UNIVERSIDAD DE GUANAJUATO

Divisin de Ciencias Naturales y Exactas

Laboratorio de Bioqumica
Unidad IV: Protenas
Equipo:
Njera Torres ngel Humberto
Zavala Nez Monserrat
Surez Vzquez Mariela (slo parte III y IV)


12/05/2014

Guanajuato, Gto.


En estas prcticas se realiz la determinacin de protenas, la purificacin por
intercambio inico, electroforesis y actividad enzimtica. Primeramente se utiliz el
mtodo de Folin-Ciocalteau para determinar la concentracin de protenas en un
espectrofotmetro. Para la purificacin de intercambio inico se us una resina
(fase estacionaria) dentro de una columna plstica, y por encima se coloc un
amortiguador (fase mvil) en este caso Tris-HCl. Una vez obtenidas las protenas
con carga negativa se leyeron las muestras en un espectrofotmetro a 280nm.
Para la electroforesis, los geles de poliacrilamida constituyen el medio excelente
para separacin de protenas de acuerdo a su PM.
Dentro de las diversas tcnicas, la ms utilizada es la SDS-PAGE. Del mtodo
anterior se puede deducir el peso molecular de una protena comparando su
movilidad electrofortica con protenas de PM conocido. Finalmente se determin
la actividad enzimtica en geles de poliacrilamida y gelatina para homogenados de
trichomonas vaginalis.

METODOLOGA
PARTE II
1. Se coloc 1 l de la muestra problema y se aadi 1l de NaOH 0.1 M.
2. Se prepar en una placa ELISA tres curvas estndar con albumina srica
de bovino (BSA) de 2.5 a 2g. Se afor a 20l con agua destilada.










3. Se prepar una solucin con 10l de solucin de CuSO
4
al 4% en agua
(P/V) ms 10l de solucin de tartrato de sodio al 2.5 % (P/V) en agua y 1
ml de solucin de Na
2
CO
3
al 2% en NaOH 0.1 M.
4. Se agregaron 100l del reactivo de Folin diluido 1:1 en agua, y a cada tubo
se le mezcl con cuidado.
5. Se incubo durante 30 min a temperatura ambiente.
6. Finalmente ley la absorbancia a 620nm.
PARTE III
1. Se coloc una resina la cual es la fase estacionaria (con carga positiva para
poder hacer el intercambio aninico Q) en una columna plstica, hasta
que el volumen de la resina compactada fuera de 2.5 ml manteniendo por lo
menos 1 ml de agua por encima de la resina.
2. Se lav la columna con 6 volmenes de amortiguador de equilibrio, en este
caso fue el Tris-HCl 50 mM pH 8.0. (para darle a la columna un pH igual)
3. Se aplicaron 200l de la muestra problema en 800l del amortiguador de
equilibrio, en la parte superior de la resina.
4. Despus se aplicaron 8.5 ml del amortiguador de equilibrio y se procedi a
colectar fracciones de 1 ml en tubos Eppendorf, en un aproximado de 10
tubos. (captura de cationes)
5. Al termin se aplic 8.5 ml del amortiguador de elusin I Tris-HCl 50 mM,
NaCl 200 mM pH 8.0, y se colectaron fracciones de 1 ml. (captura de
cationes y aniones, con ayuda de la sal se separan estas partculas de la
columna).
6. Al finalizar se aplic 8.5 ml de amortiguador de elusin II el cual contena
NaCl 500 mM y se colectaron fracciones de 1 ml. (captura de aniones, se
trata de quitar la mayor cantidad de aniones, que es la fraccin de inters
de la resina).
7. Despus se procedi a lavar la columna con 8 volmenes de agua
destilada y se colecto la resina, almacenndola a 4C
8. Al termino se leyeron la fracciones en un espectrofotmetro a 280nm

PARTE VI
Primeramente y antes de someterse a electroforesis, las protenas se hirvieron en
una solucin que contena SDS (CH
3
- (CH
2
)
10
- CH
2
OSO
3
Na), -mercaptoetanol,
azul de bromofenol y glicerol. El SDS es un detergente aninico que se une
fuertemente a las protenas y las desnaturaliza. El -mercaptoetanol reduce los
puentes disulfuro que mantienen su estructura terciaria. De esta manera, todas las
protenas se abren y quedan con una serie de molculas de SDS cargadas
negativamente a lo largo de la cadena. El azul de bromofenol permite el
seguimiento de la migracin de las protenas a lo largo del gel, mientras que el
glicerol confiere densidad baja a las muestras para depositarse fcilmente en el
pozo de carga.
El gel de poliacrilamida ya estaba preparado, solo se mont la cmara con
solucin del buffer 4x llenando completamente el espaci entre las 2 placas.
Posteriormente se llenaron los pozos del gel, el primer pozo con 10 L de
marcadores de peso molecular, los siguientes 7 pozos se llenaron con
5,7,10,8,6,9,2,5 L de muestra (protenas) respectivamente.
Al aplicar corriente elctrica, las muestras pasaron primeramente a un gel
concentrador de 4%-5% de poliacrilamida para que las protenas formaran una
banda definida y compacta antes de entrar al gel separador. Una vez alcanzado el
gel separador, los complejos SDS-protena cargados negativamente continuaron
movindose hacia el nodo y, ya que tuvieron la misma carga por unidad de
longitud, viajaron con diferentes velocidades en el gel separador bajo el campo
elctrico conforme a su peso molecular. Concluida la electroforesis, el gel se ti
con azul de Comassie para observar las bandas de protena y estimar su peso
molecular.
PARTE V
Nota: el gel de poliacrilamida se elabor con anticipacin a la prctica.
1. El gel se coloc en la cmara de electroforesis y se sell cuidadosamente
para que no tuviera fugas, a este se le agreg el buffer hasta el tope de la
cmara.
2. Una vez que se termin la colocacin del gel se coloc la muestra en los
pozos (uno si y uno no) comenzando por 2l hasta llegar a 10l.
3. Cuando se termin de agregar las muestras se coloc la tapa de la cmara,
se conectaron los electrodos a la fuente de energa y se dej correr las
protenas por 1 hora a 110 volts, manteniendo la cmara en hielo para
evitar la completa desnaturalizacin de la protena por el calor de la
corriente.
4. Cundo termino el tiempo se desmonto el gel y se sumergi en una
solucin de Tritn X-100 al 2.5% V/V, en agua por 45 min a 4C.
(detergente no inico, sustituye al SDS).
5. Al termin se lav 2 veces con agua destilada, y se incubo en el
amortiguador de reaccin (30 ml de PBS 1X con 50 l de
mercaptoetanol) a 37C por 30 min (renaturalizacin).
6. Al termin se lav dos veces con agua destilada y se ti con azul de
Comassie por 15 min. (revelar protenas)
7. Despus se desti con una solucin de metanol al 40% V/V y cido
actico al 10% V/V por 15 min. Esto para distinguir las zonas degradadas
de lo dems, en estas zonas es donde actu la proteasa.
8. Cabe mencionar que el gel utilizado tiene la misma composicin que un gel
de electroforesis para determinacin de PM, la diferencia es que el utilizado
en esta prctica contiene un sustrato especial capaz de ser desintegrado
por la enzima.




RESULTADOS
Parte I: Propiedades qumicas y caracterizacin de protenas
En esta parte se revisaron las propiedades de las protenas tales como la
formacin de complejos, tambin se observ el efecto del pH y la temperatura o
incluso del disolvente en las mismas, es decir, si su forma permaneca nativa o se
desnaturalizaba, de la misma manera se identificaron enlaces peptdicos y grupos
fenlicos o indlicos en el caso de aminocidos y se distinguieron entre pptidos y
protenas con las reacciones de Biuret por ejemplo, lo nico que no se pudo
observar fue el efecto de metales en la precipitacin de las protenas, sin embargo
se investig que el Zn
2+
, Fe
3+
, Cu
2+
, Sb
3+
, Ag
+
, Cd
2+
y Pb
2+
pueden hacerlo.
Parte II: Determinacin de protenas
Al graficar la absorbancia contra concentracin de albmina se obtuvo el siguiente
resultado
g 1 2 3 PROMEDIO
A 0 0 0.01 0.018 0.00933333
B 2.5 0.046 0.013 0.04 0.033
C 5 0.034 0.077 0.05 0.05366667
D 10 0.157 0.188 0.134 0.15966667
E 15 0.217 0.234 0.239 0.23
F 20 0.281 0.313 0.264 0.286
G X 0.305 0.574 0.418 0.43233333










y = 0.0147x - 5E-05
R = 0.9876
-0.05
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0 5 10 15 20 25
Concentracin-absorbancia
albmina

Esta grfica muestra la cantidad de albmina contra su correspondiente absorbancia.
Se le ajusto una lnea de tendencia cuya R
2
es de 0.9876, se consider como un buen
ajuste por lo que la ecuacin de la recta fue aceptada.
De esta manera si:
y = 0.0147x - 5E-05
x= (y + 5E-0.5)/ 0.0147
Donde x es el valor desconocido de g de protena.
Cuando y= 0.4323333
X= (0.4323333 + 5E-0.5)/0.0147
X= 29.7505 g
Por lo tanto en un 1l de muestra problema hay 29.7505 g de protena, (BSA).

Parte III: Purificacin de protenas (cromatografa en columna)
De una muestra problema se realiz la purificacin de protenas segn su carga neta, es
decir una cromatografa de intercambio inico, hacindose especficamente de
intercambio aninico, con una resina tipo Q.
Se utiliz el amortiguador de equilibrio, uno de elusin I y de elusin II, los ltimos dos
con una concentracin de 200 y 500 mM de NaCl respectivamente, a pH de 8. Despus
de 3 series de 9 tubos, los resultados del espectrofotmetro fueron los siguientes:

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA: INTERCAMBIO
ANIONICO A

FRACCION CATIONES CATIONES/ANIONES ANIONES B PROMEDIO
1 0.367 0.16 0.046 S 0.191
2 0.225 0.05 0.025 O 0.1
3 0.059 0.031 0.022 R 0.03733333
4 0.056 0.019 0.087 B 0.054
5 0.051 0.016 0.023 A 0.03
6 0.053 0.015 0.024 N 0.03066667
7 0.052 0.009 0.024 C 0.02833333
8 0.061 0.011 0.033 I 0.035
9 0.085 0.149 0.027 A 0.087






Como se puede observar, la lnea que corresponde a cationes tiene los valores
ms altos en los primeros tres tubos pero con un rpido descenso, es de
esperarse ya que como la resina era de carga neta positiva, las partculas con
carga igual saldran ms rpido y en mayor cantidad, luego se observa un
comportamiento ms o menos constante.
La lnea de aniones/cationes, de la misma manera se ve un predominio sobre la
de aniones en los primeros tres tubos, despus sigue una tendencia decrecida
hasta el tubo 8 donde crece siguiendo una recta, hasta que en el tubo 9 supera en
cantidad a las otras dos series.
Finalmente la serie de inters, aniones, es la que tiene los valores ms constantes
desde inicio a fin exceptuando solo el valor del tubo 4 donde su concentracin es
superior a las otras dos series. De aniones se puede observar que no estn en
grandes cantidades.
La informacin que nos brinda este grfico es el comportamiento de cada fraccin
por separado, en un grfico de una sola lnea se vera como el siguiente.
(Ntese el predominio de la fraccin de cationes al inicio, su paulatino descenso y
una fraccin ms o menos constante hasta el final donde comienza a predominar
aniones y cationes.)
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
INTERCAMBIO INICO DE PROTENAS
CATIONES
CATIONES/ANIONES
ANIONES













PARTE VI: Electroforesis


Se tomaron los datos del marcador de peso molecular utilizado, se midieron las
distancias recorridas en el gel de cada banda de protena as como tambin se
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
INTERCAMBIO INICO: PROMEDIO
midi la distancia total de corrida (hasta el frente) y se calcularon los Rf
correspondientes. Los datos fueron concentrados en la siguiente tabla.
Marcador(KDa) Log(PM) Distancia
recorrida por la
protena
Distancia Total
de corrida del
gel
Rf
200 2.30103 1.1 5.7 0.19298246
150 2.17609126 2.1 5.7 0.36842105
100 2 3 5.7 0.52631579
75 1.87506126 4 5.7 0.70175439
50 1.69897 5.5 5.7 0.96491228

De los datos anteriores se tomaron los valores de los Rf y Log (PM), con los
cuales se construy la grfica siguiente.



Este grfico sirve para extrapolar valores de Rf y as obtener pesos moleculares
de bandas de protenas cuyo peso molecular sea desconocido. Tal fue el caso de
dos bandas cuyas distancias recorridas fueron:




Se hizo el clculo de su Rf:
Rf
1
=

0.64912281 Rf
2
=

0.57894737
BANDA 1 BANDA 2
3.7 cm 3.3 cm
Log (PM) = -0.7956 Rf + 2.4485
R = 0.9916
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Log(PM)
Log(PM) Linear (Log(PM))

Ya calculado el Rf de cada banda, se pudo obtener el valor del peso molecular
sustituyendo el Rf y despejando el peso molecular de la siguiente ecuacin
proporcionada por la grfica: Log (PM) =-0.7956 Rf +2.4485

BANDAS Log (PM) ANTILOGARITMO

PESO MOLECULAR
1 Log (PM
1
) =(-0.7956 *
0.64912281)+2.4485=1.93205789


10E1.93205789 85.52 kDa
2 Log (PM
2
) =(-0.7956
*0.57894737)+2.4485=1.98788947

10E 1.98788947 97.25 kDa

Se observ que las protenas pequeas recorran una distancia mayor que las
protenas con pesos moleculares grandes. Esto es porque las protenas pequeas
fcilmente pasan a travs de los poros del gel mientras que las protenas ms
grandes son sucesivamente retenidas en la malla de la poliacrilamida.

PARTE V: Cintica enzimtica
Una vez corrido y revelado el gel con el sustrato, se observ la actividad
enzimtica de la protena, ya que en ste se distinguieron diferentes lneas
horizontales, que es donde la proteasa actu, se pueden ver claramente los
degradados del gel en las zonas marcadas con los crculos rojos, e incluso desde
el gel concentrador. Esto nos dice que la proteasa aislada tena mucha actividad
aun despus de desnaturalizarla parcialmente. Tambin es importante mencionar
que el peso molecular de la enzima no se puede determinar de esta manera ya
que slo nos interesa saber si la proteasa tiene efecto sobre algn sustrato
especfico.









DISCUSIN
En este bloque se intent determinar muchas cualidades de las protenas y
adems conocer los mtodos de purificacin que nos permiten conocer adems
de su peso molecular, su punto isoelctrico o su actividad como enzimas. En la
determinacin de protenas se pudo calcular cuntos microgramos haba de
albmina srica de bovino en un microlitro de muestra, comparado con otros
equipos que no tuvieron dificultades al momento de realizar su trabajo, se puede
decir que la tcnica utilizada (microfolin} resulta un poco ms amplia en cuestin
de informacin que se obtiene a comparacin del mtodo Bradford.
En la cromatografa de intercambio inico, se puede decir tambin que dio mejores
resultados que la de exclusin molecular, ya que el equipo que realiz este
mtodo no obtuvo resultados, adems de que les fue ms tardado hacerla.
En la parte de electroforesis para determinacin de peso molecular y actividad
enzimtica, fue una de las tcnicas ms interesantes ya que brinda informacin
crucial y muy especfica de la muestra que se est estudiando, sin embargo
tambin es un mtodo que requiere ms inversin de tiempo, dinero y cuidados.
BIBLIOGRAFA
1. David L. Nelson, Principios de Bioqumica, 5
a
edicin, editorial OMEGA,
Barcelona Espaa 2009, pg. 71-84.
2. Pilar Roca, Bioqumica: Tcnicas y Mtodos, Editorial Hlice, Madrid
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3. Donald Voet, Bioqumica, 3
a
edicin, Editorial Medica PANAMERICANA,
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4. Antonio Pea, Bioqumica, 2
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edicin, Editorial LIMUSA, Mxico D.F.
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