Universidade Estadual do Rio Grande do Sul

Disciplina: Microbiologia Geral

Professora: Roberta Bussamara











METODOS PARA TESTAR SENSIBILIDADE DAS BACTRIAS AOS ANTIBITICOS
CONTROLE DA POPULAO BACTERIANA POR MTODOS FSICOS E QUMICOS









Grupo
Luana Reichert
Vanessa Schmidt






Novo Hamburgo, 27 de maio de 2014.


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2 Microbiologia Geral 27 de maio de 2014.
INTRODUO

A cincia para o controle do crescimento microbiano teve incio a cerca de 100 anos,
quando Pasteur levou os pesquisadores a acreditarem que os micrbios seriam uma
possvel causa das doenas. Na metade do sculo XIX, o mdico hngaro Ignaz
Semmelweis e o mdico ingls Joseph Lister utilizaram algumas das primeiras prticas de
controle microbiano para procedimentos mdicos. Essas prticas incluam a lavagem das
mos com hipoclorito de clcio e a utilizao de tcnicas cirrgicas asspticas. At aquele
momento as infeces nosocomiais (hospitalares) matavam pelo menos 10% dos pacientes
cirrgicos e 25% das parturientes.
A ignorncia a respeito dos micro-organismos era tanta que, durante a Guerra Civil
Americana, no era incomum um cirurgio limpar seu bisturi, entre as incises, na sola de
sua bota. A preveno e o controle de enfermidades infecciosas podem ser eficientemente
realizados mediante aplicao de agentes qumicos ou fsicos sobre os micro-organismos
antes que estes entrem em contato com os hospedeiros, ou antes que atravessem a
barreira cutnea. Tais procedimentos podem ser utilizados sobre os alimentos, gua,
objetos em geral ou sobre a pele/mucosa.
A natureza do agente a ser utilizado (fsico ou qumico), seu tipo especfico (grupo a
que pertence) e sua intensidade de aplicao tm de ser apropriados para a natureza do
material que se vai submeter ao tratamento, bem como devem ser condizentes com o grau
de eliminao dos micro-organismos que se almeja alcanar. Assim sendo, pode-se planejar
desde uma inativao seletiva, at uma destruio completa de todos os micrbios
presentes no local.














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INTRODUO TERICA

O conceito de que grande parte das bactrias relevantes do ponto de vista clnico
resistente a agentes antimicrobianos de extrema importncia para a abordagem do quadro
clnico que causam. Faz-se necessrio, portanto, a avaliao do perfil de susceptibilidade
das bactrias isoladas a drogas antimicrobianas (antibiograma), mesmo que se realize uma
escolha emprica em um primeiro momento. A realizao do antibiograma e sua
interpretao no uma tarefa fcil, por suas limitaes e principalmente pela crescente
descoberta de novos mecanismos de resistncia, o que exige cada vez mais atualizao e
treinamento dos profissionais.
A metodologia de Kirby e Bauer para antibiograma a mais difundida e utilizada at
hoje na rotina de anlises clnicas, devido a sua praticidade de execuo, baixo custo e
confiabilidade de seus resultados. Apesar de sua relativa simplicidade de execuo, a
tcnica de Kirby e Bauer exige que as instrues sejam seguidas rigorosamente de forma
que os resultados obtidos correspondam realidade e possam ser comparados com as
tabelas internacionais.
A preveno e o controle de enfermidades infecciosas podem ser eficientemente
realizados mediante aplicao de agentes qumicos ou fsicos sobre os micro-organismos
antes que estes entrem em contato com os hospedeiros, ou antes que atravessem a
barreira cutnea. Tais procedimentos podem ser utilizados sobre os alimentos, gua,
objetos em geral ou sobre a pele/mucosa. A natureza do agente a ser utilizado (fsico ou
qumico), seu tipo especfico (grupo a que pertence) e sua intensidade de aplicao tm de
ser apropriados para a natureza do material que se vai submeter ao tratamento, bem como
devem ser condizentes com o grau de eliminao dos micro-organismos que se almeja
alcanar. Assim sendo, pode-se planejar desde uma inativao seletiva, at uma destruio
completa de todos os micrbios presentes no local. Sendo assim faz-se necessrio
conceituar alguns vocbulos essenciais e fazer consideraes bsicas sobre os mesmos.
Um termo frequentemente usado, e mal empregado, ao discutir o controle do
crescimento microbiano a esterilizao (esterilizao a remoo ou destruio de todas
as formas de vida microbiana). O aquecimento o mtodo mais comum usado para matar
micro-organismos, incluindo as formas mais resistentes, como os endosporos. Agentes
utilizados em processos de esterilizao so denominados esterilizantes. Lquidos ou gases
podem ser esterilizados por filtrao.
O controle voltado para a destruio de micro-organismos nocivos denominado
desinfeco. Este termo normalmente refere-se destruio de patgenos na forma
vegetativa (no formadores de endosporos), o que no o mesmo que esterilidade

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completa. Processos de desinfeco podem ser realizados com o uso de substncias
qumicas, radiao ultra violeta, gua fervente ou vapor. Na prtica, o termo mais
comumente aplica do ao uso de um produto qumico (um desinfetante) para tratar uma
superfcie ou substncia inerte. Quando esse tratamento dirigido a tecidos vivos,
denominado antissepsia, e o produto qumico ento denominado antissptico. Assim, na
prtica, uma mesma substncia qumica pode ser denominada um desinfetante para um
determinado uso e um antissptico para outro.
Existem variaes da desinfeco e da antissepsia. Por exemplo, quando algum
precisa receber uma injeo, a pele limpa com lcool o processo de degerminao, que
resulta principalmente na remoo mecnica, em vez da morte, da maioria dos micro-
organismos em uma rea limitada. Os copos, as louas e os talheres dos restaurantes esto
sujeitos sanitizao, que tem a finalidade de reduzir as contagens microbianas a nveis
seguros de sade pblica e minimizar as chances de transmisso de doena de um usurio
para outro.

MTODOS FSICOS:

1. Temperatura: O calor constitui um dos mais importantes mtodos empregados
para o controle do crescimento e para a eliminao de micro-organismos. um dos
mtodos preferenciais por ser eficiente contra os micrbios, relativamente seguro para quem
o executa, ter custo baixo e por no formar produtos txicos. Da mesma forma o mtodo
que se baseia nas baixas temperaturas se apresenta seguro para quem o usa e no forma
produtos nocivos.
O calor aparentemente mata os micro-organismos pela desnaturao de suas
enzimas, que resulta na mudana tridimensional dessas protenas, inativando-as. A
resistncia ao calor varia entre os diferentes micro-organismos, e essas diferenas podem
ser expressas pelo conceito de ponto de morte trmica (PMT). O PMT a menor
temperatura em que todos os micro-organismos em uma suspenso lquida especfica sero
mortos em 10 minutos.
a) Esterilizao pelo calor: Distinguem-se o calor mido e o calor seco. O calor
mido a gua ou o vapor de gua a alta temperatura, possui maior poder de penetrao
comparativamente ao calor seco. O calor seco mata os micro-organismos por efeitos de
oxidao. Uma analogia simples a lenta carbonizao do papel em um forno aquecido,
mesmo quando a temperatura permanece abaixo do ponto de ignio do papel. Um dos
mtodos mais simples de esterilizao com calor seco a chama direta ou flambagem, o
qual utilizado muitas vezes no laboratrio de microbiologia para a esterilizao das alas

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de inoculao. E para que o processo de esterilizao seja efetivo neste processo, a ala de
inoculao dever ser aquecida at a obteno de um brilho vermelho (incandescente).
b) Baixas temperaturas: atuam principalmente mediante reduo da atividade
enzimtica microbiana, o que diminui sua taxa metablica e velocidade de crescimento. Os
mtodos mais empregados so:
Refrigerao usado principalmente nas residncias e nos estabelecimentos de
comercializao de alimentos. Possui efeito bacteriosttico e fungiosttico.
Congelamento utilizam-se temperaturas abaixo de 0C. O congelamento rpido
tende a inibir as bactrias sem mat-las (nitrognio lquido, - 179C). No congelamento
lento, cristais de gelo se formam e crescem, rompendo as estruturas celulares de bactrias
e fungos.

2. Radiaes: determinadas radiaes eletromagnticas, ionizantes e no ionizantes
so capazes de inativar (matar) de forma eficaz os micro-organismos. Possuem
dependncia de seus efeitos quanto ao comprimento de onda, da intensidade, durao e
distncia da fonte.
Existem dois tipos de radiao que possuem efeito de esterilizao:
A radiao ionizante so utilizados istopos radioativos que emitem radiao,
como por exemplo, as radiaes gama. Esse tipo de radiao possui comprimento de onda
mais curto e carrega mais energia do que a radiao no-ionizante. O principal efeito da
radiao ionizante a morte ou inativao do micro-organismo, atravs da destruio do
DNA celular.
A radiao no ionizante utilizam-se radiaes com comprimento de onda mais
longo (acima de 1 nm), como a luz ultra-violeta (UV), que provoca alterao no DNA. As
desvantagens do uso da UV so: baixo poder de penetrao, obrigando a exposio direta
dos micro-organismos aos raios para que sejam mortos (atua somente na superfcie dos
materiais) e os efeitos nocivos sobre a pele e os olhos.

MTODOS QUMICOS:

Os mtodos qumicos so baseados em substncias naturais ou sintticas para
eliminar ou inibir o crescimento dos micro-organismos em tecidos vivos ou em objetos
inanimados. Infelizmente, poucos agentes qumicos proporcionam a esterilidade, a maioria
apenas reduz as populaes microbianas em nveis seguros ou removem as formas
vegetativas de patgenos nos objetos. Nenhum desinfetante isolado apropriado para todas
as circunstncias. Fatores como pH, temperatura, tempo de contato, presena de matria

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orgnica (inativa algumas substncias), fase do ciclo vital do micro-organismo, concentrao
do composto qumico e presena de outras substncias qumicas podem influenciar na ao
dos agentes antimicrobianos, alm da variao na resistncia dos micro-organismos aos
produtos qumicos.
Existem duas categorias principais de efeitos dos mtodos qumicos:
Efeito esttico (bacteriosttico ou fungiosttico) ocasiona a inibio no crescimento
microbiano.
Efeito microbicida / germicida (bactericida, fungicida, viruscida, protozoocida ou
esporocida) promove a destruio dos micro-organismos.
A capacidade de eliminar micro-organismos, a rapidez assim como o espectro de
ao, define o nvel de desinfeco que pode ser alcanado por determinado produto.
Tendo em vista isso, podemos classific-los da seguinte forma:
Nvel baixo eliminao da maioria das bactrias, de alguns vrus e alguns
fungos, sem inativao de micro-organismos mais resistentes como microbactrias e formas
esporuladas.
Nvel intermedirio inativao das formas vegetativas de bactrias, da
maioria dos vrus e maioria dos fungos.
Nvel alto destruio de todos os micro-organismos, com exceo de formas
esporuladas.
Alguns tipos de desinfetantes e antisspticos:
Agentes alquilantes: glutaraldedo, formaldedo, xido de etileno.
Fenis: fenis
lcoois: etlicos e isoproplicos
Biguanidas: clorexidina
Halognios: compostos clorados e iodo
Compostos de Amnio Quaternrio: cloreto de benzalcnico
Peroxignios: perxido de hidrognio, cido peractico, oznio
Corantes: violeta de genciana








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OBJETIVO

Um antibiograma um ensaio que mede a susceptibilidade/resistncia de uma
bactria a um ou mais agentes antimicrobianos. Objetivo deste tanto a anlise do espectro
de sensibilidade/resistncia a drogas de uma bactria quanto determinao da
concentrao mnima inibitria. O teste, denominado antibiograma, feito utilizando-se
discos de difuso antibiticos depositados sobre a superfcie do meio onde se inoculou, por
espalhamento, uma amostra de uma cultura bacteriana previamente crescida em meio
lquido.
Em relao a outras prticas, o objetivo ter conhecimento dos agentes fsicos e
qumicos utilizados para o controle de populaes bacterianas.

























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METODOLOGIA

Prtica 08: Mtodos para testar a Sensibilidade das Bactrias aos Antibiticos

Procedimento
Saturou-se um swab de algodo com a suspenso bacteriana.
Semeou-se a suspenso bacteriana uniformemente sobre a superfcie estril do
meio de gar Muller-Hinton com o swab de algodo, em 3 direes, a fim de obter
um inculo uniforme.
Deixou-se a superfcie das placas secar por 15 segundos.
Colocou-se os discos de antibiticos sobre a superfcie do gar inoculado, com
auxlio de uma pina estril, pressionou-se levemente cada disco para baixo para
assegurar um contato uniforme.
Deixou-se a placa em incubao 37 C.


Prtica 09: Controle da Populao Bacteriana por Mtodos Fsicos

Procedimento
Calor mido:
Com a caneta de retroprojetor, fez-se 4 divises iguais na parte de inferior da placa.
A partir de uma cultura em gar inclinado, foi feita uma suspenso da bactria em
gua destilada estril. Ferveu-se esta suspenso em banho-maria. Aps 5, 10 e 15
minutos uma alquota da suspenso ser semeada na placa de Petri demarcada.
Colocou-se a placa semeada na estufa 37C.

Radiao no-ionizante:
Com a caneta de retroprojetor, fazer 2 divises iguais na parte de inferior da placa.
Com auxlio da ala de platina ou cotonete de algodo, semear a cultura bacteriana
de forma estufa 37C.






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Prtica 10: Controle da Populao Bacteriana por Mtodos Qumicos

Procedimento
O experimento que ser realizado tem por objetivo verificar a ao de anti-spticos
sobre a microbiota das mos, para tanto devem ser seguidas as seguintes etapas:
Com a caneta de retroprojetor, fazer 4 divises iguais na parte de inferior da placa.
Identificou-se cada quadrante com os respectivos nmeros 1, 2, 3 e 4.
No quadrante identificado como 1 encostou-se o dedo (sem lavar) no gar por 1
minuto.
A seguir lavou-se as mos com um anti-sptico (lcool 90), sec-las levemente e
encostar o mesmo dedo no quadrante do gar identificado como 2 por 1 minuto.
O aluno ento deve lavar as mos com um outro anti-sptico (lcool 70), sec-las e
encostar o mesmo dedo no quadrante do gar identificado como 3 por 1 minuto.
O quadrante constando o nmero 4 deixa-se para controle.
A placa deve ser levada para incubao.





















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RESULTADOS E DISCUSSES

Prtica 08: Mtodos para testar a Sensibilidade das Bactrias aos Antibiticos

Com o auxlio de uma rgua foi medido o dimetro dos halos inibitrios de cada
disco, com posterior comparao, para determinar se a bactria em anlise sensvel ou
no ao antibitico testado.















Figura 01: Discos de antibitico postos nas extremidades da placa.











Figura 02: Medindo os halos inibitrios de cada disco.

A bactria utilizada para o experimento foi a E. Coli. Ao fazer sua medida, o
antibitico Eritromicina teve como diametro < 8, logo resistente Bactracina. Por sua vez, o
antibiotico Polimixina tambm obvete resultados similares ao antibitico anterior e portanto
resistente Bactracina.

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Prtica 09: Controle da Populao Bacteriana por Mtodos Fsicos

Antes:
Figura 03: Preparao da placa. Figura 04: Placa sob raios UV

Fez-se tcnica de esgotamento em toda placa. Foi colocada no fluxo e tampou-se a
metade da placa e logo aps ligaou-se a UV por 15 min. (Figura 04)
Na prtica feita por calor mido, na regio 1, a bactria E. Coli foi aquecida em 3 minutos,
na regio 2 foi aquecida por 9 minutos, na regio 3 foi aquecida por 15 minutos e por ltimo,
na regio 4 a bactria foi aquecida por 21 min. Logo aps deixou-se por 96 horas incubado
na estufa a 37C. (Figura 03 e 05)

Depois:











Figura 05: A bactria cresceu em toda a placa Figura 06: Houve crescimento bacteriano em toda a placa



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Prtica 10: Controle da Populao Bacteriana por Mtodos Qumicos












Figura 07: Resultado da prtica.



1- Controle
2- Mos sujas
3- lcool 90%
4- lcool 70%















1
2
3 4
lcool 90%
lcool 70%
x
x
Placa
Controle
Mo suja
Crescimento Bacteriano
- + ++ +++ ++++
x
x

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QUESTES

Prtica 08: Mtodos para testar a Sensibilidade das Bactrias aos Antibiticos
(antibiograma).
1. O que deve ser observado na leitura de um antibiograma? Deve ser observado o
dimetro do halo, incluindo o dimetro do disco (a medida do seu raio).

2. Explique o resultado do seu antibiograma. Ao fazer sua medida, o antibitico
Eritromicina teve como diametro < 8, logo resistente Bactracina. Por sua vez, o
antibiotico Polimixina tambm obvete resultados similares ao antibitico anterior e
portanto resistente Bactracina.

3. Qual o princpio do teste de sensibilidade realizado nesta aula? Serve para
medir a sensibilidade de determinada bactria e determinar o melhor antibitico a ser
utilizado para cada isolado bacteriano.

4. Houve diferenas quando o mesmo antibitico era utilizado contra diferentes
bactrias? Justifique sua resposta. Os antibiticos normalmente atuam sobre a sntese
proteica bacteriana impedindo a sua reproduo ou causando a sua morte. So divididos
em:
Antibiticos bactericidas: so aqueles que matam as bactrias
Antibiticos bacteriostticos: so aqueles que impedem a reproduo bacteriana
ou cessam o seu metabolismo parcialmente sem matar o micro-organismo.
Ambos atuam sobre a sntese proteica. Os bactericidas cessam totalmente a sntese
proteica. A associao dos dois tipos de antibiticos resulta na sua perda de atividade.

Prtica 09: Controle da Populao Bacteriana por Mtodos Fsicos

1. O que pode ser observado com a utilizao do calor mido? Interprete os
resultados. No obteve resultados satisfatrios.

2. Interprete o resultado observado na placa que foi colocada sob raios UV
Crescimento bacteriano obtido com sucesso, porm no houve diferenciao entre a
irradiao dos raios UV e o lado que no teve irradiao dos raios UV. A bactria se
espalhou por completo.


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Prtica 10: Controle da Populao Bacteriana por Mtodos Qumicos

1. Por que o lcool 70% mais eficaz que o lcool a 100%? Dentre os processos de
desinfeco, o lcool um dos elementos mais usados, pela sua eficincia e pelo
seu baixo custo. O lcool a 70 GL (70% lcool e 30% gua) o mais eficiente nesse
processo porque os micro-organismos patognicos (que causam doenas) captam a
gua existente no lcool, s que junto captam tambm o lcool que letal para elas.
Quanto maior for a concentrao do lcool e consequentemente menor for a
concentrao de gua, menor ser a sua capacidade de desinfeco. O lcool 70
GL tem ainda a vantagem de ter um baixo potencial alrgico, no ser txico e no
deixar resduos.

























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CONCLUSES

O antibiograma foi um mtodo satisfatrio ao determinar a sensibilidade das
bactrias utilizadas e os resultados foram os esperados de acordo com os antibiticos
usados. A ampicilina age contra cocos gram-positivos e alguns bacilos gram-negativos por
isso houve halo de inibio. Como este antibitico inibe a ao de enzimas na formao da
camada de peptdeoglicano, sua inibio mais acentuada em bactrias gram-positivas,
pois possuem maiores concentraes desta molcula na parede celular.
As aes dos agentes de controle microbiano alteram a permeabilidade da
membrana plasmtica das clulas e causam danos s protenas e aos cidos nucleicos.
Existem alguns fatores que influenciam de certa forma na efetividade dos tratamentos
antimicrobianos como por exemplo o nmero de microrganismos, influncias ambientais,
tempo de exposio e as suas caractersticas microbianas, obtivemos resultados
satisfatrios na execuo das prticas.




























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REFERNCIAS


Setor Tcnico da Laborclin, Manual para Antibiograma, Disponvel em:
<http://www.interlabdist.com.br/dados/noticias/pdf_190.pdf> Acesso em: 17/05/2014

TORTORA, Gerard, FUNKE, Berdell, CASE, Christine. Microbiologia, editora Artmed,
decima edio, pagina 185.

STAINKI, Daniel, CENTRO DE CINCIAS DA SADE CCS, Departamento de
Microbiologia e Parasitologia. Pgina 3 a 7.