente).
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2.3. Tincin diferencial de Gram
Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la
desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden
dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los trminos positivo
y negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente designan dos
grupos morfolgicos distintos de bacterias).
Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente: el Frotis fijado con
calor se tie 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin
Yodada durante 1 - 2 min. y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol
etlico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 1 2 min.
Lavar y secar.
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las
diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula
bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis
osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el
peptidoglicano. La pared de la clula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas
interconectadas de peptidoglicano a s como algo de cido teicoico.
Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula gram-positiva es peptidoglicano.
La pared de la clula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada,
nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de
fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula
gram-negativa es peptidoglicano.





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Descripcin de la tincin de GRAM
Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una
solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son
lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las
clulas, tanto las grampositivas como las gramnegativas, estn teidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico.
El ingrediente activo es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en
agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el
cristal violeta. De nuevo tanto las clulas grampositivas como las gram
negativas se encuentran en la misma situacin.
Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-
acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos
organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros
(gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de
clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin; esta resistencia se
debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas,
la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana
exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana
citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de
peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la
clula se decolora. Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares
ms espesas (tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al
disolvente, provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede
atrapado dentro de la pared celular. Despus de la decoloracin las clulas
grampositivas son todava azules, pero las gramnegativas son incoloras.
Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin
de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina
o la fucsina bsica. Despus de la coloracin de contras te las clulas
gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas permanecen azules.
Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram:
1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El
yodo por s solo tiene poca afinidad con las clulas.
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2) EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso
del tiempo para evitar que pierdan la tincin las clulas grampositivas.
3) Cultivos de ms de 24 horas de teidos pueden perder su habilidad de
retener el complejo cristal violeta - yodo.

III. MATERIALES Y METODOS
3.1. Materiales
Mechero Bunsen o de Alcohol
Asa de Siembra o aguja enmangada
Pinzas
Portaobjetos
Muestras bacterianas de origen natural, Sarro Dental, etc.
Palillos
Microscopios
Soporte de Tinciones
Goteros
Gasas
3.2. Reactivos
Agua destilada
Aceite de inmersin
Solucin de cristal Violeta
Solucin de safranina Etanol 95%
Lugol
Alcohol acetona

IV. METODOLOGIA
Desarrollar la prctica teniendo en cuenta el siguiente procedimiento:
Limpiar el portaobjetos con gasas y encender el mechero.
Colocar una gota de agua destilada o solucin salina sobre el porta objetos y
luego esterilizar el asa bacteriolgica.
Tomar una pequea muestra de la cepa y diluirla en el porta objetos y
posteriormente esterilizar el asa.
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Fijar la muestra al calor flamendola en el mechero, cuidando no quemar la
muestra. Colocar el portaobjetos sobre un soporte.
Cubrir la muestra con cristal violeta. Esperar que transcurra 1 minuto escurrir
y enjuagar.
Cubrir la muestra con solucin de lugol y esperar que transcurra 1 minuto .
Escurrir y enjuagar.
Cubrir la muestra con safranina y esperar que transcurra 1 minuto. Escurrir y
enjuagar.
Dejar secar la muestra. Agregar una gota de aceite de inmersin y observar en
el microscopio a 10X, 100x, etc.
V. CUESTIONARIO
VI. Indicar la utilidad de los reactivos ulizados en la practica
VII. Causas que alteran la ncin de Gram
VIII. 6.3 Indicar las bacterias resistentes a la tincin Gram
IX. 6.4 Cules son las fuentes de errores mds camunes de error en la Tincn de Gram.
X. 6.5 Explique qu reaccin de Gram darn las levaduras. Estos tendrn la misma
importancia que
XI. para las bacterias.
XII. Explique el fundamento de la Tincin negativa realizada en la prdctica. Qu tipo
XIII. de informacin se obtiene.
XIV. 6.7 Investigue otra tcnica de Tincin selectiva que permita observar otras estructuras
bacterianqs.
XV. 6.8 A qu se debe el distinto comportamiento de las bacterias segn sean Gram+ o Gram-?







XVI. RESULTADOS Y DISCUSIONES



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XVII. CONCLUCIONES




XVIII. BIBLIOGRAFIA
Benson, Harold. 1979. Microbiological Applications. A Laboratory Manual in
General Microbiology. Third edition. Wm. C. Brown Company Publishers.
Dubuque, lowa
Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiologa. Manual de Mtodos
Generales (segunda edicin). Facultad de Farmacia. Universidad Central de
Venezuela.
Pelczar and Chan. 1977. Laboratory Exercises in Microbiology. Fourth edition. Mc
Graw-Hill Book Company.
Seely. H; Van Demark, P. 1962. Microbios en accin. Manual de Laboratorio para
Microbiologa. Editorial Blume. Madrid-Espaa.
Tortora, Funke and Case. Introduccin a la Microbiologa. 9na Edicin 2007.
Editorial Mdica Panamericana.