Tpicos Selectos de Diseo I

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UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA
DE INGENIERIA CAMPUS GUANAJUATO
INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

Ingeniera Biotecnolgica

Produccin de Lactona (6-pentil--pirona) a partir
de Trichoderma harzianum en medio solido.
6BV1
10/09/13
Equipo
Alcarz Duran Jos Carlos.
Bravo Acosta Martha Clementina.
Daz Infante Morales Daniela.
Gonzlez Jimnez Oscar Manuel.
Valadez Castillo Juan Carlos.

Tpicos Selectos de Diseo I

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ndice.
Portada........ 1
ndice........... 2
1) Introduccin.. 3
2) Marco terico........ 5
2.1) Objetivo .. 5
2.2) Soluciones limpiadoras. 5-7
2.3) Proveedores de limpieza . 8
2.4) Limpieza in situ 9-12
2.5) Tuberas e instrumentacin para limpieza in situ...... 12-13
3) Diagrama de proceso .... 14-15
4) Aplicaciones..... 14
4.1) Soluciones limpiadoras..... 14
4.2) Limpieza in situ.... 15
4.3) Protocolo de cuartos limpios........... 18
4.4) Protocolo para tuberas e instrumentacin......19-24
4.5) Conclusiones 25
5) Referencias.. 26-27



Tpicos Selectos de Diseo I

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1) Introduccin.
La demanda de aromas y sabores ha incrementado
sustancialmente en los ltimos aos, a partir de los aos 70 el uso de
aditivos en la industria alimentaria se ha intensificado
significativamente en nuestro pas. [3] La legislacin europea
considera viables los componentes aromticos producidos
biotecnolgicamente por un proceso natural, su nica condicin es
que los precursores en la sntesis sean naturales. [1]
Se utilizara una fermentacin en estado slido, por su ventaja
econmica y practica, incluyendo la alta productividad, baja inversin
de capital, reduccin de requerimientos energticos y
concentraciones altas en el medio para producir 6-Pentil-alfa-Pirona
(C
10
H
14
O
2
) poseedor de un aroma caracterstico a coco, es
considerada un agente saborizante no txico la principal aplicacin
es como aditivo en bebidas, yogures, panadera y confiteria. [3] Se
puede producir por sntesis qumica pero esta requiere una reaccin
de siete pasos a 490 C siendo un proceso difcil y costoso, por esta
razn el proceso se hace mediante la forma alternativa de
fermentacin en agar papa dextrosa (PDA) con un soporte natural
bagazo de caa, con una composicin KH
2
PO
4
7 g/L, Na
2
HPO
4
2
g/L, MgSO
4
7H
2
O 1.5 g/L, CaCl
2
6H
2
O 0.1 g/L y (NH
4
)
2
SO
4
0.0094
g/L con un pH 5.6 a 25 C. [4]





Figura 1. Estructura qumica del compuesto 6-Pentil--Pirone. [4]
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Utilizando un fermentador de tanque agitado con agitacin
mecnica y neumtica, ya que el medio posee caracterstica viscosa
por los pellets del hongo. [3]
Se seleccion Trichoderma harzianum, ya que es de los
microorganismos ms eficientes que se han estudiado para la
sntesis de esta lactona, pues una de las desventajas de la
produccin de esta es que la mayora de los hongos que pueden
crearla lo hacen con muchas deficiencias, o de manera muy costosa.
Sin ser la excepcin con Trichoderma h. se ha observado que la
concentracin de 6PP en el caldo de fermentacin disminuye
despus de alcanzar la concentracin mxima. Este fenmeno ha
sido constantemente observado y no parece ser dependiente de las
condiciones de cultivo sino se debe a una biotransformacin de la
molcula por el hongo y se lleva a cabo de manera intracelular o
extracelular [5]. Lo cual se considerara para poder llevar a cabo
nuestra biorreacin.
Para poder llevar a cabo la produccin industrial de un
bioproceso se debe poseer con las condiciones de equipo,
instalaciones, mantenimiento y limpieza en las reas donde se
realizaran los pasos consecutivos a lo largo del proceso desde la
inoculacin hasta la purificacin y obtencin final de la lactona para
su comercio posterior; todos este proceso de limpieza y las
condiciones a las cual se debe trabajar de esterilizacin, se
disearn y abordarn en este trabajo, un protocolo amplio de
limpieza.
Entonces se necesitara cumplir las diferentes normas
internacionales y nacionales en la producto, cumpliendo los
requerimientos para poder exportar el producto obtenido. El proyecto
se basa en las normas de IFS, HACCP, FDA y las normas mexicanas
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-120-SSA1-1994.
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2) Marco terico.
2.1) Objetivo
El alumno disear sistemas y procedimientos de limpieza in situ,
adems seleccionar el sistema de limpieza o sus componentes de
los disponibles proveedores industria en la produccin lactacto de
coco.

2.2) Soluciones limpiadoras, cotizaciones.
La limpieza se refiere a la remocin de materia orgnica y
suciedad de los objetos y elementos.
Existen diferentes tipos de soluciones limpiadoras, dependiendo
su aplicacin:
a) Antisptico: sustancia se utiliza en tejidos vivos y destruye o
inhibe el desarrollo de microorganismos.
b) Desinfectante: solucin qumica que elimina cierto nmero y
tipo de microorganismos dependiendo de su categora. Se
aplica sobre superficies y elementos.
c) Esterilizantes: son las sustancias que producen la muerte
de todo organismo, incluyendo sus formas de resistencia
(esporas). Se obtiene por mtodos fsicos o mtodos
qumicos.
Para poder realizar la eleccin de una sustancia limpiadora
adecuada, se toma en cuenta lo siguiente:
Seguridad
Compatibilidad con otros productos
Efectividad
Toxicidad
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(Castro, 2005)
Clasificacin de las soluciones limpiadoras.
a) Fenlicas
Los mecanismos de accin de los fenoles son varios: alteracin de la
permeabilidad celular, alteracin directa de las protenas y enzimas
bacterianas, as como la alquilacin intracelular de las materias
indispensables para la sntesis de protenas. Su actividad es mayor sobre
Gram (-) que sobre Gram (+), excepto el hexoclorofenol, que lo hace a la
inversa. Se adhieren a materiales porosos y pueden causas irritacin a
tejidos orgnicos, an despus de una aclarado abundante. No parecen
presentar problemas ambientales, pues se degradan por vas biolgicas,
el producto ms simple es el fenol, el cual en forma pura se utiliza como
referencia de poder de los desinfectantes. Se emplea diluido en agua o
en alcohol al 2-5%.
b) Clorados
Son sustancias con un grupo NCL que se hidroliza y depende CIOH. Se
utiliza de 100 a 10000 ppm de cloro. El cloro reacciona con el agua para
formar cido hipocloroso y cido clorhdrico, que en una segunda
reaccin liberan oxgeno lo que da lugar al poder oxidante. Acta por
oxidacin de los microorganismos y por combinacin de las protenas
dando lugar a la formacin de cloraminas.
c) Yodados
El yodo es un eficaz bactericida, pero precipita cuando tiene contacto con
protenas, mancha la ropa y es una sustancia irritante. Son sustancias
activas contra los microorganismos, hongos, virus e incluso esporas.
Polmeros se unen con el yodo libre y forman complejos que mantienen
la actividad germicida del yodo y lo liberan lentamente.
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d) Sales cuaternarias de amonio
Representan compuestos antimicrobianos en los cuales las cuatro
valencias del tomo de nitrgeno estn ocupadas por grupos de alquilo.
Son solubles en agua y en alcohol y poseen propiedades tensoactivas.
Estos compuestos actan a nivel de la superficie celular, incrementando
la permeabilidad de la membrana con la consecuente prdida de los
componentes citoplstimos. Su nivel de efectividad es bajo frente a virus
y esporas.
(Mart, et al. 2001)






Figura 2. Indicaciones de las diluciones empleadas, propiedades y posibles aplicaciones.
(Mart, et al. 2001)
Cotizacin de soluciones limpiadoras ms utilizadas.
Tabla I. Cotizacin de soluciones limpiadoras (QuimiNet, 2000)



Soluciones Precios
cido peractico (0.2-0.5%) $ 45 /L (mnimo 20L)
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Alcohol etlico (96) $ 400/ galn
Glutaraldehido (2%) $ 170/ 5 litros
Agua oxigenada $ 32 / L
Alcohol isoproplico $ 38 / L
Formol-formaldehdo $ 80 /L
Yodos $ 92. 64 / 250 mL
c. Nitrico 85 x Kg
$ 27/ 200 mL
Percloro Etileno x K $ 33/ 200 mL

Para la limpieza de tanques, tubos y biorreactor se propone
utilizar la solucin bsica NaOH, una solucin acida Ac. Ntrico
y un compuesto clorado, agua blanda.
2.3) Proveedores de Limpieza y materiales.
QuimiNet .
Comercial gasso .
Abaco .
Sosa Tech .
DOFASCO.
BALPER S.A de C.V.
PIGGING ASESORES Y CONSULTORES S.A de C.V.
Hastinik, S.A.







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2.4) Limpieza in situ
La planta y las instalaciones sern construidas de tal manera que
los pisos, paredes y techos puedan ser limpiados adecuadamente y
conservados en buen estado ya que se puede acumular
contaminacin por polvo, partculas, cabellos, bacterias, hongos.
Evitando las uniones angulares de paredes, juntas y techos. La
ventilacin deber ser adecuada en toda la planta para minimizar
vapor de agua y vapores txicos en las reas donde se pueda
contaminar se deber colocarlos de manera que no afecte
potencialmente la contaminacin de materiales, reas de contacto y
empaques. Deben de poseer soportes adosados al piso para la
seguridad industrial y soporte del peso debiendo ser fciles de
limpiar y desmontar.
Todos los equipos deben ser instalados de tal manera que pueda
facilitarse tanto las actividades de mantenimiento y limpieza.


Procesos Upstream
Biorreactor y Tanque: Son diseados acorde a la aplicacin y deben
cumplir con los requisitos de sanitizacin, adems de la
acumulacin de ningn tipo de reaccin con los productos y con los
productos de limpieza. Deben de estar hechos de material no toxico
y resistente a la corrosin y ambiente, acero inoxidable AISI 316L y
fondo abombado, deben recibir mantenimiento para la
contaminacin de cualquier tipo.

Cada taque debe estar equipado:
-Tres soportes ajustables tubulares
-Una tapa
-Seis conexiones sanitarias
-Tres sensores de nivel
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-Una vlvula de bola neumtica para la entrada de agua
-Una vlvula de diafragma del fondo, con conexin Tri Clamp y
actuador manual.













Figura 3. Imagen partes de un biorreactor [5]

Cuartos Limpios.
Son cuartos especiales diseados para reducir la contaminacin de
los procesos y materiales, en la preparacin de inoculo,
investigaciones, clonaciones en las que se necesita un control
absoluto de las contaminaciones por todos los medios posibles esta
definida por la Organizacin Internacional de Estandarizacion (ISO
14644)
Un cuarto limpio regula el control:
Nivel de partculas contaminantes suspendidas en el aire,
Temperatura 22.2 C- 23.8C, Humedad es necesario para prevenir
corrosin, condensacin sobre superficies de trabajo 30%-70%
humedad relatica, presin, contaminacin por personas y maquinaria.
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Debe estas ailado del ambiente y sus altededores esto se lleva a
cabo presurizando el cuarto, utilizando mecheros. [10]
Sus principales componentes:
Rejillas en el techo
Ventanas de vidrio
Paneles de pared
Suelo conductor o el piso levantado
Antesala para entrar limpio
Duchas de aire
Ventanas de cristal full
Caja de pasar.[9]











Figura 4. Fotografa de un cuarto limpio.[10]






Figura 5. Cuarto de lavado para personal [10]

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Figura 6. Caja de paso de material [10]

2.4)1. Tuberas e instrumentacin para limpieza in situ
Para realizar operaciones de limpieza de manera simultnea para la
produccin o mantenimiento del producto en un depsito mientras se
limpian las tuberas adyacentes, se debe establecer entre los
circuitos la ruptura de seguridad para evitar que por fallo de una
vlvula pueda contaminarse el producto con soluciones de limpieza.
Las vlvulas de doble asiendo disponen generalmente de tres
actuadores independientes, aunque en ocasiones es posible emplear
vlvulas de un solo actuador (IMAGE, 2009)
Los circuitos tienen que estar diseados de manera que se
minimicen los caudales de limpieza necesarios, que se drenen
completamente cuando se finalice la limpieza para evitar prdidas de
producto, y sobre todo se garantice la limpieza adecuada de los
componentes.
La recuperacin de producto mediante empuje con cantidades de
agua controlada, empuje con aire o empleo de proyectiles que se
desplazan por las tuberas, contribuyen a la reduccin de mermas y
de la carga contaminante de las aguas residuales.
El sistema de empuje Pigging est diseado para la limpieza in situ.
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Las unidades de limpieza deben garantizar que las soluciones
circulen a la velocidad, concentracin y temperatura adecuadas en
todo momento.




















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3) Diagrama de proceso.


Cepa especfica de
Trichoderma
harzianum
Esterilizar un
fermentador de
150L

Adicionar un medio
de PDA y como
soporte bagazo de
caa de azucar
esteril
Inocular la cepa
en el medio de
cultivo
Operar por 7 das
a 3.3 rps en
agitacin y a 1vvm
de flujo de aire
Mantener pH=5.6
mediante la
adicin de NaOH
(2N)
Usar
espectofotometra
de masas para
evaluar la lactona
Evaluar biomasa
(morf.) y CO
2
(IR)
Bioseparar la
lactona de la
biomasa y purificar
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Figura 7. Diagrama descripcin del proceso con sus operaciones unitarias.





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4) Aplicaciones
4.1) Sustancias limpiadoras
Para la produccin de Lactona (6-pentil--pirona) a partir de
Trichoderma harzianum es necesario realizar la limpieza y
desinfeccin del bioreactor donde se va a llevar a cabo el proceso.
Las sustancias desinfectantes que se han decidido utilizar son las
siguientes:
Alcohol etlico al 70% , Alcohol iproplico 70% (es ms potente que el
alcohol etlico): Ambos alcoholes son bactericidas rpidos contra
formas vegetativas de bacterias. No destruyen las esporas
bacterianas. El alcohol isoproplico es incapaz de actuar frente a los
virus hidrfilos. La concentracin ptima est entre el 60 y 90%.
Cloruro de Benzalconio, DG6, M.R.: se utiliza para materiales no
crticos y limpieza del medio ambiente.
Hipoclorito de Sodio: la actividad microbicida del cloro se debe a su
disociacin en cido hipocloroso. Es dependiente del pH, si este
aumenta, ms iones de hipoclorito se formarn y por lo tanto la
actividad microbiana disminuir. Una disolucin de 1 en 1,000 de
lavandina provee cerca de 50 ppm de cloro libre y una dilucin de 1
en 50 provee cerca de 1,000 ppm. Las concentraciones de 1,000
ppm pueden destruir el 99% de esporas en 5 minutos y hongos en
menos de 1 hora.
Glutaraldehdo 2%: Desinfectante de alto nivel y esterilizante
qumico. Es una slucin estable, bactericida de amplio espectro,
eficaz contra virus y efectiva accin esporicida. Resulta activo ante la
presencia de materia orgnica. No es corrosivo para los metales,
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gomas y lentes. Para superficies no crticas debido a su toxicidad y
alto costo. Condiciones: pH= 7.9, concentracin 2% y temperatura
ambiente.
Ortoftaldehdo al 0.55%: Desinfectante de alto nivel. Posee actividad
microbicida superior al glutaraldehdo al 2% y resulta mnimamente
afectado por materia orgnica. Tiene actividad esterilizante despus
de 60 minutos a 20C. Pueden utilizarse en los siguientes materiales:
Metales Aluminio, aluminio anodizado, acero al carbono,
cromados, cobre, niquelados, acero inoxidable, titanio, acero al
vanadio.
Plsticos Polimetilmetacrilato, nylon, polietiletereftalato (PET),
poliestireno, policarbonato, polietileno, poliamida.
Elastmeros Kraton G, poliuretano, goma ltex natural, goma
de silicona.
Adhesivos Cianoacrilato, EPO-TEK 301 Epoxy, EPO-TEK 353
Epoxy.
(Castro, 2005)
4.2) Limpieza in situ
Protocolo para un Biorreactor Tanque Agitado 150L.
1.- Retirar costras mediante la adicin de agua a una temperatura
80 C con presin hasta retirar y eliminar residuos.
2.- Inundar el tanque con una solucin alcalina NaOH
3.- Enjuagar para retirar residuos alcalinos NaOH
4.-Inundar el tanque con una solucin cido ntrico
5.- Enjuagar para retirar residuos cido ntrico
Utilizando maquinaria automatizada para poder llevar continuamente
la limpieza del tanque o reactor.
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Figura 8. Estacin central CIP (Bratland and Rosenberg, 1992)

4.3) Protocolo de limpieza de cuartos limpios
La aplicacin que daremos de los cuartos limpios en nuestro
proyecto es relevante debido a que al tratarse de una empresa pseudo-
alimenticia la contaminacin de nuestro producto es muy sencilla a lo cual
nos apegarmos a el protocolo de Cuartos Limpios de la Organizacin
Internacional de Estandarizacin (ISO 14644) para la mayora de nuestros
procesos del upstream y dowstream. (Sosa Tech).
El protocolo para el uso de cuartos limpios marca los siguientes
pasos para darle mantenimento a un cuarto limpio:
1. Enjuagar con chorros de agua de flujo turbulento para la remocin de
las macromolculas.
2. Realizar una limpieza con el uso de algunos detergentes para
remover las costras.
3. Despus se deja secar para poder aplicar ahora los sanitizantes
mencionados anteriormente siempre rotndolos para evira la
recistencia de los microorganismos y poder eliminarlos.
4. El siguiente paso es secar el cuarto.
5. Ya seco el cuarto se procede a hacer la ultim eliminacin fsica de
posibles microorganismos que puediesen seguir ah, lo cual se hace
con luz UV por todo el cuarto.
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Condiciones a las cual debe estar sujeta el cuarto limpio son
dependiendo al producto sin embargo por lo general y en este caso
deben ser temperaturas -23.8 a 22 C, presiones mayores a la
admosferica, vestiementa especial para los trabajadores cuando estn
dentro de el y controlar la humedad. El laboratorio estar construido
sobre material antiesttico ESD con el fin de evitar cualquier tipo de
carga electroesttica.

Figura 9. Dibujo de un cuarto limpio. [14]

4.4) Protocolo de limpieza de tuberas e instrumentacion

Para llevar a cabo la limpieza se deben tener en cuenta algunas
consideraciones como la presin a la que se trabajara y el flujo de los
fluidos que se transportaran. Se deben de tener en cuenta las vlvulas,
codos y otros accesorios que se encuentren en el sistema.
Las tuberas sern diseadas con acero inoxidable, se emplearan
soluciones acidas y bsicas. Las soluciones bsicas actan como
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emulsionantes, lo que ayudara a disolver las grasas y protenas adems
de que actan como agentes bactericidas, se pretende usar sosa
caustica en concentraciones del 0.2 % - 2%. Este producto reacciona
con las grasas depositadas y produce agentes tenso activos que van a
mejorar el proceso de lavado. La solucin acida (acido ntrico) se
empleara en una concentracin del 0.5 %, la cual va a remover
depsitos de sales incrustadas a lo largo de las tuberas.
Para el actual trabajo se pretende usar un sistema conocido como
pigging para la limpieza de las tuberas, el cual se distribuye por la
empresa comercial gasso, fabricante y distribuidor de productos
relacionados con la conduccin de fluidos.
Los sistemas de pig son utilizados para vaciar y limpiar tuberas
aprovechando al mximo el producto y ahorrando producto residual. El
rascador o pig acta como una escobilla y es empujado por un producto
propulso (aire, N
2
, etc) o un liquido, moviendo se a lo largo de toda la
tubera y limpiando las paredes interiores.
VENTAJAS.
Permite reducir los costes de tubera y accesorios.
Posibilidad de vehicular diferentes productos sin efectos de
contaminacin o mezcla entre ellos.
Aumento de disponibilidad de produccin.





Se pretende usar un sistema pig doble con cmara de limpieza, el cual
consiste en el siguiente mecanismo:
Figura 10. pig con labios reemplazables. 4 labios roscados entre dos piezas de apriete.
Tpicos Selectos de Diseo I

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Los dos pigs son introducidos en la estacin de inicio. Despus de que
el trasvase del producto haya finalizado, la tubera se limpia con los dos
pigs. Se introduce la solucin o agente de limpieza que se vaya a
emplear entre los dos pigs. Posteriormente el producto es vaciado de la
tubera. Cuando
el primer pig llega a la estacin receptora, el lquido de limpieza puede
ser cambiado. Se puede tambin enviar a los dos pigs de nuevo a la
estacin de inicio transportando el lquido o solucin de limpieza entre
ellos.














Figura 12. Esquema de sistema pig con estacin lanzadora.
Figura 11. Esquema de sistema pig doble con cmara de limpieza.
Tpicos Selectos de Diseo I

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Se llevaran a cabo los siguientes pasos para la limpieza in situ del
sistema de tuberas:
-Enjuague inicial. El cual se lleva a cabo en un tiempo establecido,
en el que se circula agua limpia en el circuito de lavado para
desprender la mayor parte de los residuos del proceso. En este paso
no se hace uso del sistema pigging.
-Recirculacin con sosa caustica. Se emplea el sistema pigging
antes descrito, colocando la solucin entre los dos pigs durante un
tiempo determinado. Se coloca agua en el espacio disponible
separado por los pigs para enjuagar la tubera de los residuos y la
solucin.
-Recirculacin con acido ntrico. Ahora se coloca la solucin acida
entre los dos pigs y al igual que el paso anterior, se coloca agua
para dar un enjuague final a las tuberas.
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D
H
G
C E B
F
A
Texto mostrado Descripcin
A Si stema pi ggi ng
B Tanque agua enj uagues
C taque sol uci ones aci das/al cal i nas
D tanque agi tado
E tanque al i mentaci on de medi o
F control y uni on de si stemas de tuberi as
G sol uci on sosa causti ca
H Sol uci on aci do ni tri co
Lista de equipamiento

Figura 13. Diagrama del sistema de instalacin de tuberas.

Tpicos Selectos de Diseo I

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Para la instalacin de tuberas, sistema pigging, as como vlvulas se
solicitaran a los siguientes proveedores:
Tuberas acero inoxidable 1, empresa DOFASCO (Tlalnepantla edo.
Mexico. Cp 54020).
Fabricacin de tanques de almacenamiento y reactor, BALPER bajo
s.a. de c.v.
Para el sistema pigging se pretende contactar a la empresa
PIGGING ASESORES Y CONSULTORES S.A DE C.V. ubicada en
puebla.













Tpicos Selectos de Diseo I

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5) Conclusiones
Se aprendi a disear sistemas y protocolos de limpieza in situ, as
como a resaltar la importancia de implementar estos sistemas en
nuestro proceso; obteniendo un criterio amplio para seleccionar el
sistema de limpieza o sus componentes y a los mismos proveedores
disponibles; todo eso para poder aplicarlo a una empresa que bio-
produzca lactato de coco














Tpicos Selectos de Diseo I

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5) Referencias.
[1] CEE. 1988. Directive du Conseil du 22 juin 1988 realtive au
rapprochement des legislations des Etats mebres dans le domaine
aromes destines a etre empoys dans less denrees alimentaries et
des materiaux de base pour leur production (88/388/cee), Journal
Officiel des Communautes Europeennes nL 184/61-66 (15.7.88),
European Economic Commission Brussels
[2] Serrano-Carren., F.C. (1997). gamma-Decalactone Production bt
Trichiderma harzianum in Stirred Bioreactors. Bioreachnol, 205-208,
[3] Garca G., Ramrez Q., Lpez Mungua. Biotecnologa
Alimentaria. 453-478. Mxico D.F: Limusa S.A, 2004.
[4] Valrie, S.-B. (2000). Production of 6-Pentyl-a-pirone by
Trichoderma harzianum in liquid and solid state culture. Elsiever, 1-7.
[5] QuimiNet (2000) Informacin y Negocios Segundo a Segundo.
Mxico DF. http://www.quiminet.com/principal/solicitud.php
[6] Mart, MC, et al. (2001). NTP 429: Desinfectantes: caractersticas
y usos ms corrientes. Ministerio de Trabajo y Asuntos Sociales-
Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. Espaa.
[7] Castro, E. (2005) Norma de Utilizacin de Soluciones
Antispticas, Desinfectantes y Detergentes de Uso Hospitalario.
Hospital Provincial Neuqun. Argentina
[8] Delgado, A. (2006) Estudio de los mtodos de extraccin con el
microorganismo Trichoderma viride en la generacin de lactona (6-
Pentil--Pirona). Universidad Tcnica de Ambato, Facultad de
Ciencia e Ingeniera en alimentos.
[9] Calayag Sid., Cleanroom/ Cleanzone Protocol
http://www.slideshare.net/sidcalayag/basic-cleanroom-protocol
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[10] Manual/ Cuartos limpios
http://www.abaco.com.co/cuartos_limpios.html
[11] IMAGE. . (2009). IMAGE. Ingeniera, Marketing y gestin.
Recuperado el 15 de Febrero de 2013, de LIMPIEZA Y
ESTERILIZACIN IN SITU: http://www.image-ingenieria-
alimentaria.com/CIP/CIP.htm
[12] Manual: Sosa Tech. Soluciones Industriales. / Cuartos Limpios
[13] Manual: Abaco. NAFA National Air Filtration Association. /
Diseo de cuartos limpios.
[14] Cuartos limpios, Nuestro Laboratorio, Recuperacin de
Datoshttp://www.slideshare.net/sidcalayag/basic-cleanroom-protocol
[15] Antonio, Matachana. Esterilizacin por vapor. Jornada
Tcnica, 2005: 1-11.

[16] Black, J. 1999. Microbiology Principles and Exploration. Fourth
edition. John Wiley & Son, Inc.
[17] Grupo Hastinik., Aceros inoxidables y aleaciones
especiales.2008. 1-146