Broamtologa 2007

ANALISIS DE LECHE Y PRODUCTOS LACTEOS

Preparacin de la muestra
Llevar la muestra de leche a aproximadamente 20C y mezclar por trasvase a otro
recipiente limpio, repitiendo la operacin hasta asegurar una muestra homognea. Si no
se han dispersado los grumos de crema, entiiar la leche en un a!o de agua a aprox.
"#C y mezclar hasta homogeneidad. $n%riar a 20C antes de medir un volumen para
analizar &'('C )*020, )+#,-.
Caracteres oranol!pticos "#$$%&' olor, color, saor, aspecto, presencia de
sedimento.
La leche %resca otenida en circunstancias normales, es de color lanco intenso,
completamente opaca, de olor dil y saor suave, pastoso y dilmente azucarado.
Control Tam(o Entera Descremada
(lor .il
Color /lanco intenso
Saor Suave, pastoso
y dilmente
azucarado
'specto (paca
0resencia de
sedimento
1o
Determinacin de la densidad "#$$%&
Se puede determinar con picnmetro, alanza hidrost2tica o lactodens3metro, a
)4.*C &'('C )*02), )+#,-.
$l lactodens3metro est2 calirado a )4C. ' temperaturas di%erentes &)4C 5 4C-
se puede hacer una correccin sumando o restando 0.0002 a la densidad le3da, por cada
grado de temperatura respectivamente mayor o menor a )4C.
Determinacin de la composicin
)ateria rasa ")!todo de *er(er& "#$$%&
Nota' el mtodo de 6erer se utiliza para leche con contenido graso entre ) a #7 y para
leche 2cida.
+undamento8 se trata la %raccin proteica de la leche en el denominado utirmetro con
2cido sul%9rico en caliente, separ2ndose por centri%ugacin la grasa lierada. La adicin
del 2cido am3lico %acilita la separacin de %ases, de manera :ue, luego de centri%ugar, el
contenido de grasa se lee directamente en la escala del instrumento.
Procedimiento8 ;edir con pipeta )0 ml de S(,<2 6erer &densidad ).#)" = ).#)> a
20C, aprox. +07- e introducirlos en un utirmetro para leche, cuidando de no mo?ar las
paredes internas del cuello. 'gregar con rapidez )) ml de leche medidos con pipeta de
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dole a%oro, de manera :ue %orme una capa sore el 2cido sin mezclarse con ste.
'gregar inmediatamente ) ml de alcohol am3lico y tapar con el tapn correspondiente.
'gitar suavemente pero en %orma e%ectiva, teniendo la precaucin de tomar el utirmetro
con un repasador, y su?etando el tapn con el pulgar. @eri%icar :ue est2 ien tapado y
colocarlo en un a!o de agua a *4=>0C durante 4=)0 min con el tapn hacia aa?o.
Aetirarlo del a!o, secarlo por a%uera y centri%ugar durante "=4 min en la centr3%uga
especial con los tapones hacia a%uera. Llevar nuevamente al a!o de agua ,=4 min y leer
inmediatamente el espesor de la capa de grasa en la parte superior graduada del
utirmetro. 0or a?uste adecuado del tapn de cierre se puede hacer coincidir la ase de
la capa de grasa con el cero de la escala. La lectura del menisco da directamente el
porcenta?e de grasa de la leche.
E,tracto seco total "#$$%&
Procedimiento- Barar un cristalizador ien limpio y seco de di2metro no menor de 4 cm
con )0=)4 g de arena calcinada. 'gregar 4 ml de leche con pipeta a%orada, calentar a
a!o ;ar3a )0=)4 min. Llevar luego a estu%a a +#=)00C hasta peso constante &aprox. "
h-. $n%riar en desecador, pesar r2pidamente y expresar el resultado como 7 de slidos
totales &pCv-. &'('C )*0"2, )+#,, modi%icado-.
E,tracto seco no raso
Se otiene por di%erencia entre el valor de extracto seco total y el valor de materia
grasa.
Determinacin de prote.nas
Se pueden emplear el mtodo de D?eldahl &1 x %actor *."#- o el mtodo de
/rad%ord sore las prote3nas precipitadas con 2cido tricloroactico &BC' )27- y
neutralizadas y dilu3das en solucin alcalina. (tra alternativa es emplear el mtodo de
1itrgeno 2lcali l2il descrito a continuacin8
Determinacin de prote.nas en lec/e por destilacin directa- )!todo de 0o1ran2i o
del Nitreno 3lcali l3(il- &)+40. ;ilchEissenscha%ts, 4)=4, @ol. 2-.
+undamento- $s un mtodo r2pido asado en la lieracin de amon3aco cuando la leche
es calentada a eullicin en solucin alcalina. La mayor parte del amon3aco lierado
proviene de la r2pida hidrlisis de glutamina y asparagina.
Procedimiento- Colocar en un aln D?eldahl )0 ml de leche, 20 ml de /aCl2 )0 7 &usar
propipeta- y >0 ml de 1a(< "2 7. .estilar durante * min &exactamente medidos a partir
del inicio de la eullicin-, recogiendo sore )00 ml de /("<" 2 7. Bitular el destilado con
S(,<2 0.)1, usando como indicador * a # gotas de una solucin 0.0)* 7 de ro?o de
metilo y 0.0#" 7 de verde de romocresol en alcohol. Calcular el porcenta?e de prote3na
&pCp- utilizando una curva de caliracin :ue relaciona el 7 prote3nas con los ml de S(,<2
0.)1 gastados.
Curva de caliracin8 se otiene siguiendo el procedimiento anterior pero con muestras
de leche con contenidos de prote3na conocidos. 0ara otener las distintas muestras de
leche se parte de una leche entera a la :ue se le midi el 7 de prote3nas por el mtodo
de D?eldhalF con esta leche se hacen diluciones o se agrega case3na para otener las
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concentraciones proteicas deseadas. $l contenido de prote3nas :ue cura el rango de la
curva de caliracin, dee ser de ) a , 7 &pCv-.
1(B'8 'ctualmente los an2lisis en leche se realizan siguiendo la metodolog3a
especi%icada en las normas G.H, de la Hederacin Gnternacional de Lecher3a &HGL-. 0ara la
determinacin del contenido de prote3nas se utiliza el mtodo de D?eldhal, utilizando 2cido
rico para recoger el destilado.
Determinacin de Lactosa "#$$%&
La determinacin de lactosa seg9n la '('C tamin se puede realizar por mtodo
espectro%otomtricos &)*04), '('C, )+#,- o enzim2ticos &)*04+, '('C, )+#,-.
Procedimiento- Colocar en un matraz de )00 ml, )0 ml de leche exactamente medidos,
diluir con *0=#0 ml de agua destilada, agregar 4 ml del reactivo de Courtonne &suacetato
de plomo al "0 7-, agitar enrgicamente y llevar a )00 ml con agua destiladaF
homogeneizar y %iltrar por papel. @alorar la lactosa en el l3:uido %iltrado utilizando el
mtodo de Hehling=Causse=/onnans.
@aloracin por el mtodo de Hehling=Causse=/onnans modi%icado &'('C )+*4, p. ,+4- a-
@aloracin del reactivo8 $n un erlenmeyer de 240 ml de capacidad se colocan exactamente
)0 ml de reactivo HC/, "0 ml de agua destilada y 2 o " trozos de porcelana porosa y se
calienta a eullicin. Ina vez alcanzada sta, se comienza a agregar desde la ureta la
solucin patrn de az9car a una velocidad de goteo controlada &medirla- evitando
interrumpir la eullicin. Cuando la coloracin azul del reactivo disminuye de intensidad o
alcanza un tono celeste verdoso, se agregan " gotas de la solucin acuosa de azul de
metileno y se contin9a con el agregado de solucin patrn, gota a gota, hasta decoloracin.
La primera gota :ue torna a amarillo oro parte de la solucin indica el punto %inal. Se dee
realizar esta valoracin por duplicado.
.een gastarse alrededor de 4=* ml de la solucin patrn para decolorar )0 ml de
reactivo de HC/. Si el volumen gastado cae %uera de estos valores hay :ue modi%icar la
velocidad de adicin hasta lograr el valor indicado. La velocidad de goteo encontrada como
ptima ser2 la empleada al valorar las soluciones prolema.
- @aloracin de gl9cidos solules reductores8 Se titulan )0 ml de reactivo HC/ seg9n el
procedimiento seguido en a- pero esta vez cargando la ureta con la solucin de az9cares
solules otenida a partir de la muestra &%iltrado-. $l gasto de esta valoracin dee estar
comprendido entre " y # ml, si no es as3 hay :ue modi%icar la concentracin de la solucin
de az9cares.
1ota )8 $s conveniente :ue el agregado de solucin de az9cares &patrn y prolema- se
haga al principio a razn de ) gotaCseg y despus del agregado de azul de metileno, a )
gotaC" seg.
1ota 28 Se dee tener sumo cuidado en la oservacin del punto %inal de la titulacin, pues
la coloracin amarilla camia r2pidamente a parda.
c- 6l9cidos solules reductores previa hidrlisis 2cida8 $n vaso de precipitado de capacidad
conveniente, se colocan 40 ml del %iltrado preparado para determinar gl9cidos directamente
reductores &punto -, se agregan )=2 ml de <Cl puro &8),)+-, se lleva a a!o ;ar3a por
espacio de "0 min, se neutraliza con solucin de 1a(< o con 1a<C(" slido y se lleva al
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volumen inicial &40 ml- con agua destilada. Hiltrar y en el l3:uido %iltrado valorar los az9cares
reductores mediante la tcnica descripta en -.
C2lculo8 Los gl9cidos directamente reductores se expresan com9nmente en porcenta?e de
glucosa y los no reductores &calculados a partir de la di%erencia c=- son expresados en
porcenta?e del disac2rido mayoritario, multiplicando por el %actor correspondiente.
Considerar las siguientes e:uivalencias al e%ectuar los c2lculos8
40 mg glucosa J ** mg lactosa anhidra J *+.4 mg lactosa hidratada
Control del estado de conser4acin
Determinacin del pH "#$$%&
Procedimiento- 0oner un volumen adecuado en un vaso precipitado y medir el p< en un
p<metro previamente calirado.
Esta(ilidad 1rente al areado de alco/ol
Procedimiento- Colocar 2 cm
"
de leche en un tuo de ensayos y agregar igual volumen
de etanol >07. 'gitar y oservar si coagula.
Acide5 "#$$%&
Procedimiento- ;edir exactamente 20 ml de muestra o pesar con exactitud alrededor de
20 g. Colocar en un erlenmeyer de 240 ml. .iluir con aproximadamente 2 veces su
volumen con agua destilada lire de C(2 &para eliminar el C(2 hervirla 4 min y en%riarla
evitando la incorporacin de aire-. 'gregar 2 ml de %eno%tale3na al )7 &solucin de
%eno%tale3na )7 en etanol de +47 vCv-, y titular con 1a(< 0.) 1 hasta color rosa dil
pero persistente. $xpresar los resultados en 7 en 2cido l2ctico pCp &'('C )*02", )+#,-.
1(B'8 La acidez de la leche puede expresarse tamin en grados .ornic &ver 0rolema
) de la gu3a de Seminarios de L$C<$-.
Ensa2o del a5ul de metileno- Reductasimetr.a "#$$%&
Procedimiento- Braa?ar en condiciones de esterilidad y evitar la exposicin a la luz
solar. Colocar en un tuo de ensayo ancho &aprox. "=, cm de di2metro- ,0 ml de leche
cuidando de no mo?ar un costado de la pared interior del tuo. 'gregar ) ml de solucin
de azul de metileno sin :ue la punta de la pipeta entre en contacto con la leche. Bapar el
tuo con un tapn de algodn y colocarlo en un a!o de agua a ">="#C. $l nivel de
agua en el a!o dee exceder al de la leche en el tuo. ;edir el tiempo en :ue se
produce decoloracin total o hasta 4 mm de la super%icie.
La leche se clasi%icar2 seg9n la siguiente tala8
6-7 )u2 mala' se decolora antes de los 20 min.
#-7 )ala' se decolora entre 20 min y 2 h.
8-7 )ediocre' se decolora entre las 2 h y 4 h.
9-7 :uena' conserva el color por m2s de 4 h.
1(B'8 La solucin de azul de metileno se prepara disolviendo azul de metileno en
alcohol de +* hasta saturacin, y diluyendo 4 ml de esta solucin con )+4 ml de agua
destilada estril. .escartar despus de 2 meses. 1o exponer a la luz..
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Ensa2o de la 1os1atasa alcalina
Procedimiento- $l ensayo consiste en incuar la muestra con un sustrato de la enzima
en condiciones de temperatura y p< adecuados para la reaccin enzim2tica. $l producto
%inal se detecta por una reaccin colorimtrica. .ee hacerse un ensayo en lanco en las
mismas condiciones pero con la misma leche previamente hervida y en%riada.
$l ensayo se llevar2 a cao con un Kit de Liener La, seg9n se indica en el
siguiente protocolo8
Sustrato, %enil%os%ato de sodio. Cada comprimido contiene 2, moles de sustrato y se
disuelve en *.4 ml de u%%er C("
M
CC("<
=
.
Aeactivo diazo, na%talen=),4 disul%onato de la sal de diazonio del 4=nitro=2=amino anisol.
Cada comprimido contiene ,.4 mg de reactivo y se disuelve en ,.4 ml de agua destilada.
/IHH$A8 ,*.+ g de C("1a2, ">.2 g C("<1a y agua destilada, cantidad su%iciente para )
litro.

;uestra /lanco
Leche 2 ml ==
Leche calentada ) min a #0=+0C == 2 ml
.e?ar )0 min a ">=,,C
Sustrato 2 ml 2 ml
tapar el tuo y agitar por inversin varias veces. .e?ar )0 min a ">=,,C. <ervir y en%riar.
Aeactivo diazo ) ml ) ml
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PREPARACION DE PRODUCTOS LACTEOS
6-7 COA*ULACION EN;I)ATICA DE LA LECHE
a- )edida de la acti4idad coaulante
Recuerde que la actividad es una medida de velocidad, estar dada por la accin
cataltica de la enzima sobre un sustrato, en este caso estamos viendo el efecto de
la renina sobre la kapa-casena.
La mezcla de incuacin se prepara con 2.0 ml de leche, 0.2 ml de Cl 2Ca 0.) ;,
en el momento de agregar la solucin de enzima &0."ml- dee contailizar el tiempo.
La temperatura de traa?o ser2 de ">C.
Se mide el tiempo necesario para :ue comience la coagulacin, :ue se detecta
por agitacin de la mezcla de incuacin con una varilla de vidrio, inclinando el tuo. Se
eleva la varilla sore el nivel del l3:uido, rozando la pared del tuo y se oserva en el
l3:uido :ue cae sore la pared, la aparicin de pe:ue!os co2gulos.
;ezcla de reaccin8 2.0 ml Leche
0.2 ml Cl2Ca 0.) ;
0." ml $nzima
En este caso particular, usted no detendr la accin de la enzima, simplemente
definir el tiempo en que ha comenzado la coagulacin.
a medida de actividad coagulante de la leche ser e!presada directamente como
el tiempo de coagulacin requerido para los "ml de leche ensa#ados.
(- E1ecto de la 4ariacin de la concentracin de en5ima en el tiempo de
coaulacin-
Tiempo de coaulacin con di1erente concentracin de coaulante
Recuerde que al ser el tiempo de coagulacin una medida indirecta de la actividad
de la enzima, mas especficamente podemos decir que es inversamente
proporcional, podemos observar cual ser el efecto de la concentracin de la
enzima en los tiempos de coagulacin. $omo se esta traba%ando a concentracin
de sustrato saturante # se fi%a el tiempo en que aparece el coagulo, se puede decir
que la variacin en el tiempo esta relacionado con la variacin en la concentracin
de enzima.
Procedimiento- Braa?ara con cuatro mezclas de reaccin a ">C, colocando en cada
tuo un volumen di%erente de solucin enzim2tica &coagulante-, hasta un volumen
m2ximo de 0." ml. La mezcla de reaccin es e:uivalente a la del punto a., con un
volumen %inal de 2.40 ml. $l volumen se completa con DCl 0.)4 ;. La solucin enzim2tica
&coagulante- se agrega en 9ltimo trmino e inmediatamente se incuan los tuos y se
contailiza el tiempo. ' continuacin tiene una tala donde se resumen las , mezclas de
reaccin.
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)e5cla 6 )e5cla # )e5cla 8 )e5cla 9
Lec/e "ml& 2.00 2.00 2.00 2.00
Cl#Ca $-6 ) 0.20 0.20 0.20 0.20
0Cl $-6< ) "ml& 0."0 0.20 0.)0 0.00
En5ima "ml& 0.00 0.)0 0.20 0."0
Se miden los tiempos de coagulacin para cada mezcla de reaccin, :ue deer2n
estar en el rango de ) a "0 min. Si no %uera as3, se deer2 repetir la serie, modi%icando
las cantidades de solucin coagulante.
6ra%icar el tiempo de coagulacin en %uncin de la cantidad de solucin de enzima.
<aga una interpretacin de estos resultados.
c- O(ser4acin de las dos etapas del proceso de coaulacin
Recuerde que se ha propuesto un mecanismo en dos etapas para que ocurra la
coagulacin, en este caso deber interpretar los protocolos # analizar los resultados.
0reparara mezclas de reaccin, con concentraciones di%erentes de enzima, con
temperaturas de incuacin di%erentes y con agregado de CaCl2 en momentos di%erentes.
$n todos los casos se medir2n los tiempos de coagulacin de cada tuo.
Las mezclas ) y 2 ser2n los controles :ue utilizara para el estudio. Las mezclas "
y , le permitir2n estudiar la inactivacin de la enzima por e%ecto de la a?a temperatura,
ya :ue deer2 incuar amas mezclas a 0
o
C durante 2 horas y posteriormente llevar a
">
o
C. Las mezclas 4 y * le permitir2n estudiar el e%ecto del agregado de calcio, ya :ue
deer2 incuar amas mezclas en ausencia de cloruro de calcio durante "0 minutos y a
partir del agregado del mismo contailizara el tiempo de coagulacin.
8%
o
C $
o
C "#/& = 8%
o
C 8%
o
C
)e5cla 6 )e5cla # )e5cla 8 )e5cla 9 )e5cla < )e5cla >
Lec/e "ml& 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00
Cl#Ca $-6 ) 0.20 0.20 0.20 0.20 "0min 0.2ml "0min 0.2ml
0Cl $-6< ) "ml& 0.20 0.00 0.20 0.00 0.2 0.0
En5ima "ml& 0.)0 0."0 0.)0 0."0 0.) 0."
&aga un anlisis de los resultados obtenidos para los pares de mezclas de
reaccin, identificando con ellos el mecanismo propuesto para el proceso de
coagulacin.
#-7 COA*ULACION ACIDA DE LA LECHE- CINETICA DE ACIDI+ICACION
DE LA LECHE POR ACCION :ACTERIANA-
Procedimiento- 0reparar una mezcla de incuacin con )00 ml de leche y 4 ml de
inculo. Hraccionar la mezcla en # tuos estriles, poniendo 4 ml exactos en cada tuo.
Gncuar a ,2C. Cada "0 min sacar un tuo y valorar la acidez con 1a(< 0.)1.
1(B'8 $l inculo acteriano dee ser un cultivo %resco en %ase estacionaria temprana,
con )0
#
IHCCml. $l %ermento para yogur dee tener una proporcin )8) de Streptococcus
termophilus y Lactobacillus bulgaricus.