Petrifilm

Placas para Recuento de E. coli y Coliformes

Esta gua sirve para familiarizarse con los resultados obtenidos en las placas 3M

Petrifilm

para Recuento de E. coli

y Coliformes (EC). Para ms informacin, contactar con el distribuidor oficial de Productos 3M Microbiology.
Las placas Petrifilm EC contienen los nutrientes del VRB, un agente gelificante soluble en agua fra, un indicador
de la actividad glucuronidasa BCIG y un indicador de tetrazolio que facilita la enumeracin de colonias. El film superior
atrapa el gas producido por la fermentacin de la lactosa por los Coliformes y E.coli.
El tiempo y temperatura de incubacion, as como
la interpretacin de las placas Petrifilm EC puede variar
segn el mtodo seguido. Por lo tanto, se pueden obtener
resultados ligeramente diferentes. Las temperaturas
de incubacin usadas normalmente en la mayora de mtodos
se mencionan en el folleto del producto, y se muestran
ejemplos en la seccin tcnica (Pg. 2 y 3) de esta Gua.
No contar las colonias que aparecen sobre la zona
blanca, ya que no se hallan bajo la influencia selectiva
del medio.
Incubar a la temperatura y tiempo normalmente seguido
en el laboratorio. Las temperaturas ms usadas son:
35, 37, 42 44C durante 24 a 48 horas.
E. coli :
E. coli es capaz de crecer en medios conteniendo
los nutrientes del Violeta Rojo Bilis (VRB). La mayora
de E. coli (aprox. el 97%) producen beta-glucuronidasa,
que reacciona con un indicador (colorante) BCIG presente
en la placa Petrifilm EC y que hace que la colonia sea
de color azul a rojo-azul. Aproximadamente el 95%
de E. coli producen gas a partir de la lactosa, lo que viene
indicado como colonias asociadas (aproximadamente
el dimetro de una colonia) a gas atrapado. Ver Crculo 1. Las colonias de E.coli aparecen de color azul a rojo-azul
y producen gas; confirmar las colonias de color azul a rojo-azul sin gas. Ver Crculo 2. En algunos procesos de validacin,
esta interpretacin se ha modificado: las siguientes organizaciones AOAC, NMKL, EMMAS, han validado
o evaluado el uso de las Placas para Recuento de E. coli y Coliformes bajo condiciones especficas. Ver pginas
2 y 3 de esta Gua de Interpretacin.
Observacin :
La mayora de cepas de E. coli O157:H7 son atpicas : no crecen a temperaturas 44.5C, son glucuronidasa negativas,
y por lo tanto, no producirn un precipitado azul. Aparecern como Coliformes no-E. coli (rojas con gas).
Coliformes :
Las Placas para Recuento de E. coli y Coliformes pueden usarse tambin para la investigacin de Coliformes.
La ISO define los Coliformes por su capacidad de crecer en medios especficos y selectivos. El mtodo ISO 4832,
que enumera los Coliformes por la tcnica del recuento de colonias, define los Coliformes por el tamao de las colonias
y la produccin de cido en el Agar VRB con lactosa (VRBL). En las placas Petrifilm EC, estos coliformes productores
de cido se muestran como colonias rojas con o sin gas (dentro de aproximadamente el dimetro de una colonia).
Ver Crculo 3. El mtodo ISO 4831, que enumera los Coliformes por el mtodo del Nmero Ms Probable (NMP),
define los Coliformes por su capacidad de crecer y producir gas a partir de la lactosa en un caldo selectivo. En las placas
Petrifilm EC, estos coliformes se muestran como colonias rojas asociadas a gas (dentro de aproximadamente el dimetro
de una colonia). Ver Crculo 4.
La AOAC INTERNATIONAL y el U.S. FDA Bacteriological Analytical Manual (BAM) definen los Coliformes como
bacilos Gram negativos que producen cido y gas a partir de la lactosa durante la fermentacin metablica. Las colonias
de Coliformes que crecen en las placas Petrifilm EC producen cido que oscurece el color del gel. El gas atrapado
alrededor de las colonias de Coliformes (dentro de aproximadamente el dimetro de una colonia) indica Coliformes
confirmados. Ver Crculo 4.
1
1
4
3
2
Gua de
Interpretacin
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53 E. coli.
47 E. coli, mtodo oficial AOAC.
87 Coliformes confirmados, mtodo oficial AOAC.
Mtodo recomendado en Francia
Incubacin :
24h +/- 2h a 42C +/- 1C.
Interpretacin :
E. coli : Contar todas las colonias azules con o sin gas.
Lectura segn la AOAC International, todos los
alimentos (mtodo 991.14)
Incubacin :
Coliformes en todos los alimentos : incubar 24h +/- 2h
a 35C +/- 1C.
Enumeracin de E. coli en todos los productos, excepto
los abajo mencionados : incubar 48h +/- 2h a 35C +/- 1C.
Lectura segn la AOAC International, carnes,
aves y mariscos (mtodo 998.08)
Incubacin :
Enumeracin de E. coli en Carne, Volatera y Productos
del Mar, y Coliformes en todos los productos : incubar
24h +/- 2h a 35C +/- 1C.
Interpretacin (Metodos 991.14 y 998.08)
E. coli : colonias azules con gas.
Coliformes confirmados : todas las colonias con gas
(azules y rojas).
1A
1B
Interpretaciones de las Placas 3M Petrifilm EC
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53 E. coli, mtodo NMKL.
95 Coliformes totales, mtodo NMKL.
53 E. coli, mtodo evaluado EMMAS.
Lectura segn la NMKL (mtodo 147.1993)
Incubacin :
37C +/- 1C.
Interpretacin :
E. coli : Contar todas las colonias azules, con y sin gas
tras 48h +/- 2h de incubacin.
Coliformes : Contar las colonias rojas con gas y todas las
colonias azules con o sin gas despus de 24 h +/- 2h
de incubacin.
Lectura segn mtodo evaluado por la EMMAS
Incubacin :
48h +/- 2h a 37C +/- 1C.
Interpretacin :
E. coli : Contar todas las colonias azules con y sin gas.
Es aconsejable confirmar las colonias azules sin gas, en especial
cuando estn presentes en una alta proporcin.
1C
1D
Guide PEC - Espagne 12/09/05 14:54 Page 4
No crecimiento
Recuento de E. coli = 0
Las burbujas de fondo son una caracterstica del gel
y no resultado del crecimiento de E. coli o Coliformes.
Las burbujas de fondo son pequeas o puntiformes,
de forma regular y no tienen una colonia asociada.
Ver Recuadro 1.
Recuento de E. coli = 13
Recuento de Coliformes productores de gas =28
Al igual que las placas de Agar VRB, el intervalo ptimo de
recuento (colonias totales) en las placas Petrifilm EC es 15-150.
No contar las colonias que aparecen sobre la zona blanca
ya que no estn bajo la influencia selectiva del medio.
Ver Crculo 1.
Recuento E. coli = 3
Toda coloracin azul presente en una colonia (azul a rojo-azul)
indica la presencia de E. coli. Utilizando una iluminacin
frontal puede facilitar la visualizacin del precipitado azul
formado por una colonia.
El Crculo 1 muestra una colonia rojo-azul usando una
iluminacin de fondo
El Crculo 2 muestra la misma colonia con iluminacin
frontal. El precipitado azul en este caso se visualiza mejor.
Recuento E. coli = 20
Recuento total estimado = 150
El rea de crecimiento circular de la placa Petrifilm EC
es de aproximadamente 20 cm
2
. Se pueden hacer estimaciones
en placas con ms de 150 colonias contando el nmero de
colonias en uno o varios cuadrados representativos y obteniendo
el promedio. Multiplicar dicho nmero por 20 para obtener
el recuento total por placa.
3 2
5 4
Placas 3M Petrifilm para Recuento de E. coli y Coliformes
Observar el cambio de color del gel en las figuras 2 a 8. Al incrementar el recuento de E. coli y Coliformes,
el color del gel se vuelve rojo oscuro o azul-prpura.
1
1
Iluminacin
de fondo
Iluminacin
frontal
1 2
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Recuento real ~ 10
6
Las placas Petrifilm EC con colonias TNTC tienen
una o ms de las caractersticas siguientes: muchas colonias
pequeas, muchas burbujas de gas, y un oscurecimiento
del color del gel de rojo a azul-prpura.
Recuento real ~ 10
8
Altas concentraciones de E. coli causarn que el rea
de crecimiento se vuelva azul-prpura.
Recuento real ~ 10
8
Altas concentraciones de Coliformes (no E. coli) causarn
que el rea de crecimiento se vuelva rojo oscuro.
Cuando sto ocurra, realizar diluciones adicionales para
determinar la presencia de E. coli.
Recuento real ~ 10
8
Cuando un alto nmero de microorganismos no-Coliformes,
tales como Pseudomonas, estn presentes en las placas
Petrifilm EC, el gel puede virar a amarillo.
7 6
9 8
Placas TNTC (Demasiado Numeroso Para Contar)
Para obtener un recuento ms preciso, diluir ms la muestra.
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Las partculas alimentcias tienen forma irregular y no estn
asociadas a burbujas de gas. Ver Figura 10.
La Figura 11 muestra como la forma de las burbujas puede
variar.
Algunas veces el gas deforma la colonia y hace
que la colonia perfile la burbuja. Ver Crculos 1 y 2.
Pueden aparecer burbujas como artefactos debidas a una
inoculacin inadecuada de la placa Petrifilm EC o de aire
atrapado en la muestra. En este caso, las burbujas tienen
forma irregular y no estn asociadas a una colonia.
Ver Crculo 3.
No contar las colonias que aparecen en la zona blanca
ya que no estn bajo la influencia selectiva del medio.
1 3
4 6
7
5
8 9
2
A continuacin se muestran varios ejemplos de burbujas
asociadas a una colonia. Todos ellos se deben tener
en cuenta.
11 10
12
Burbujas
1
2
3
1
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Instrucciones
de uso
Petrifilm
3M

Petrifilm

Placas para Recuento de E. coli y Coliformes

Conservar las bolsas cerradas
a 8C. Usar antes de la fecha
de caducidad impresa en la
bolsa.
Almacenamiento
1
Petrifilm
Para cerrar las bolsas que
se estn utilizando, doblar
los extremos y cerrarlos
con celo.
2
Petrifilm
Mantener las bolsas una vez
cerradas a 25C, a HR <50%.
No refrigerar las bolsas
abiertas.
Usar las placas Petrifilm
en un mes desde su apertura.
3
Pesar o pipetear el producto
alimenticio en un contenedor
estril adecuado, como una bolsa
Stomacher, frasco de dilucin,
bolsa Whirl-Pak

, o cualquier otro
contenedor estril.
Preparacin
4
Aadir una cantidad apropiada
de uno de los siguientes diluyentes
estriles: tampn fosfato
de Butterfield (tampn fosfato IDF,
KH
2
PO
4
a 0.0425g/l , ajustar pH
a 7.2), agua peptonada al 0.1%,
peptona sal (mtodo ISO 6887),
solucin salina (0.85 - 0.90%)
o agua destilada.
5
Mezclar u homogeneizar
la muestra mediante los mtodos
habituales.
6
Inoculacin
7
Con una pipeta colocada
de forma perpendicular
a la placa Petrifilm, colocar 1 ml.
de la muestra en el centro
del film inferior.
8
Bajar el film superior
con cuidado evitando introducir
burbujas de aire. No dejarlo caer.
9
Colocar la placa Petrifilm
en una superficie plana.
Levantar el film superior.
Para Advertencias, Precauciones, Responsabilidad del Usuario, Garanta Limitada,
Almacenamiento y Eliminacin, e Instrucciones de Uso, ver el folleto del producto.
No usar tampones que contengan
citrato, bisulfito o tiosulfato.
Ajustar el pH de la muestra diluida
entre 6.6 y 7.2:
para productos cidos, usar NaOH 1N,
para productos alcalinos, usar HCl 1N.
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Con la cara lisa hacia abajo,
colocar el aplicador en el film
superior sobre el inculo.
10
Con cuidado, ejercer una presin
sobre el aplicador para repartir
el inculo sobre el rea circular.
No girar ni deslizar el aplicador.
11
Levantar el aplicador. Esperar
un minuto a que solidifique el gel. 12
Interpretacin
14
Las placas Petrifilm pueden leerse
con un contador de colonias
standard u otra lente de aumento.
Para leer los resultados, consultar
la Gua de Interpretacin.
15
Las colonias pueden aislarse
para una posterior identificacin.
Levantar el film superior
y seleccionar la colonia del gel.
<70F
Incubacin
13
Incubar las placas cara arriba en pilas
de hasta 20 placas.
El tiempo e incubacin vara segn
el mtodo*.
Mtodos aprobados ms usuales :
Mtodo Oficial AOAC 991.14 :
para coliformes, incubar 24h 2h
a 35C 1C ; para E.coli, incubar 48h
2h a 35C 1C
Mtodo Oficial AOAC 998.08: para
E. coli en carnes, aves y mariscos,
y Coliformes en todos los alimentos,
incubar 24 h +/- 2 h a 35C +/-1C.
Mtodo NMKL 147.1993 :
Para Coliformes, incubar 24h 2h
a 37C 1C ; para E.coli, incubar
48h 2h a 37C 1C.
* Ver el folleto del producto.
Recordar inocular y repartir el inculo en cada placa Petrifilm antes de pasar a la siguiente placa.
El tiempo y temperatura de incubacin puede variar segn el mtodo utilizado, ver el folleto del producto.
Comentarios adicionales
Departamento de Microbiologa
3M Espana, S.A.
Juan Ignacio Luca de Tena, 19-25
28027 Madrid
Tel : 91 321 6246
Fecha Versin
Marzo 2002 1.0
Referencia de documento
3M y Petrifilm son marcas registradas de 3M Company.
Whirl-Pak es una marca registrada de Nasco
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