Mtodos de ensino em Biologia Celular e dos Tecidos:
estudo das estruturas e processos celulares;
Microscopias de luz (ML) e eletrnica (ME) permitem o reconhecimento da clula como um componente dinmico e participante do metabolismo corporal; Ferramentas utilizadas: lminas com coloraes histolgicas e histoqumicas - ML; Telas de cobre contrastadas por metais pesados - ME (de transmisso, de varredura, etc.) Tcnicas de preparao e estudo de lminas citolgicas Tcnicas de preparao e estudo de lminas citolgicas Microscpio de Luz e Microscpio Eletrnico de Transmisso
Unidades de medida usadas: O aumento total do objeto observado calculado multiplicando-se os valores do aumento da objetiva e da ocular. Portanto: Preparo de lminas ----- lquidos de montagem; Geralmente contm elementos ou substncias que conferem as propriedades de: - Colorir esporos e outras estruturas do patgeno e/ou clulas e estruturas do tecido do hospedeiro = melhor clareza na visualizao ao microscpio. - Fixar a pea ou estrutura a ser observada. - Impedir o dessecamento da preparao e preservar integridade estrutural, por tempo mais ou menos longo. www.bioaula.com.br Preparao Tecidual 1. Coleta do tecido do animal 2. Corte do tecido em pedaos 3. Fixao 4. Desidratao 5. Incluso a.em parafina para Microscopia ptica (MO). b. em resinas para Microscopia Eletrnica de Transmisso (MET). 6. Obteno de cortes a.com navalha metlica para MO. b. com lmina de vidro ou de diamante para MET. 7. Montagem a. em lminas de vidro para MO. b. em grades metlicas para MET. Tcnicas de Preparao de Lminas Preparao do material que se deseja observar microscopia = etapas de confeco:
1 - Coleta do Material -Partes dos rgos ou tecidos so retiradas bisturi, pina ou lmina de barbear extremamente finos (mx. 4 mm)
2 - Fixao
objetivo: insolubilizar as protenas dos tecidos; procedimentos fsicos (congelamento) ou qumicos (+ utilizados) agentes fixadores + comuns: formol 10% lquido de Bouin: formaldedo, cido actico, cido pcrico) ambos fixam as protenas evitando sua degradao 1. Coleta do espcime 2. Fixao:
Evita a destruio das clulas por suas prprias enzimas, ou por bactrias. Insolubiliza as protenas dos tecidos. Formaldedo 4-10% em soluo tamponada (pH 7,4). 2. Fixao: Fragmentos com 5 mm de espessura Tempo de fixao varivel dependendo do tamanho do fragmento e do fixador. Tcnicas de Preparao de Lminas 3 - Processamento
objetivo: preparar o material para ser analisado em microscpio tico. etapas rigorosamente seqenciais e obrigatrias, na grande maioria das tcnicas, e uma etapa mal executada acarretar em material de m qualidade para anlise.
3.1 - Desidratao
Objetivo: retirada de gua da pea --- substncias inclusoras so insolveis em gua; Utilizao de alcois etlicos graduados em tempos adequados: (70 - 80 - 90 - 100%) - evitar a retrao pronunciada do tecido ocasionando leses estruturais da clula de carter irreversvel. O volume de lcool dever ser 10 a 20 vezes maior que o volume da pea. 2 min em cada graduao. 3. Desidratao Tem como finalidade retirar gua dos tecidos. Consiste em banhos de concentraes crescentes de etanol: 70%, 80%, 90%, 2x 100%. 4. Diafanizao ou Clareamento Objetivo: retirada do lcool da pea (as substncias inclusoras dissolvem-se mal no lcool) --- torn-la transparente; O etanol substitudo por um lquido miscvel com o meio de incluso (xilol). Os tecidos embebidos em xilol tornam-se translcidos, razo porque essa etapa denominada diafanizao ou clareamento. 3.3 - Incluso (Impregnao)
Objetivo: eliminar completamente o xilol contido no material e a total penetrao da parafina nos vazios deixados pela gua e gordura, antes existentes no tecido. preparar o material para os cortes, removendo o clarificante (xilol) e endurecendo-o suficientemente e dando-lhe a consistncia adequada para que possa ser cortado.
Procedimento para Incluso Tecido: passado em duas trocas de parafina para assegurar a substituio de todo o agente clarificador pela parafina; Parafina: temperatura de 56 a 60 C (parafina fundida) --- bloco de tecido: imerso na parafina fundida (em estufa) durante o tempo necessrio para a completa impregnao. Blocos retirados da estufa e deixados temperatura ambiente --- parafina endurea; Bloco de parafina com o tecido: retirado da frma e conduzido ao corte. www.bioaula.com.br 5. Incluso ou Impregnao: Estufa a 60C: parafina ocupa os espaos antes ocupados pelo xilol.
Obteno dos blocos de parafina. 4 - Microtomia
obteno de cortes de material includo em parafina o mais delgado possvel --- observao aos microscpios ticos; Utiliza-se o micrtomo: aparelho cuja regulagem medida em micrmetros (MO) --- obteno do corte na espessura desejada; duas peas principais: o suporte ou mandril (onde fixada a pea a cortar) e a navalha; espessura mais utilizada em microscopia ptica de 4 a 6 micrmetros Aps esta etapa = cortes coletados em lminas de vidro. www.bioaula.com.br 6. Microtomia: Cortes de 5 m de espessura. www.bioaula.com.br Micrtomo www.bioaula.com.br Cortes Histolgicos 5 - Colagem do Corte Lmina
Na superfcie de uma lmina --- um ponto de aderncia (normalmente com albumina de ovo) --- corte parafinado se adere; Antes --- corte colocado em banho-maria --- dobras provocadas pelo corte no tecido desapaream
www.bioaula.com.br Cortes em Banho-Maria: Colocao dos cortes em lminas de vidro. www.bioaula.com.br Lmina contendo cortes sem colorao: www.bioaula.com.br 7. Colorao: Colorao rotineira H-E. Hematoxilina (bsica). Eosina (cida). Ncleo cido e o citoplasma relativamente bsico. Hidratao, Colorao, Desidratao e Clarificao. www.bioaula.com.br Coloraes Corantes que diferenciam cidos de bases. - formam ligaes salinas com radicais ionizveis presentes nos tecidos. Corantes que diferenciam componentes fibrosos da matriz extracelular. Sais metlicos que precipitam nos tecidos formando depsitos de metal (ex: tecido nervoso). As coloraes foram desenvolvidas para visualizar componentes das clulas e dos tecidos que na maioria so incolores www.bioaula.com.br Coloraes Baseadas no princpio cido-base
A hematoxilina uma base, cora componentes cidos da clula em uma cor azulada ncleo (DNA e RNA) A eosina um cido que cora componentes bsicos (protenas citoplasmticas) da clula em rseo. www.bioaula.com.br Reao e corantes histolgicos comuns
REAGENTES
RESULTADOS Hematoxilina (base) Azul: ncleo; regies cidas do citoplasma: matriz da cartilagem. Eosina (cido) Rosa: regies bsicas do citoplasma; fibras de colgeno. Tricrmico de Masson Azul-escuro: ncleos. Vermelho: msculo; queratina; citoplasma. Azul-claro: mucingeno, colgeno. Orcena, corante para fibras elsticas Castanho: fibras elsticas. Weigert, corante para fibras elsticas Azul: fibras elsticas. Colorao com prata Preto: fibras reticulares. Hematoxilina frrica Preto: estrias dos msculos, ncleos e hemcias. cido peridico de Schiff Magenta: glicognio e molculas ricas em carboidratos. Corantes Wright e Giemsa Usados para a colorao diferencial das clulas do sangue. Rosa: hemcias, grnulos dos eosinfilos. Prpura: ncleos dos leuccitos, grnulos dos basfilos. Azul: citoplasma dos moncitos e linfcitos. C O L O R A
E S www.bioaula.com.br Hematoxilina-Eosina www.bioaula.com.br Tricrmico de Masson www.bioaula.com.br Resorcina-Fucsina de Weigert www.bioaula.com.br 8. Montagem: Uso de lamnulas. Meio de montagem: resinas (Entellan) ou blsamo do Canad.
7 - Montagem
Aps corte corado ---- novamente desidratado (a retirada da gua objetiva aumentar a sobrevida do preparado); concentraes crescentes de lcool etlico. Corte banhado em xilol; Montado em um meio solvel em xilol = meio de montagem ((para os cortes de parafina usado o Blsamo de Canad) Coloca-se uma gota do meio de montagem em cima do corte j fixado; coloca-se a lamnula sobre o corte imerso no meio de montagem --- comprime-se com firmeza evitando formao de bolhas de ar;