PROTEINA RECOMBINANTE:

Protena produzida por engenharia gentica, que codificada por um transgene, inserido em
bactrias ou clulas eucariticas, onde se expressa. / Protena produzida a partir da expresso
de uma molcula de DNA recombinante em um sistema de expresso adequado.
Muitos medicamentos so protenas recombinantes, como a vacina da hepatite B.
DNA RECOMBINANTE:
Molcula de DNA produzida a partir da combinao de seqncias de DNA provenientes de
diferentes fontes.
COMO PRODUZIR PROTEINA RECOMBINANTE?
- A escolha de um sistema de expresso deve ser feita de forma a obedecer critrios referente
a: Vetores de expresso; Expresso em clulas animais; Expresso em pichia pastoris (levedra);
Expresso em plantas; Expresso no leite
Caractersticas desejveis da clula hospedeira para produo de protenas heterlogas:
o Crescimento rpido
o Relao custo/rendimento
o No ser nocivo ou patognico
o Ser estvel em cultura
o Ser capaz de receber DNA exgeno
SISTEMA PROCARITICO e SISTEMA EUCARITICO
Procarioto tem maior rendimento e menor custo.
As bactrias, nomeadamente E. coli so vastamente utilizadas para a expresso dos
produtos de rDNA. Oferecem vantagens de peso, nomeadamente, nveis elevados de
expresso das protenas recombinantes, crescimento rpido da populao celular e
necessidade de um meio de cultura simples. As limitaes deste sistema so a
acumulao intracelular de protena produzida, a possibilidade de degradao do
produto devido presena de proteases contaminantes e a produo de endotoxinas.
As leveduras (como a Saccharomyces cerevisae, Hansenulla polymorpha e a Pichia
pastoris) so os seres eucariotas mais simples. Crescem com relativa rapidez e so
facilmente adaptveis para produo em larga escala. Apresentam como vantagens:
no produzir endotoxinas, serem capazes de glicosilar protenas, embora no
exactamente como nos sistemas de mamferos.
As clulas de mamfero (como as clulas de ovrio de hamster chins, CHO, e de rim
de hamster beb, BHK) so os sistemas de eleio para produzir protenas humanas
teraputicas. Estes sistemas j so capazes de glicosilar as protenas no locais
correctos, embora, por vezes, com alguma diferena no tipo de modificao
glicosdica. O custo de produo nestes sistemas muito mais elevado devido ao seu
lento crescimento e necessidade de meio nutritivo dispendioso.

PROCEDIMENTO UTILIZADO:
- ISOLAMENTO DO DNA QUE PRODUZ A PROTEINA DE INTERESSE
Utilizando enzimas de restrio iguais.
- CLONAGEM DO DNA UTILIZANDO PLAMDEO
Para construir um DNA recombinante, a primeira etapa envolve a produo de fragmentos de
DNA e origens diferentes com o mesmo conjunto de extremidades fitas simples, ou seja, a
digesto das molculas de DNA com a mesma enzima de restrio. Na segunda etapa, estes
dois fragmentos so ligados por um enzima (DNA ligase) ou renaturao.
- TRANSFORMAO PELO DNA
Introduo do plasmdeo ( com o DNA recombinante) em uma clula que o incorpore e
replique. Mtodos de introduo do DNA na clula: Clulas competentes; Eletroporao;
Bombardeamento de DNA revestido de Tungstnio; Microinjeo; e Transfeco. O resultado
ser o surgimento de varias colnias contendo cpias do mesmo plasmdeo.
- SELEO E ANALISE DE RECOMBINANTES
Selecionar os clones corretos na mistura de clones que foram criados. A presena de genes
reprteres um dos artifcios mais importante e, para esse fim, o gene lacZ muito utilizado,
poi produz a enzima betagalactosidade. A presena desta enzima faz com que a colnia de
bactrias que contem o gene lacZ fique azul quando corada com IPTG e X-gal. Quando se
adiciona um fragmento exgeno de DNA dentro deste plasmdeo, o gene que produz a
betagalactosidade destrudo e, depois da colorao, os clones deste plasmdeo ficaram
brancos e as colnias intactas (que ainda produzem a enzima) ficaro azuis.
- EXPRESSO DE PROTEINAS RECOMBINANTES
Primeiro sistema de expresso de protenas: operon lac (transcrio ativada por molcla
indutora)
Algumas colnias so inoculadas em meio de cultura lquido rico e ento induzidas com
indutor (lactose ou IPTG). Os principais plasmdeos de expresso utilizam os promotores Lac e
Tac. O promotor Lac semelhante ao utilizado pelas cepas tipo selvagem de E. coli, sendo
ento reprimido pela protena repressora lacI na ausncia de indutor (lactose ou IPTG) e
induzido em sua presena. Assim, ambos promotores so induzidos por lactose ou IPTG e
utilizam a RNA polimerase bacteriana para transcrever o gene de interesse.
Muitas protenas tm atividades biolgicas somente aps sofrerem modificaes ps-
traducionais. Estas protenas devem ser ento produzidas em sistemas de expresso de
eucariotos, como por exemplo, clulas de mamferos.
- PURIFICAO DE PROTEINAS RECOMBINANTES
A seguir, as clulas bacterianas so coletadas por centrifugao, e o nvel de expresso
proteica verificado por eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS de uma pequena amostra
de bactrias induzidas. Depois de purificadas as protenas devem ser caracterizadas e, como ja
dito, as protenas podem ser separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE.
Desvantagens da expresso em bactrias que retm a protena intracelularmente e formam
corpos de incluso (protenas insolveis no funcionais), por isso o custo da purificao
muito alto. Em vista disso, a produo de protenas de fuso facilita a purificao.
Utilizao de protenas de fuso: No transgene so acrescentadas as sequncias nucleotdicas
da enzima glutationa-S-transferase (GTS). Protena de fuso resultante pode ser purificada a
partir de outros contedos da clula com uma coluna de afinidade contendo glutationa
(tripeptdeo) ligada a matriz.
A purificao utilizando leveduras compensa mais, visto que elas secretam o produto de
interesse para o meio extracelular sem ter seus componentes liberados.
- APLICAES DA TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
Tatamento de doenas relacionadas com a ausncia ou disfuno de uma protena
normalmente sintetizada no organismo reposio da protena em falta;
Minimizao de efeitos secundrios de terapias agressivas Administrao de factores de
crescimento;
Imunizao na preveno de doenas infecciosas Vacinas;
Correo de doenas genticas Terapia Gnica;
Melhoramento animal e vegetal.
METODOLOGIA:
Na produo de produtos de rDNA, o primeiro passo a identificao e o isolamento do gene
responsvel pela expresso do produto desejado. Aps isolamento e caracterizao do gene
humano este introduzido por tecnologia de DNA recombinante num genoma de um
plasmdeo, que lhe vai conferir a capacidade de auto replicao numa clula hospedeira. O
plasmdeo recombinante pois introduzido em clulas bacterianas, de leveduras ou de
mamfero em cultura. Os clones de clula hospedeiras transformadas so isolados e os que
produzem a protena de interesse nas quantidades desejadas so seleccionados. medida que
vo sendo necessrios os clones so amplificados e cultivados em larga escala em
fermentadores ou garrafas rotativas.
Vector de Clonagem:
Elemento gentico com capacidade de replicao autnoma, usualmente um vrus ou um
plasmdeo, que usado para transportar um fragmento de DNA para uma clula hospedeira
para fins de clonagem gentica.
Pequenas moleculas de DNA dupla fita, contendo os elementos necessrios para sua
replicaoe pelo menos um gene que confereresistncia a antibioticos. Um plasmideo
considerado com vetor de clonagem se: possui uma origem de replicao (uma sequencia que
permite que ele seja replicado na celula hospedeira); possui gene de resistencia a antiobiotico;
e apresenta sitio de clonagem multipla.
Podem ser plasmdeos, cosmdeos, cromossomo artificial bacteriano (BAC), cromossomo
artifical de fungos (YAC), retrovirus, etc.
Enzimas de restrio:
Nucleases que clivam uma molcula de DNA em qualquer posio onde ocorra uma pequena
sequncia especfica de nucletidos. Nucleases de restrio diferentes cortam em sequncias
especficas diferentes.
H dois tipos de clivagem:
a) Os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da sequencia especifica, gerando
extremidades abruptas;
b) Os cortes so feitos simetricamente, porem, fora de eixo de simetria, gerando
extremidades coesivas.
As extremidades coesivas permitem que dois fragmentos de DNA liguem-se mais facilmente do
que os fragmentos que contenham extremidades abruptas devido serem estruturalmente mais
adequadas para a complementariedade de bases. Assim, fragmentos com extremidades
abruptas se ligam com menos eficincia.
Promotor:
Sequncia nucleotdica no DNA qual se liga a polimerase de RNA para iniciar a transcrio.
Exemplos de Protenas Recombinantes
Hormnio de crescimento humano a administrao deste hormnio durante a infncia
permite a correo dos casos de nanismo.
Anticoagulantes ativadores de plasminognio tecidual que por sua vez ativam a plasmina,
enzima que dissolve os trombos (evita ataques cardacos).
Dismatase do superxido previne danificao de tecidos quando este exposto falta de
oxignio.
Anticorpos monoclonais so usados em testes diagnsticos; transporte direccionado (drogas,
toxinas, componentes radioactivos utilizados na terapia cancergena), assim como outras
aplicaes.