Capitulo 3 Stryer: Investigacin en protenas y proteomas

Las protenas cumplen roles cruciales en catlisis, transduccin de seales y como soportes
estructurales.
El primer paso es la purificacin de la protena. Las protenas se pueden separar en base a su
solubilidad, su tamao, carga y capacidad de unin.
Una vez purificada se puede secuenciar o identificar mediante la medicin y comparacin de
su masa con una base de datos. La espectroscopia de masas efecta esta medicin. El
conteto fisiolgico de una protena puede entenderse mediante sondas !anticuerpos
monoclonales" identificacin y cuantificacin de protena. La espectroscopia #$% y la
cristalografa & son utilizadas para determinar la estructura tridimensional de las protenas.
3.1 La purificacin, el primer paso
'(mo aislar una protena de una mezcla comple)a de protenas* El bio+umico necesita un
ensayo para identificar alguna propiedad especfica de la protena. Este normalmente mide la
actividad enzimtica, capacidad +umica de la enzima de inducir la reaccin.
La cuestin asociada con la purificacin es maimizar la actividad especfica... En un enzima
puro la actividad especfica ser constante.
Elegido el ensayo y escogida la fuente de protena, se debe fraccionar la c,lula y sus
componentes. En primer paso se forma un -omogenado por ruptura de membrana celular,
fraccionndose la c,lula por centrifugacin y dando lugar a un precipitado de material pesado
en el fondo del tubo. El sobrenadante se centrifuga luego sucesivamente en una t,cnica
denominada centrifugacin diferencial.
.e purifica la protena en base a la solubilidad, tamao, carga y afinidad especifica de unin.
/recipitacin .alina
La mayora de las protenas son menos solubles a concentraciones elevadas de sal, este
efecto es llamado precipitacin salina. Las concentraciones de sal en las +ue se precipita una
protena varan de una protena a otra. 0dems es til para concentrar disoluciones diluidas de
protenas. /ara eliminar la sal, se puede utilizar la dilisis.
1ilisis
Las protenas se pueden separar de mol,culas pe+ueas mediante la dilisis a trav,s de una
membrana semipermeable, por e). membrana porosa de celulosa. Las mol,culas grandes se
retienen en la bolsa, mientras +ue las mol,culas ms pe+ueas y los iones atraviesan los
poros.
(romatografa de filtracin en gel o de eclusin molecular
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.e basa en discriminar por tamao. La muestra se coloca en lo alto de una columna rellena de
bolitas porosas compuestas por un polmero insoluble, pero altamente -idratado, como son el
detrano o la agarosa !carbo-idratos" o la poliacrilamida. .ep-ade, .ep-arosa y 2iogel son
preparaciones comerciales. Las mol,culas pe+ueas ingresan dentro de los poros de las
bolitas. 0s, las mol,culas grandes fluyen ms rpidamente a trav,s de esta columna y
aparecen antes por+ue tienen accesible un volumen de l+uido ms pe+ueo. Las pe+ueas
siguen un camino ms largo y sern las ltimas en salir.
(romatografa de intercambio inico
.e separan en base a su carga neta. .i una protena tiene una carga neta positiva a p3 4 se
unir a una columna +ue contenga carboilatos, si tiene carga negativa no se unir. Luego de
unida, puede eluirse alimentando la 56 de cloruro sdico u otra sal en el buffer de elucin por+ue
los iones sodios compiten con las protenas unidas. .i estas protenas tienen una ba)a
densidad de carga positiva neta eluirn primero, si tienen alta densidad tardarn ms.
La columna de ($7celulosa tiene carga !7" y la 1E0E7celulosa carga !8".
(romatografa de afinidad
.e basa en la alta afinidad de algunas protenas por grupos +umicos especficos. /or E).9 una
mezcla proteica se eluye a trav,s de una columna +ue contiene secuencias especificas de
1#0 unidas a una matriz: las protenas con mayor afinidad por la secuencia se unirn y
+uedarn retenidas. Luego el factor de trascripcin se libera lavando con una disolucin +ue
contiene alta concentracin de sal.
En general, se puede utilizar en el aislamiento una protena + reconoce a determinado grupo &
por9 la unin covalente de & o un derivado a la columna: la adicin de un mezcla de protenas a
esta columna, +ue se lava luego con buffer para eliminar protenas no unidas: por la elucin
de la protena deseada aadiendo una concentracin elevada de una forma soluble de & o
cambio de las condiciones para alterar la afinidad de la unin. Esta t,cnica es ms efectiva
cuando la afinidad protena mol,cula es muy especifica.
E). ;9 una serie de residuos de 3is se pueden aadir al etremo amino o carboilo <erminal de
una protena epresada. La protena eti+uetada se pasa a trav,s de una columna de bolitas
+ue contienen unido de forma e+uivalente #i
;8
u otros iones metlicos +ue se unen a la
protena deseada mientras +ue las otras protenas atraviesan la columna. /osteriormente se
pueden eluir las protenas de la columna aadiendo imidazol u otros compuestos +umicos +ue
se unen a los iones metlicos y desplazan a la protena.
(romatografa li+uida de alta presin
El relleno de la columna esta muc-o ms finamente dividido, con lo +ue -ay ms centros de
interaccin y por lo tanto mayor poder de resolucin. .e debe aplicar presin para obtener
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velocidades de flu)o adecuadas. El resultado neto es una elevada resolucin y una separacin
rpida.
Electroforesis
(onstituye un m,todo mediante el cul se visualiza la eficacia de la purificacin a trav,s de las
protenas +ue se presentan en cada paso.
En gel
Una mol,cula con carga el,ctrica neta se desplazar en un campo el,ctrico. La velocidad de
migracin de una protena en un campo el,ctrico depende de la fuerza de ese campo, la carga
neta de la protena y del coeficiente de friccin. El coeficiente de friccin depende tanto de la
masa como de la forma de la mol,cula +ue migra como de la viscosidad del medio. Las
separaciones electrofor,ticas se llevan a cabo sobre geles !o sobre papel" por+ue actan como
tamices moleculares +ue potencia la separacin. Las mol,culas pe+ueas pasan fcilmente
mientras +ue las grandes permanecen casi inmviles.
Las protenas se pueden separar de acuerdo a su masa molecular, utilizando electroforesis de
poliacrilamida pero en condiciones desnaturalizantes. La mezcla de protenas se disuelve en
.1. dodecil sulfato sdico, un detergente aninico +ue rompe casi todas las interacciones no
covalentes en las protenas nativas. El mercaptoetanol !;7tioetanol" o ditiotreitol reduce puentes
disulfuro. Los aniones .1. se unen a la cadena principal, a razn de un anin .1. por cada
dos residuos de aminocido. Este comple)o tiene una gran carga negativa +ue es proporcional
a la masa de la protena. Estos comple)os se someten a electroforesis. Las protenas se
pueden visualizar ti,ndolas con plata o 0zul de (oomasie.
El desplazamiento en estas condiciones de la mayor parte de los polip,ptidos es linealmente
proporcional al logaritmo de su masa. La .1.7/0=E es rpida sensible y capaz de un alto
grado de resolucin
>soelectroenfo+ue
.eparacin electrofor,tica en base a sus contenidos relativos de 00 bsicos o cidos. El /> es
el p3 al cual la carga neta de la protena es ?: su movilidad electrofor,tica tambi,n es ?. (ada
protena se desplaza -asta +ue alcanza una posicin en el gel en la +ue el p3 es igual al /> de
la protena. El gradiente de p3 en el gel se obtiene sometiendo a electroforesis precia una
mezcla de polianfolitos !polmeros pe+ueos con mltiple carga" con diferentes valores de />.
Electroforesis bidimensional
Es la combinacin del isoelectroenfo+ue y la .1.7/0=E obteniendo una separacin de
resolucin muy elevada. Una muestra se somete a isoelectroenfo+ue. Este gel de calle nica
se coloca -orizontalmente en la parte superior de un gel de .1.7poliacrilamida. 0 continuacin
se somete de nuevo a electroforesis obteni,ndose una distribucin bidimensional de las
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manc-as: -orizontalmente se -an separado de acuerdo a su /> y verticalmente de acuerdo a
su masa molecular.
Las tablas de purificacin permiten analizar los resultados9 protena total: actividad total:
actividad especifica: %endimiento !actividad despu,s de cada paso de purificacin" y grado de
purificacin.
Un alto grado de purificacin y ba)o rendimiento proporciona poca protena con la +ue
eperimentar. Un alto rendimiento con una ba)a purificacin de)a muc-os contaminantes y
complica la interpretacin de los eperimentos.
Ultracentrifugacin
/ermite determinar parmetros tales como la masa y la densidad, conocer algo sobre la forma
de la mol,cula e investigar las interacciones entre mol,culas. Las partculas se desplazan por
la fuerza centrifuga. /ara valorar la velocidad se calcula el coeficiente de sedimentacin s@ m
!A7vp"Bf. .iendo !A7vp" la fuerza de flotacin. El coeficiente se epresa en .vedberg y cuanto
menor sea ms lentamente se mover la mol,cula.
La velocidad de sedimentacin depende en parte de la masa de la partcula. $ayor masa
sedimenta ms rpido. La forma influye en el coeficiente de friccin, ya +ue cuanto mas
compacta sea la partcula mayor la velocidad de sedimentacin. Un partcula densa sedimenta
ms rpido +ue una de menor densidad, por+ue la fuerza de flotacin contraria es menos para
las partculas menos densas. La velocidad de sedimentacin tambi,n depende de la densidad
de la disolucin, las partculas se -unden cuando vpCA y flotan cuando vpDA, no se desplazan
cuando vp@A.
La centrifugacin en gradiente se usa para separar protenas con diferentes coeficientes de
sedimentacin. .e forma un gradiente de densidad en un tubo. El papel del gradiente es evitar
el flu)o de conveccin. La mezcla de la protena se coloca en pe+ volumen en la parte superior
del gradiente de densidad. Las protenas se separan de acuerdo a su coeficiente de
sedimentacin.
La masa de una protena se puede determinar por e+uilibrio de sedimentacin9 una muestra se
centrifuga a vel ba)as para +ue se e+uilibre por difusin. Es una t,cnica muy precisa y se puede
aplicar en cond no desnaturalizantes manteniendo estruct cuaternarias: a diferencia de .1.7
/age +ue nos da una estimacin del /$.
3.2 Las secuencias se determinan por dman
La composicin de 00 se realiza mediante -idrlisis cida, calor 8 3(l E $. Estos 00 luego se
pueden separar por cromatografa de intercambio inico. La identidad de los 00 se averigua
por el Fol. de elucin y cuantificado por nin-idrina !color azul ecepto con /ro +ue da amarillo".
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La concentracin de un 00 es proporcional a la absorbancia. .e puede usar un colorante ms
especifico como la fluoroescamina.
La determinacin del aminocido #7terminal se logra por la degradacin de Edman, +ue separa
secuencialmente del etremo amino <erminal un residuo tras otro. El fenilisotiocianato
reacciona con el grupo amino <erminal no cargado del p,ptido para formar un derivado del
feniltiocarbamato. /osteriormente ba)o condiciones cidas suaves, se libera un derivado cclico
del 00 <erminal lo +ue de)a un p,ptido intacto acortado en un 00. El compuesto cclico es un
aminocido feniltio-idantona !/<3700" +ue se puede identificar por cromatografa.
El m,todo de Edman presenta una eficiencia ba)a en p,ptidos muy etensos. /or lo +ue es
conveniente fragmentar la protena selectivamente.9 bromuro de ciangeno: tripsina:
+uimotripsina, etc. Los p,ptidos obtenidos por ruptura enzimtica se separan
cromatograficamente. La secuencia de cada p,ptido se determina por Edman. .i la muestra
inicial de protena consta de varias cadenas se necesitan por e). Una electroforesis .1.7gel en
cond reductoras, para una protena consistente en ; o ms cadenas unidas no covalentemente
se utilizan ag desnaturalizantes como urea o -idrocloruro de guanidina. Los p disulfuro se
separan por mercaptoetanol o ditiotreitol: y para evitar +ue los residuos de cisterna se
recombinen se al+uilan con yodoacetato.
/ara determinar las posiciones de los puentes disulfuro originales se utiliza electroforesis en
diagonal para aislar las secuencias peptdicas +ue contienen estos enlaces. .e fragmenta la
protena en p,ptidos ba)o cond en +ue los p disulfuro se mantengan intactos. La mezcla de
p,ptidos se coloca en una -o)a de papel y se somete a electroforesis de una sola calle. La -o)a
resultante se epone a vapores de cido perfrmico, +ue rompen los p disulfuro y los convierte
en residuos de cido cisteico. Los p,ptidos unidos por disulfuro se vuelven independientes y
ms cidos debido al grupo 7.G
H
7
.
Esta mezcla se somete a electroforesis en direccin
perpendicular a la anterior Bpero en la mismas cond". Los p,ptidos + no intervienen en
disulfuros tendrn igual movilidad +ue en la primera por lo +ue se ubican en la diagonal. /or el
contrario, los p,ptidos reci,n formados + contienen el cido cisteico migrarn diferente, fuera
de la diagonal. Estos p,ptidos se pueden aislar y secuenciar, para determinar la localizacin
del puente disulfuro.
.ecuencias de 0minocidos
I La secuencia puede indicar si pertenece a una familia de protenas. /or e)emplo la tripsina y
la +uimiotripsina son similares y pertenecen a la familia se serinproteasas.
I La comparacin de secuencias de la misma protena en diferentes especies proporciona
datos sobre las vas evolutivas. /or e). Las albminas s,ricas del ser -umano y el simio
africano.
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I Las secuencias puede presentar repeticiones internas +ue brindan informacin sobre la
-istoria de una protena especfica. /or e). La calmodulina contiene cuatro mdulos de unin
generados por duplicacin g,nica
I $uc-as protenas contienen secuencias +ue sirven como seales para indicar su destino o
controlar su maduracin. /or e). Un seal de ;? 00 -idrofbicos cerca del amino terminal
dirigen la protena a una membrana.
I La secuencia provee datos para la sntesis de anticuerpos especficos contra la protena de
inter,s.
I Las secuencias son tiles para fabricar sondas de 1#0 especficas para los genes +ue
codifican a las correspondientes protenas
<ecnologa del 1#0 recombinante
/ara p,ptidos mayores a A??? la degradacin de Edman resulta inadecuada. /or ello se utiliza
la t,cnica del 1#0 recombinante9 el clonado y secuenciacin de -ebras largas de 1#0 y la
secuencia de nucletidos revela directamente la secuencia de aminocidos codificada por el
gen. .in embargo esta t,cnica revela la secuencia de la protena naciente, pero no de la
protena funcional, resultante de las modificaciones postraduccionales.
3.3 Inmunologa como t!cnica de investigacin
0nticuerpos monoclonales
Estos m,todos aprovec-an la alta especificidad de anticuerpos por sus protenas7diana. Los
anticuerpos marcados proporcionan medios para eti+uetar una protena, y aislarla, cuantificarla
o visualizarla.
Un anticuerpo es una protena sintetizada en respuesta a la presencia de una sustancia, el
antgeno. Las mol,culas pe+ueas pueden producir anticuerpos si estn asociadas a un
transportador macromolecular. Un anticuerpo reconoce un grupo especfico o agrupacin de
aminocidos en la mol,cula diana +ue se denomina determinante antig,nico o eptopo. Los
anticuerpos en los animales se encuentran en el suero de la sangre. El obstculo de la t,cnica
es +ue la mayor parte de los antgenos tienen varios eptopos. Los anticuerpos policlonales son
mezclas -eterog,neas de anticuerpos, cada uno especfico para uno de los diversos eptopes
del antgeno. .e resuelve esta barrera con anticuerpos monoclonales, anticuerpos con todos
los sitios de unin al antgeno iguales. Estos se sintetizan por medio de la fusin de una c,lula
productora de anticuerpo de corta vida con una c,lula inmortal de mieloma.
1eteccin y cuantificacin mediante ensayo de inmunoabsorcin asociada a enzima
Los anticuerpos pueden utilizarse para cuantificar protena u otro antgeno. La t,cnica de
ensayo de inmunoabsorcin asociada a enzima utiliza una enzima +ue reacciona con un
sustrato incoloro y produce un producto coloreado. La enzima se une covalentemente a un
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anticuerpo especfico +ue reconoce a un antgeno diana. .i el antgeno est presente, el
comple)o anticuerpo7enzima se unir a ,l, y el componente enzimtico del comple)o enzima7
anticuerpo catalizar la reaccin +ue generar el producto coloreado, la presencia del mismo
indica la presencia de antgeno. Eisten dos tipos de EL>.0. El EL>.0 indirecto se utiliza para
detectar la presencia de anticuerpo, se utiliza en la deteccin de 3>F. .e coloca en un pocillo
protenas del ncleo vrico, se agregan los anticuerpos del paciente. .e agregan anticuerpos7
Enzima +ue se unan a los anticuerpos. .e agrega el sustrato9 la reaccin enzimtica indica la
presencia de anticuerpos para el retrovirus.
El EL>.0 sndJic- permite la deteccin del antgeno y no del anticuerpo. .e adsorbe en un
pocillo un anticuerpo contra una enzima en particular, se agrega la sangre u orina + se estima
contiene el antgeno. .e aade un segundo anticuerpo !asociado a una enzima" al antgeno. La
reaccin +ca cuantifica la cantidad de antgeno.
<ransferencia Kestern
Esta t,cnica de inmunoensayo permite detectar pe+ueas cantidades de protena. .e somete
la muestra a electroforesis en un gel de .1.7poliacrilamida. Las protenas separadas en gel se
transfieren a la superficie de una lmina de polmero para -acerlas ms accesibles a la
reaccin. .e aade a la lmina de anticuerpo +ue sea especfico para la protena de inter,s y
,ste reacciona con su antgeno. El comple)o antgeno7anticuerpo puede ser detectado por otro
anticuerpo especfico para el primero. .i este est marcado radiactivamente puede realizarse
una autorradiografa.
La fluorescencia posibilita la visualizacin
Los marcadores fluorescentes permiten eaminar las protenas en su entorno biolgico.
<ambi,n aportan datos acerca de la funcin +ue cumple la protena.
3." Sntesis de p!ptidos en fase slida
Estos p,ptidos son tiles por+ue9 L /ueden servir como antgenos para estimular la formacin
de anticuerpos especficos. Estos anticuerpos se pueden utilizar para aislar la protena intacta,
o localizarla en la c,lula. L .e pueden usar para aislar receptores de -ormonas y mol,culas
seal, tambi,n en columnas cromatogrficas L /ueden utilizarse en frmacos L /ermiten
definir las reglas +ue gobiernan la estructura tridimensional.
'(mo se realiza* El grupo amino de un aminocido se une al carboilo de otro, para esto es
necesario blo+uear algunos grupos y activar otros. El grupo M7amino del Aer 00 del p,ptido se
blo+uea con /ert7butiloicarbonilo !t72oc", dando t72oc7aminocido. El grupo carboilo de este
mismo aminocido se activa con el reactivo diciclo-eilcarbodiimida !1((". El amino libre del
siguiente aminocido ataca el carboilo activado, originando un enlace peptdico y liberando
diciclo-eilurea. El grupo carboilo del dip,ptido resultante se activa con 1(( y reacciona con
7
el grupo amino libre del aminocido +ue va a ser el tercer residuo del p,ptido. Este proceso se
repite -asta completar el p,ptido. La eposicin del p,ptido a cido diluido libera el grupo t7boc
protector del Aer aminocido.
La unin de la cadena peptdico creciente a una matriz insoluble incrementa aun ms la
eficiencia. La venta)a de este m,todo es +ue como la cadena esta unido a la fase slida no se
necesita purificar intermediarios y al efectuarse siempre en el mismo recipiente se evita p,rdida
de producto. En el caso de utilizar la fase slida, el carboilo del Aer 00 se une a esta, luego se
procede como lo eplicado. 0l final de la sntesis, se libera el p,ptido con cido fluor-idrico, +ue
rompe el ancla)e ,ster carbolico sin alterar los enlaces peptidicos.
3.# spectrometra de masas
/ermite determinar masas proteicas con una precisin de una unidad de masa. 0naliza formas
ionizadas de mol,culas en fase gaseosa. Es aplicable a gases o l+uidos voltiles +ue liberan
iones en fase gaseosa. Las medidas se realizan determinando con +ue facilidad se acelera un
ion al aplicarle un campo el,ctrico.
1ado +ue los p,ptidos y protenas no son voltiles se debe generar una concentracin lo
suficientemente alta en la fase gaseosa de protena ionizada, pero intacta. /ara esto se -a
desarrollado dos m,todos9 espectrometra de desercin7ionizacin en matriz inducida !$0L1>"
e ionizacin por electrospray !E.>". En $0L1>, la protena o p,ptido se coprecipita con un
compuesto orgnico +ue absorbe la luz de una longitud de onda apropiada !la matriz". El
destello de una luz sobre la preparacin epulsa las mol,culas de la superficie. Estas mol,c
capturan e7 cuando salen de la matriz y por lo tanto la de)an como iones negativos. En E.>, las
disoluciones +ue contienen a la protena o el p,ptido fluyen a trav,s de una fina punta metlica
mantenida a un potencial el,ctrico distinto de cero. .e liberan pe+ueas gotculas cargadas
+ue contienen tanto protena como disolvente. El disolvente se evapora, concentrando la carga.
La repulsin de las mol,culas cargadas se incrementa, y los iones moleculares individuales
vuelan libres.
1espu,s de -aber generado los iones en fase gaseosa, se pueden utilizar varias
aproimaciones para determinar su masa. En el anlisis de tiempo de vuelo !<GN", los iones se
aceleran en un campo el,ctrico -acia un detector, los iones ms pe+ueos via)an ms rpido y
llegan primero al detector.
La masa de una protena normalmente no es suficiente para identificarla entre un con)unto de
protenas. .in embargo, la masa de la protena )unto con la masa de fragmentos proteicos
producidos por un m,todo de ruptura especfico, provee una identificacin nica.
3.$ %eterminacin de la estructura tridimensional
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(ristalografa de rayos &
Nue la primera t,cnica en desarrollarse. %evela posiciones tridimensionales eactas de la
mayor parte de los tomos de una mol,cula de protena. La radiacin de rayos & proporciona la
me)or resolucin por+ue la long de onda de los rayos es apro. iguala la long del enlace
covalente. /ara llevar a cabo una cristalografa se necesita un cristal de protena, una fuente de
rayos & y un detector.
La adicin lenta de sulfato amnico u otra sal, a una disolucin concentrada de protena
favorece la formacin de cristales muy ordenados. 1ebe ensayarse varias veces para lograr un
cristal idneo. Los rayos producidos por la fuente, atraviesan en parte el cristal sin cambios y el
resto se dispersa. Estos rayos dispersados o difractados se registran en una pelcula
fotogrfica o bien por medio de un detector electrnico de estado slido. El cristal se sita con
una orientacin precisa respecto al -az de rayos y a la pelcula. .e -ace girar para +ue el -az
incida en todas direcciones. Esto produce una fotografa de rayos & +ue consiste en una serie
de manc-as llamadas refleiones. Las intensidades y posiciones de cada manc-a son los
datos eperimentales, +ue permitirn la reconstruccin de una imagen de la protena a partir de
las intensidades observadas. La imagen se forma aplicando la transformada de Nourier. La
resolucin del anlisis de rayos & viene determinada por el nmero de intensidades dispersas
usadas en la sntesis de Nourier.
Espectroscopia de %esonancia $agn,tica #uclear
%evela la estructura atmica de macromol,culas en disolucin !concentradas". .e basa en el
-ec-o de +ue algunos ncleos atmicos son intrnsecamente magn,ticos !poseen spin". La
rotacin de un protn genera un momento magn,tico, cuando se aplica un campo magn,tico
eterno, este momento puede adoptar una de dos orientaciones. 0plicando un pulso de
radiacin electromagn,tica se puede cambiar el spin de una posicin de ba)a a alta energa,
obteniendo una resonancia. El espectro se obtiene manteniendo el campo constante y variando
la frecuencia de la radiacin electromagn,tica.
El flu)o de e7 alrededor de un ncleo magn,tico genera un pe+ueo campo magn,tico local +ue
se opone al campo aplicado. Los ncleos absorben a frecuencias de resonancia
caractersticas, +ue se conoce como desplazamiento +umico. (on esta informacin se pueden
deducir los cambios de un grupo +umico determinado en diferentes condiciones, tales como el
cambio conformacional de una protena de estructura desordenada a una -,lice alfa en
respuesta a un cambio de p3.
Gtra variante es el espectro bidimensional obtenido por espectroscopia de intensificacin
nuclear Gver-auser !#GE.O", +ue muestra grficamente pares de protones +ue estn muy
cercanos, incluso aun+ue no est,n )untos en la estructura primaria. La base de esta t,cnica es
el efecto nuclear Gver-auser, una interaccin entre ncleos +ue es proporcional al inverso de
9
la seta potencia de su distancia. .e induce una magnetizacin transitoria en una muestra por
aplicacin de un pulso de radiofrecuencia, posibilitando alterar la rotacin de un ncleo y
eaminar el efecto producido en la rotacin de otro ncleo vecino. El efecto proporciona un
medio para detectar la localizacin relativa de un tomo respecto a otro en la estructura
tridimensional de la protena. La diagonal de un espectro de #GE.O corresponde al espectro
unidimensional. Los picos fuera de la diagonal proporcionan una informacin nueva crucial9
identifican pares de protones +ue estn separados menos de P Q.
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