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Joo Batista Teixeira

Phellippe Arthur Santos Marbach
Marcelo de Oliveira Santos
Otimizao da metodologia de
embriognese somtica visando
a propagao clonal de
gentipos elite de cacau
(Theobroma cacao L.)
Braslia, DF
2002
ISSN 0102 - 0110
Outubro, 2002
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria
Centro Nacional de Pesquisa Recursos Genticos e Biotecnologia
Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento
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Tratamento de Ilustraes: Alysson Messias da Silva
Editorao Eletrnica: Alysson Messias da Silva
Capa: Alysson Messia da Silva
1
a
edio
1
a
impresso (2002): tiragem 150
Todos os direitos reservados.
A reproduo no autorizada desta publicao, no todo ou em
parte, constitui violao dos direitos autorais (Lei n
o
9.610).
Teixeira, Joo Batista.
Otimizao da metodologia de embriognese somtica
visando a propagao clonal de gentipos elite de cacau
(Theobroma cacao L.) / Joo Batista Tavares, Phellippe Arthur
Santos Marbach, Marcelo Oliveira Santos. - Braslia: Embrapa
Recursos Genticos e Biotecnologia, 2002.
xx p. - (Documentos / Embrapa Recursos Genticos e
Biotecnologia, ISSN 0102-0110; n. 79)
1. Embriognese - Cacau. 2. Propagao Clonal - Cacau. 3.
Theobroma cacao. I. Marbach, Phellippe Arthur Santos. II.
Santos, Marcelo de Oliveira. III. Ttulo. IV. Srie.
CDD 633.74 Ed. 21
Embrapa 2002
Agr., PhD., Biologia Celular, Embrapa-Recursos
Genticos e Biotecnologia.
E-mail: batista@cenargen.embrapa.br
Bilogo., M.S., Gentica, Embrapa-Recursos Genticos e
Biotecnologia.
Bilogo, M.S., Gentica, Universidade Federal de Juiz
de Fora. E-mail: mosantos@icb.ufjf.br
Autores
Sumrio
Introduo ........................................................................................ 7
Produo de mudas via embriognese somtica ................................. 8
Protocolo de embriognese somtica descrito por Lopez-Baez
et al. (1993) .................................................................................. 10
Protocolo de embriognese somtica descrito por Li et al. (1998) ..... 12
Comparao entre os protocolos de Lopez Baez et al. (1993) e
Li et al.. (1998) .............................................................................. 14
Otimizao da metodologia de embriognese somtica ..................... 15
Avaliao da Curva de crescimento do calo primrio ......................... 17
Efeito da Posio de corte do estaminide ...................................... 18
Comparao do cultivo sob iluminao e escuro ............................... 19
Influncia do pr tratamento em baixa temperatura ............................ 19
Comparao de botes florais de diferentes comprimentos ................. 20
Influncia da injria mecnica do estaminide .................................. 22
Efeito do Nitrato de Prata, inibidor da ao do etileno, quando aplicado
nos meios PCG, SCG e ED ........................................................... 23
Efeito do tiossulfato de prata, inibidor da ao do etileno, quando
aplicado nos meios PCG, SCG e ED ................................................ 23
Efeito do nitrato de prata, inibidor da ao do etileno, quando aplicado
alternativamente nos meios PCG, SCG e ED..................................... 24
Efeito de aminovinilglicina (AVG), inibidor da sntese do etileno, quando
aplicado nos meios PCG, SCG e ED ................................................ 25
Efeito do cido aminociclopropano (ACC), precursor imediato na rota de
sntese do etileno, quando aplicado no meio PCG ............................. 27
Efeito do cido Abscsico e sacarose, quando aplicados no meio ED.... 28
Avaliao de gentipos procedentes do Centro de Pesquisa do Cacau
(CEPEC-CEPLAC) ..................................................................... 30
Aclimatao das plntulas obtidas .............................................. 31
Concluses Gerais e Recomendaes .................................... 32
Referncias Bibliogrficas ......................................................... 33
Otimizao da metodologia
de embriognese somtica
visando a propagao clonal
de gentipos elite de cacau
(Theobroma cacao L.)
Introduo
O cacau (Theobroma cacao L.) j foi o segundo produto mais importante na lista
de exportaes brasileiras, sendo o Brasil o maior produtor mundial. O sul do
estado da Bahia chegou a responder por 95% da produo brasileira, com uma
rea de cultivo de mais de 700.000 hectares, o que representava 50% das
exportaes do estado da Bahia.
Entretanto, o agronegcio do cacau tem enfrentando uma crise sem precedentes
desde 1989, quando foi detectado no sul do estado da Bahia a doena
conhecida por vassoura de bruxa, causada pelo fungo Crinipellis perniciosa.
Mais de 90% da rea cultivada foi contaminada por este fungo, com perdas de
at 100% da lavoura.
A propagao clonal de gentipos superiores tem sido apontada como a melhor
estratgia para uma rpida recomposio das reas atingidas pela vassoura de
bruxa, e conseqentemente, recuperao da produo. Contudo, esta
recomposio deve ser conduzida de modo a ampliar a variabilidade gentica das
novas plantaes, visto que a base gentica estreita das plantaes foi um dos
fatores que contribuiu para que a vassoura de bruxa assumisse propores
desastrosas.
Variedades clonais tolerantes vassoura de bruxa e com alta produtividade j
foram desenvolvidas. Entretanto, para a manuteno desta caracterstica, as
8 Otimizao da metodologia de embriognese somtica visando a propagao clonal
de gentipos elite de cacau (Theobroma cacao L.)
novas variedades precisam ser propagados clonalmente. A propagao via
enxertia visando, sobretudo, a substituio de copa, vem sendo conduzida pela
Comisso Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC). Da mesma forma,
processos de propagao clonal utilizando o enraizamento de estacas foram
desenvolvidos e esto sendo utilizados com sucesso na recomposio das
lavouras cacaueiras.
Alm destes dois mtodos de propagao clonal, a micropropagao via
embriognese somtica tem sido apontada como mais uma alternativa, visto que,
por meio dela, possvel se alcanar altas taxas de propagao. Entretanto, esta
metodologia encontra-se ainda em fase de desenvolvimento.
A embriognese somtica tambm tem sua importncia no desenvolvimento de
uma metodologia eficiente de transformao gentica desta espcie tendo em
vista a possibilidade de introduzir genes para resistncia a doenas, que possam
contribuir para o controle da vassoura de bruxa bem como de outras doenas
que acometem a cultura do cacau.
A partir de 1999, a Embrapa-Recursos Genticos e Biotecnologia deu incio aos
primeiros ensaios visando avaliar as metodologias de multiplicao clonal de
cacau via embriognese somtica. Inicialmente, foram utilizadas cinco plantas
matrizes existentes no campo experimental da Embrapa-Recursos Genticos e
Biotecnologia, as quais foram denominadas de Cenargen-1, Cenargen-2,
Cenargen-3, Cenargen-4 e Cenargen-5. Posteriormente, aps a otimizao da
metodologia, gentipos procedentes da CEPEC-CEPLAC foram avaliados quanto
resposta embriogncia. Os resultados de trs anos de trabalho so
apresentados a seguir.
Produo de mudas via embriognese somtica
A formao de embries somticos em cacau foi primeiramente observada em
embries zigticos imaturos (Esan, 1977; Pence et al., 1979). A capacidade
regenerativa deste tipo de explante estava relacionada fase de desenvolvimento
dos embries (Pence et al., 1979). A mxima capacidade regenerativa foi
observada em embries com 4,5 a 10,0 mm de comprimento, equivalente a 100
a 110 dias aps a polinizao. Embora os embries somticos apresentassem
desenvolvimento normal at a fase cotiledonar, a sua germinao in vitro no foi
obtida. Posteriormente, com os trabalhos desenvolvidos por Novk et al. (1986),
foi possvel desenvolver uma metodologia de germinao dos embries
somticos.
Utilizando explantes de folhas novas obtidas a partir de estacas enraizadas,
originadas de rvores adultas, Litz (1986) relatou a obteno de embries
somticos pela adio ao meio de cultura de altas concentraes de cido
2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) na concentrao de 5 a 20 mg/L e
benzilaminopurina (BAP) na concentrao de100 a 140 mg/L. Entretanto, os
embries morreram na fase inicial de desenvolvimento. Embries somticos
derivados de tecidos de plantas adultas s foram obtidos a partir de 1988, com
os trabalhos publicados por Sndahl e al. (1993) e Figueira & Janick (1993),
que utilizaram tecidos nucelares como fonte de explantes. Posteriormente,
embries somticas e plntulas completas foram obtidas a partir de tecidos
florais (Lopez-Baez et al., 1993; Alemanno et al., 1996).
Mais recentemente, Li et al. (1998) relataram o desenvolvimento de um
protocolo de induo de embriognese somtica de alta freqncia utilizando o
tidiazurn (TDZ) como fonte de citocinina. Entretanto, uma grande variao foi
observada na freqncia de induo de calos embriognicos, de 0,8 a 100%, e
na mdia dos embries por calo embriognico, de 1 a 45,7. As plantas
derivadas de embrio somtico mostraram morfologia e caractersticas de
crescimento similares as das plantas derivadas de sementes.
Os protocolos descritos por Lopez-Baez et al. (1993) e Li et al.. (1998) so
considerados os mais eficientes em termos de resposta embriognica. Ambos
utilizam estaminides de botes florais fechados como explante inicial.
Entretanto, os procedimentos de cultivo so bem distintos. No protocolo de
Lopez-Baez et al. (1993), foram utilizados, alm dos estaminides, outros tipos
de explantes como estames, ptalas e base das peas florais, entretanto, com
resultados inferiores aos obtidos com estaminides.
Durante o trinio 1999/2001, foi feita, na Embrapa-Recursos Genticos e
Biotecnologia, uma reviso dos dois principais protocolos de regenerao de
plantas via embriognese somtica em cacau, i., os de Lopez Baez et al. (1993)
e Li et al. (1998).
Protocolo de embriognese somtica descrito por
Lopez-Baez et al. (1993)
De acordo com o protocolo descrito por Lopez-Baez et al. (1993), estaminides
retirados de botes florais fechados so cultivados em meio de induo (MI)
durante trs semanas. Aps este perodo, os explantes so transferidos para
meio de expresso (ME), permanecendo neste meio por mais 6 a 8 semanas,
durante o qual ocorre a formao de embries globulares. Em seguida, os
embries so transferidos para o meio de maturao (MM), permanecendo a por
4 a 6 semanas. Os embries desenvolvidos so transferidos para o meio de
germinao (MG), no qual so mantidos por mais 4 a 6 semanas. Finalmente, as
plntulas so transferidas para o meio de crescimento (MC), onde so mantidas
por 6 a 8 semanas. A maturao dos embries conduzida em ambiente com
baixa intensidade de luz (7molm
-2
s
-1
), a qual elevada para 60 molm
-2
s
-1
nas
fases posteriores. O fotoperodo utilizado o de 12 horas para todas as fases e
a temperatura mantida entre 26 e 27 C (Tabela 1).
Segundo Lopez-Baez et al. (1993), os embries somticos foram observados
aps 6 a 8 semanas no meio de expresso (ME) e a taxa de embriognese mais
alta, em meio contendo 1,0 mg/L de 2,4-D combinado com 0,25 mg/L de
kinetina, aps trs semanas, no meio de induo (MI). Em explantes mantidos
por mais de trs semanas neste meio, a taxa de embriognese observada
foi zero.
Este protocolo foi testado para vrios gentipos resultando em taxas de
embriognese que variaram de 1,3 a 18,7%. De 419 embries obtidos, 313
(74,7%) germinaram, dos quais 280 (89,5%) foram convertidos em plntulas
completas, com bom desenvolvimento do sistema radicular.
Tabela 1. Componentes do meio bsico de Murashige & Skoog (1962),
acompanhado das concentraes de benzilaminopurina (BAP) e cido
naftalenoactico (ANA) dos meios de iniciao (MI), expresso (ME), maturao
(MM), germinao (MG) e crescimento (MC), segundo protocolo de
embriognese somtica de cacau descrito por Lopez-Baez et al (1993).
Componentes(*) Meio Meio Meio Meio Meio
MI ME MM MG MC
KNO
3
1900 1900 1900 1900 1900
NH
4
NO
3
1650 1650 1650 1650 1650
CaCl
2
.2H
2
O 440 440 440 440 440
MgSO
4
.7H
2
O 370 370 370 370 370
KH
2
PO
4
170 170 170 170 170
Na
2
EDTA.2H
2
O 37,3 37,3 37,3 37,3 37,3
FeSO
4
.7H
2
O 27,8 27,8 27,8 27,8 27,8
MnSO
4
.4H
2
O 22,3 22,3 22,3 22,3 22,3
ZnSO
4
.7H
2
O 8,6 8,6 8,6 8,6 8,6
H
3
BO
3
6,2 6,2 6,2 6,2 6,2
KI 0,83 0,83 0,83 0,83 0,83
Na
2
MoO
4
.2H
2
O 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
CuSO
4
.5H
2
O 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025
CoCl
2
.6H
2
O 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025
Tiamina 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Piridoxina 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
cido Nicotnico 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Mio-inositol 100 100 100 100 100
Glicina 3 1,0 - - -
L-leucina 0,4 0,2 0,4 0,4 0,4
L-lisina 0,4 0,2 0,4 0,4 0,4
L-triptofano 0,2 0,1 0,2 0,2 0,2
L-arginina 0,4 0,2 0,4 0,4 0,4
2,4-D 1,0 - - - -
Kinetina 0,25 - - - -
AIA - - 0,05 - -
AIB - - 0,05 - -
ANA - - - 0,01 -
GA
3
- - 0,02 0,02 -
Continua...
Continuao da Tabela 1.
Protocolo de embriognese somtica descrito por Li
et al. (1998)
Segundo o protocolo descrito por Li et al. (1998), os explantes, constitudos
por estaminides de botes florais fechados, so inoculados em meio de
crescimento de calo primrio (PCG), por um perodo de duas semanas, sendo em
seguida transferidos para o meio secundrio de crescimento de calos (SCG), por
mais duas semanas. Finalmente, os explantes so transferidos para o meio de
desenvolvimento de embres (ED), onde permanecem por dois perodos de
cultivo de duas semanas cada, com renovao do meio ao final das duas
primeiras semanas. Embries bem desenvolvidos so transferidos finalmente para
o meio de germinao e regenerao de plantas (PR), onde permanecem at o
completo desenvolvimento da plntula, havendo renovao do meio a cada duas
semanas (Tabela 2). O meio bsico utilizado para PCG foi o DKW (Driver &
Kuniyuki, 1984), enquanto que o do SCG foi o WPM (Lloyd & McCown,
1980). O meio PR foi constitudo do meio bsico de DKW/5.
Foram testados, por estes autores, 19 gentipos, de trs grupos genticos
distintos. A percentagem de explantes embriognicos variou de 0,8 a 100%,
sendo que a maior freqncia foi de 0,8 a 45,8%, com 16 gentipos.
Apenas 3 gentipos responderam acima de 85%.
Componentes(*) Meio Meio Meio Meio Meio
MI ME MM MG MC
2-iP - - - 0,2 -
ABA - - - 1,0 -
Sulfato de - - 0,5 0,5 -
Adenina
gua de Coco 50,0 ml/L 100ml/L - - -
Carvo Ativado - - - 1,0g/L 0,15g/L
Sacarose 4,0% 4,0% - - -
Maltose - - 4,0% 8,0% ou -
Glucose - - - 4,0% 0,05%
Fitagel 0,2% 0,2% 0,2% 0,3% 0,3%
pH 5,5 5,5 5,6 5,8 5,8
(*)
Concentrao em mg/L, exceto quando especificado.
Tabela 2. Componentes dos meios PCG, SCG, ED e PR, segundo protocolo de
embriognese somtica de cacau, descrito por Li et al. (1998).
Componente (*) Meio PCG Meio SCG Meio ED Meio PR
KNO
3
- - - 200,0
NH
4
NO
3
1416,0 400,0 1416,0 283,2
CaCl
2
.2H
2
O 112,5 - 112,5 22,5
Ca(NO
3
)
2
1367,0 - 1367,0 273,4
CaCl
2
anidro - 72,5 - -
CaNO
3
- 386,0 - -
MgSO
4
.7H
2
O 361,49 180,3 361,49 72,3
KH
2
PO
4
265,0 17,0 265,0 53,0
K
2
SO
4
1559,0 990,0 1559,0 311,8
Na
2
EDTA 45,4 37,3 45,4 9,1
FeSO
4
.7H
2
O 33,8 27,8 33,8 6,76
MnSO
4
.H
2
O 33,5 22,3 33,5 6,7
ZnSO
4
.6H
2
O 17,0 8,6 17,0 3,4
H
3
BO
3
4,8 6,2 4,8 0,96
Na
2
MoO
4
.2H
2
O 0,39 0,25 0,39 0,078
CuSO
4
.5H
2
O 0,25 0,25 0,25 0,05
NiSO
4
.5H
2
O 0,005 - 0,005 0,001
Tiamina 2,0 10,0 2,0 2,0
Piridoxina - 1,0 - -
cido Nicotnico 1,0 1,0 1,0 1,0
Mio-inositol 200,0 100,0 100,0 100,0
Glicina 2,0 - 2,0 2,0
Glutamina 250,0 - - -
2,4-D 9,0 M 9,0M - -
TDZ 22,7 nM - - -
Kinetina - 1,4M - -
gua de Coco - 50,0 ml/L - -
Sacarose - - 3,0% 0,5%
Glucose 2,0% 2,0% 0,1% 1,0%
Fitagel 0,2% 0,22% 0,2% 0,17%
pH 5,8 5,8 5,8 5,8
(*) Concentrao em mg/L, exceto quando especificado.
Comparao entre os protocolos de Lopez Baez et al.
(1993) e Li et al. (1998)
Estaminides de botes florais fechados procedentes de cinco gentipos
(Cenargen-1, Cenargen-2, Cenargen-3, Cenargen-4 e Cenargen-5) foram
utilizados para comparao dos dois principais protocolos de regenerao de
plantas via embriognese somtica. Foram utilizados 100 estaminides de cada
gentipo por protocolo, divididos em quatro repeties de 25 estaminides
cada. As culturas foram incubadas em cmara de crescimento tipo B.O.D., no
escuro temperatura de 250,5 C.
Em ambos os protocolos, a calognese teve inicio no local de corte dos
estaminides e depois, eventualmente, se estendia por todo o explante.
Basicamente, formavam-se dois tipos de calo: calo tipo 1 e calo tipo 2. O calo
tipo 1 era bem desenvolvido e apresentava uma aparncia frivel e
esbranquiada, geralmente pouco embriognico. Por outro lado, o tipo 2 era
pouco desenvolvido, com crescimento restrito ao local de corte do explante e
tinha maior tendncia oxidao. Os calos tipo 2 se mostraram os mais
embriognicos, com embries surgindo preferencialmente da poro mais
oxidada do calo.
No protocolo de Lopez-Baez et al. (1993), o aparecimento de embries foi
observado, aps 8 semanas de cultivo no meio de expresso ME, ao passo que,
no protocolo de Li et al. (1998), a formao de embries teve incio ao final da
segunda semana no meio ED, quando j podiam ser observados embries desde
a fase cordiforme at incio da fase cotiledonar. Geralmente, em torno de metade
dos calos potencialmente embriognicos foram identificados nesta etapa do
processo e o restante, s ao final da quarta semana no meio ED.
Dois tipos de embries somticos foram observados: um de aspecto leitoso e
outro de aparncia translcida e colorao amarelada. O primeiro tipo
assemelhava-se ao embrio zigtico e era convertido mais facilmente planta,
quando transferido para meio de germinao. O segundo tipo representava a
maior parte dos embries produzidos pelo protocolo bsico de Li et al. (1998),
algo em torno de 70% e geralmente apresentava uma baixa taxa de converso
planta.
No geral, o protocolo descrito por Li et al. (1998) apresentou um desempenho
muito superior ao descrito por Lopez-Baez et al. (1993), tanto na freqncia de
formao de calo embriognico (de 11 a 42,2%, dependendo do gentipo)
como no nmero mdio de embries somticos por calo embriognico
(de 1,6 a 14; Tabela 3). Alm disso, a influncia do gentipo foi menor,
havendo induo de embriognese somtica em todos os gentipos testados
enquanto que, no protocolo descrito por Lopez Baez et al. (1993), a induo de
embriognese foi observada em apenas dois gentipos.
O gentipo Cenargen-2 apresentou maior freqncia de calos embriognicos em
ambos os protocolos, e foi utilizado como fonte de explantes nos experimentos
subseqentes.
Tabela 3. Eficincia de regenerao de dois protocolos de embriognese
somtica em cacau (Lopez-Baez et al., 1993; Li et al., 1998).
Protocolos Gentipos Freqncia de calo N
o
mdio de
embriognico (%) embries somticos
por calo
embriognico
Cenargen-1 1,4 2,0
Cenargen-2 2,0 1,5
Cenargen-3 0,0 0,0
Cenargen-4 0,0 0,0
Cenargen-5 0,0 0,0
Cenargen-1 26,4 14,2
Cenargen-2 42,2 9,3
Cenargen-3 14,0 2.0
Cenargen-4* - -
Cenargen-5 11,0 1,6
(*)
Nao apresentava botes florais na poca do experimento
Protocolo
descrito por
Lopez-Baez et
al. (1993)
Protocolo
descrito por Li
et al.(1998)
Otimizao da metodologia de embriognese somtica
Embora o protocolo descrito por Li et al.(1998) tenha dado uma resposta muito
superior a do Lopez-Baez et al. (1993), a taxa de formao de embries
translcidos foi muito alta, prximo a 70%. Alm do mais, verificou-se uma
grande variao tanto na freqncia de calo embriognico como no nmero de
embries somticos por calo em todos os gentipos testados.
A possvel causa desta variao ainda desconhecida, mas poderia estar
associada com algum fator relacionado ao explante, meio de cultura ou
condies ambientais de cultivo, como luz e temperatura.
Visando averiguar possveis fatores envolvidos no processo embriognico de
cacau, foi conduzida uma srie de experimentos, onde foram estudados:
1. Avaliao da Curva de crescimento do calo primrio
2. Efeito da Posio de corte do estaminide
3. Comparao do cultivo sob iluminao e escuro
4. Influncia do pr tratamento em baixa temperatura
5. Comparao de botes florais de diferentes comprimentos
6. Influncia da injria mecnica do estaminide
7. Efeito do Nitrato de Prata, inibidor da ao do etileno, quando aplicado nos
meios PCG, SCG e ED
8. Efeito do tiossulfato de prata, inibidor da ao do etileno, quando aplicado
nos meios PCG, SCG e ED
9. Efeito do nitrato de prata, inibidor da ao do etileno, quando aplicado
alternativamente nos meios PCG, SCG e ED
10. Efeito de aminovinilglicina (AVG), inibidor da sntese do etileno, quando
aplicado nos meios PCG, SCG e ED
11. Efeito de cido aminociclopropano (ACC), precursor imediato na rota de
sntese do etileno, quando aplicado nos meios PCG, SCG e ED
12. Efeito do cido Abscsico e sacarose, quando aplicado no meio ED
O protocolo descrito por Li et al. (1998) e o gentipo Cenargen-2 foram
utilizados nos experimentos descritos a seguir.
Botes florais foram coletados sempre pela manh, levados para o laboratrio e
mantidos em capela de fluxo laminar, onde foram desinfestados em alcool a
70% por 1 a 3 minutos seguido de tratamento com hipoclorito de sdio a 0,5%
por 10 minutos, sendo em seguida lavados trs vezes em gua destilada estril,
em banhos que duraram, pelo menos, cinco minutos cada. Os botes foram
deixados em copo de Becker tampados com uma placa de Petri estril at o
momento do uso. Em seguida, os botes foram abertos e os estaminides,
excisados com a ajuda de um bisturi. O corte para retirada dos estaminides
foram feitos invariavelmente na base, onde eles se inserem no receptculo floral.
Os estaminides foram inoculados no meio primrio de crescimento de calos,
PCG, (Tabela 2) em nmero de 20 por placa, em, pelo menos, quatro repeties
por tratamento. As placas foram incubadas no escuro, a uma temperatura de
250,5 C. Aps duas semanas no meio PCG, os explantes foram transferidos
para o meio secundrio de crescimento de calos, SCG, (Tabela 2), permanecendo
neste meio por mais duas semanas. Ao final deste perodo, os explantes foram
subcultivados em meio para desenvolvimento de embrio, ED (Tabela 2), onde
permaneceram por quatro semanas, havendo renovao de meio ao final da
segunda semana. Neste momento, foram feitas as avaliaes de nmero de calos
embriognicos e nmero de embries por calo.
Avaliao da Curva de crescimento do calo primrio
A calognese foi observada inicialmente no local de corte dos estaminides e,
eventualmente, depois, se estendia por todo o explante. A taxa de crescimento
dos calos foi baixa, at a quarta ou quinta semana de cultivo. A partir da quinta
semana, j no meio ED observou-se uma acelerao do crescimento. A matria
fresca dos calos aumentou em seis vezes, ao final da oitava semana de cultivo,
quando comparado com o peso da matria fresca aps cinco semanas de cultivo
(Fig. 1).
Fig. 1. Curva de crescimento do calo primrio durante os dois primeiros meses de
cultivo, de acordo com o protocolo descrito por Li et al. (1998).
O aumento da matria seca seguiu um padro muito parecido com o da matria
fresca, o que sugere que o crescimento observado se deveu no apenas a um
aumento no tamanho das clulas, mas igualmente no nmero de clulas dos
calos (Fig. 2).
Fig. 2. Curva de crescimento do calo primrio durante os dois primeiros meses de
cultivo, de acordo com o protocolo descrito por Li et al. (1998).
Efeito da Posio de corte do estaminide
A conexo do estaminide com o receptculo uma regio de transio entre
este e o estaminide. Por essa razo, a posio de corte do estaminide pode
influenciar de alguma forma a resposta embriognica. Visando padronizar a
posio de corte, os estaminides foram excisados em trs posies distintas:
posio 1, na base, junto ao receptculo, onde eles se encontram fundidos com
os estames; posio 2, no ponto onde os estames e estamindes se separam
logo acima do receptculo e posio 3, na posio mediana dos estaminides.
Verifica-se, pela Tabela 4, que tanto a freqncia de calo embriognico quanto o
nmero mdio de embries somticos por calo embriognico foram
substancialmente menores nos estaminides cortados na posio 3.
Entretanto, nas posies de corte 1 e 2, no houve diferenas marcantes entre
si, o que sugere que os tecidos da base dos estaminides so os mais
propensos resposta embriognica.
Os calos oriundos dos estaminides cortados na posio 3 foram
predominantemente do tipo 1, i., bem desenvolvidos e com pouca oxidao
fenlica, justamente os do tipo no embriognicos.
Tabela 4. Influncia da posio de corte do estaminide na freqncia de
formao de calos embriognicos e nmero de embries por calo.
Posio de Corte Calo Embriognico (%) Nmero de Embries/Calo
Posio 1 45,834,2
A
5,670,5
Posio 2 50,836,1 5,670,5
Posio 3 1,671,2 1,331,0
(A)
Intervalo de confiana a 95% de probabilidade
Comparao do cultivo sob iluminao e escuro
O efeito da luz na induo de embriognese somtica em cacau foi avaliada
expondo os estaminides a um fotoperodo de 16 horas durante o cultivo nos
meios de induo ( PCG e SCG). Posteriormente, os calos oriundos destes
explantes foram cultivados no meio ED, no escuro, para a diferenciao dos
embries.
A presena de luz durante o cultivo dos estaminides nos meios de induo
(PCG e SCG) teve efeito altamente inibitrio na induo de calo embriognico e
no nmero de embries por calo embriognico (Tabela 5). Todos os
estaminides cultivados na presena de luz deram origem a calos do tipo 1.
Tabela 5. Influncia da luz na freqncia de formao de calos embriognicos e
nmero de embries por calo.
Tratamento Calo Embriognico (%) Nmero de Embries/Calo
Escuro 36,674,2
A
10,004,5
Luz 3,334,6 0,330,5
(A)
Intervalo de confiana a 95% de probabilidade.
Influncia do pr tratamento em baixa temperatura
O tratamento de flores e inflorescncias em baixa temperatura tem sido utilizado
para estimular a resposta embriognica em anteras de vrias espcies. Os gros
de plen tratados com baixas temperaturas por perodos em torno de uma
semana apresentam uma resposta embriognica mais elevada em comparao
com explantes no tratados. Os efeitos da baixa temperatura variam de espcie
para espcie, mas, em geral, leva a uma desacelerao do metabolismo celular.
Entretanto, pouco se sabe sobre os efeitos da baixa temperatura sobre a
reprogramao celular, necessria para que clulas no embriognicas se tornem
embriognicas durante o cultivo in vitro.
Para avaliar o efeito de baixa temperatura, botes florais de cacau foram
mantidos a 41
o
C durante 24 horas antes da exciso dos estaminides e
inoculao no meio PCG. Embora o intervalo de confiana tenha sido muito
elevado, houve uma clara tendncia de reduo da freqncia de calos
embriognicos bem como do nmero de embries por explante em pr
tratamento com baixa temperatura (Tabela 6).
Tabela 6. Influncia do pr tratamento a 41
o
C durante 24 horas na
freqncia de formao de calos embriognicos e nmero de embries por calo.
Controle 46,6712,8 5,330,3
Pr Tratamento 26,6716,6 2,330,7
(A)
Comparao de botes florais de diferentes comprimentos
Diferentes tipos de explantes tem sido utilizados em embriognese somtica de
cacau. Entretanto, dos tecidos somticos de cacau, que podem dar origem a
clones de plantas matrizes apenas tecido nucelar, ptalas e estaminides tm
dado resultados satisfatrios, sendo os estaminides os que mais respondem
embriognese in vitro.
O grau de desenvolvimento de um determinado tecido ou rgo influencia a
resposta embriognica e, em geral, tecidos mais novos ou rgos menos
desenvolvidos respondem melhor. Desta forma, visando verificar a influncia da
idade e do grau de desenvolvimento na embriognese somtica de cacau, botes
florais de 4, 6 e 8 mm foram avaliados. Estes tamanhos foram escolhidos por
serem facilmente distinguidos entre si e, alm disso, os botes de 3 mm eram de
difcil manipulao e os maiores que 8 mm j se encontravam no incio da
antese, com abertura dos botes florais.
Observa-se pela Tabela 7 que a freqncia de calos embriognicos e nmero de
embries por calo aumentaram com o aumento do tamanho do boto floral.
A freqncia de calos embriognicos variou de 11,88% para botes florais de
4,0mm para 45% em botes florais de 8,0mm, com valores intermedirios para
botes florais de 6,0mm. O valor mximo de freqncia de calos embriognicos
encontrado pode ser considerado elevado tendo como referncia os resultados
apresentados por Li et al. (1998).
No se sabe as razes pelas quais botes florais maiores tenham dado os
melhores resultados, j que o esperado era que os mais novos, com menor grau
de diferenciao viessem a responder com taxas mais elevadas de embriognese.
O nmero de embries somticos por calo embriognico foi igualmente
influenciado pelo tamanho do boto floral, variando de 4,38 a 7,50.
Entretanto, possvel observar que a freqncia de calos embriognicos foi mais
afetada pela reduo do tamanho do boto floral que o nmero de embries por
calo embriognico.
Uma possvel hiptese para explicar a influncia do tamanho do boto floral na
resposta embriognica a que diz respeito aos nveis endgenos de hormnios
durante o desenvolvimento floral e antese. sabido que, prximo da antese,
ocorre um aumento do nvel endgeno de substncias hormonais, principalmente
auxina e etileno, que regulam o processo de abertura da flor. O etileno continua
agindo mesmo aps a fecundao e responsvel pela queda dos restos florais.
Assim, o etileno endgeno pode estar exercendo algum efeito na induo de
embriognese somtica de cacau.
Tabela 7. Influncia do tamanho do boto floral na freqncia de formao de
calos embriognicos e nmero de embries por calo.
Tamanho do Boto Floral (mm) Calo Embriognico (%) Nmero de
Embries/Calo
4,0 11,882,6
A
4,381,2
6,0 32,506,4 6,001,0
8,0 45,005,0 7,500,9
(A)
Influncia da injria mecnica do estaminide
Durante o processo embriognico somtico, tm sido observadas respostas
distintas ao etileno. Em alguns sistemas o etileno atua de forma a estimular a
resposta embriognica ao passo que em outros, o efeito inibitrio. Em caf,
verificou-se efeito estimulatrio ou inibitrio do etileno sobre a resposta
embriognica, o que est de acordo com as respostas verificadas normalmente
para reguladores de crescimento, onde se verificam efeitos estimulatrios em
concentraes timas e efeitos inibitrios em concentraes supra timas
(Hatanaka et al., 1995).
Visando testar o efeito da injria mecnica, foram feitas pequenas incises com o
auxlio de um bisturi ao longo dos estaminides em botes florais de 8,0 mm.
Embora tenha havido um aumento de 5,84 % na freqncia de explantes com
formao de calos embriognicos, esta diferena foi pouco expressiva. Por outro
lado, a reduo do nmero de embries por explante foi considervel, de 5,67
para 3,33 embries (Tabela 8).
Esses resultados podem ser considerados pouco conclusivos, tendo em vista
que as incises podem ter causado outros distrbios que no apenas o da
sntese de etileno.
Tabela 8. Influncia da injria mecnica no estaminide na freqncia de
formao de calos embriognicos e nmero de embries por calo.
Sem injria 50,837,5
A
(89,7) 5,670,6 (100)
Com injria 56,676,4 (100) 3,330,5 (58,7)
(A)
Visando investigar mais cuidadosamente o papel do etileno na induo de
embriognese somtica de cacau, foram conduzidos alguns experimentos para
avaliar o efeito de inibidores da ao e sntese de etileno, como ons prata na
forma de nitrato e tiosulfato de prata e acetovinilglicina (AVG), respectivamente.
Por outro lado, foi avaliado o efeito da adio de aminociclopropano (ACC),
substncia precursora da sntese de etileno.
Efeito do Nitrato de Prata, inibidor da ao do etileno,
quando aplicado nos meios PCG, SCG e ED
O on prata considerado um dos mais potentes inibidores da ao do etileno.
Embora este efeito no seja bem compreendido, supe-se que o on prata se liga
a um possvel receptor de etileno na membrana plasmtica celular, com isso
impedindo que as molculas de etileno se liguem a este receptor e
conseqentemente desencadeie a ao especfica desse hormnio.
A adio do nitrato de prata em todos os meios, mesmo em concentraes
baixas (1M) foi suficiente para inibir completamente a induo de formao de
calos embriognicos, o que sugere algum papel do etileno no processo
embriognico de cacau (Tabela 9).
Tabela 9. Influncia de nitrato de prata na freqncia de formao de calos
embriognicos e nmero de embries por calo, quando adicionado nos meios
PCG, SCG e ED.
Nitrato de Prata (M) Calo Embriognico (%) Nmero de Embries/Calo
0,0 59,333,3
A
3,870,1
1,0 0,0 0,0
5,0 0,0 0,0
10,0 0,0 0,0
20,0 0,0 0,0
(A)
Efeito do tiossulfato de prata, inibidor da ao do etileno,
quando aplicado nos meios PCG, SCG e ED
O nitrato de prata, por ser uma substncia oxidante pode acarretar efeitos
indesejveis ao meio de cultura e conseqentemente ao explante. Desta forma,
foi utilizado, para fins comparativos, o tiossulfato de prata, como fonte de ons
prata, considerado menos txico clula.
Observa-se, pela Tabela 10, que, de forma similar ao nitrato de prata, o
tiossulfato de prata foi inibitrio formao de calos embriognicos, em
concentraes eqimolares. A induo de calos embriognicos de 2,5% para
1,0 M correspondeu a apenas 6,0% da obtida na ausncia de tiossulfato de
prata. Da mesma forma, observa-se uma reduo na mdia de embries por calo
embriognico de 7,67 para 1,6 embries para o mesmo tratamento.
Efeito do nitrato de prata, inibidor da ao do etileno,
quando aplicado alternativamente nos meios PCG,
SCG e ED
Como o nitrato de prata parece apresentar resultados muito parecidos com os do
tiossulfato de prata, foi adicionado alternativamente nos meios PCG, SCG, ED
(primeiro cultivo) e ED (segundo cultivo), com o objetivo de avaliar o efeito da
prata em diferentes fases do processo embriognico (Tabela 11).
A adio de nitrato de prata em todos os meios, como observado anteriormente,
inibiu totalmente a embriognese somtica. Da mesma forma, quando adicionado
no meio PCG, a inibio foi completa. A adio no meio SCG resultou numa
inibio, de 52,7% em relao ao controle. Por outro lado, a adio de nitrato de
prata no meio ED, seja no primeiro ou segundo subcultivo no resultou em
inibio da embriognese havendo mesmo um pequeno aumento na taxa
embriognica de 16,9 e 14,8%, respectivamente, em relao ao controle.
O nmero de embries por calo foi afetado de forma similar pela presena de
nitrato de prata nos diferentes meios.
Os resultados do presente experimento sugerem que a inibio da ao do
etileno pelos ons prata afetam negativamente a induo de embriognese
somtica em estaminides de cacau durante as primeiras semanas de cultivo,
quando os explantes se encontram no meio PCG, o qual contem 2,4-D e TDZ,
sabidamente estimuladores da sntese de etileno em tecidos vegetais.
Tabela 10. Influncia do tiossulfato de prata na freqncia de formao de calos
embriognicos e nmero de embries por calo, quando adicionado nos meios
PCG, SCG e ED.
Tiossulfato de prata (M) Calo Embriognico (%) Nmero de Embries/Calo
0,0 41,676,0
A
7,671,6
1,0 2,501,5 1,500,8
5,0 0,00 0,00
10,0 0,00 0,00
20,0 0,00 0,00
A
Portanto, o etileno parece intermediar a resposta embriognica em estaminides
de cacau. A presena de ons prata no tem efeito inibitrio nas fases posteriores
de cultivo, sobretudo, no meio ED tanto no primeiro quanto no segundo
subcultivo, havendo mesmo uma pequena resposta estimulatria, o que sugere
que o etileno no tem nenhum papel relevante nessas fases de cultivo.
importante ressaltar que o aparecimento dos embries s se inicia no final do
primeiro cultivo de duas semanas no meio ED.
Tabela 11. Influncia de nitrato de prata na concentrao de 5,0 M na
freqncia de formao de calos embriognicos e nmero de embries por calo,
quando adicionado alternativamente nos diferentes meios.
Adio de Nitrato de Prata Calo Embriognico (%) Nmero de
Embries/Calo
Em nenhum dos meios 40,505,3
A
11,171,6
Em todos os meios 0,0 0,0
Apenas no meio PCG 0,0 0,0
Apenas no meio SCG 21,334,4 8,001,7
Apenas no meio ED 47,333,5 8,001,7
(primeiro cultivo)
(segundo cultivo)
(A)
Efeito de aminovinilglicina (AVG), inibidor da sntese do
etileno, quando aplicado nos meios PCG, SCG e ED
Aminovinilglicina (AVG) uma substncia inibidora especfica da sntese de
etileno. Com isso, a sua adio aos diferentes meios de cultura deveria inibir a
induo de embriognese de forma similar ao ocorrido com os ons prata tanto
do nitrato quanto do tiossulfato.
Observa-se, pela Tabela 12, que a adio de AVG inibiu a induo de formao
de calos embriognicos em at 66,7% para a concentrao mais elevada. Parece
haver uma estabilizao do nvel de inibio de AVG sobre a embriognese, o
que sugere a presena endgena de etileno anteriormente adio de AVG ou
que a presena de AVG, na forma como foi aplicado, no suficiente, mesmo na
maior concentrao, para inibir totalmente a sntese de etileno. Entretanto, parece
no haver dvida de que o etileno deve estar envolvido na reprogramao das
clulas somticas para clulas embriognicas em estaminides de cacau.
Tabela 12. Influncia de AVG na freqncia de formao de calos embriognicos
e nmero de embries por calo, quando adicionado no meio PCG.
AVG (M) Calo Embriognico (%) Nmero de Embries/Calo
0,0 65,006,6
A
8,951,4
1,0 58,176,2 9,681,6
10,0 31,676,1 6,301,4
20,0 23,173,4 10,271,2
40,0 21,676,9 7,171,6
(A)
Efeito de aminovinilglicina (AVG), inibidor da sntese do etileno, quando aplicado
alternativamente nos meios PCG, SCG e ED. A adio de AVG alternativamente
nos diferentes meios resultou numa inibio da embriognese semelhante ao
observado para ons de prata, i., a inibio foi maior quando aplicada nos meios
PCG e SCG. Quando adicionado no meio ED, principalmente no segundo
subcultivo, a inibio foi substancialmente menor. Este resultado est de acordo
com o observado para ons de prata e sugere a importncia da sntese e ao do
etileno na fase de induo de embriognese, i. , nas fases iniciais de cultivo,
meios PCG e SCG (Tabela 13).
Tabela 13. Influncia de AVG na concentrao de 40,0 M na freqncia de
formao de calos embriognicos e nmero de embries por calo, quando
adicionado alternativamente nos meio PCG, SCG e ED.
Adio de AVG Calo Embriognico (%) Nmero de Embries/Calo
Em nenhum dos meios 56,6711,6
A
5,671,0
Em todos os meios 35,008,3 9,000,5
Apenas no meio PCG 26,677,4 7,002,6
Apenas no meio SCG 31,678,1 5,331,4
(primeiro cultivo)
(Segundo cultivo)
(A)
Efeito do cido aminociclopropano (ACC), precursor
imediato na rota de sntese do etileno, quando aplicado no
meio PCG
O aminociclopropano (ACC) um precursor imediato na rota de sntese do etileno.
Sua adio ao meio de cultura foi avaliada com o intuito de verificar o papel do 2,4-D
e TDZ na sntese de etileno. Desta forma, estas duas substncias reguladoras de
crescimento foram alternativamente substitudas por ACC no meio PCG, onde foi
observado maior efeito dos inibidores de sntese e ao do etileno e respectiva inibio
do processo embriognico. Observa-se que a adio de 10 e 50 M de ACC no
resultou em aumento da resposta embriognica quando adicionado no meio PCG
desprovido de 2,4-D (Tabela 14).
Entretanto, quando a adio de ACC foi conduzida em meio PCG desprovido de TDZ,
observou-se um aumento significativo de 10,8 para 29,7% do controle, mostrando um
claro efeito do ACC e, conseqentemente, do etileno como um dos possveis
intermediadores do papel do TDZ na induo de embriognese somtica em cacau
(Tabela 15). Possivelmente, concentraes maiores de ACC podero acarretar em
aumentos adicionais na resposta embriognica na ausncia de TDZ.
Em relao ao nmero de embries por calo, no se observou nenhum padro de
resposta definido (Tabela 15).
Deve-se notar igualmente que a ausncia de 2,4-D no meio PCG resultou numa
completa inibio do processo embriognico (Tabela 14). De forma semelhante, a
ausncia de TDZ no meio PCG acarretou uma drstica reduo na taxa de formao
de calos embriognicos, de 49,33 para 5,33% (Tabela 15). Estes resultados
constituem evidncias de que a combinao de 2,4-D e TDZ no meio PCG tem um
efeito sinergstico no desencadeamento do processo embriognico em estaminides de
cacau.
Tabela 14. Influncia de 2,4-D e ACC no meio PCG, na freqncia de formao
de calos embriognicos e nmero de embries por calo.
Controle 60,002,3
A
8,671,2
2,4-D(-) 0,00 0,00
2,4-D(-)+10M ACC 0,00 0,00
2,4-D(-)+50M ACC 0,00 0,00
(A)
Tabela 15. Influncia de TDZ e ACC no meio PCG, na freqncia de formao de
calos embriognicos e nmero de embries por calo.
Controle 49,337,3
A
4,000,6
TDZ(-) 5,331,3 4,332,4
TDZ(-)+10M ACC 5,332,6 3,002,0
TDZ(-)+50M ACC 14,671,3 3,670,3
(A)
Efeito do cido Abscsico e sacarose, quando aplicados no
meio ED
Embora a taxa de induo de calos embriognicos para o gentipo Cenargen-2
tenha sido prxima a 50%, com uma mdia de 8 embries por calo
embriognico, o ndice de converso desses embries em plntulas foi
inicialmente abaixo de 20%.
Dois tipos de embries foram observados aps o cultivo no meio ED, um de
aspecto branco leitoso e outro branco amarelado, de aspecto translcido.
Observou-se que a taxa de converso de embries translcidos era muito baixa,
prxima de zero, ao passo que os embries leitosos apresentavam uma elevada
taxa de converso a plantas, em torno de 60%.
Visando aumentar a percentagem de formao de embries leitosos, embries
imaturos com comprimento mdio de 3,9 mm foram inoculados no meio ED,
contendo diferentes concentraes de sacarose combinadas com diferentes
concentraes de cido abscsico. Aps um ms de cultivo nestes meios, foi
feita nova avaliao do comprimento dos embries e verificou-se que o
comprimento mdio em todos os tratamentos foi de 8,9 mm.
Aps 30 dias de cultivo, nos diferentes tratamentos, verificou-se uma reduo
da percentagem de formao de embries translcidos e um respectivo aumento
da percentagem de formao de embries leitosos (Tabela 16), tanto em funo
do aumento da concentrao de ABA quanto na de sacarose. A percentagem de
embries translcidos foi de 71,1 na presena de 3% e 0,0 M de ABA, contra
29,4 para 15 M de ABA, para a mesma concentrao de sacarose. Por sua
vez, a percentagem de embries leitosos foi de 28,9 e 70,6, respectivamente,
para as mesmas concentraes. Entretanto, para o nvel de ABA de 0,0 M, a
percentagem de formao de embries leitosos aumentou de 28,9 para o nvel
de sacarose de 3% para 86,1 para 10,0% de sacarose. Portanto, h evidncias
de que a sacarose parece ter um efeito superior ao ABA na formao de embries
leitosos, em detrimento da formao de embries translcidos. Observa-se,
igualmente, um efeito complementar na combinaes mais elevadas de ABA e
sacarose.
Aps os tratamentos de ABA x sacarose, apenas os embries leitosos
provenientes dos respectivos tratamentos foram transferidos para meio de
germinao, em meio PR, sem ABA e com a concentrao de sacarose de 3%,
onde permaneceram por 60 dias at serem avaliados em termos de germinao.
A taxa de germinao aps o cultivo por sessenta dias em meio PR mostrou um
efeito acentuado dos tratamentos de cido abscsico e sacarose (Tabela 16).
A taxa de germinao subiu de 58,3 para 99,3 em funo dos tratamentos
utilizados. Em nveis baixos de sacarose, observou-se uma influncia positiva do
cido abscsico. Entretanto, em nveis mais altos de sacarose, 8% e 10%, a
influncia do cido abscsico foi sensivelmente menor.
De qualquer forma, pode-se concluir que, tanto a presena de ABA quanto de
sacarose em concentraes mais altas que 3% contribuem para a taxa de
formao de embries translcidos e aumento da taxa de embries leitosos,
havendo um efeito sinergstico entre estes fatores. O efeito de ABA e sacarose
refletem igualmente na taxa de germinao dos embries leitosos, i. , mesmo
para embries leitosos, observou-se uma diferente capacidade de germinao em
funo do prvio tratamento com ABA e sacarose.
Tabela 16. Influncia do teor de sacarose combinada com cido abscsico no
meio ED na formao de embrio translcido e leitoso, aps 30 dias de cultivo,
bem como na taxa de germinao de embries leitosos aps 60 dias de cultivo
em meio PR, sem ABA na presena de 3% de sacarose.
Sacarose(%) cido Embrio Embrio Taxa de
Abscsico (M) Translcido (%) Leitoso (%) Germinao
leitosos (%)
3 0 71,116,7
A
28,916,8 58,36,5
5 33,614,2 66,414,2 92,54,9
10 37,117,6 62,917,6 95,03,9
15 29,49,7 70,69,8 93,04,3
6 0 19,57,3 80,57,3 83,57,5
5 14,36,5 85,76,4 95,05,4
10 19,56,4 80,56,4 94,14,9
15 12,88,4 87,28,4 97,33,4
8 0 13,26,4 86,86,4 86,48,2
5 4,73,2 95,33,2 97,53,8
10 8,88,1 91,28,1 98,12,0
15 10,87,0 89,27,8 97,98,0
10 0 13,97,6 86,17,6 81,99,7
5 5,03,1 95,03,1 98,81,9
10 3,63,8 96,43,8 99,31,3
15 6,84,8 93,24,8 97,83,9
Mdia Geral -
(A)
Avaliao de gentipos procedentes do Centro de
Pesquisa do Cacau (CEPEC-CEPLAC)
Aps os testes de otimizao do processo embriognico em cacau, oito
gentipos do campo experimental do CEPEC-CEPLAC foram avaliados quanto a
resposta embriognica.
A resposta embriognica variou substancialmente de acordo com o gentipo, de
0,0 para o gentipo SGU-2 a 25,6 para o gentipo VB-902. O nmero de
embries por calo embriognico variou de 0,0 a 7,8 dependendo do gentipo.
Aclimatao das plntulas obtidas
As plntulas obtidas pela germinao dos embries somticos foram plantadas
em tubetes contendo Plantmax
e imediatamente transferidas para casa de

vegetao para aclimatao, quando apresentavam 5 a 8 cm de altura e 2 ou 3
pares de folhas. A taxa de pegamento, neste novo ambiente, foi alta, embora
no tenha sido feita uma avaliao criteriosa sobre este procedimento. Para
propiciar uma melhor sobrevivncia em casa de vegetao, tomou-se o cuidado
de deixar as plantas em frascos Magenta
por algumas semanas, perodo durante

o qual ocorreu uma substancial desidratao do meio de cultura.
As plantas encontram-se atualmente com 15 pares de folhas bem desenvolvidas
e apresentam um desenvolvimento aparentemente normal.
Tabela 17. Freqncia de formao de calos embriognicos e nmero de
embries por calo em estaminides de oito gentipos procedentes da CEPLAC.
Gentipo Calo Embriognico(%) Nmero de embries/calo
SGU-2 0,0 0,0
CEPEC-51 0,50,9
A
1,52,7
SCAV-6 2,02,8 0,91,3
TSH-792 3,33,7 0,80,9
CCN-10 12,54,5 3,81,2
TSH-1188 14,06,0 7,83,9
VB-514 19,215,8 6,32,8
VB-902 25,614,9 5,52,2
(A)
Concluses Gerais e
Recomendaes
Ao final, dos experimentos conduzidos, chegou-se s seguintes concluses:
A. O protocolo descrito por Li et al. (1998) foi expressivamente superior ao de
Lopez-Baez et al. (1993);
B. Houve influncia marcante do gentipo sobre a resposta embriognica;
C. O estaminide, em experimentos preliminares, apresentou melhor resposta
embriognica, quando comparado com outras fontes de explantes;
D. Botes florais bem desenvolvidos, coletados, logo antes da abertura da flor
foi a melhor fonte de estaminides;
E. O estaminide deve ser excisado pela base, tomando-se o cuidado de permitir
a reteno de alguma parte do receptculo. Este tecido parece ser o mais
embriognico;
F. O estaminide deve ser cultivado no escuro e sob temperatura em torno de
25
o
C;
G. Qualquer tipo de injria mecnica ao estaminide pode afetar sua resposta
embriognica;
H. A presena de 2,4-D e TDZ no meio PCG fundamental para se obter uma
alta taxa de embriognese;
I. H evidncias de que o etileno um intermediador da ao do TDZ na induo
de embriognese em estaminides de cacau e seu efeito ocorre nas
primeiras duas semanas de cultivo, isto , no meio PCG;
J. Dois tipos de embries foram observados ao final da quarta semana de cultivo
no meio ED: leitoso e translcido amarelado;
K. O embrio leitoso apresentou uma taxa de germinao e converso em plantas
muito superior aos embries translcidos;
L. O tratamento com altas concentraes de sacarose no meio ED resultou na
formao de uma maior percentagem de embries leitosos;
M. Em baixas concentraes de sacarose, a presena de ABA levou ao
aparecimento de uma maior percentagem de embries leitosos;
N. A taxa de germinao e converso em plantas chegou a 99,3% para os
embries leitosos.
O. As plntulas apresentaram um bom desenvolvimento na casa de vegetao
com fentipo parecido ao de plntulas derivadas de sementes.
P. A resposta embriognica dos gentipos procedentes da CEPLAC variou
substancialmente entre si.
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