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TECNICHE DI SEPARAZIONE

Sono tecniche preparative del campione da sottoporre all'analisi, affinch si abbia la separazione
della sostanza da analizzare (pura) dalla miscela complessa in cui presente in natura. Quando si
analizza un campione biologico, per esempio la clorofilla, la si deve estrarre con dei trattamenti
dalla sua matrice, ovvero le foglie.
La scelta della tecnica di separazione del campione da analizzare dipende dalle sue caratteristiche
chimicofisiche (polarit!, acidit!, stato fisico, solido, ecc..)
FILTRAZIONE
"ecnica utilizzata per separare un solido da un li#uido. Si ha #uindi a che fare con un sistema
eterogeneo. Si utilizza un diaframma poroso, in altri termini, un filtro, che generalmente fatto di
carta o di n$lon, che ha la funzione di trattenere la fase solida al fine di separarla dalla fase li#uida.
%l filtro va adagiato all'interno di un imbuto, in cui viene versata la soluzione & il filtro tratterr! il
solido e la parte li#uida andr! a finire nel becher sottostante. %l filtro si avvolge su se stesso a
formare un cono. 'ra la superficie di #uesto cono pu( essere liscia o pieghettata. )el primo caso si
ha una minore superficie filtrante, il cono liscio viene utilizzato #uando la sostanza di interessa
#uella in fase solida. *na volta terminata la filtrazione si pu( facilmente recuperare la fase solida
dal filtro con una spatola. Se invece la sostanza da analizzare la fase li#uida si utilizza un cono a
superficie pieghettata. %n #uesta maniera si ottiene una separazione pi+ ottimale che fornisce un
li#uido pi+ puro proprio perch, grazie alla maggiore superficie del filtro, si trattenuto pi+ solido.
,ato che il cono pieghettato permette una migliore riuscita della filtrazione perch non utilizzarlo a
prescindere dalla fase del componente di interesse- .erch nel caso in cui il componente di nostro
interesse sia il solido non poi semplice estrarlo dalla superficie pieghettata del filtro/
%n #uesto caso la filtrazione avviene per 0123%"4, ma se la soluzione piuttosto densa #uesto
processo molto lento e #uindi si utilizza la filtrazione per 2S.%125%')6. 2vviene in maniera
esattamente analoga a #uella precedentemente descritta, solo che il recipiente di raccolta una
beuta codata, perch presenta un beccuccio a cui pu( essere applicata una pompa (generalmente ad
ac#ua) che permette la realizzazione del vuoto favorendo l'aspirazione della fase li#uida dal
miscuglio. 7' un ulteriore differenza nelle due tecniche di separazione, e riguarda l'imbuto. )el
caso della filtrazione per aspirazione si utilizza un imbuto buchner che presenta un piano sul #uale
si appoggia il filtro che #uindi, a differenza della filtrazione per gravit!, non assume la forma di
cono.
CENTRIFUGAZIONE
"ecnica di separazione dei componenti di un sistema eterogeneo con l'ausilio della forza centrifuga
che agisce su un corpo rotante. Si basa sulle differenti densit! delle particelle presenti nel sistema.
.er effettuare la centrifugazione si utilizza un dispositivo che si chiama, appunto, centrifuga, e la si
trova in diversi modelli (ultra centrifughe, in grado di separare anche molecole con differenze di
densit! molto lievi) proprio perch molto utilizzata nel campo della chimica analitica e non solo,
viene anche utilizzata per esempio per separare i vari organelli cellulari o gli acidi nucleici. Sono
innumerevoli le applicazioni della centrifugazione. 2ll'interno della centrifuga sono presenti dei fori
che sono gli alloggiamenti delle provette.
.er arrivare ad una buona riuscita della separazione necessario che le provette vengano alloggiate
in maniera bilanciata, ovvero in maniera diametralmente opposto l'una rispetto all'altra (provette
aventi lo stesso peso). *na volta inserite le provette all'interno del dispositivo si applica una
velocit! angolare dal rotore. La forza che agisce sulle particelle data dall'e#uazione &
8 9 8
:
; 8
<
9 (m
:
= m
<
) >
<
r
,ove 8: la forza agente sul solido, 8< la spinta di 2rchimede ( che si oppone alla spinta del
solido), m: la massa del solido, m< la massa del li#uido spostato, > la velocit! angolare del
rotore (che si oppone alla spinta del solido) ed r il raggio della centrifuga.
).?. Se la massa del solido uguale o minore della massa del li#uido separato m:@m< non si avr!
alcuna separazione/
2l termine della separazione sul fondo della provetta ci sar! la fase pi+ densa che prende il nome di
precipitato e in alto ci sar! la fase meno densa che si chiamer! surnatante.
CRISTALLIZZAZIONE
"ecnica di separazione di sostanze solide basata sulla diversa solubilit! in un determinato solvente o
miscela di solventi del composto da separare rispetto alle impurezze.
Si scioglie la sostanza impura in un solvente opportuno, si riscalda all'ebollizione e poi si lascia
raffreddare lentamente. ,opo di che si filtra la soluzione. La buona riuscita della cristallizzazione
risiede nella scelta del solvente. Le impurezze devono essere o molto solubili nel solvente o
totalmente insolubili a #ualun#ue temperatura. 7on il raffreddamento della soluzione si ottiene la
cristallizzazione del solido da separare che inizia con un germe cristallino che si ingrossa
lentamente. Quindi la scelta del solvente va effettuata anche tenendo conto che il solido da separare
sia solubile a caldo, ma insolubile a freddo (altrimenti non avremmo la formazione del germe
cristallino).
).?. A importante che si ottengano cristalli ben formati del composto puro e che il solvente non
alteri chimicamente la sostanza/ *n solvente ottimale deve avere anche una temperatura di
ebollizione non molto alta, altrimenti andrebbe a denaturare il soluto/ 2ncora il solvente deve essere
affine alla soluzione, se polare dobbiamo scegliere un solvente apolare, se apolare si sceglie un
solvente polare.
ESTRAZIONE CON SOLVENTE
"ecnica analitica che si avvicina molto alla cromatografia, tecnica analitica per eccellenza. A basata
sul trasferimento selettivo di uno o pi+ componenti di una miscela solida, li#uida o gassosa da un
solvente ad un altro solvente immiscibile col primo. 7onsiste nel trattare il campione in esame con
un solvente organico nel #uale la solubilit! del composto desiderato nettamente superiore rispetto
a #uella degli altri componenti della miscela. A una delle tecniche di preparazione del campione da
esaminare pi+ utilizzate nel campo della chimica analitica. La scelta del solvente organico viene
effettuata, anche in #uesto caso, tenendo conto delle stato chimicofisico della sostanza,
fondamentale la polarit! e #uindi la solubilit!. Questa tecnica di separazione si basa sulla Blegge
di ripartizioneC. 7onsideriamo un sistema chiuso, un sistema controllato dal punto di vista dei
parametri temperatura e pressione. Se ho un soluto sciolto per esempio in ac#ua, e tratto #uesta
soluzione con un soluto organico (etere etilico) di polarit! opposta all'ac#ua, e #uindi immiscibile,
ci sar! un trasferimento di soluto dall'ac#ua all'etere etilico, fino a #uando non si raggiunger! un
e#uilibrio.
'vviamente il solvente organico deve essere affine con il soluto, altrimenti non ci sar! alcun
trasferimento/
Se il soluto completamente miscibile nella fase estraente al raggiungimento dell'e#uilibrio trover(
il soluto interamente nella fase estraente. Qual il vantaggio- L'etere etilico ha una temperatura di
ebollizione molto pi+ bassa rispetto all'ac#ua, #uindi potr( facilmente estrarre il soluto portando ad
ebollizione il li#uido.
La condizione di e#uilibrio si chiama ripartizione ed regolata da una costante di e#uilibrio D 9
concentrazione del soluto nella fase 2 concentrazione del soluto nella fase ?
D 9 7
2
7
?
La costante di e#uilibrio una costante termodinamica e dipende dai parametri temperatura e
pressione (non a caso si opera in un sistema chiuso).
Supponiamo di avere un sistema che ci dia la possibilit! di separare i due eluenti e di riuscire a
determinare le concentrazioni del solvente nella fase 2 e nella fase ?. Se riportassimo in un sistema
cartesiano i valori delle concentrazioni otterremo delle rette passanti per l'origine il cui coefficiente
angolare dato dal valore di D (coefficiente di ripartizione), secondo l'e#uazione 7
2
9 D E 7
?
'vviamente, come abbiamo detto poc'anzi, il valore di D varier! al variare, per esempio, della
temperatura. Se la concentrazione del soluto nell'eluente 2 uguale alla concentrazione nel soluto
dell'eluente ? (ovvero l'analita avr! la stessa affinit! per i due solventi)
7
2
9 7
?
2vremo che D9:
)on abbiamo raggiunto il nostro scopo, l'analita non si trasferito completamente nella fase
estraente.
)el caso in cui DF: e #uindi 7
2
F7
?
siamo ad un risultato ancora peggiore di #uello precedente,
perch l'analita presente in maggiore concentrazione nella fase di origine rispetto alla fase
estraente.
.er avere un buon risultato necessario che D@:, ovvero #uando 7
2
@ 7
?
.
)el caso in cui le sostanze da separare dalla fase di origine siano pi+ di una, ad esempio due, e si
voglia separare per estrazione, affinch si arrivi ad un buon risultato la condizione necessaria che
abbiano diversa affinit! con la fase estraente e con la fase di origine. A indispensabile, #uindi, che le
loro costanti di ripartizione siano diverse, e che #uindi il coefficiente di separabilit! G sia diverso da
:.
G 9 D
:
D
<
La resa di estrazione aumenta all'aumentare del numero di cicli di estrazione. .erch-
La massa del residuo di soluto nella fase di origine direttamente proporzionale alla massa totale
per il fattore messo tra parentesi. Questo fattore legato alle costanti di ripartizione ed sempre
minore di :. 6ssendo #uesto valore inferiore ad uno ed elevato ad una potenza sar! tanto pi+ piccolo
#uanto maggiore sar! la potenza. 6 #uindi la massa del soluto rimasto nella fase di origine sar!
tanto minore #uanto maggiore sar! il numero delle estrazioni.
.er separare le due fasi si utilizza un imbuto separatore in cui si inseriscono le due fasi immiscibili.
L'imbuto dispone di un rubinetto erogatore. Si agita energicamente l'imbuto in maniere tale da far sH
che le due soluzioni vengano a contatto tra di loro (ovviamente non si scioglieranno mai, creeranno
un emulsione). 7osH facendo il soluto, venendo a contatto con entrambe le fasi, avr! l'opportunit! di
passare da una fase all'altra. .oi si aspetta che le due fasi si separino in base alla diversa densit!.
'ra se ho utilizzato un eluente meno denso dell'ac#ua (etere etilico) dovr( far scorrere la fase
sottostante e isolare, #uindi la fase superiore. 2l contrario, se ho utilizzato un eluente pi+ denso
dell'ac#ua (cloroformio) dovr( recuperare la fase sottostante.
.er convenzione bisogna sempre porre l'ac#ua al numeratore (in #uesto caso 7
:
) altrimenti avremo
valori di D diversi.
7onsideriamo, come in #uesto caso, di aver utilizzato un eluente pi+ denso dell'ac#ua, e che #uindi
la fase % sia rappresentata dall'ac#ua.
Se DF: allora la concentrazione del soluto nell'ac#ua sar! maggiore della concentrazione del soluto
nella fase %%. 3iceversa, se D@: la sostanza tender! a concentrarsi nella fase %%.
%n base al valore di D si possono effettuare due tipi diversi di estrazione.
ISe D elevato si effettua la separazione con imbuto separatore. 'vviamente per migliorare
l'efficienza dell'estrazione bisogna operare con volumi piccoli e #uindi con estrazioni multiple
(procedimento discontinuo)
ISe D basso si utilizzano delle apparecchiature che prendono il nome di perforatori o percolatori
(processo continuo). 7on i perforatori si possono effettuare si estrazioni li#uido=li#uido che
estrazioni solido=li#uido con un dispositivo chiamato SoJhlet.
Ac
q
.er #uanto riguarda l'estrazione li#uido=li#uido si tratta la soluzione ac#uosa con un solvente
estraente, e #uest'ultimo viene posto in un ampolla che viene riscaldata. 6vaporando, il solvente
estraente, o meglio i vapori del solvente estraente raggiungono una serpentina di raffreddamento.
7ondensando, passano goccia dopo goccia all'interno della soluzione. %l soluto a #uesto punto si
metter! in una condizione di e#uilibrio tra fase ac#uosa e fase estraente. Questa soluzione,
attraverso un tubo di raccolta, ritorna all'ampolla e pu( essere ancora sottoposta ad elaborazione,
per cui si attuano con lo stesso solvente diversi cicli di evaporazione e #uindi diversi cicli di
estrazione.
*n processo di estrazione li#uido=solido pu( essere #uello di estrazione della clorofilla dalle foglie
delle piante. Si posiziona la sostanza in esame alla base della colonna del soJhlet e come nel caso
precedentemente si inserisce il solvente estraente in un ampolla. 2nche in #uesto caso il solvente
verr! riscaldato e passer! in fase vapore attraverso la serpentina di raffreddamento da cui uscir! in
fase li#uida andandosi a depositare sull'analita.
CROMATOGRAFIA
Le tecniche cromatografiche hanno molto a che fare con l'estrazione con solvente. La cromatografia
una tecnica di separazione di miscele omogenee basata sulla differente distribuzione dei
componenti da separare tra due fasi immiscibiliK una di esse, definita 82S6 S"25%')21%2 (8S)
costituita da un letto attraverso il #uale si muove l'altra fase che definita 82S6 L'?%L6 (8L). Le
due fasi non hanno alcun affinit! l'una nei confronti dell'altra. L'analita si pone in e#uilibrio tra
#ueste due fasi, tale e#uilibrio determina la costante di distribuzione &
D
,
9 7
8S
7
8L
)el caso dell'estrazione con solvente avevamo a che fare con un e#uilibrio statico, dovevamo cio
attendere che il soluto passasse dalla fase di origine alla fase estraente. )el caso della
cromatografia, poich la fase mobile fluisce continuamente sulla fase stazionaria l'e#uilibrio di
tipo dinamico. %n base al valore della costante di distribuzione delle varie sostanze presenti in una
miscela perfettamente omogenea si avranno diverse velocit! di spostamento. 6d proprio in virt+ di
#ueste differenti velocit! di spostamento che sar! possibile effettuare la separazione delle varie
componenti della miscela.
Quanto maggiore !a "o#tante $i $i#tri%u&ione tanto minore !a 'e!o"it( $i migra&ione)
Questo perch se la costante di distribuzione assume un valore alto significa che il soluto sar!
presente in maggiore concentrazione nella fase stazionaria che nella fase mobile (D
,
9 7
8S
7
8L
). %n
altre parole, un #o!uto ten$e a$ interagire "on !a *a#e mo%i!e +uanto ,i- a**ine "on +ue#ta *a#e
ri#,etto a!!a *a#e #ta&ionaria)
A necessario utilizzare una fase estraente che abbia diversa affinit! per le varie componenti della
miscela & se avesse la stessa affinit! con ognuna delle componenti, magari anche un elevata affinit!,
avremmo sH che la velocit! di migrazione sar! molto elevata, ma non riusciremmo assolutamente a
separare le varie componenti/ Quindi affinch ci sia separazione le componenti della miscela
devono avere costanti di distribuzione diverse.
Le tecniche cromatografiche possono essere classificate in base ai seguenti criteri &
I%n base alla natura della fase stazionariaK
I%n base alla natura della fase mobileK
I%n base al fenomeno che regola la separazioneK
I%n base alla polarit! della fase stazionaria e della fase mobile
82S6 S"25%')21%2
La fase stazionaria pu( essere un solido o un li#uido. Se siamo in presenza di un solido come nel
caso della "L7 l'analita si metter! in e#uilibrio tra fase mobile e fase stazionaria. La la fase
stazionarie un solido #uindi l'analita sar! adsorbito sulla fase stazionaria. )on a caso si chiama
"romatogra*ia a$ a$#or%imento) La fase mobile si muover! sulla fase stazionaria per capillarit! se
operiamo su una lastrina ("L7). Se invece abbiamo a che fare con la cromatografia su colonna la
fase mobile si muover! per gravit! o si pu( applicare una certa pressione, con l'ausilio di pompe,
per spingerla all'interno della fase stazionaria (M.L7).
82S6 L'?%L6
La natura della fase mobile pu( essere gassosa o li#uida. )el caso in cui gassosa si parla di gas
cromatografia, mentre se la fase mobile li#uida si parla di cromatografia in fase li#uida.
86)'L6)' 2LL2 ?2S6 ,6LL2 S6.2125%')6
%l fenomeno alla base della separazione dipende a sua volta dalla natura della fase stazionaria
(solido, li#uido, resina scambiatrice di ioni, o resina porosa che esercita un'esclusione
dimensionale).
82S6 S"25%')21%2 S'L%,2 & 71'L2"'0128%2 ,% 2,S'1?%L6)"'
La fase stazionaria un solido adsorbente e la separazione bastata su un susseguirsi di stadi di
adsorbimento e di desorbimento. %l termine adsorbimento indica la capacit! di alcuni solidi porosi e
finemente suddivisi di tener legate molecole di soluto sulla loro superficie. % pi+ comuni solidi
adsorbenti sono il gel di silice e l'allumina. %l gel di silice si ottiene dal silicato di sodio trattato con
acido cloridrico ad alte temperature. L'allumina, invece, si ottiene dall'idrossido di alluminio per
disidratazione.
3ediamo #uali sono le interazione che avvengono nell'adsorbimento. 7i sono forze che dipendono
dalla polarit! delle sostanze & se abbiamo a che fare con sostanze polari si avranno forze dipolo=
dipolo eo legami idrogeno. Lentre se ci si trova di fronte a composti apolari le interazioni saranno
rappresentate dalle forze di 3an der Naals.
Quanto pi+ polare il gruppo funzionale tanto pi+ sar! trattenuto sull'allumina o sul gel di silice,
#uesto perch i legami polari, soprattutto i legami idrogeno, sono molto pi+ forti dei legami apolari,
le interazioni di 3an der Naals, infatti, sono interazioni deboli. Se la fase polare tratterr! con
maggiore forza composti di tipo polare. La fase mobile sar! rappresentata in #uesto caso da un
eluente apolare (in effetti noi abbiamo usato esano e acetato di etile con la lastrina di gel di silice).
82S6 S"25%')21%2 L%Q*%,2 & 71'L2"'0128%2 ,% 1%.21"%5%')6
16S%)2 S72L?%2"1%76 ,% %')% & 71'L2"'0128%2 2 S72L?%' %')%7'
6sistono delle resine a scambio cationico e delle resina a scambio anionico. La resina deve
contenere gruppi ionici di carica opposta a #uella degli ioni contenuti nel campione. 3ariando il pM
della soluzione si riesce ad eluire anioni e cationi dalla resina. Se ho una resina scambiatrice di
cationi e la pongo in una soluzione contenente cationi #uesti si legheranno alla resina non
comportando alcuna separazione. .er separali devo far sH che il gruppo carico negativamente della
resina non lo sia pi+, e #uindi variando il pM della soluzione. %n #uesta maniera posso staccare il
catione e raccoglierlo all'uscita della colonna cromatografica. Questa tecnica viene utilizzata per la
separazione delle proteine e degli acidi nucleici.
71'L2"'0128%2 2, 6S7L*S%')6 ,%L6)S%')2L6
La resina presenta dei pori, ora se il diametro di #uesti pori molto piccolo le particelle che non
riescono a passarci si separeranno da #uelle che invece riusciranno a passarci. .er le prime il
cammino all'interno della colonna sar! breve, per le seconde, invece sar! lungo. )on dimentichiamo
che comun#ue le particelle verranno trasportate dalla fase mobile, solo che #uelle che non passano
attraverso i pori avranno una velocit! sicuramente minore rispetto a #uelle che riescono invece a
passarci.
.'L21%"4 ,6LL2 82S6 S"25%')21%2 6 ,6LL2 82S6 L'?%L6
Se la fase stazionaria di natura fortemente polare (gel di silice) e la fase mobile non polare
(esano o etere etilico) si parla di "romatogra*ia a *a#e norma!e)
Se la fase stazionaria di carattere non polare, mentre la fase mobile polare si parla di
"romatogra*ia a *a#e in'er#a.
CROMATOGRAFIA SU COLONNA
La fase stazionaria (solido adsorbente) posto nella colonna attraverso la #uale viene fatta fluire la
fase mobile. La fase mobile si muove, #uindi, per gravit!. Si pu( anche intervenire con una pompa e
#uindi spingere la fase mobile applicando pressione (in #uesto caso si parla di M.L7).
2bbiamo la fase stazionaria all'interno della colonna, la miscela da separare posta sulla sommit!
della fase stazionaria. 2bbiamo un miscuglio che contiene tre componenti, per esempio. Si fa fluire
la fase mobile (solvente o eluente) & ogni singolo componente della miscela si pone in e#uilibrio con
le due fasi, e iniziano a muoversi all'interno del sistema cromatografico con diversa velocit! (che
ricordiamo essere in funzione delle rispettive costanti di distribuzione). .onendo un recipiente
all'estremit! inferiore della colonna possibile recuperare i singoli componenti estratti. Se poniamo
un rivelatore alla base della colonna posso costruire un cromatogramma con il segnale fornito dal
rilevatore in funzione del tempo. %l tempo considerato (t
O
) va dal momento in cui applico
dall'estremit! superiore della colonna l'intero miscuglio.
Lo studio del cromatogramma permette di ottenere informazioni sul tempo morto e sui tempi di
ritenzione dei tre analiti. %l tem,o morto il tempo necessario alla fase mobile per attraversare la
colonna. %l tem,o $i riten&ione il tempo che intercorre tra l'applicazione del miscuglio e la
fuoriuscita dei vari componenti. % tempi di ritenzione e i tempi morti vanno presi in corrispondenza
dell'apice della curva gaussiana. %l cromatogramma utile per un analisi #ualitativa e #uantitativa.
.er l'analisi #ualitativa basta vedere se c' o meno il picco, per l'analisi #uantitativa si osserva
l'altezza del picco ( o l'area sottesa) & #uanto pi+ alto (o #uanto maggiore l'area) maggiore sar! la
concentrazione di #uel componente.
Note teoriche sulla cromatografia
La cromatografia regolata da una costante di e#uilibrio D che detta coefficiente di ripartizione
ed data da &
D 9 P2Q
S
P2Q
L
D 9 7
8S
7
8L
'ra la concentrazione uguale a numero di moli su volume, #uindi possiamo scrivere l'e#uazione
anche in #uesta maniera fino a scrivere il rapporto tra numero di moli della fase stazionaria e
numero di moli della fase mobile come il *attore $i "a,a"it( o *attore $i riten&ione ./ che
spesso utilizzato per esprimere la velocit! di migrazione dell'analita nella colonna. 2nche D' pu(
essere ricavato dal cromatogramma/ 6d dato dalla differenza del tempo di ritenzione meno il
tempo morto fratto il tempo morto &
%l fattore di ritenzione D' inversamente proporzionale alla velocit!. 0eneralmente i valori di D'
devono essere compresi tra : e R.
2ffinch avvenga la separazione delle varie componenti della miscele i coefficienti di ritenzione
delle varie sostanze devono essere diversi. 7osH come nell'estrazione con solvente c' il parametro G
che esprime il rapporto tra i due coefficienti di ripartizione D: e D< #ui il parametro si chiama S ed
il *attore $i #e!etti'it( )
)ella cromatografia su colonna si calcola il tempo di ritenzione, mentre nella cromatografia su
strato sottile si calcola l'1
f
che il rapporto della distanza percorsa dalla sostanza e la distanza
percorsa dal solvente.
7onsideriamo una soluzione binaria composta da due componenti, #uindi, 2 e ?. Questi
componenti sono presenti nella miscela con diverse frazioni molari. Supponiamo la tensione di
vapore standard di 2 (che eserciterebbe se fosse puro) sia .T
2
e che la tensione di vapore del
componente ? sia .T
?
. 6ssendo presenti entrambi nella miscela la tensione di vapore della miscela
sar! compresa tra il valore della tensione di vapore del componente 2 e #uella del componente ?.
Stando alla legge di 1aoult sappiamo che la tensione di vapore in funzione alla frazione molare.
)el grafico evidente che la tensione di vapore dei componenti diminuisce all'aumentare della
frazione molare. La tensione di vapore totale della miscela sar! la somma di .
2
e .
?
. La legge di
1aoult descrive la tensione di vapore relativa alla soluzione, la legge di ,alton, invece, descrive la
tensione di vapore della fase vapore. Si definisce 'o!ati!it( re!ati'a il rapporto tra la tensione di
vapore del componente 2 e la tensione di vapore del componente ?.
2nalizziamo lo stesso diagramma di stato che abbiamo riportato per le tensioni di vapore mettendo
per( la temperatura in funzione della frazione molare.
La miscela bollir! #uando la tensione di vapore totale eguaglier! la pressione esterna. %l vapore avr!
una composizione differente rispetto al li#uido che l'ha generato, #uindi nel momento in cui la
nostra soluzione bollir!, la fase vapore si arricchir! maggiormente dal componente pi+ volatile. Se il
nostro li#uido rappresentato da ac#ua pura la temperatura di ebollizione si manterr! sempre
costante fino a #uando tutto il li#uido non passer! allo stato vapore. )el caso della miscela non
cosH. ,ato che nella fase di evaporazione la soluzione perde maggiormente la componente pi+
volatile cambier! continuamente composizione, per cui ci sar! un aumento della temperatura di
ebollizione.
,%S"%LL25%')6 2 .16SS%')6 '1,%)21%2
L'apparecchio utilizzato per la distillazione a pressione ordinaria dispone di un pallone, ovvero una
caldaia in cui si metter! la miscela da separare. 2l di sotto della caldaia si inserisce una fonte di
calore, non una fiamma diretta perch potrebbe portare alla rottura della caldaia, si utilizza il bagno
ad olio che pi+ consono anche per #uanto riguarda l'omogeneit! della distribuzione del calore.
2lla testa di distillazione si applica un termometro per tenere sotto controllo la temperatura. % vapori
vengono convogliati in una serpentina refrigerante in cui viene fatta scorrere dell'ac#ua di rubinetto
con lo scopo, appunto, di condensare i vapori che poi verranno depositati in un recipiente di
raccolta. 1icordiamo che la distillazione a pressione ordinaria si pu( effettuare #uando la
temperatura di ebollizione inferiore ai :<OT e i punti di ebollizione dei singoli componenti
differiscono almeno di <RT
,%S"%LL25%')6 8125%')2"2
Questo tipo di distillazione utilizzato #uando le componenti della miscela hanno punti di
ebollizione molto vicini (la cui differenza inferiore ai <RT). Si ripetono n cicli di condensazione e
di vaporizzazione. La composizione dei vapori dopo n cicli data dalla volatilit! relativa che
moltiplica il rapporto tra le frazioni molari &
Siccome a un valore sempre maggiore di : all'aumentare del numero di cicli si avr! che la
composizione del vapore sar! via via maggiore del rapporto tra le frazioni molari.
.er la raccolta dei vapori si utilizzano delle colonne di frazionamento che dispongono di delle
campane di raffreddamento nelle #uali i vapori condensano e si separano.
,%S"%LL25%')6 2 .16SS%')6 1%,'""2
U un processo analogo a #uello della distillazione a pressione ordinaria, solo che al dispositivo si
aggiunge una pompa che va a creare il vuoto. Si utilizza il vuoto perch siamo in presenza di li#uidi
con punti di ebollizione superiori a :ROT e che differiscono tra loro di almeno <RT.
,%S"%LL25%')6 %) 7'116)"6 ,% 32.'16
.ermette l'isolamento di li#uidi termolabili o alto bollenti immiscibili con l'ac#ua. Si effettua per
li#uidi la cui temperatura di ebollizione inferiore ai :OOT. Se i li#uidi sono immiscibili tra di loro
la tensione di vapore totale non dipender! dalle frazioni molari, ma solo dalle tensioni di vapore dei
singoli componenti.
TECNICHE SPETTROSCOPICHE
Quando una radiazione luminosa colpisce un corpo pu( essere respinta o pu( essere assorbita. Le
tecniche spettroscopiche si basano sull'assorbimento della radiazione magnetica. La radiazione pu(
essere assorbita in maniera integrale dalla materia oppure pu( essere parzialmente assorbita e #uindi
anche trasmessa. %n tal caso si parla di a##or%imento #e!etti'o, ovvero la radiazione luminosa viene
assorbita solo a certe lunghezze d'onda comportando la riduzione dell'energia della radiazione.
L'assorbimento dell'energia selettivo perch solo le radiazioni che hanno un energia sufficiente per
permettere il salto dell'elettrone dallo stato fondamentale allo stato eccitato possono essere
assorbite, tutte le altre non saranno assorbite. %l passaggio dallo stato fondamentale allo stato
eccitato prende il nome di tran#i&ione e si verifica solo se l'energia del fotone assorbito corrisponde
esattamente alla differenza di energia dei due stati interessati.
'gni onda elettromagnetica caratterizzata da dei parametri che sono & lunghezza d'onda, periodo,
fre#uenza.
2d ogni onda elettromagnetica associata un energia. "ale energia data dall'e#uazione di .lanV
che pone l'energia in un rapporto inversamente proporzionale con la lunghezza d'onda.
L'assorbimento delle onde viene misurato con uno strumento che prende il nome di
#,ettro*otometro, che registra appunto l'assorbimento dell'energia in funzione della lunghezza
d'onda o della fre#uenza. % grafici che si ottengono mettendo l'assorbanza in funzione della
lunghezza d'onda si chiamano #,ettri $i a##or%imento. 'gni molecola presenter! un suo
caratteristico spettro di assorbimento. ,all'analisi dello spettro di assorbimento possiamo
individuare la sostanza incognita irradiata dalla radiazione luminosa. Questa una determinazione
di tipo #ualitativo, ma si possono attuare anche analisi di tipo #uantitativo, in relazione alla
concentrazione di una specie presente nella soluzione colpita dalla radiazione luminosa. 7' una
relazione, infatti, tra assorbanza (ad una determinata lunghezza d'onda) e concentrazione, in
particolar modo sono in rapporto di proporzionalit! diretta.
LEGGE DI LAMBERT-BEER
La legge di Lambert=?eer mette in relazione l'assorbanza con la radiazione luminosa e la
concentrazione ad una determinata lunghezza d'onda. .ermette, #uindi, di effettuare delle
determinazioni di tipo #ualitativo e #uantitativo. Quando una radiazione colpisce un corpo pu(
essere in parte assorbita ed in parte trasmessa.
La radiazione trasmessa sar! sicuramente inferiore della radiazione incidente. La radiazione
trasmessa o radiazione emergente (%) uguale a &
% 9 radiazione trasmessa dal campione
%
O
9 radiazione incidente
6 9base di )epero
D9 una costante, viene definita "oe**i"iente $i a##or%imento del campione alla lunghezza d'onda
considerataK indica la capacit! della molecola di assorbire una determinata lunghezza d'onda,
tipica di ogni specie ed una sua propriet! intrinseca. Quindi V legato alla radiazione luminosa e
alla specie. D rappresenta proprio il motivo per il #uale abbiamo la selettivit!, ovvero spettri diversi
a seconda della specie, che ci permettono di effettuare analisi #uantitative.
L9spessore del campione attraversato dalla luce
)el caso delle soluzione possiamo sostituire al coefficiente di assorbimento V, a E c.
).?. 9 a non il coefficiente angolare della retta, sempre il coefficiente di assorbimento della
specie in soluzione (#uindi ha lo stesso significato di D).
7 la concentrazione della specie in soluzione. 2vremo #uindi in #uesto caso, dato che V 9 a E c
.ossiamo riarrangiare l'e#uazione anche in #uesto modo &
.er togliere la base di )epero passiamo ai logaritmi naturali &
2pplicando le propriet! dei logaritmi possiamo anche scrivere che il logaritmo del rapporto di %
O
%
(il reciproco del rapporto precedente) uguale ad a E c E l (invertito di segno).
%l rapporto % %
O
ovvero il rapporto tra luce trasmessa e luce incidente definito tra#mittan&a. La
trasmittanza pu( assumere dei valori compresi tra O e :. 2ssumer! valore O #uando la luce
trasmessa (%) sar! uguale a O, ovvero #uando la radiazione sar! completamente assorbita. Sar!
invece uguale ad : #uando % 9 %
O
e #uindi #uando non c' assorbimento.
A chiaro, #uindi che tra assorbanza e trasmittanza c' una relazione che data dall'e#uazione &
La prima abbiamo dimostrato che !n I
0
1I 2 a 3 " 3 !4 trasformiamo il logaritmo naturale in
logaritmo decimale, utilizzando il fattore di conversione <.WOW &
La !og 51T non altro che l'assorbanza, #uindi &

6)707 3 A 2 a 3 " 3 !
.ortiamo <.WOW al secondo membro e assumiamo che il rapporto a<.WOW sia uguale ad un nuovo
parametro che chiamiamo 82"oe**i"iente $i a##or%imento mo!are, e rappresenta sempre la
capacit! della specie di assorbire la radiazione luminosa.
%n sintesi, la legge di Lambert=?eer espressa dall'e#uazione &
L'assorbanza una grandezza adimensionale, e #uindi sar! moli
=:
cm
=:
Se le soluzioni sono molto concentrate si hanno delle interazioni tra luce e materia che modificano
#uesta relazione. .er cui la legge di Lambert=?eer vale solo per soluzioni diluite. 'gni volta
bisogna definire il range di linearit!, ovvero in #uale intervallo di concentrazioni #uesta relazione
valida e pu( pertanto essere applicata per l'analisi #ualitativa. 0eneralmente valida per soluzioni
con concentrazioni inferiori a :O
=<
L.
S.6""1'8'"'L6"1'
Lo spettrofotometro formato da una sorgente luminosa, una lampada monocromatica a tungsteno
o deuterio. Le lampade a tungsteno emettono radiazioni luminose ad una lunghezza d'onda che va
dai WWO ai XWO nm (visibile WYO=ZRO). Le lampede al deuterio sono invece utilizzate sia per l'*3 che
per il visibile, emettendo radiazioni luminose dalla lunghezza d'onda di :YO=ZWO nm. A importante
la scelta della sorgente luminosa in base al campione che si deve analizzare. A ovvio che non
consono l'utilizzo della lampada al tungsteno per radiazioni *3/ 2ffinch si possa sfruttare la
relazione tra assorbanza e concentrazione fornita dalla legge di Lambert=?eer necessario che la
luce sia monocromatica. .ertanto la luce si fa passare attraverso un prisma (monocromatore). La
radiazione incide sulla cella portacampione (cuvetta di #uarzo o vetro). A molto utilizzato il #uarzo
perch si lascia attraversare dalla luce, il vetro , invece, controindicato per le analisi a *3 perch
il vetro assorbe la radiazione ultravioletta e andrebbe #uindi a compromettere la buona riuscita della
misura. La radiazione trasmessa viene poi rilevata da uno strumento, un rivelatore, che genera un
differenza di potenziale proporzionale all'energia della luce incidente. *n registratore fornisce
infine lo spettro di assorbimento.
Lo spettro di assorbimento fornisce un analisi #ualitativa. 1icordiamo che lo spettro di
assorbimento il grafico che si ottiene posizionando su un sistema di assi cartesiani il valore
dell'assorbanza in funzione della lunghezza d'onda. A caratteristico per ogni molecola #uindi
l'analisi #ualitativa si effettua in base al riconoscimento dello spettro.
La spettrofotometria abbiamo detto avere dei vincoli & il campione deve essere diluito, la sorgente
luminosa deve essere monocromatica. %noltre se sono presenti pi+ sostanze in una soluzione
registreremo uno spettro di assorbimento che dato dalla sommatoria delle specie presenti in
soluzione. Quindi la sostanza deve essere pura. )on solo, se abbiamo delle sostanze in soluzione si
ionizzano in presenza di altre specie come gli indicatori di pM, e cambiano colore, otterremo una
variazione dello spettro finale.
.er effettuare un analisi #uantitativa bisogna scegliere una determinata lunghezza d'onda, in
particolare #uella che rappresenta il massimo dell'assorbimento. A importante determinare la
lunghezza d'onda perch [ ed l devono rimanere costanti, la variazione deve essere determinata solo
dalla concentrazione. L'e#uazione di Lambert=?eer, entro i parametri di linearit!, pu( essere
considerata come l'e#uazione di una retta.
POTENZIOMETRIA
"ecnica analitica che fornisce informazioni #uali=#uantitative sugli analiti in soluzione mediante la
misura della differenza di potenziale (o forza elettromotrice) di una cella costituita da un elettrodo
indicatore ed un elettrodo di riferimento.
%l potenziale dell'elettrodo indicatore varia al variare della concentrazione dell'analita.
L'elettrodo di riferimento un elettrodo a idrogeno il cui potenziale per convenzione fissato zero a
tutte le temperature.
.er #uanto riguarda gli elettrodi indicatori possono essere &
I6lettrodi metallici & rispondono a reazioni redoJ, possono essere di %, %% o %%% specie ed il
potenziale di #uesti elettrodi regolato dalla !egge $i Nern#t 9
Questa legge mette in relazione il potenziale dell'elettrodo con la concentrazione della specie
presente in soluzione ai fini di un analisi #uantitativa. (6T il potenziale standard dell'elettrodo).
I6lettrodo a membrana & possono essere a membrana di vetro, cristallina o li#uida. La risposta di
#uesti elettrodi, a differenza degli elettrodi metallici, non dipende da reazioni redoJ, ma dalla
variazione di scambio con ioni presenti sulla membrana. Quindi in #uesto caso non si pu( pi+
utilizzare la legge di )ernst.
ELETTRODO A VETRO
U costituito da un tubo di vetro o di plastica a pareti spesse alle cui estremit! saldata una
membrana di vetro sensibile alla variazione della concentrazione di ioni PMW'\Q e #uindi alla
variazione di pM. .er valutare il potenziale su #uesta sottile membrana di vetro necessario
costruire una cella, #uindi di un elettrodo indicatore e di un elettrodo di riferimento. % due elettrodi,
in realt! si presentano incorporati in un unico dispositivo che una cella che contiene l'elettrodo di
riferimento a calomelano saturo e l'elettrodo a vetro.
)ell'elettrodo a vetro c' una cera isolante e un sottile filo d'argento che pesca in una soluzione di
M7 O.: L saturata con argento cloruro (2g7l). %l filo d'argento arriva fino alla membrana di vetro,
che l'elemento sensibile al pM.
.erch l'elettrodo sensibile alle variazioni di pM- 3ediamo cosa accade sulla membrana di vetro.
Le membrane di vetro sono costituite da silicati (silicio legato a tre atomi di ossigeno). %l silicato
assume una geometria molecolare tale da BintrappolareC gli ioni calcio, sodio o litio che servono a
rendere la struttura neutra (struttura simile a #uella di una spugna, con tante concavit!).
La sottile membrana di vetro a contatto con due soluzioni & #uella interna (Mcl saturato con 2g7l)
e #uella esterna, che la soluzione incognita. Lo strato della membrana direttamente a contatto con
la soluzione ac#uosa si idrata e pu( accadere che gli ioni )a\ (o Li\, ioni piccoli) distribuiti
all'interno della struttura cristallina del vetro passino in soluzione. .arallelamente al passaggio degli
ioni )a\ c' il trasferimento degli M\ dalla soluzione ac#uosa al vetro. Questo scambio
importante perch determina la formazione di un gel, l'acido silicico sulla membrana. L'acido
silicico subisce una dissociazione &

H:G!; < H: : G!;
Questo e#uilibrio di dissociazione si ha sia sul lato interno della membrana che sul lato esterno della
membrana perch siamo in entrambi casi in presenza di una soluzione ac#uosa & nel primo caso
siamo in presenza di Mcl, nel secondo siamo in presenza della soluzione ac#uosa a pM incognito.
Questo e#uilibrio sar! influenzato dalla concentrazione degli ioni M\. La sul lato interno della
membrana la concentrazione degli M\ costante (Mcl O,: L). Se c' una differenza di
concentrazione degli ioni M\ i due lati della membrana risulteranno carichi diversamente. 'gni lato
risponde alla concentrazione di ioni M\ della soluzione con cui a contatto. Se abbiamo diversa
concentrazione di ioni M\ si avr! una differenza di potenziale, una vera e propria differenza di
carica.
Si misura la differenza di potenziale ]6 che data dal potenziale dell'elettrodo di riferimento meno
il potenziale dell'elettrodo indicatore. Si somma un altra grandezza che il potenziale di giunzione
li#uida 6
^.
.ossiamo scrivere un'e#uazione che mette in relazione il potenziale dell'elettrodo indicatore con
l'attivit! degli ioni idrogeno della soluzione esterna (concentrazione). Questa relazione molto
simile a #uella di )ernst ma in realt! non ha nulla a che vedere con essa (abbiamo detto #uando
abbiamo introdotto gli elettrodi a membrana che non sono regolati, infatti, dalla legge di )ernst).
)el caso dell'e#uazione di )ernst 6T il potenziale standard dell'elettrodo, in #uesto caso, invece,
il ,oten&ia!e norma!e che contiene alcune costanti. *na di esse il potenziale all'interno della
membrana (che rimane costante perch Mcl O.:L). %l parametro 6T contiene anche il ,oten&ia!e $i
a#immetria determinato dall'impossibilit! che i due lati della membrana di vetro siano
perfettamente identici, per cui il potenziale non sar! mai proprio uguale a O. Quindi riassumendo 6T
la somma del potenziale interno pi+ il potenziale di asimmetria.
2ndando a sostituire nella prima e#uazione il valore di 6
ind
sopra esplicato, portando 6
ind
al primo
membro e ]6 al secondo otteniamo &
6splicitiamo l'e#uazione per ;!og a. La a la concentrazione degli ioni M\ e #uindi essendo =log a
9pM sostituiamo pM a log a ricordandoci per( di cambiare di segno cosH come abbiamo fatto per il
primo membro (abbiamo inserito un meno davanti al logaritmo che prima non c'era) anche al
secondo membro.
.ossiamo racchiudere tutte le costanti in un unico parametro D.
0li strumenti di misura rilevano la differenza di potenziale, che sostituito all'ultima e#uazione
fornisce direttamente il valore di pM della soluzione.
L'amminoacido in soluzione ac#uosa si presenta come ione bipolare, ovvero in forma
&=itterioni"a.
Si definisce ,unto i#oe!ettri"o, #uel valore di pM in cui l'amminoacido presente prevalentemente
in forma z_itterionica, e forma anionica e cationica sono presenti in egual concentrazione.
%l prevalere della forma anionica o della forma cationica dipender! dal pM della soluzione in cui
immerso l'amminoacido. %n base al pM e #uindi alla forma in cui l'amminoacido si presenta
dipender! la sua disposizione nello spazio e la sua attivit!.
%n base ai diversi punti isoelettrici delle proteine possibile separarle mediante la tecnica di
e!ettro*ore#i4 che si basa sull'utilizzo di un campo elettrico. Se la proteina porter! carica positiva
migrer! verso il polo negativo e viceversa. Se la proteina neutra non risentir! dell'interazione del
campo magnetico.
72L7'L' ,6L pM %S'6L6""1%7'
7onsideriamo la 0L%7%)2 nella sua forma protonata. Si comporta come acido biprotico, fornendo
ben due e#uilibri di dissociazione &
Lettiamo a sistema le due costanti di dissociazione. Lettendo in evidenza la concentrazione
dell'amminoacido in forma z_itterionica P22Q possiamo eguagliare i due membri e #uindi scrivere &
,ato che al punto isoelettrico la concentrazione della forma anionica e della forma cationica sono
uguali posso scrivere una nuova relazione che mi porter! ad affermare che la concentrazione degli
PMW'\Q
<
uguale al prodotto delle due costanti di dissociazione. 8acendo la radice #uadrata di
primo e secondo membro posso facilmente ricavarmi il valore della concentrazione degli ioni
MW'\. La #uello che realmente ci interessa il pM, #uindi moltiplico primo e secondo membro per
=log. 'ttengo l'e#uazione finale che il punto isoelettrico.
Quindi conoscendo le due costanti di dissociazione acido posso calcolarmi il punto isoelettrico.
Supponiamo di dover calcolare il p% e di non conoscere i valori delle due costanti di dissociazione
(esperienza di laboratorio).
La glicina nella sua forma protonata (MW)\=7M<=7''M), si presenta come acido biprotico poich
possiede due valori di Da e #uindi due e#uilibri di dissociazione &
)ella prima fase dell'esperimento si inserisce un volume di Mcl necessario per protonare del tutto la
glicina.
La reazione che avviene la seguente &
Si pu( verificare con l'ausilio di un pMmetro che la soluzione ha valori di pM molto bassi e #uindi
che la glicina presente nella sua forma cationica.
%n un secondo momento aggiungendo #uantit! minime di )a'M si pu( notare come il pM aumenta
gradualmente.
Questo fenomeno si pu( spiegare con il fatto che aggiungendo gradualmente )a'M, l'amminoacido
comincia a cedere gli M\ per ripristinare l'e#uilibrio, secondo tale reazione &
Questa reazione continua fino a #uando tutti i gruppi carbossilici in miscele perdono gli M\ e si
presentano dun#ue nella forma dissociata 7''=.
2 #uesto punto la glicina si presenta in forma z_itterionica in cui il valore di pM corrisponde al
cosiddetto punto isoelettrico.
7on una piccola aggiunta (O.R ml) di )a'M, da :`mL a :`.RmL, il pM subisce un aumento
considerevole passando da un valore di `.:a a Y.OO.
7ontinuando ad aggiungere )a'M in soluzione, in piccole dosi fino a #uando tutti gli )MW\
cedono gli M\ trasformandosi in )M<, secondo la reazione &
La glicina si presenta ora nella sua forma anionica.
1icavati dal grafico i volumi e#uivalenti in corrispondenza dei due salti &
3e#: 9 :`mL b pM 9 p% 9 `.:a
3e#< 9 <YmL b pM 9 :O.`X
Si possono calcolare i valori di pDa< che corrispondono al valore di pM in corrispondenza
rispettivamente di c del 3e#: e d del 3e#<. 1icavati poi i due pDa (pDa: 9<.RYK pDa< 9 X.YZ) si
pu( calcolare il p% della glicina con la relazione &
p% 9 c (pDa: \ pDa<) 9 c (<.RY \ X.YZ) 9 a,<<R