Microbiologa General AGM

Cuantificacin Microbiana
Adriana Meja 2012-2
MEDICIN DEL CRECIMIENTO
MICROBIANO
Manejo de operaciones con exponentes y diluciones
Conceptos como: soluto, disolucin, dilucin,
solucin, inoculacin, crecimiento.
Caractersticas nutrimentales de los microorganismos.
Medios de cultivo: Clasificacin y uso
Condiciones de desarrollo.
Antecedentes
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Muestras
Puras o mixtas (benficos nocivos).
SIN microorganismos. Ej. productos estriles
Pocos microorganismos. Ej. Agua embotellada
Muchos microorganismos. Ej. Yogurt
Muchos microorganismos. Ej. Agua contaminada
Cuantificacin de microorganismos
Cuantificar : Conocer el nmero de
microorganismos en una muestra
Curva de crecimiento
A
B
C
D
E
Tiempo
L
o
g
d
e
l

n

m
e
r
o

d
e

m
i
c
r
o
o
r
g
a
n
i
s
m
o
s
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Medidas de crecimiento microbiano
Recuento Directo
(Clulas totales)
1. Microscpico
2. Turbidimetra
3. Contadores Electrnicos
4. Biomasa
Recuento Indirecto
(Clulas viables)
1. Recuento en placa
Miles-Misra
Vertido en placa
Extensin superficial
2. Nmero ms probable(NMP)
3. Filtracin
Mtodos para el conteo de
microorganismos viables
Estos mtodos se basan en poner
en evidencia la presencia de los
microorganismos vivos.
Requieren al menos 24 horas
para el cultivo y la interpretacin
de resultados.
Se emplean medios de cultivo
generales, enriquecidos selectivos
y diferenciales dependiendo de
los microorganismos a cuantificar.
Cuenta en medios slidos en caja Petri
Se determina el nmero de microorganismos en una muestra en
relacin a las colonias que forman, las UFC (Unidades Formadoras
de Colonias). Se emplean soluciones diluidas o diluciones de una
muestra concentrada para que cada colonia formada provenga
de un solo microorganismo aunque algunas agrupaciones no
pueden ser separadas por las diluciones. Se utilizan principalmente
para la cuantificacin de bacterias, levaduras y hongos
filamentosos.
Se reporta como: UFC ****/unidad de volumen o peso
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Tcnica de dilucin y vertido en
placa: conteo de colonias
Diluciones y cuenta en placa
Diluciones y cuenta en placa
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Cuenta de colonias
Criterio: 25 a 200 UFC por placa
Comentarios
acerca del mtodo
No usar para
muestras con pocos
microorganismos.
Las diluciones mal
hechas, el medio
de cultivo muy
caliente, la mala
homogenizacin,
error al contar y en
los clculos, pueden
ser
PUNTOS CRTICOS
Recordar:
LA TCNICA DE SIEMBRA
POR AGOTAMIENTO
NO SIRVE
PARA CUANTIFICAR
MICROORGANISMOS.
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Variaciones
del recuento
en placa
Tcnica
de vertido
Tcnica de
extensin
Vaciado en placa y extendido
en placa
VARIACIONES DEL RECUENTO EN PLACA
(Extensin superficial)
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Contador automtico de
colonias de alta resolucin
Contador de colonias automtico
Se pueden contar todo tipo de colonias en cualquier
tipo de medio, no importa qu tipo de colonias se
cuenten, el instrumento est equipado con una
cmara de alta resolucin que detecta colonias de
1/15 mm aproximadamente.
El medio no es un problema, con un sistema de
iluminacin patentado los medios con agar
transparentes/opacos no tienen dificultad.
Recuento de colonias, realizar medidas de zonas de
inhibicin de antibiticos o conectar al Plate Handler
(muestreador de placas Petri automtico).
Miles y Misra
Involucra la preparacin de diluciones seriadas de
una suspensin bacteriana. Las placas son divididas
en sectores separados. Se inocula cada sector una
gota empleando una Pipeta Pasteur calibrada o bien
micropipetas inoculando 0.02mL.
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Miles y Misra
Involucra la preparacin
de diluciones seriadas
de una suspensin
bacteriana. Las placas
son divididas en sectores
separados. Se inocula
cada sector una gota
empleando una Pipeta
Pasteur calibrada o bien
micropipetas
inoculando 0.02mL.
Miles y Misra
Las placas se incuban de 18 a 24 horas a la
temperatura adecuada (37C). Se toman en cuenta
los sectores donde hay menos de 20 UFC. El nmero
de bacterias viables se obtiene calculando la media
de cada dilucin en las repeticiones realizadas.
Mtodo de Miles y Misra
No se emplea para
gran cantidad de
microorganimos en
muestras.
Ventaja
Duplicado o
triplicado en la
misma caja.
Muestras lquidas y
slidas.
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Asa calibrada
La utilizacin de agujas o
asas calibradas permite
tomar volmenes pequeos,
que son inoculados en la
superficie del agar mediante
la tcnica de siembra
masiva. Las colonias son
contadas y se multiplican
por el factor de dilucin del
asa empleada. El uso ms
frecuente de est mtodo
es en el urocultivo. Se
determinan las UFC/g o mL
de muestra.
Filtracin
La membrana de
celulosa retiene a los
microorganismos en su
malla con poros de 0.25-
0.45mm. Esta membrana
se transfiere a un medio
de cultivo para el
desarrollo de colonias.
Cuantificacin mediante
Filtracin a travs de un filtro membrana
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Filtracin
USOS
Sirve para
muestras:
lquidas sin slidos
Con baja
cantidad de
microorganismos
12 UFC/100 ml
Mtodos para el conteo de
microorganismos totales
Estos mtodos se basan en poner en evidencia la presencia
de los microorganismos vivos y muertos los cuales no se
pueden distinguir.
Son rpidos pero se requiere contar en algunos casos con
curvas de calibracin.
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Nefelometra (Turbidimetra)
Longitud de onda (l)
Bacterias 540nm
Protozoarios 580nm
Levaduras 600nm
La turbidez producida por el
crecimiento microbiano de
microorganismos unicelulares puede ser
medida de acuerdo a la capacidad de
absorber la luz. La muestras a
determinar son generalmente
translcidas cuando no presentan
crecimiento microbiano.
Turbidez
La turbidez se determina por la densidad ptica (DO) que puede
ser expresada como Absorbancia, % de Transmitancia o
Unidades Klett (UK).
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Turbidimetric
Turbidimetric measurements as indicators of bacterial growth.
The greater the turbidity the larger the population density.
Escala de Mc Farland
Tubo Vol (mL)
H
2
SO
4
1%
Vol (mL)
BaCl
2
1%
# de celulas
/mL
0 10 0 0
1 9.9 0.1 3x10
8
2 9.8 0.2 6x10
8
3 9.7 0.3 9x10
8
4 9.6 0.4 12x10
8
5 9.5 0.5 15x10
8
6 9.4 0.6 18x10
8
7 9.3 0.7 21x10
8
8 9.2 0.8 24x10
8
9 9.1 0.9 27x10
8
10 9.0 1.0 30x10
8
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Recuento microscpico
Uso del equipo micromtrico
Cuenta de Breed
10mL
1cm
2 cm
Teir
A
B
Observar 10 campos, contar las bacterias de
cada uno de ellos y obtener el promedio X
rea de la muestra =
bxh y convertir a mm
2
Determinar el rea del
campo: A= pxr
2
(mm
2
)
C Factor= Am/Ac
D
Calcular el nmero de bacterias por mL
X x Factor x 100 = bacterias_____ /mL
100 es la dilucin inicial al tomar 0.01mL
1mL = 1000mL
1cm = 10 000mm
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Cuenta de Breed
Muestra a evaluar (directa o diluida)
Microscopio
Objetivo micromtrico
Asa calibrada o micropipeta
Portaobjetos
Colorantes de Gram u otros colorantes.
Cmaras de Petroff-Hausser y de
Neubauer
Limitaciones:
Es muy tedioso, no es prctico para un gran nmero
de muestras.
No es muy sensible, se necesitan al menos 106
bacterias/mL para que sean observadas al
microscopio.
No distinguen clulas vivas de muertas.
Nmero Ms Probable (NMP)
Tambin llamada tcnica de dilucin en tubo, proporciona
una estimacin estadstica de la densidad microbiana
presente con base a que la probabilidad de obtener tubos
con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el
volumen de muestra inoculado.
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Mtodo del NMP
Volumen de
muestra
Tres series de 5 tubos
Nmero de
tubos positivos
Tabla
de
NMP
Mtodo de NMP
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Anlisis Microbiolgico del Agua
10-19-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios.
Determinacin de bacterias coliformes. Tcnica del nmero ms probable.
NMP
Actividad metablica
(produccin de CO
2
)
1. Muestra de suelo
2. Recipiente con agua
3. Solucin de NaOH 0.5 N
4. Aguja #20 (Venocat calibre
17)
5. Jeringa desechable de 20mL
6. Tubo de plstico flexible de 1-
2 mm de dimetro
7. Plastilina
CO
2
+ 2NaOH Na
2
CO
3
+ H
2
O
Na
2
CO3 + BaCl
2
BaCO
3
+ 2NaCl
NaOH (residual) + HCl NaCl + H
2
O
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Para los fisilogos bacterianos, bioqumicos y
bilogos moleculares una medida del crecimiento
es el incremento de biomasa: la sntesis
macromolecular y un incremento en la capacidad
para la sntesis de los componentes celulares es
una medida del crecimiento
Determinacin de peso hmedo
Determinacin de peso seco
Determinacin de nitrgeno total
Determinacin qumica de un cido nucleico
Peso seco y determinacin de
protena
La protena se relaciona al
crecimiento, por lo que un
incremento en la cantidad
de protena en el paquete
celular indica que hay mayo
concentracin de clulas.
El peso seco (contenido de slidos) de las clulas bacterianas que
se encuentran en una suspensin se obtiene por el secado de un
volumen en un horno a 105C hasta peso constante.
Es til para grandes volmenes. La desventaja de este mtodo es
que componentes voltiles de la clula pueden perderse por el
secado y puede existir alguna degradacin. La muestra seca puede
recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente
tiene una humedad relativa alta.
Curva patrn para la determinacion
de protenas por el mtodo de Lowry
Curva de crecimiento
Viables vs Totales
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Diferencia entre curvas de peso seco y curvas
con nmero de microorganismos
Mtodos tradicionales
Desventajas
Personal capacitado
Preparacin de medios de cultivo
Material
Demasiados pasos
Posibilidad de que ocurra alguna
contaminacin.
Tiempos de anlisis muy prolongados (Listeria
monocytogenes >7 das).
Costos mayores
Baja sensibilidad
Mtodos rpidos
Ventajas
Fciles de manejar
Semiautomatizados o automatizados
Resultados en poco tiempo ( minutos a <24 horas)
Ahorran espacio
Poco material
Ms sensibles (1 clula)
Desventajas
Costo (Reactivos adicionales, Equipo, material, etc.)
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Mtodos rpidos
Bibliografa
http://www.univie.ac.at/chromogenic/
http://www.idexx.com/Water/Products/colilert/science.cfm