EFECTIVIDAD BIOLGICA DE EXTRACTOS POLIFENLICOS CONTRA

BACTERIAS FITOPATGENAS

Eduardo Osorio-Hernndez
1
, Janeth M. Ventura-Sobrevilla
2
, M. Flores-Dvila
2
, Faustino
Lara
2
, Ral Rodrguez-Herrera
2
F. D. Hernndez-Castillo
1
y Cristbal N. Aguilar
1
*

1. Departamento de Parasitologa Agrcola. Universidad Autnoma Agraria Antonio Narro,
Buenavista, Saltillo, Coahuila, Mxico.
2. Departamento de Investigacin en Alimentos. Facultad de Ciencias Qumicas. Universidad
Autnoma de Coahuila, Mxico. *cristobal.aguilar@mail.uadec.mx

RESUMEN
La tendencia mundial por encontrar productos de origen natural para el control de bacterias fitopatgenas ha creado
la necesidad de detectar y estudiar plantas con potencial bactericida. El objetivo de esta investigacin fue evaluar la
efectividad antibacteriana de extractos de gobernadora (Larrea tridentata Cov.), nuez (Carya illinoensis) y la granada
(Pnica granatum), se probaron 4 concentraciones de cada uno de los extractos (Gobernadora, 0.77, 0.35, 0.17,
0.08 ppm; nuez, 0.20, 0.10, 0.05, 0.02 ppm; granada. 0.21, 0.11, 0.05, 0.02 ppm), el efecto de estas
concentraciones se evaluaron sobre Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Smith y col., 1992) Dye, Xanthomonas
axonopodis pv. vesicatoria (Doinge); Erwinia carotovora subsp. carotovora (Van hall) Dye y Pseudomonas cichorii
(Siwingle) Stapp. La inhibicin del crecimiento se evalu despus de 60 h de la inoculacin. El mayor efecto
inhibitorio se observ que el extracto de hojas de gobernadora, mientras que las bacterias fitopatgenos ms
susceptibles fueron Pseudomonas cichorii y Xanthomonas axonopodis pv. Vesicatoria.

Palabras clave: Larrea tridentata, Carya illinoensis, Pnica granatum.

1. INTRODUCCIN
Las bacteria causan importantes prdidas a la agricultura mundial, estos patgenos son importantes porque causan
enfermedades devastadoras, cuando se presentan las condiciones ambientales adecuadas; Entre los gneros de
importancia agrcola se encuentran las bacterias Erwinia, Pseudomona y Xanthomona. (Aranda, 2002). La
aplicacin excesiva e indiscriminada de bactericidas para el control de enfermedades agrcolas ha ocasionado un
sin nmero de problemas de resistencia, afectacin del medio ambiente y graves complicaciones a la salud humana.
Adems de que elevan los costos de produccin por la utilizacin de esta clase de bactericidas. Ante esta situacin,
el nuevo enfoque en el combate de las bacterias trata de integrar nuevas opciones encaminadas a la proteccin y
aumento de cosechas pero con alternativas no perjudiciales; en este caso la utilizacin de sustancias de origen
natural, que las mismas plantas han desarrollado a travs de la evolucin pueden ser una alternativa para limitar
poco a poco el uso de agroqumicos. Esto pudiera eliminar varios efectos adversos causados por el uso de
compuestos sintticos debido a la rpida biodegradabilidad de los metabolitos orgnicos, ya que estos desparecen
con facilidad del medio ambiente areo y del suelo despus de que son aplicados en el campo (Tanaka y
Andomuro, 1993).
La tendencia mundial por encontrar productos de origen natural para el control de enfermedades causadas por
bacterias fitopatgenas tales como: Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli que ocasiona el tizn comn del frjol,
Xanthomonas axonopodis pv. Vesicatoria que ocasiona mancha bacteriana; Erwinia carotovora subsp. carotovora
causante de la enfermedad pudricin blanda y Pseudomonas cichorii que ocasiona la bacteriosis de la lechuga, ha
creado la necesidad de detectar y estudiar plantas que tengan un potencial de uso como bactericidas naturales,
debido a los metabolitos secundarios que biosintetizan y que tienen un efecto bactericida, tratando con ello de que
en un futuro se puedan generar productos orgnicos derivados de la misma para el control de enfermedades
agrcolas.
La bsqueda de estrategias, tcnicas y mtodos que incrementen la productividad agrcola y mantengan el equilibrio
ecolgico sin agredir los ecosistemas, sin arriesgar la salud humana, constituye hoy en da un gran reto para la
agricultura y su desarrollo (Gallegos y col., 2004). Existen antecedentes que indican el potencial antimicrobiano de
componentes de especies vegetales distribuidas en la zona semidesrtica de Mxico. Entre estas especies
vegetales destacan la gobernadora (Larrea tridentata Cov.) (Lira, 2003), mientras que la nuez (Carya illinoensis) y la
granada (Punica granatum) se encuentran en menor proporcin y en regiones localizadas del semidesierto
mexicano. Estos ltimos cultivos se caracterizan por tener una gran cantidad y variedad de polifenoles.
Dentro de los compuestos polifenlicos que presentan la gobernadora (Larrea tridentata Cov.), la nuez (Carya
illinoensis) y la granada (Punica granatum) estn los galotaninos, elagitaninos, taninos complejos y taninos
condensados, los cuales tienen funciones de proteccin contra mamferos y microorganismos. Se sabe que los
taninos en concentraciones altas son antinutricionales, pues contienen muchos grupos funcionales del tipo OH, los
cuales reaccionan fcilmente con protenas y polisacridos, volviendo estos productos insolubles, y de esta manera,
impiden su absorcin. Adems la hidrlisis de estos compuestos genera monofenoles de alto inters mdico-
farmacutico, alimentario, agronmico e industrial. La distribucin de los compuestos fenlicos en los tejidos y
clulas vegetales vara considerablemente de acuerdo al tipo de compuesto qumico que se trate, situndose en el
interior de las clulas o en la pared celular. Debido a que a la cscara de la nuez y de la granada se considera
como basura y no se le da un uso, en el presente trabajo se plantea aprovechar estos materiales, as como tambin
aprovechar el recurso de la gobernadora como inhibidores del crecimiento de bacterias fitopatgenos.
Hay reportes de la inhibicin del crecimiento bacteriano por extractos vegetales (Gven y col., 2005, Gven y col.,
2006). El efecto sobre el crecimiento de bacterias patgenas de humanos tambin ha sido observado;
Staphylococcus aureus fue inhibido con la aplicacin de extracto de Indigofera suffruticosa (Pereira y col., 2006;
Orhan y col., 2007). Escherichia coli y Pseudomonas aerugeniosa fueron inhibidos con extractos de Lupinus
angustifolius (Erdemoglu y col., 2007); Helicobacter pylori fue inhibida con extractos de ajo (Cellini y col., 2006 ).
Extractos vegetales metanlicos y acuosos han resultado efectivos para inhibir el crecimiento de diversos bacterias
(Koduru y col., 2006). Extractos de Cajanus cajon, usando como solventes agua, ter de petrleo, etanol, cloroformo
y metanol inhibieron el crecimiento de E. coli, S. aureus y Salmonella typhimurum (Okigbo y col., 2006). Los
reportes de inhibicin del crecimiento de bacterias fitopatgenas por extractos vegetales son menos numerosos,
destacando el trabajo reportado por Pretorius y col. (2003), quienes probaron extractos de 26 especies vegetales
contra 5 bacterias fitopatgenas reportando que todos los extractos tuvieron efecto inhibitorio. El objetivo del
presente trabajo fue evaluar la efectividad biolgica de extractos polifenlicos contra bacterias fitopatgenas.

2. MATERAILES Y MTODOS
2.1 Obtencin del material vegetal
Las muestras de follaje (hojas y pequeos tallos) de gobernadora fueron recolectadas en los suburbios de la ciudad
de Saltillo, las cscaras de la nuez y granada se obtuvieron de las ciudades de Ramos Arizpe y Sabinas todas
estas ciudades del estado de Coahuila Mxico. El material vegetal fue secado a 60
0
C por 48 h posteriormente fue
pulverizado y almacenado a temperatura ambiente en recipientes obscuros para evitar la oxidacin de polifenoles
por exposicin directa a la luz.

2.2 Extraccin de polifenoles
Los extractos de la gobernadora y nuez se llevaron a cabo mediante destilacin a reflujo. Para el caso de de
gobernadora se empleo una proporcin 1:4 de material seco y acetona al 70 %. Para la nuez se emple metanol al
70 % relacin 1:4 y para el caso de la extraccin de polifenoles de la granada, en un recipiente de plstico, se
colocaron 150 g de polvo de cscara y se utiliz como solvente el agua (relacin 1:5).

2.3 Efectividad antibactericida de extractos polifenoles
Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli fue aislada de semillas de frjol (Phaseolus vulgaris), las cuales se
desinfectaron con cloro y enseguida se colocaron en un matraz con agua destilada, posteriormente se agreg
peptona y se mantuvo en agitacin durante tres horas, enseguida se realiz la siembra en cajas petri con medio B
King (KB), posteriormente se realiz la identificacin de acuerdo a las claves de Schaad y col. (2001). Para el caso
de Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria se aisl de tomate, Pectobacterium carotovora subsp. carotovora se
aisl de papa y Pseudomonas cichorii se aisl de lechuga. Para el aislamiento se tom material enfermo y se puso
en una bolsa de maceracin a la cual se le agrego agua destilada y posteriormente se realiz la siembra para el
caso Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria se utiliz el medio de B King, mientras que para el Pectobacterium
carotovora subsp. carotovora (Van hall) Dye y Pseudomonas cichorii (Siwingle) Stapp se utiliz el medio de KB.
Posteriormente se realiz la identificacin siguiendo las clave Schaad y col. (2001).

2.4 Conservacin y activacin de las bacterias
Las bacterias fueron conservadas en tubos de Eppendorf (1.5 mL), en los que se agregaron 100 L de bacteria
activa con 500 L de caldo (KB sin peptona) y se posteriormente se congelaron a una temperatura -20

C. Para
la activacin se prepararon diluciones bacterianas agregando 100 L de la bacteria activa, a un tubo de ensaye con
4 mL de caldo KB, enseguida se mezcl y la solucin se ley en un espectrofotmetro (THERMO SPECTRONC) a
625 nm, ajustndose a 0.08-0.1 de absorbencia, esta turbidez corresponde a una concentracin de 1.5x10
8

UFC/mL.

2.5 Bioensayo de la inhibicin de los extractos sobre las bacterias fitopatgenas
El Bioensayo se realiz en microplacas de poliestireno esterilizadas en autoclave por 20 min. a una presin de 5-10
Lb. A cada pozo de la placa se le agreg 200 L de medio KB, el medio se dej reposar durante 30 minutos,
enseguida se le agregaron 20 L de inculo (previamente ajustado), despus se agregaron 20 L de extracto a
diferentes concentraciones (Cuadro 1) y se emple el agua como Testigo. Las microplacas fueron incubadas a 28

C
durante 60 h. La observacin microscpica se realiz con un estereoscopio, esto con el fin de determinar la
inhibicin del crecimiento de manera cualitativa.

Cuadro 1. Concentraciones (ppm) de los extractos polifenlicos evaluados a diferentes
concentraciones sobre la inhibicin de crecimiento de bacterias fitopatgenas.


2.6 Diseo experimental
El anlisis estadstico que se utiliz fue un diseo completamente al azar con arreglo factorial donde los factores
fueron tipo y concentracin del extracto y la especie bacteriana. La unidad experimental fue un pozo de la
microplaca, se utilizaron 6 repeticiones, la variable de respuesta fue la inhibicin del crecimiento, la cual se evalu
en forma cualitativa (presencia, ausencia). Para la evaluacin de los resultados se emple un anlisis categrico de
datos usando tablas s x r donde las variables de las columnas y de las hileras fueron clasificadas nominalmente.
Para este anlisis se emple el programa SAS Versin 1997.


3. RESULTADOS Y DISCUSION
Evaluacin de la actividad biolgica de los extractos, sobre cepas de bacterias fitopatgenas
El estadstico al azar de Qs est marcado como Chi-cuadrada de Mantel-Haenszel, el valor Chi-cuadrada de
Pearson Qp esta etiquetado Chi-cuadrada. Qs tiene un valor de 21.073 (Cuadro 2) y P=0.001; Qp tiene un valor de
173.413 y P=0.001, ambos son altamente significativos, por lo que se concluye que hay una estrecha asociacin
entre el extracto y la inhibicin del crecimiento de las bacterias. Para el variable extracto se encontr un valor de
21.073 el cual es altamente significativo, por lo tanto los extractos inhiben en forma diferente el crecimiento de las
bacterias (cuadro 3). La gobernadora inhibe ms el crecimiento de las bacterias seguido del extracto de la nuez y
finalmente el extracto de granada present menor efecto inhibitorio (cuadro 4). El valor QMH para la correlacin no
cero fue =21.073, con 1 grado de libertad este es claramente significativo, lo cual refuerza la idea de la relacin
estrecha entre el extracto y la inhibicin de crecimiento de la bacterias (Cuadro 3). Una posible explicacin es que la
gobernadora presenta una mayor concentracin de polifenoles, en comparacin con la nuez y la granada. Cabe
sealar que Aguilera-Carbo y col. (2005) reportan que la gobernadora y la granada tienen efectos inhibitorios sobre
bacterias de alimentos a concentraciones mayores de 50 gmL
-1
. En este estudio se evalu el efecto de los
extractos de gobernadora sobre el crecimiento de bacterias fitopatgenas, con resultados que coinciden con los
reportados para bacterias de alimentos. Es de enfatizar que aunque no se tienen estudios del efecto de los tres
extractos (gobernadora, nuez y granada) sobre bacterias fitopatgenas, Peralta-Bello (2006) report que se
present inhibicin del crecimiento de las bacterias Pseudomanas cichorii, Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli y
Erwinia carotovora pv atroseptica, con extractos de Flourensia cernua D.C. El control de Xanthomonas axonopodis
pv vesicatoria y de Erwinia carotovora carotovora es importante dado que la primera es el agente causal de la
enfermedad conocida como mancha bacteriana de tomate y chile, mientras que la segunda causa daos estimados
entre 10 y 60 % en frutos de chile. Las plantas se enferman aproximadamente a los 40 das de su plantacin (Garca
y col., 2000) las recomendaciones tradicionales para controlar de estas enfermedades son las aplicaciones de
bactericidas a base de cobre combinadas con mancozeb o estreptomicina; sin embargo, su control no ha sido del
todo satisfactorio (Carrillo y col., 2001). Para estas bacterias los extractos vegetales probados en esta investigacin
tiene potencial como un mtodo alternativo de control.

Extracto Concentracin (ppm) Testigo
Gobernadora 0.70 0.35 0.17 0.08 0
Nuez 0.20 0.10 0.05 0.02 0
Granada 0.21 0.11 0.05 0.02 0
Cuadro 2. Estadstico de extracto menos inhibicin de las bacte
Estadstico
Chi-Cuadrado
Taza de versimilitud Chi-Cuadrada
Chi-Cuadrada Mantel-Haenszel
Coeficiente Phi
Coeficiente de Contingencia
Cramer's V
Muestras totales = 475
De acuerdo a las concentraciones del extracto de
a mayor concentracin es mayor la inhibicin, ya que las c
de las 4 bacterias (P. c. subsp. c=
Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli
cichorii, mientras con el testigo no hu
Peralta-Bello (2006), obtuvo extractos de
metanol-cloroformo) y observ que el mayor efecto inhibitorio se present a la concentracin ms alta (4000 ppm)
Extractos de plantas con alto contenido de taninos como la corteza de
antibacteriana. La resina de gobernadora a dosis bajas tiene efectos bactericidas contra las bacterias fitopatgenas
Erwinia amylovora, E. atroseptica y Pseudomonas solanacearum
nuez (Figura 2), se observ que slo
cabe sealar que no existen trabajos q
fitopatgenas. La figura 3 muestra el efecto de
bacteriano, en este caso solo la concent

Figura 1. Inhibicin del cre
a 4


Figura 2. Inhibicin de crecimiento de 4 bacteri
a 4 co
Concentraciones
I
n
h
i
b
i
c
i
o
n

d
e
l

c
r
e
c
i
m
i
e
n
t
o

0
50
100
I
n
h
i
b
i
c
i
o
n
d
e
l

c
r
e
c
i
m
e
i
n
t
o

(
%
)
Estadstico de extracto menos inhibicin de las bacterias fitopatgena

Grados de libertad Valor
Cuadrado 6 173.413
Cuadrada 6 209.316
Haenszel 1 21.073

Coeficiente de Contingencia


del extracto de gobernadora que se utilizaron (figura 1) se observo
a mayor concentracin es mayor la inhibicin, ya que las concentraciones 1 y 2 inhibieron totalmente el crecimiento
de las 4 bacterias (P. c. subsp. c= Pectobacterium carotovora subsp. carotovora (Van hall) Dye, X. a. pv. p=
phaseoli, X. a. pv. v= Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria y P. c=
mientras con el testigo no hubo inhibicin del crecimiento. Estos resultados coinciden con lo obtenido por
extractos de Flourensia cernua D.C. con diferentes solventes (hexano, ter, e
el mayor efecto inhibitorio se present a la concentracin ms alta (4000 ppm)
Extractos de plantas con alto contenido de taninos como la corteza de mimosa han reportado tener una gran actividad
La resina de gobernadora a dosis bajas tiene efectos bactericidas contra las bacterias fitopatgenas
Pseudomonas solanacearum (Lira-Saldivar, 2003). Para el e
la concentracin ms alta inhibi el crecimiento de las 4 bacterias fitopatgena
cabe sealar que no existen trabajos que evidencien el potencial inhibitorio de estos extractos
La figura 3 muestra el efecto de las concentraciones del extracto de granada,
la concentracin ms alta inhibi el crecimiento de las cuatro bacterias fitopatgenas.
Inhibicin del crecimiento de 4 bacterias fitopatgenas sometidas
a 4 concentraciones de extracto de gobernadora.
Inhibicin de crecimiento de 4 bacterias fitopatgenas sometidas
concentraciones del extracto del cscara de nuez.
0
20
40
60
80
100
P.c. sub.c
X.a. pv. v
P.c
X.a.pv. p
Concentraciones
C1
C2
C3
C4
Testigo
P.c
X.a.pv.
v
X. a. pv. p
P. c. sub.c
Concentraciones
genas
P
0.001
0.001
0.001
0.604
0.517
0.427
e utilizaron (figura 1) se observo claramente que
on totalmente el crecimiento
(Van hall) Dye, X. a. pv. p=
y P. c= Pseudomonas
Estos resultados coinciden con lo obtenido por
tes solventes (hexano, ter, etanol,
el mayor efecto inhibitorio se present a la concentracin ms alta (4000 ppm).
mimosa han reportado tener una gran actividad
La resina de gobernadora a dosis bajas tiene efectos bactericidas contra las bacterias fitopatgenas
Para el extracto de cscara de
ento de las 4 bacterias fitopatgenas,
de estos extractos sobre bacterias
granada, sobre el crecimiento
de las cuatro bacterias fitopatgenas.

s

s

Figura 3. Inhibicin de cre
a 4 co

Cuadro 3. Comparacin estadstica para el efecto del extracto sobre el crecimiento bacteriano con el estadstico
Cochran-
___________________________________________________
Estadstico Hiptesis alternativa gl Valor Prob
___________________________________________________
1 Correlacin no cero
2 Difer. Calific.promedio hileras
3 Asociacin general 6 173.048
___________________________________________________


Cuadro 4. Porciento de crecimiento de diferentes bacterias
a tres extractos vegetales y cuatro concentraciones

P.c. sbsp. c Ps. c X.
Gobernadora 50 0 25 0 75
10.53 0.00 5.26 0.00 15.79
66.67 0.00 33.33 0.00
33.33 0.00 14.29 0.00
_____________________________________________________________
Granada 75 75
15.79 15.79 15.79 15.79 63.16
25.00 25.00 25.00 25.00
50.00 100.00 42.86 100.00
_________________________________________________________________
Nuez 25 0 75 0 100
5.26 0.00 15.79 0.00 21.05
25.00 0.00 75.00 0.00
16.67 0.00 42.86 0.00
_________________________________________________________________
Total 150 75 175 75 475
31.58 15.79 36.84 15.79 100.00
_______________________________________________________________




0
20
40
60
80
100
I
n
h
i
b
i
c
i
o
n
d
e
l

c
r
e
c
i
m
i
e
n
t
o

(
%
)

Inhibicin de crecimiento de 4 bacterias fitopatgenos sometidas
a 4 concentraciones del extracto de cscara de granada.
Comparacin estadstica para el efecto del extracto sobre el crecimiento bacteriano con el estadstico
-Mantel-Haenszel (Basado en calificaciones de rango).
___________________________________________________
Estadstico Hiptesis alternativa gl Valor Prob
___________________________________________________
1 Correlacin no cero 1 21.073 0.001
Difer. Calific.promedio hileras 2 37.089 0.001
3 Asociacin general 6 173.048 0.001
___________________________________________________
Nmero total de muestras=475
Porciento de crecimiento de diferentes bacterias fitopatgenas expuestas
a tres extractos vegetales y cuatro concentraciones

P.c. sbsp. c Ps. c X. a. pv ph X. a. pv v Total
Gobernadora 50 0 25 0 75
10.53 0.00 5.26 0.00 15.79
66.67 0.00 33.33 0.00
33.33 0.00 14.29 0.00
_____________________________________________________________
Granada 75 75 75 75 300
15.79 15.79 15.79 15.79 63.16
25.00 25.00 25.00 25.00
50.00 100.00 42.86 100.00
_________________________________________________________________
Nuez 25 0 75 0 100
5.26 0.00 15.79 0.00 21.05
25.00 0.00 75.00 0.00
16.67 0.00 42.86 0.00
__________________________________________________
Total 150 75 175 75 475
31.58 15.79 36.84 15.79 100.00
_______________________________________________________________
P.c.sub. C
X.a. pv. v.
Concentraciones

s
Comparacin estadstica para el efecto del extracto sobre el crecimiento bacteriano con el estadstico
4. CONCLUSIONES
Las mayores actividades inhibitorias sobre el crecimiento de las bacterias fitopatgenas se presentaron a las dosis
ms alta en todos los extractos. Por su parte los extractos de follaje de gobernadora y de cscara de nuez
mostraron mayor efecto bactericida en comparacin con el extracto de cscara de granada. Finalmente las bacterias
ms sensibles fueron Pseudomonas cichorii y Xanthomonas axanopodis pv. vesicatoria.

5. Agradecimientos
El presente trabajo forma parte del proyecto CONAFOR-CONACYT-2004-13

6. Referencias
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