FACULTAT DE VETERINARIA

UNIVERSITAT AUTNOMA DE BARCELONA

PRCTIQUES DE PRODUCCI ANIMAL II




CURS 2005-06



PRODUCCI DE LLET











2. Protenas de la leche (v.2)







1
PRODUCCION DE LECHE: PRACTICA 2


ANLISIS Y COMPOSICIN QUMICA DE LA LECHE

1. - VALORACION DE LA PROTENA BRUTA (PB): MTODO DE KJELDAHL

1.1. Fundamento:

Transformacin de las distintas formas de Nitrgeno presente en la muestra a
forma amoniacal (NH
4
+
), mediante una digestin cida y en caliente en presencia de un
catalizador. El NH
4
+
es posteriormente neutralizado a NH
3,
mediante una base fuerte en
exceso, y destilado por la accin del vapor. El amoniaco liberado es recogido en forma
de NH
4
+
mediante burbujeo del destilado en una disolucin de cido brico que se
valora posteriormente con una solucin de cido clorhdrico diluida de concentracin
conocida.

1.2. Material y aparatos:

- Pipeta para muestras de leche de 5 y 10 ml.
- Bloque digestor con termostato.
- Campana de extraccin de gases y trompa de agua.
- Tubos de digestin de 250 ml.
- Destilador automtico o semi-automtico.
- Pipeta automtica o dosificador para cido de 15 ml
- Probeta de 100 ml

1.3. Reactivos:

- Acido Sulfrico concentrado al 96% (H
2
SO
4
).
- Catalizador en pastillas de Cu-Se para Kjeldahl.
- Hidrxido sdico (NaOH) al 35%.
- Acido brico (H
3
BO
3
) al 1%.
- Acido clorhdrico (HCl) de factor y normalidad (0.05 0.1 N) conocida.
- Indicador (verde de bromocresol y rojo de metilo).
- Agua destilada

1.4. Procedimiento completo de digestin, destilacin y valoracin:

a.- Digestin:
Pipetear 5 ml (leche) 25 ml (sueros de leche) e introducirlos en los tubos de
digestin.
Aadir 2 pastillas de catalizador.
Aadir 15 ml de H
2
SO
4
concentrado.
Para el ensayo en blanco, operar de la misma manera sin aadir muestra.
Colocar los tubos de digestin en el bloque digestor bajo campana de extraccin
de humos, conectar la trompa de vaco y el extractor. Ajustar la temperatura del
bloque digestor a 420
o
C (para sueros precalentar 45 min a 150C para evaporar
agua) y digerir durante 90 min. Pasado este tiempo, sacar los tubos del digestor
y dejarlos enfriar en una gradilla bajo la campana de extraccin de gases.
2
Aadir suavemente 70 ml de agua destilada a cada tubo antes de su destilacin.

b.- Destilacin - Valoracin:
Comprobar que el equipo est listo para realizar la destilacin y asegurarse de
que ha sido anotado el valor obtenido previamente.
Abrir la trampa frontal del destilador, introducir el tubo de inyeccin de vapor en
el tubo de digestin y ajustarlo a la boca de destilacin. Cerrar la trampa frontal
y comprobar que se realiza la descarga de la cantidad de NaOH en exceso
previamente fijada (75 ml).
Esperar hasta que se complete el volumen del vaso de valoracin, para asegurar
que se ha destilado todo el amonio contenido en la muestra, comprobando que se
produce el viraje de color verde a rojo-grisceo. El equipo debe detener
automticamente la destilacin cuando se haya completado el volumen fijado de
destilacin.
Anotar el volumen de HCl de la valoracin y proceder a continuacin a retirar la
muestra analizada (utilizar un guante de proteccin para calor), levantando la
trampa frontal del destilador. El equipo realizar la descarga automtica del vaso
de valoracin.
Vaciar suavemente el contenido del tubo de digestin en el contenedor de
residuos, a fin de proceder a su tratamiento y evitar la contaminacin de las
aguas residuales con el catalizador Cu-Se.

1.5. Clculos:

% N = 14.01 (V b) N f 100
m 1000


% PB = % N-Total 6.38
Donde:
14.01 = Peso atmico del Nitrgeno.
V = Volumen de HCl para la muestra en ml.
b = Volumen de HCl para el blanco en ml.
N = Normalidad del HCl.
f = factor de correccin de la normalidad del HCl.
6.38 = factor Kjeldahl (15.67% de N en la protena lctea).
m = volumen de muestra (ml)

2. - VALORACION DE LA PROTENA BRUTA: MTODO DE SIMPLIFICADO
DE DESTILACIN DIRECTA (DD)

2.1. Fundamento:

Es una variante del mtodo de Kjeldahl por la que se lleva a cabo la destilacin y
valoracin del Nitrgeno directamente de la muestra, sin realizar una digestin cida
previa. Este procedimiento supone un importante ahorro de tiempo, reactivos y una
disminucin de los residuos contaminantes.
El mtodo se basa en que la adicin de NaOH concentrado tiene un efecto
custico sobre la protena de la leche, que resulta as desnaturalizada y libera la mayor
parte de su Nitrgeno en forma de NH
3.
Este NH
3
puede ser recogido y valorado, tal
3
como se ha descrito previamente en el mtodo de Kjeldahl. La cantidad de NH
3
liberado
depende de la naturaleza de la protena, pero presenta una elevada correlacin con el
nitrgeno contenido en la muestra (R
2
> 0.9 en el caso de las protenas lcteas).
Para ello se realiza previamente una calibracin obteniendo una recta de
regresin entre el volumen de HCl utilizado en la valoracin por DD y el volumen de
HCl obtenido por el mtodo completo de Kjeldahl, tal como se muestra en la Figura.
0.00
10.00
20.00
30.00
40.00
50.00
60.00
70.00
2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00
V-Destilacin Directa, ml
V
-
K
j
e
l
d
a
h
l
,

m
l

La ecuacin de conversin vara segn el tamao de muestra y la N del HCl utilizado.

2.2. Material y aparatos:

- Pipeta para muestras de leche de 5 y 10 ml.
- Tubos de digestin de 250 ml.
- Destilador automtico o semi-automtico.

2.3. Reactivos:

- Hidrxido sdico (NaOH) al 35%.
- cido brico (H
3
BO
3
) al 1%.
- cido clorhdrico (HCl) de factor y normalidad (0.05 0.1 N) conocido.
- Indicador (verde de bromocresol y rojo de metilo).

2.4. Procedimiento simplificado de destilacin y valoracin:

a.- Destilacin - Valoracin:
Pipetear 5 ml (leche) 25 ml (sueros lcteos) e introducirlos en los tubos de
digestin.
Comprobar que el equipo automtico o semiautomtico de destilacin est listo
para realizar una destilacin directa (modo DD), lo que realizar una mayor
descarga de NaOH, y asegurarse de que ha sido anotado el volumen de la
valoracin obtenido previamente.
Abrir la trampa frontal del destilador, introducir el tubo de inyeccin de vapor en
el tubo de digestin y ajustarlo a la boca de destilacin. Cerrar la trampa frontal
y comprobar que se realiza la descarga de la cantidad de NaOH en exceso (110
ml) previamente fijada.
Esperar hasta que se complete el volumen del vaso de valoracin, para asegurar
4
que se ha destilado todo el amonio liberado en la muestra, comprobando que se
produce el viraje de color verde a rojo-grisceo. El equipo debe detener
automticamente la destilacin cuando se haya completado el volumen de
destilacin fijado.
Anotar el volumen de HCl de la valoracin y proceder a continuacin a retirar la
muestra analizada (utilizar un guante de proteccin para calor), levantando la
trampa frontal del destilador. El equipo realizar la descarga automtica del vaso
de valoracin.
Vaciar suavemente el contenido del tubo de digestin en el contenedor de
residuos, a fin de proceder a su tratamiento y evitar la contaminacin de las
aguas residuales con NaOH.

2.5. Clculos:

Un ejemplo de ecuacin de DD obtenida para el caso de muestras de leche de
distintas especies (R
2
= 0.99), que puede tambin utilizarse de forma aproximada para
otras especies, es la siguiente:

V (ml HCl Kjeldahl; N = 0.1) = 2.0 + 7.864 (V-b) (ml HCl mtodo DD)

Por lo que el clculo de protena resultar:

% N = 14.01 [2.0 + 7.864 (V-b)] N f 100
m 1000

% PB = % N-Total 6.38
Donde:
14.01 = Peso atmico del Nitrgeno.
V = Volumen de HCl de la DD (ml).
b = blanco de HCl en la DD (ml)
N = Normalidad del HCl.
f = factor de correccin de la normalidad del HCl.
m = volumen de muestra (ml)


3. FRACCIONAMIENTO DE LAS PROTEINAS LACTEAS: NITRGENO NO
PROTEICO (NNP) y PROTENA VERDADERA (PV)

3.1. Fundamento:

Segn el esquema de Rowland, la Protena Bruta de la leche se descompone en
las siguientes fracciones:

Protena Bruta (N-Total)
Protena Verdadera
(N-Proteico o coagulable)
Casenas
(N-Casenico)
Protenas Sricas
(N-Srico)
No Protena
(N-No Proteico)
5


El NNP es la fraccin nitrogenada de la leche que no est constituida por
protena verdadera (PV), siendo la urea uno de los principales componentes. Su
determinacin se basa en forzar la precipitacin de todas las protenas mediante cido
tricloroactico (TCA), quedando el NNP en la fase lquida. El NNP se separa por
filtracin y posteriormente se valora siguiendo el mtodo de Kjeldahl (completo o por
destilacin directa). El N-Proteico se calcula restando el NNP del N-Total, siendo
despus transformado a protena verdadera (PV).

N-Proteico = N-Total NNP

3.2. Material y aparatos

- Pipeta de 10 ml.
- Bola o mbolo de succin para pipeta.
- Probeta graduada de 50 ml (2).
- Tubos de digestin de 250 ml.
- Destilador automtico o semi-automtico.
- Matraz aforado de 100 ml o Erlenmeyer de 125 ml (2).
- Embudo de cristal para filtracin.
- Papel de filtro.

3.3. Reactivos:

- Solucin de cido tricloractico (TCA) al 20%.
- Agua destilada.

3.4. Procedimiento de separacin del NNP:

Medir 25 ml de leche mediante una probeta o pipeta e introducirlos en un matraz
aforado o en un Erlenmeyer de 125 ml.
Medir 25 ml de solucin de TCA al 20% mediante otra probeta distinta de 50 ml
y aadirlos al matraz con la leche.
Agitar suavemente durante un minuto para asegurar un buen reparto del TCA y
dejarlo reposar durante 15 min.
Preparar un filtro doblado en el embudo de cristal y colocar sobre un nuevo
Erlenmeyer de 125 ml.
Agitar de nuevo y filtrar, recogiendo el filtrado hasta aproximadamente 30 ml.
Pipetear 25 ml del filtrado, utilizando una bola o embolo de succin (no
succionar con la boca), o medir con probeta e introducirlo en un tubo de
digestin.
Analizar el contenido en Nitrgeno segn el mtodo Kjeldahl o la variante DD.
El blanco estar compuesto en este caso por 25 ml de agua destilada y 25 ml de
TCA.

3.5. Clculos:

El volumen de HCl obtenido en la valoracin corresponde a 20 ml de filtrado y
no de la muestra de leche original. Por ello se debe transformar la cantidad de muestra
6
destilada en su equivalente de muestra original, de acuerdo con la marcha analtica
seguida. As:

Volumen equivalente de muestra destilada (m
1
) = . ml de leche

% NNP = 1.401 (V b) N f
m
1


En el caso de utilizar el procedimiento de destilacin directa (DD) el volumen de
HCl deber corregirse tal como se indic previamente (V y b).


% N-Proteico = (% N-total) (% NNP)

% PV = % N-Proteico 6.38


4. FRACCIONAMIENTO DE LAS PROTEINAS LCTEAS: NITRGENO NO
CASENICO (NNC), PROTENA SRICA (PS) y CASENA (CN)

4.1. Fundamento:

Su determinacin se basa en precipitar la casena (CN) situndola al pH de su
punto isoelctrico (mnima solubilidad) mediante un tampn de cido actico-acetato
(pH = 4.6) y separarla por filtracin. El lquido filtrado contiene el Nitrgeno no
casenico (NNC), que incluye las protenas del suero y el NNP, y se valora por anlisis
mediante el mtodo de Kjeldahl completo o por destilacin directa (DD).
Ya que el NNC del filtrado incluye tambin el NNP, el N-Srico se calcula
restando el NNP del NNC, siendo despus transformado a protena srica. El N-
Casenico se calcula restando la suma el NNC del contenido en N-Total, y su valor
transformado en protena es el contenido en Casena.

N-Casenico = NTotal NNC
N-Srico = NNC NNP


4.2. Material y aparatos

- Pipetas de 1 y 10 ml.
- Bola o mbolo de succin para pipeta.
- Probeta graduada de 100 ml.
- Tubos de digestin de 250 ml.
- Destilador automtico o semi-automtico.
- Matraz aforado de 100 ml o Erlenmeyer de 125 ml (2).
- Embudo para filtracin.
- Papel de filtro.

4.3. Reactivos:

- cido actico (CH
3
-COOH) al 10%.
- Acetato sdico (CH
3
-COONa) 1 M.
7
- Agua destilada.

4.4. Procedimiento:

Pipetear 10 ml de leche y transferirlos a un matraz aforado de 100 ml o a un
Erlenmeyer de 125 ml.
Medir 80 ml de agua destilada templada (40 C) con una probeta y aadirlos a la
leche. Si hay que preparar varias muestras a la vez, mantener los matraces en un
bao de agua a 40 C.
Medir 1 ml de cido actico al 10%, utilizar una pipeta automtica, bola o
embolo de succin (el actico es irritante y se evapora a temperatura ambiente) y
aadirlo al matraz con la leche. Agitar suavemente.
Medir 1 ml de solucin de acetato sdico 1 M (tampn actico-acetato) y
aadirlo al matraz.
Dejar enfriar el contenido del matraz a 20 C y completar el volumen del matraz
con aproximadamente 8 ml de agua destilada, hasta 100 ml.
Preparar un filtro doblado en el embudo y colocar sobre un nuevo Erlenmeyer de
125 ml.
Cuando el precipitado de CN y materia grasa se haya depositado filtrar a travs
de papel, recogiendo el lquido filtrado en el Erlenmeyer hasta mas de 50 ml.
Medir 25 ml del filtrado y analizar su contenido en Nitrgeno no Casenico
(NNC) utilizando el mtodo Kjeldahl o DD.
En este caso se utilizar como blanco una mezcla formada por 50 ml de agua
destilada, 0.5 ml de solucin de cido actico y 0.5 ml de la solucin de sodio
acetato 1 M.

4.5. Clculos:

El volumen de HCl obtenido en la valoracin corresponde a 25 ml de filtrado y
no de la muestra de leche original. Por ello se debe transformar la cantidad de muestra
destilada en su equivalente de muestra original, de acuerdo con la marcha analtica
seguida. As:

Volumen equivalente de muestra destilada (m
2
) = . ml de leche

% NNC = 1.401 (V b) N f
m
2


En el caso de utilizar el procedimiento de destilacin directa (DD) el volumen de
HCl deber corregirse tal como se indic previamente (V y b).


% N-Srico = (% NNC) (% NNP)

% PS = % N-Srico 6.38

% N-Casenico = (% N-Total ) (% NNC)

% CN = % N-Casenico 6.38

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5.- COAGULACION DE LA LECHE Y RENDIMIENTO QUESERO

5.1. Fundamento:

La coagulacin de leche mediante el empleo de cuajo (animal, vegetal o
microbiano), produce la cuajada que se separa en dos fracciones: una slida (quesada)
utilizada para la fabricacin del queso, que contiene grasa y casena, y otra lquida
(suero) que contiene la lactosa, sales minerales y las protenas no coagulables. Este
suero se utiliza para la elaboracin del requesn mediante ebullicin, que corresponde a
las protenas termolbiles y los restos de casena floculados.
5.2. Material y aparatos:

- Bao Mara con termostato.
- Probeta de 50 ml
- Cuenta gotas o pipeta Pasteur
- Centrfuga de mesa
- Tubos de centrfuga de 100 ml y gradilla
- Esptula y gasa
- Granatario

5.3. Reactivos:

- Cuajo

5.4. Procedimiento:

Medir 80 ml de leche (P
1
) con la probeta y llenar los tubos de centrfuga.
Calentar los tubos llenos de leche al Bao Mara a 38C.
Aadir 0.05 ml el cuajo y remover suavemente.
Dejar reposar en el interior del bao a 38C para que se forme la cuajada (20
min).
Cortar la cuajada con una esptula en direcciones perpendiculares hasta
conseguir un grano del tamao del arroz.
Equilibrar los tubos de centrfuga en parejas utilizando agua destilada y
centrifugar a 4.000 rpm durante 10 min.
Decantar el sobrenadante (suero de la leche) y filtrar a travs de una gasa para
separar la quesada.
Colocar la quesada sobre un recipiente previamente tarado (P
0
).
Pesar el recipiente con la quesada (P
2
).

5.5. Clculos:

El rendimiento quesero en fresco se obtiene por la expresin:
Q (%) = P
2
P
0
100
P
1



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6. - VALORES DE REFERENCIA

Pueden variar mucho en funcin de diversos factores, tales como la raza, el tipo
de leche utilizada (fresca o pasteurizada), el estado de lactacin de los animales
(principio o final de lactacin) y el tipo de alimentacin. En general los valores varan
(en %) entre:

Especie P. Bruta P. Verdadera P. Srica Casena NNP
Vaca
2.5 - 3.5 3.1 - 3.4 0.6 - 0.7 2.5 - 2.7 0.1 - 0.3
Cabra
2.7 - 3.7 2.4 - 3.4 0.5 - 0.8 2.0 - 2.8 0.2 - 0.4
Oveja
4.0 - 7.0 5.2 - 6.2 0.9 - 1.1 4.3 - 5.1 0.2 - 0.4


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7. - CUESTIONARIO

7.1. Indicar los valores de HCl (ml) obtenidos en cada una de las destilaciones
realizadas y sus correspondientes blancos. Estimar el valor equivalente que se obtendra
con el mtodo Kjeldahl completo. Completar el cuadro indicando el volumen
equivalente de muestra de leche finalmente destilado.

V (de DD) b (de DD) V-b V m (ml)
N-Total

NNP

NNC



7.2. Calcular los contenidos en protena y el fraccionamiento del nitrgeno en las
muestras de leche analizadas:

% N % Protena Fraccionamiento (%)
Total
100
NNP
- - -
Suero

Casena



7.3. A partir de los valores obtenidos, indicar la especie mas probable productora de la
leche utilizada y si la relacin CN : PB es correcta o debe sealarse alguna anomala?.
Especie: vaca; oveja; cabra

CN: PB (%) =

Observaciones:

7.4. Indicar la naturaleza del precipitado y del sobrenadante obtenidos al finalizar la
centrifugacin de la fabricacin de queso, as como el rendimiento quesero calculado.

Precipitado:
Sobrenadante: .

P2 (g) P0 (g) =

P1 (g) = Q (%) =
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