UNIVERSIDAD

NACIONAL
DE PIURA
FACULTAD
DE MEDICINA
HUMANA
PRCTICA
NO 2
CROMATOGRAFA
Es un mtodo
analtico
de separacin
sustancias pueden
ser coloreadas,
o no,
de sustancias
de una mezcla,
estas
gases
y compuestos
volatilizables.
Partes
del Sistema
Cromatogrfico:
1. Fase Fija: es ra parte
donde
se reariza ra separacin
der componente,
pueden
ser papel
silicagel, gas
inerte, etc.
2- Fase
Mvir:
es
,er
sorvente que
a travs
de ra fase fija va a erudir
arrastrando
con el soluto que
se quiere
,"p.rri.-
Caractersticas
para
la separacin
:
1. Peso del soluto.
2. Polaridad
del soluto y del solvente.
3. Afinidad
at sotuto poi
ta parte
fija.
4. Coeficiente
de participacin.
Fases
de la Cromatografa:
1' Extraccin: procesamiento
de la muestra para
extraer
el principio
activo por
mtodos
fsicos:
Mecnicos y SotuOitiOaO.
2' Concentracin:
apricando
sorventes
orgnicos
vortires.
3' Cromatograma'
poner
la muestra para
su recorrido
a travs de la fase fija.
4' Revelado:
usar sustancias patrones,
densitmetro
y reactivo
apropiado.
Tipos
de Cromatografa:
1
cromatografa
de papel
(mono y bidimensional).
?
cromatografa
capa fina.'
9
cromatografa
de gas.
I
cromatografa
de particin
o reparto.
:
cromatografa
de exclusin
rnoi".ut.r.
Sphadex.
I
cromatografa
de intercambio
Onico.
7. cromatografa
de columna.
8. cromatografa
por
electroforesis.
LABORATORIO
3 ESTRUCTURA
Y TUruCIru
CELULAR Y TISULAR
II
UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA
FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
L cromatografa
de exclusin
molecular'
Precipitacin
isoelctrica
:
La solubilidad
de la mayor
parte de
protenas globulares se h.alla
piot,rnOa.ente influiOa
por el'pH del sistema, casi todas las protenas muestran
un mnimo de solubilidt'd
"rnqu"
el pH al que ello ocurre varia de una a otra'
El pH al
que una
protena muestra un mnimo de solubilidad
es su
pH
isolctrico definido iomo aquel valor del pH al que la molcula no posee carga
lectrica.
Ejemplo: ovoalbmina
(huevo), pH 4.6, ureasa
pH 5; en esas
condiciones
no exist,e repulsin
electrosttica
entre molculas
de protenas
vecinas
y tiende a coalcer
y precipitar, sin embargo' cuando los
Valores del
pH estn
por encima o debajo del punto isoelctrico,
todas las
molculas de
protenas poseen carga elctiica neta del mismo signo' Por dicha
raznse repelen mutuamente
impiiendo
las coalescencias
de molculas
para
formar agregados
insolubles'
Puesto
que las diferentes
protenas poseen valores de
pH isoelctrico
diferente, con frecuencia
pueden ."purur.e
una de otra, mediante
precipitacin
isoelctrica,
cuando el
pH de una mezcla de protena se ajusta al
pH
isoelctrico de uno de sus componentes'
La mayor
parte o casi todo el componente
precipitar quedando solucin de
proten-as cuyos valores de
pH isoelctrico
precipitado
permanece en su
conformacin
nativa
-
y pueoe disolverse
en un medio a
pH apropiado
y
concentracin
salina adecuada'
PRIMERA
PARTE
MTODOS
CROMATOGREIC9S
Y DE SEPARACIN
EN LA
DETERMIruIT.I
DE AMINOCIDOS
Y PROTENAS
1. DISEO EXPERIMENTAL
A) CROMATOGRAFA
EN PAPEL:
. Les ser dado un
papel whatman
N-1 cortado en tiras de 15.25 cm'
Aproximadamente,
manipule el papel por las esquinas evitando agarrarlo en
lo posible, colquelo
sobre un papel limpio'
. Engrape un hilo a la parte superior del
papelWhatman'
. con un lpiz marque el punto de origen, trazando una lnea, esta debe estar
por encima de la altura del solvente'
LABORATORIO
3
ESTRUCTURA Y TUI'CIru CELULAR Y TISULAR II
UNIVERSIDAD
NACIONAL
DE PIURA
FACULTAD
DE MEDICINA
HUMANA
'
Aplique
utirizando ros tubos capirares
ras diferentes
muestras
segn er
esquema (no
toque el papel
con los dedos).
NolA:
Para apricar ra muestra
tocar er paper
revemente
con er tubo
capilar puesto
verticarmente.
Retire er tubo .r"noo
la mancha
haila
alcanzando
unos 3 mm. De dimetro.
una vez
;;;l; mancha
repetir ra
aplicacin
dos veces ms.
a
a
a
coloque
el paper
en ra cmara
dejando que
er borde inferior quede
sumergido
1 2 cm. En el solvente.
Dejar el paper
en posicin
rectar asegurando
ros hiros a ros rados de ra cinta
adherida.
una vez que
ra muestra haya corrido, sacar er paper y marcar er rmite de
migracin
de frente del solvente.
Secar los papeles
en un horno.
Rociar una sorucin reveradora,
Ninhidrina-corina-acido
actico graciar.
calentar
er paper
en un horno a 100
oc
hasta que
aparezcan
ras manchas
de
los aminocidos.
calcular
el Rf de cada mancha, y haga la identificacin
tentativa
de los
aminocidos,
comparando
ros Rf, obtenidts
con ra muestra probremas.
a) cRoMArocRnrn
EN PAPEL:
Antes que
todo analizamos
el porqu
se da el fenmeno
de arrastre
de
las protenas,
en debate, se concluy que
las causas
son:
.
El peso
molecular
.
La polaridad
.
La disolvancia
Ahora pasamos
en s al experimento.
1. Tenemos
en primer
lugar la muestra:
En dos crisores se chancaron
dos tipos de hojas,
una verde y otra roja (por
er
caroteno), para
extraer, ras protenas
en dos pequeos
frascos.
se preparo
tambin
un tercer frasco con una muestra de ra mezcra
de ambos rquidos,
er
cual actuar
como el desconocido.
LABORATORIO
3 ESTRUCTURA
Y rUruCIIrI
CELULAR Y TISULAR
II
UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA
FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
Frente del
solvente: se marca
despus de
realizado el efecto
Lnea de inicio:
se marca antes de
echar las gotas
para que todas
estn a una misma
Antes del arrastre
4. Ahora se proceden a realizar las medid
t
Hoja verde
,sG
3ffilff
ABD
Hoia roia
2. Ahora
procedemos a echar la gota del lquido obtenido sobre la fase fija, que
es
papel filtro de celulosa. La fase fija se marca de la siguiente manera:
3. Ahora colocamos
la fase de solvente,
que constituye la fase
generalmente metanol o piridina' Y procedemos a utilizar
rrastre
y dejamos
que el rastro cromtico de las protenas
punto ya se marca elfrente del solvente'
mvil: se usa
el efecto de
suba. En este
Despus del arrastre, la lnea azul
representa el frente del solvente
LABORATORIO 3 ESTRUCTURA
Y FUNCIN CELULAR Y TISULAR II
UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA
Frente del solvente
Marcamosl
Ar De: ln,[lo d t
:rltc cie l :.let:ci-ra
Bl De, i;:c!o i
fre:rte cle; 5g;t,g.1g
Medidas:
A: Al:18mm,
A2:29mm
A3:39mm, B=52mm
B: A1:22mm,
A2:47mm, B:52mm
C: A1:20mm,
FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
Resolucin
de Frente de cada mancha, las
El resumen en el siguiente cuadro:
)"
t
5. Ya con las medidas calculamos la
cuales representan los pigmentos.
i rlr{r dql
rl$rl1'. tttt
ii|,iflrl
l!lt:r(ril
,-lcl {tlt}tlruql!,'
t
Muestra
Presencia
de xantofila
Medida,
Resolucin de frente
A
18mm
51.':.'l:
16lr rl
B
22mm
i
*
nr ttt
*-
I f
lll irr
t.36
c
20mm
5 lill::
lf
-
1/.
iuil:i::
Muestra
Presencia
de clorofila
Medida
Resolucin de frente
A
29mm
5
i
irr rr
ilt
=::-=1.79
'9il: ii:
LABORATORIO 3 ESTRUCTURA Y FUNCIN CELULAR Y TISULAR II
UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
SEGUNDA PARTE
DETERMINACIN DEL PUNTO ISOELCTRICO DE LAS
PROTENAS
a) Marcar una serie de tubos del 1 al 9
b) En el tubo 01, medir 3.2 ml. de acido actico
'1N
y 6.8 ml. de agua destilada.
c) Medir 5 ml. de agua destilada en cada uno de los B tubos restantes.
d) Sacar 5 ml. de solucin del tubo 01, y agregarle al tubo 02, mezclar.
e) Sacar 5 ml. del tubo 02 y transferir al tubo 03, continuar as hasta el tubo 09, al
final se eliminan 5 ml.
f) Agregar 1 ml. de casena en acetato de sodio 0.1N, mezclar.
g) Observar el efecto en la solubilidad en cada tubo.
h) Despus de 30'anotar el pH.
i) Agregar 1 gota de fenoftalena y mezclar.
j)
Agregar Na(OH) al10o/o, agitar hasta la aparicin de un color rosado y observar
elefecto sobre la solubilidad.
Tenemos.
3,2 ml de cido actico 1 N
+
6,8 ml de agua destilada
=
10ml de
disolucin
Como a los dems tubos ya tienen 5 ml
traspaso de un tubo a otro va quedando
concentracin a la mitad de cido
de agua destilada, con cada
10 ml en cada tubo, con una
B 47mm
5l::l:l
i;'i=-::-=1,10
*,'iltiil
c 29mm
5l; r r'r
5F---lf
Jq
ir' ;r'
Muestra
Presencia de caroteno
Medida Resolucin de frente
A 39mm
5l:::ir':
.1 5---r ??
J9]: rI
B
c 42mm
5lt:til::
,q,F
---
1
a
.liir:
il
LABORATORIO 3 ESTRUCTURA Y FUNCIN CELULAR Y TISULAR II
UNIVERSIDAD
NACIONAL DE PIURA
FACULTAD DE MEDICINA
HUMANA
PRIMERO
Oa
-(!
E
bo'E
oo^dE
\OE
g
joo
C.-
.-
"{.H
'E
ao c
2 J 4
SEGUNDO
(g
s
a
o
3(
bol
cdI
a)
r')
I
EI
,.E-
Ug
ta)
I
6
7
LABORATORIO
3 ESTRUCTURA Y FUNCIN CELULAR Y TISULAR II
UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
TBRCERO
o
p
()L
.o
>.8
tr
hoc
()o
.otr
I
o9
|
Eol
q.<)
I
s.b I
\
ra)
POR LTIMO
I de solucin de agua, CASENA en acetato y cido
actico de mayor a menor concentracin
cida
2345
678
usemos la Ecuacin de Henderson-Hasselbalch,
teniendo que:
pk
(casena)
=
4.7
As para
el tubo No 3, por ejemplo:
Fji
=
p.:
- .,_-,n_1
No Acido 5ml
Sal I ml
3
0,:

-----
lin:,
L, -L -' -
I nnfi
Casena en acetato de sodio
0.1N
9
LABORATORIO 3 ESTRUCTURA Y FUNCIN CELULAR Y TISULAR II
UNIVERSIDAD
NACIONAL
DE PIURA
FACULTAD
DE MEDICINA
HUMANA
No de tubos
1 2
3 4 5
6 7
I I
pH
de cada
tubo
3.5 3.8 41 4.4
S
47
5.0 5.3 5.6
5.9
Enturbiamie
nto al
mezclar
NO NO NO
NO
NO
S NO NO
NO NO
Enturbiamie
nto o
precipitado
a 30'
NO NO
NO NO NO
NO NO NO
Solubilidad
despus
de
calentar
NO NO +[-
S
NO NO NO NO
TERCERA
PARTE
Al encontrar
er punto
isoerctrico,
procedemos
a echar Na(oH),
!:rFi:"r::*::ly,o_t
gl
pH.
con una
sota
det indicador
Fenotftatena.
Si
se tie de rojo nos.informara
que
es un medo
eci
-J';"J:fi,".'":jl
entonces
es bsico.
El resultado
fue color rojo.
-
--'r
3!:3::i:[il
51'"Zna
se constituve
como una de ras pocas protenas
que
Ahora completamos
la tabla resumen
de la prctica:
Hacemos
el clculo para
todos los tubos:
Tubo
ICH3GOOHI
=
meq
[t
N]
[casena] =
meq
01
NI
Ecuacin
OeEeAeEon_
--Hasselbalch
PH
1 1.6 ml
*
1N
=1.6 meq
1 ml " 0.1N= 0.1 meq
. t,l
:---T,. --Lr:i;-;
=_r,f
l
3.5
2 0.8 ml
*
1N
=
0.g meq
1 ml
*
0.1N
=
0.1 meq
t,1
:r-.=-i,.
-.o$;;
=_r,t
.,'J
3.8
3 0.4 ml
*
1N
= 0.4 meq
1 ml
.0.1N
= 0.1 meq
"
t.l
.-:. -
T,.
-
-LH-;
=:.1
s,'=
4.1
4 0.2 ml
*
1N
=
0.2 meq
1 ml- 0.1N
= 0.1 meq
4.4
5 0.1 ml
*
1N
=
0.1 meq
1 ml
*0.1N=0J
meq 4.7
6 0.05 ml
*
1N
= 0.05 meq
1 ml
.0.1N
=
0.1 meq
. -1,1
:.-1'.-.uH;-;=:
=LLI
-
U.U-\
5.0
7
8
0.025 ml* 1N
=
0.025 meq 1 ml
-
0.1N
= 0.1 meq
5.3
0.0125 ml* 1N
=
0.0125 meq 1 ml
*
0.1N
= 0.1 meq
5.6
9
u.uuozc mt
-
1N
= 0.00625
meq
1 ml
*
0.1N
= 0.1 meq
5.9
LABORATORIO
3 ESTRUCTURA
Y FUNCIN
CELULAR Y TISULAR
II
UNIVERSIDAD
NACIONAL
DE PIURA
FACULTAD
DE MEDICINA
HUMANA
CUESTlONARIO
CUESTIONARIO
^
!.
ZQu
entiende por
Cromatografa?
2' Diga
tres aplicaciohes
de la ci-omatografa
en muestras
biotgicas.
3. Diga el fundamento
de 2 tipos de cromatografa.
4' Diga 2 importanc3."
gq ra separacin
de protenas
desde
er punto
de
vista de la aplicacin
biolgia.
5'
Qu entiende por punto
isoerctrico
de tas protenas?
6'
Qu entiende por
coagulacin,
precipitacin
y desnaturalizacin
de
protenas?
7.
ir"#1il""1r.mtodos
de fraccionamiento
de tas protenas
y
8.
Cmo se clasifican
las protenas?
9. Diga funciones
de las protenas.
10.
En
que
se fundamenta
la electroforesis?
11-En que
se fundamenta
er mtodo
cromatogrfico
de excrusin
e
intercambio
inico,
ejemplo
medico?
12-En que
se fundamenta
ra cromatografa
riquida
de arta precisin
y
ejemplo
de aplicacin
mdica.
LABoRAToRto
3 EsTRUCTURA y
rurucllr
cELULAR
y
lsuLAR
l
10