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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA BENITO JUÁREZ DE OAXACA

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA BENITO JUÁREZ DE OAXACA Facultad de Ciencias Químicas Laboratorio de Inmunología Titular: QB.
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA BENITO JUÁREZ DE OAXACA Facultad de Ciencias Químicas Laboratorio de Inmunología Titular: QB.

Facultad de Ciencias Químicas

Laboratorio de Inmunología

Titular: QB. Antonio Girón

REPORTE DE PRÁCTICA N. 1 ”Pruebas Cruzadas”

MESA # 4

Alumnos:

Cruz Hernández Diego Sait Patricio Jiménez Víctor Eduardo Ríos Ríos William de Jesús Ruiz RíosBárbara Zárate Ramos Rosa Andrea

6 to Semestre

Grupo: “A”

Ciclo Escolar: 2014 2014

Marzo de 2014, Oaxaca; Oaxaca

INTRODUCCIÓN

.

Las pruebas cruzadas son procedimientos relativamente sencillos pero de gran cuidado, que tienen como propósito garantizar la compatibilidad serológica (in vitro) entre la muestra de sangre del receptor y la unidad de sangre que se le pretende transfundir.

La validez de las pruebas cruzadas radica en la correlación que existe entre las pruebas de compatibilidad realizadas in -vitro y la sobrevida de los hematíes en la circulación del paciente.

Como mencionamos, el objetivo de las pruebas de compatibilidad es prevenir la transfusión de sangre incompatible (definimos como compatibilidad de transfusión como la falta de reacción inmune entre antígenos (Ag) y anticuerpos (Ac) de donante y receptor, donde la compatibilidad no garantiza identidad entre ambos, solamente indica que, en ese momento, no habrá disminució n de rendimiento transfusiones por causa inmune)

Desde este punto de vista las pruebas cruzadas deben garantizar:

La

compatibilidad de ABO y Rh entre el receptor y la

pretende transfundir.

unidad que se

Que el suero del receptor no existan anticuerpos de importancia clínica contra los antígenos eritrocitarios del donante.

Que

en el plasma

de

la unidad de sangre no existan anticuerpos de

importancia clínica contra los antígenos eritrocitarios del receptor.

Entre las medidas de seguridad

transfusional están aquellas encaminadas a

evitar la reacción hemolítica aguda, es decir, las que aseguran la compatibilidad entre donante-receptor.

OBJETIVOS

.

Realizar pruebas cruzadas de compatibilidad sanguínea para:

Garantizar que los eritrocitos a transfundir son ABO compatibles con el receptor.

Detectar anticuerpos en el suero del receptor que estén dirigidos contra antígenos presentes en los eritrocitos del donante.

FUNDAMENTO

.

efectúan rutinariamente en

solución salina al 0.85 %, en este medio los anticuerpos que aglutinan son principalmente de la clase IgM.

Las

pruebas

de

compatibilidad

sanguínea

se

Las

pruebas cruzadas son dos y reciben este nombre porque se hace

reaccionar en tubo:

El plasma o suero del receptor con los glóbulos rojos del donador (prueba

mayor).

El suero o plasma del donador con los glóbulos rojos del receptor (prueba

menor)

Estas pruebas sirven para asegurar que todos los glóbulos rojos transfundidos son compatibles con los anticuerpos que contiene el plasma del paciente. Así como también, para evitar estimular la producción de nuevos anticuerpos contra los glóbulos rojos en el receptor especialmente anti -Rh D.

Las pruebas cruzadas se dividen en:

a) PRUEBA MAYOR:

Consiste en poner a reaccionar el suero del receptor con los eritrocitos del donador. En la prueba mayor se verifica los anticuerpos del paciente (plasma o suero) que se encuentran en gran volumen, contra los glóbulos rojos del receptor.

b) PRUEBA MENOR:

Consiste en poner a reaccionar el suero del donador con los eritrocitos del receptor. Esta prueba se realiza cuando se va a transfundir plasma.

El empleo de albúmina bovina facilita la detección de anticuerpos de la clase IgG. Ya que éstos muy frecuentemente se ven impedidos en su efecto aglutinante por el potencial Z.

Estas pruebas son requerimiento fundamental, porque es la mejor manera de detectar anticuerpos que puedan dañar las células rojas transfundidas y causar una reacción hemolítica transfusional.

PROCEDIMIENTO

.

A. Equipo, Material y Reactivos Necesarios

Reactivos

Los reactivos deberán de ser de grado analítico

Solución salina isotónica 0.9%

Solución de albumina bovina al 22%

Materiales

4 tubos de ensaye de 13x100

Pipetas Pasteur desechables

Parafilm

Tubos Vacutainer con y sin EDTA

Ajugas para venopuncion

Torundas de alcohol

Torniquete

Material Biológico

Suero de donador y receptor.

Suspensión de eritrocitos al 5% de donador y receptor

Aparatos e instrumentos

Centrífuga.

Baño maría a 37 °C

B. Desarrollo de la Practica

Preparación de las Muestras Biológicas

1. Extracción de una muestra de sangre venosa. a) Realizar la extracción de una muestra de sangre total por punción venosa en un tubo con EDTA y uno sin anticoagulante. Ambas muestras deberán obtenerse tanto para el donador como para el receptor.

obtenerse tanto para el donador como para el receptor. b) Esperar 15 minutos para que la
obtenerse tanto para el donador como para el receptor. b) Esperar 15 minutos para que la

b) Esperar 15 minutos para que la muestra sin aditivo coagule completamente.

sin

anticoagulante para obtener el suero durante 5 minutos a 2500 r.p.m.

c) Centrifugar

la

muestra

coagule completamente. sin anticoagulante para obtener el suero durante 5 minutos a 2500 r.p.m. c) Centrifugar
d) Concluido el proceso de centrifugación verificar que el gel separador se encuentre entre las

d) Concluido el proceso de centrifugación verificar que el gel separador se encuentre entre las dos fases de la sangre total y que el suero sea transparente y no presente hemólisis .

2. Preparación de la suspensión de eritrocitos.

a) De la sangre total con EDTA bien me zclada colocar 10 gotas en un tubo de ensaye, agregar solución salina isotónica hasta ¾ partes del tubo de ensaye, colocar parafilm en la boca del tubo, mezclar suavemente por inversión.

b) Centrifugar durante 3 minutos a 1500 rpm.

c) Transcurrido el tiempo de centrifugación decantar con cuidado el sobrenadante y desecharlo.

d) Volver a adicionar solución salina isotónica como en el inciso a y repetir el mismo procedimiento que en b y c de manera que se deben realizar un total de 3 lavados.

e) Una vez que se tenga el paquete de eritrocitos lavados, resuspenderlo en solución salina isotónica para obtener una concentración aproximada del

5%.

Procedimiento.

Fase I. Salina rápida. 1. En un tubo marcado como PM (Prueba Mayor), colocar dos gotas de la suspensión de eritrocitos del donador y dos gotas del suero del receptor. Mezclar suavemente.

2 Gotas de Suspensión eritrocitaria del Donador

del suero del receptor. Mezclar suavemente. 2 Gotas de Suspensión eritrocitaria del Donador 2 Gotas de

2 Gotas de suero del Receptor

2.

En un segundo tubo, marcado como pm (prueba menor), colocar dos gotas de la suspensión de eritrocitos del receptor y dos gotas del suero del donador. Mezclar suavemente.

2 Gotas de suero del Donador

donador. Mezclar suavemente. 2 Gotas de suero del Donador 2 Gotas de Suspensión eritrocitaria del Receptor
donador. Mezclar suavemente. 2 Gotas de suero del Donador 2 Gotas de Suspensión eritrocitaria del Receptor
donador. Mezclar suavemente. 2 Gotas de suero del Donador 2 Gotas de Suspensión eritrocitaria del Receptor

2 Gotas de Suspensión eritrocitaria del Receptor

3. Centrifugar ambos tubos a 1000 rpm durante 60 segundos.

4. Observar el sobrenadante de ambos tubos en busca de hemólisis. Resuspender suavemente el, botón de los eritrocitos en busca de aglutinación. Anotar los resultados.

Fase II. Albúmina.

de aglutinación. Anotar los resultados. Fase II. Albúmina. 5. En caso de no observar aglutinación en
de aglutinación. Anotar los resultados. Fase II. Albúmina. 5. En caso de no observar aglutinación en

5. En caso de no observar aglutinación en los tubos de la

fase I, agregar a ambos tubos dos gotas de la solución de albúmina bovina al 22%. Mezclar suavemente.

6. Incubar a 37 °C durante 15 minutos.

tubos dos gotas de la solución de albúmina bovina al 22%. Mezclar suavemente. 6. Incubar a

7.

Transcurrido el periodo de incubación centrifugar ambos tubos a 1000 rpm durante 60 segundos.

8. Resuspender suavemente el botón de eritrocitos y buscar la presencia de aglutinación. Anotar sus resultados.

buscar la presencia de aglutinación. Anotar sus resultados. RESULTADOS . Dentro del desarrollo de la práctica

RESULTADOS

.

Dentro del desarrollo de la práctica usamos dos grupos sanguíneos diferentes pertenecientes al sistema AB0, y se realizaron las pruebas de forma siguiente:

Prueba Salina Rápida. 00 Donador (Víctor): Grupo 0 Receptor (Saúl): Grupo 0

En la Prueba Mayor (PM) entre grupos 00 no hay aglutinación. Los anticuerpos y los
En la Prueba Mayor (PM)
entre
grupos
00
no
hay
aglutinación. Los anticuerpos
y
los
antígenos
son
compatibles
y
por
tanto
la
aglutinación
no
se
presentara.

Paquete

Eritrocitario.

Donador.

Grupo 0

no se presentara. Paquete Eritrocitario. Donador. Grupo 0 Suero. Receptor. Grupo 0 Suero. Donador.

Suero.

Receptor.

Grupo 0

Suero.

Donador.

Grupo 0

Receptor. Grupo 0 Suero. Donador. Grupo 0 Paquete Eritrocitario. Receptor. Grupo 0 En la prueba menor

Paquete

Eritrocitario.

Receptor.

Grupo 0

En la prueba menor (pm) entre los grupos 00 no se

aglutinación.

Sucede el mismo caso que con la PM, sin embargo se realizaran a la PM y la pm la prueba de albumina.

presento

Prueba Salina Rápida. A0 Donador (Víctor): Grupo 0 Receptor (Alan): Grupo A

Paquete

Eritrocitario.

Donador.

Grupo 0

(Alan): Grupo A Paquete Eritrocitario. Donador. Grupo 0   En la Prueba Mayor (PM) entre Suero.
(Alan): Grupo A Paquete Eritrocitario. Donador. Grupo 0   En la Prueba Mayor (PM) entre Suero.
 

En la Prueba Mayor (PM) entre

Suero.

grupos A0 no hay aglutinación.

Receptor.

Los

eritrocitos del grupo 0 no

Grupo A

presentan

antígenos

que

interactúen con los anticuerpos del suero del grupo A y por tanto no hay aglutinación.

En la prueba menor (pm) entre

Suero.

los

grupos

0A

se

presento

Donador.

aglutinación.

Esto

se

debe a

Grupo 0

que los antígenos presentes en

los

eritrocitos

del

grupo

A

interacciona con los anticuerpos presentes en el suero del grupo 0, puesto que el grupo 0 posee anticuerpos Anti-A y Anti-B, provocando así la aglutinación en los eritrocitos.

anticuerpos Anti-A y Anti-B, provocando así la aglutinación en los eritrocitos. Paquete Eritrocitario. Receptor. Grupo A
anticuerpos Anti-A y Anti-B, provocando así la aglutinación en los eritrocitos. Paquete Eritrocitario. Receptor. Grupo A

Paquete

Eritrocitario.

Receptor.

Grupo A

anticuerpos Anti-A y Anti-B, provocando así la aglutinación en los eritrocitos. Paquete Eritrocitario. Receptor. Grupo A

Prueba. Albúmina. Grupos 00 A los tubos de PM y pm de los grupos 00, donde no hubo aglutinación se realizo la prueba de Albumina.

Se

añaden

2

gotas

de

albumina

a

cada

tubo,

se

llevan a baño maría a 37ºC por 15 min, y se centrifugan a 1000 rpm por 1 min.

a 37ºC por 15 min, y se centrifugan a 1000 rpm por 1 min. PM No
a 37ºC por 15 min, y se centrifugan a 1000 rpm por 1 min. PM No

PM

No hubo aglutinación

Al

no

presentar

aglutinación significa que la sangre del receptor y el

pm

No hubo aglutinación

donador

son

COMPATIBLES.

DISCUSIÓN

.

Las determinaciones de grupos sanguíneos son pruebas de alta demanda en cualquier laboratorio clínico, sea para el simple conocimiento del tipo de sangre o para un propósito determinado, sin que este siga algoritmos adecuados de control de calidad. Estos casos, sin aprobarlos, pueden pasar desapercibidos las simples técnicas usadas. En banco de sangre esto no debe pasar por alto. En la práctica se han analizado las posibilidades de las diferentes reacciones antígeno-anticuerpo que se pueden presentar sangre, cuando se encuentran en contacto fluido sanguíneo (tanto plasma como sangre) de diferentes individuos; se ha establecido que incluso individuos con sangre que en un principio parecen similares, pueden no ser compatibles y por tanto generar problemas de salud importantes. Por tal motivo se debe hacer énfasis en el control de calidad de los laboratorios mediante la aplicación de técnicas cruzadas (prue bas cruzadas) para evitar reacciones no deseables. Las pruebas cruzadas deben ser obligatorias, realizando toda la metodología correspondiente. Un resultado negativo en una reacción entre individuos de dos tipos de sangres diferentes no se puede co nsiderar como una compatibilidad segura. Factores como el potencial Z, la variabilidad de grupos antigénicos presentes en la membrana, el desequilibrio entre la concentración Ag -Ac (postzona y persona) generan resultados ambiguos.

Las reacciones inmunológicas entre antígenos y anticuerpos no son simples aglutinaciones como los que se analizan en las practicas, dentro del organismo, estas desencadenas patologías graves y es por eso la importancia de estas.

CONCLUSION

.

La respuesta inmune generada por e l organismo frente a un antígeno se fundamenta en reacciones de los anticuerpos contra estos antígenos. La presencia de antígenos sobre la membrana de los eritrocitos permite obtener una visión clara de estas respuestas, cuando existe una interacción de estos eritrocitos con anticuerpos xenóbioticos o viceversa. Las reacciones antígeno-anticuerpo se pueden determinar mediantes pruebas básicas y típicas de laboratorio, como lo son las pruebas de grupo sanguíneo comunes. Estas pruebas nos permiten cuantificar de manera cualitativa respuestas inmunológicas sobre antígenos del sistema ABO, observando reacciones de aglutinación o de hemólisis. El análisis de estas reacciones aglutinantes y/o de hemólisis ilustran las una interacción entre un antígeno y un anticuerpo, lo que está determinado por una respuestas inmune. Cuando no se observan estas características, podemos imaginar en un principio que no existe tal respuesta inmune. Hablando en términos de una transfusión de sangre, estas reacciones se pueden traducir en compatibilidad o no compatibilidad de sangre entre donadores y receptores. En las prácticas de transfusión es importante no cometer errores en la determinación de estas reacciones, así como en su apreciación. Es por eso de la importancia de realizar pruebas cruzadas, en donde, a sabiendas de las diferentes interacciones que nos resultaran sin compatibilidad y por tanto una aglutinación y/o hemólisis, debemos tener la absoluta certeza de una compatibilidad. Dos individuos con la mismo tipo de sangre no pueden estar descartados de una incompatibilidad. La membrana del eritrocito presenta una variedad de antígenos que pueden afectar la reacción antígeno-anticuerpo, o antígenos que no son potencialmente inmunogenos; pueden existir factores como el potencial Z, que alteran en cierto grado la reacción. Por tal motivo las pruebas cruzadas son técnicas obligatorias para el control de calidad de un laboratorio de transfusión.

CUESTIONARIO

.

1. Menciona al menos cuatro sistemas de clasificación de grupos sanguíneos.

Sistema ABO.

Sistema Rh.

Sistema MNS.

Sistema Lutheran.

Sistema Diego.

Sistema Duffy.

2. Explica el concepto de potencial Z aplicado a las membranas de los eritrocitos.

La superficie de los glóbulos rojos tiene carga eléctrica negativa debido a las moléculas de ácido siálico de la membrana. Cuando los hematíes están en suspensión en soluciones que contienen iones libres, los cationes son atraídos por las cargas negativas de la superficie del glóbulo rojo, de modo que se forma una nube iónica positiva alrededor de los glóbulos rojos que, por estar constituida por cargas eléctricas del mismo signo, creará una repulsión entre los eritrocitos. Esta repulsión se conoce con el nombre de potencial Zeta.

3. ¿Cómo está constituida una inmunoglobulina?

Una molécula de inmunoglobulina (Ig) o también llamada anticuerpo es una glicoproteína que se produce por los linfocitos B o sus células derivadas, las células plasmáticas; tiene una estructura nuclear simétrica compuesta de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas; dichas cadenas contienen una serie de unidades repetidas, homologas, de aproximadamente 110 aminoácidos de longitud, que se pliegan en una estructura globular llamada dominio de Ig.

Un dominio de Ig tiene dos capas de lámi na plegadas en , ambas se mantiene unidas mediante un enlace disulfuro y hélices adyacentes a cada lamina se conectan mediante asas cortas. Las cadenas pesadas y ligeras constan de regiones amino terminales variables (V) que participan en el reconocimiento del antígeno y de

regiones carboxilo terminales constantes (C); las regiones C de las regiones pasadas median las funciones efectoras.

C de las regiones pasadas median las funciones efectoras. BIBLIOGRAFÍA .  Abbas, Abul K. Inmunología

BIBLIOGRAFÍA

.

Abbas, Abul K. Inmunología Celular y Molecular. 7ª Edicion, Editorial ELSEVIER, Barcelona, España, 2012.

Murphy Kennet, Travers Paul, Walport Mark. Inmunobiologia de Janeway.

7ª Edicion, Editorial McGraw-Hill. Impreso en Mexico, 2008

Roit. Inmunología, Fundamentos. 10ª Edicion, Editorial Medica Panamericana, Barcelona, España.

Kuby. Inmunología. 6ª Edicion. Editorial McGraw-Hill, Impreso en México,

2007.