MEDICINA MOLECULAR - ONCOLOGIA

PROFESSORA MARICELMA SIMIANO JUNG

maricelma.jung@unisul.br

BIOLOGIA MOLECULAR
No organismo normal o ciclo de proliferao celular
rigorosamente controlado para que as clulas constituam
comunidades organizadas.

As clulas cancergenas no se submetem a esse esquema de
cooperao, so clulas com o DNA danificado e que, por isso,
escapam dos mecanismos de controle do ciclo celular.

O cncer surge de uma nica clula que sofreu mutao,
multiplicou-se por mitoses e suas descendentes foram
acumulando outras mutaes at darem origem a uma clula
cancerosa, portanto a incidncia destes tumores se caracteriza pela
proliferao celular anormal.
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Os principais segmentos de DNA que participam do aparecimento de
tumores so os anti-oncogenes (genes supressores) e os oncogenes,
sendo que os primeiros codificam protenas que mantm as clulas G-
zero e, portanto, fora do ciclo celular. Como exemplo podemos citar o
gene RD, o p53, p16, BRCA1, BRCA2, APC e VHL.

Os oncogenes so derivados de genes normais denominados proto-
oncogene, que leva a clula a perder o controle sobre o ciclo mittico,
dividindo-se continuamente.

Dentre os oncogenes, uns dos mais estudados o oncogene ras, com
suas variantes H-ras, K-ras e N-ras.
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CNCER

A palavra Cncer empregada para descrever um complexo
e heterogneo grupo de estados patolgicos no qual as clulas
proliferam descontroladamente e invadem tecidos vizinhos.

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O cncer uma enfermidade de carter gentico, que se produz ao
serem eliminadas as restries que limitam a diviso celular em
clulas de tecidos j diferenciados, produzindo uma massa celular
diferenciada do resto, denominada tumor.
Nmero de casos de cncer em 2010
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Um tumor pode ser:

1 - No invasivo: constitudo por um conjunto de clulas que
permanecem encapsuladas no local de origem sem produzir maiores
danos aos tecidos adjacentes. Neste caso considera-se o tumor como
benigno.

2 - Invasivo: quando somamos ao crescimento e proliferao
descontrolados a propriedade de invaso e disperso a outros tecidos
com produo de metstase, neste caso o tumor ser catalogado como
maligno.

Metstase um tumor secundrio originado pela disseminao de
clulas cancerosas procedentes de um primeiro tumor (ou tumor
primrio).

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Outra forma de denominao do cncer neoplasia, que significa
literalmente novas proliferaes ou multiplicao progressiva de clulas,
e estas podem se iniciar a partir de clulas normais em qualquer tecido
sadio.


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CLASSIFICAO BIOLGICA E CLNICA

Tumor benigno:
1) no necessariamente avana para a malignidade,
2) se mantm parecido com o tecido de origem,
3) nem todos os tipos de tecidos podem estar implicados e
4) muitas vezes esto separados do tecido normal por uma espcie de
cpsula de tecido conjuntivo.

Citologicamente no se diferenciam muito de clulas normais e os
problemas clnicos surgem, em muitos casos, de maneira indireta por
presso da massa tumoral sobre nervos ou outros tecidos prximos
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CLASSIFICAO BIOLGICA E CLNICA

Tumor maligno ao contrrio do anterior apresenta numerosas
anormalidades citolgicas, tais como:
1) variaes na forma e tamanho,
2) aumento da densidade e tamanho do ncleo celular,
3) mitoses anormais,
4) no se encapsulam,
5) destroem a membrana basal invadindo vasos sangneos e ndulos
linfticos - Angiognese


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ANGIOGNESE

Em sua fase inicial, um tumor slido composto por clulas
neoplsicas que obtm seus nutrientes e fatores de crescimento
por difuso a partir dos tecidos adjacentes.

Focos tumorais maiores que 1 a 2 mm em dimetro necessitam de
um suprimento sanguneo garantido, para que continuem a
crescer.
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ANGIOGNESE

Para isso, as clulas tumorais passam a produzir fatores de
crescimento (p.ex., VEGF - Fator de Crescimento do Endotlio
Vascular e outros) que promovem a formao de novos vasos, num
processo denominado angiognese.


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Oncologia Molecular

A compreenso dos mecanismos gnicos importante na elucidao
do desenvolvimento de diversos tumores, assim como no
conhecimento de predisposio gentica em famlias acometidas por
casos de cncer.

O diagnstico molecular fornece ao mdico informaes de grande
valia tanto para o diagnstico quanto para o prognstico de diversos
tipos de doenas.

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A clula neoplsica apresenta uma srie de anomalias genticas, grande
parte delas somticas (adquiridas).

Evidentemente, existem casos em que a alterao gentica determinante
de natureza germinativa, mas estima-se que isso ocorra em apenas 5 a
10% dos tumores.

De maneira simplificada, pode-se dividir os genes associados ao cncer
em trs grupos:
(1) oncogenes, quando o aumento da funo est associada com
neoplasias;
(2) genes supressores de tumores, quando o que se encontra no cncer
a diminuio de funo ou deleo gnica; e
(3) genes de reparo do DNA, cuja ausncia ou reduo de funo se
associa com determinados tipos de cncer.

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gene supressor de tumor

Um gene supressor de tumor um gene que reduz a probabilidade de
uma clula num organismo multicelular se tornar um tumor.

Uma mutao ou deleo de tal gene ir aumentar a probabilidade de
formao de um tumor.

Na maior parte dos cnceres, h um gene supressor de tumor deletado
ou mutado, impedindo a produo de uma protena ou levando
produo de uma protena no funcional.

Os dois membros dessa classe que j foram melhor caracterizados so
os genes que codificam para as protenas pRb e p53.
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Protenas codificadas por genes supressores do crescimento celular

A protena Rb foi inicialmente encontrada como estando mutada em
retinoblastomas e depois foi caracterizada como sendo um importante
regulador da progresso do ciclo celular.

A protena p53 consiste no mais importante regulador do ciclo celular,
com funes que vo desde a parada do ciclo celular at induo da
morte celular, sendo estimado que pelo menos 50% dos tumores
humanos possuem o gene p53 mutado.

A ausncia de represso da diviso celular ou inibio da morte
celular por apoptose, leva a imortalidade celular.

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Genes supressores Tumoral


Eles agem de diversas formas:

Interao com a matriz extracelular - O anti-oncogene DCC produz
uma protena transmembranar que interage com componentes da
matriz extracelular, sendo responsvel pela sinalizao da inibio do
crescimento por contato entre as clulas, perdida nas neoplasias.
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Regulao da transduo O anti-oncogene NF-1 age
inativando a protena do proto- oncogene ras.

Esta protena um transdutor, que tem como funo levar ao
ncleo a informao de que a clula est sendo estimulada por
fatores de crescimento ligados aos receptores de membrana.

Em casos de inativao do NF-1 por mutao ou deleo, o
sinal transdutor no ser inibido, gerando estmulo contnuo
para a clula entrar em mitose.

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Receptores Catalticos

-Glicoprotenas transmembranas;
-Mais conhecidas so as cinases proteicas;
-Esses receptores tm a parte que adere ao sinal qumico
(hormnio, fator do crescimento,etc) exposta ma MP e a parte
citoplasmtica tem ao enzimtica.
-Quando a extremidade externa recebe o sinal qumico, a
parte citoplasmtica (cinase proteica) se torna ativa e transfere
o grupamento hidroxila da tirosina de certas protenas.
-Algumas cinases agem sobre as protenas denominadas RAS
(RAT SARCOMA).
-Estimula a diferenciao e multiplicao celular.

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Regulao da transcrio do DNA - Os anti-oncogenes Rb e
p53 so o prottipo deste grupo.

O gen Rb foi o primeiro anti-oncogene a ser descoberto,
durante estudos do retinoblastoma, neoplasia maligna da retina.

Ele atua impedindo a clula de sair dos estgios G0/G1 e entrar
na fase S do ciclo celular.

Quando a clula sofre estmulos mitognicos, a protena
codificada pelo gen Rb inativada, permitindo a progresso do
ciclo proliferativo.
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Os genes supressores de tumor (anti-oncogenes) codificam protenas que
inibem a diviso celular.

Por desempenharem esta funo e terem sido descobertos em estudo de
tumores receberam esta denominao.

O primeiro gene supressor de tumor descrito foi o Rb o qual est localizado
no cromossomo 13q14 e est associado ao desenvolvimento do
retinoblastoma, que afeta aproximadamente 1 em 20.000 crianas.


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O p53 o gene supressor de tumor mais comumente relacionado
aos cnceres humanos. Alteraes nestes genes so encontradas
em aproximadamente 70% dos cnceres de clon, em 30 a 50%
dos cnceres de mama e em 50% dos cnceres de pulmo.

Alm dos tumores epiteliais, mutao no p53 tem sido
encontrada em leucemias, linfomas, sarcomas e tumores
neurognicos.

O p53 o mais comumente alterado, sendo encontrado entre
outros, nos tumores de bexiga, clon, fgado, pulmo, crebro,
mama e algumas leucemias.

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Os agentes quimioterpicos e a radioterapia agem sobre as clulas em
mitose, causando graves erros em seu DNA e induzindo a apoptose.
Isto leva a duas concluses:

(1) essas formas de tratamento no vo ter efeito satisfatrio em
tumores com grandes quantidades de clulas com o p53 inativo por
no conseguirem induzir a apoptose

(2) em neoplasias sensveis vai haver seleo de clones com p53
deficiente, possivelmente levando recada do tumor com
caractersticas mais agressivas e menos responsiva ao tratamento.
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Os genes mutantes com um efeito recessivo, isto , nos genes supressores
tumorais, expressam por mutao ou deleo nos dois alelos induzindo a
formao de um tumor.

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Qualquer mudana na sequncia de DNA constitui um erro gentico
chamado mutao.

A consequncia de tal erro pode ser de grande extenso, mesmo a
troca de um nico nucleotdeo pode ter efeitos importantes na clula,
dependendo onde a mutao ocorreu.

Uma mutao em um gene, causada pela alterao na sua sequncia
de DNA, pode levar inativao de uma protena crucial.

Por outro lado, a mutao pode ser silenciosa e no afetar a funo da
protena.
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Oncogene a denominao dada aos genes relacionados com o
surgimento de tumores, sejam malignos ou benignos, bem como
genes que quando deixam de funcionar normalmente, transformam
uma clula normal numa clula cancerosa.

As verses de funo normal de oncogenes, os proto-oncogenes,
so genes responsveis pelo controle da diviso celular (mitose), da
diferenciao celular e da traduo proteica.

Aps sofrer uma mutao gnica somtica, por exemplo, uma
translocao, amplificao ou mutao pontual um proto-oncogene
torna-se eventualmente um oncogene.
BIOLOGIA MOLECULAR
Os mecanismos de ao dos oncogenes no esto totalmente
elucidados.
Alguns oncogenes produzem oncoprotenas, como a bcl-2,
IE84 (Citomegalovrus), SV40-T (vrus SV40), E6 (HPV), EBNA-
5 (EBV) e HBx (vrus da hepatite B), que se ligam fortemente e
inibem as protenas codificadas por gens supressores do
crescimento celular ou indutores da apoptose, como o p53 e
o Rb.
clula cancergena
BIOLOGIA MOLECULAR
Os genes mutantes com um efeito dominante, isto , os oncogenes,
expressam por mutao ou deleo de um alelo apenas suficiente para
induzir a formao de um tumor.



BIOLOGIA MOLECULAR
Os proto-oncogenes podem transformar-se em oncogenes atravs de 2
formas:

-mudanas na estrutura do gene, resultando na sntese de
oncoprotenas (produtos genticos anormais) tendo funo aberrante.


-mudanas na regulao da expresso do gene, resultando um
aumento ou produo inadequada de protenas promotoras de
crescimento estruturalmente normais.


BIOLOGIA MOLECULAR
Os oncogenes codificam protenas chamadas oncoprotenas que
participam na transduo de sinais durante vrias etapas do ciclo
celular.

Existem 4 categorias de oncogenes que esto associados
a diviso celular e desenvolvimento de cncer que so:
fator de crescimento,
receptor de fator de crescimento,
protenas envolvidas na transduo de sinais e
protenas reguladoras nucleares.

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Mutao em ponto - o oncogene ras o melhor exemplo de mutao em
ponto e est associado a um grande nmero de tumores humanos. Por
exemplo, 90% dos adenocarcinomas pancreticos, 50% dos cnceres de
clon, endomtrio e tireide e 30% dos adenocarcinomas pulmonares e
leucemias mielides apresentam este tipo de alterao.


Translocao cromossmica - o rearranjo do material gentico por
translocao cromossmica usualmente resulta em aumento da expresso
do proto-oncogene. O melhor exemplo de translocao provocando tumor
ocorre no linfoma de Burkitt e resulta no movimento do seguimento
contendo c-myc do cromossomo 8 para o cromossomo 14q na banda 32.
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Amplificao gnica - a ativao do proto-oncogene associada com
aumento da expresso de seus produtos pode resultar da reduplicao
do DNA, produzindo vrias cpias de proto-oncogene nas clulas
tumorais.

O caso mais interessante de amplificao envolve N-myc em
neuroblastoma e c-erb B2 em cncer de mama.

BIOLOGIA MOLECULAR
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MECANISMOS DE INVASO E METSTASE

A invaso e metstase so processos relacionados aos tumores
malignos e se desenvolvem em vrias etapas.

Estudos revelaram que embora milhes de clulas do tumor primrio
sejam lanadas diariamente na circulao, somente algumas
metstases so produzidas.

Isto explicado pelo fato de clulas de um mesmo tumor serem
heterogneas e apenas algumas terem potencial metasttico.
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As clulas normais expressam glicoprotenas transmembrnicas que
promovem adeso intercelular, desempenhando importante papel
na manuteno da integridade estrutural.

As caderinas so as de maior importncia. No tecido epitelial so
chamadas de E-caderina. Alteraes nestas protenas diminuem a
adeso entre as clulas e facilitam o desprendimento do tumor
primrio e invaso dos tecidos vizinhos.

Caderinas so glicoprotenas formadas pro 700 a 750 AA
dependentes de Ca e permitem a ligao entre clulas vizinha.
Ligam-se na parte intracelular aos filamentos de actina e ao
citoesqueleto.
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PRINCIPAIS PROTO-ONCOGENES
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Diagnstico molecular

1) F I S H (HIBRIDAO IN SITU FLUORESCENTE)

O QUE FISH

FISH a abreviao de Fluorescent in situ hybridization
(hibridao in situ fluorescente) que define uma tcnica pela qual se
realiza o acoplamento (hibridao) de duas fitas de DNA
complementares, em lminas para microscopia.

Esta tcnica permite identificar, ao microscpio, a presena,
ausncia, quantidade ou localizao de segmentos cromossmicos
especficos, atravs de sondas de DNA marcadas com
fluorocromos.

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A tcnica consiste na hibridizao de uma sonda marcada com corantes
fluorescentes ou radioativos, para identificar o seu segmento
complementar dentro de uma metfase cromossmica espalhada numa
lmina.

O DNA dos cromossomos metafsicos desnaturado na prpria lmina
(da a tcnica ser denominada de in situ), iniciando-se, a seguir a
hibridizao com a sonda marcada.

A sonda visualizada por fluorescncia, no caso da tcnica de FISH, ou
por um filme de raio X.

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SINAIS PRODUZIDOS PELA HIBRIDAO

Os sinais coloridos produzidos pela hibridao fluorescente so visveis por
meio de microscpio de fluorescncia com epi-iluminao e filtros
apropriados.

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APLICAES DO FISH NA PRTICA CLNICA

A tcnica de FISH pode ser utilizada para detectar, elucidar e
quantificar alteraes cromossmicas numricas e/ou estruturais, tais
como as encontradas em:

1)- NEOPLASIAS

O estudo das alteraes cromossmicas presentes nas neoplasias,
principalmente hematolgicas, tem grande importncia no auxlio do
diagnstico, no prognstico e na monitorizao da doena.

A tcnica de FISH tem a vantagem de poder ser aplicada em diversos
tipos de amostras e ser mais rpida porque no necessita de cultivo de
clulas.

BIOLOGIA MOLECULAR
Por exemplo: A LMC caracteriza-se pela presena da translocao t(9;22)
que d origem ao cromossomo Philadelphia.

A sua deteco realizada, geralmente, em preparaes de aspirado de
medula ssea. Nesses casos a tcnica de FISH indicada, aps a
realizao da citogentica tradicional, nos casos em que:

a) pacientes com diagnstico de LMC apresentarem um rearranjo mais
complexo que pode mascarar a presena do cromossomo Philadelphia;
b) no so observadas clulas em metfase;
c) h necessidade de quantificar a presena de clulas com e sem o
cromossomo Philadelphia, seja aps tratamento com Interferon ou aps
transplante.

BIOLOGIA MOLECULAR
A tcnica de FISH vem sendo aplicada tambm para avaliao de
amplificao gnica em alguns tipos de cncer. Assim, por exemplo,
diferentes graus de amplificao de N-myc em neuroblastoma e de HER-
2/neu em cncer de mama esto associados a prognsticos e condutas
clnicas diferentes.




2) ALTERAES CONSTITUCIONAIS (CONGNITAS)

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Diagnstico Molecular
2) PCR
Exemplo: Cncer de Mama
os principais genes associados com cncer de mama so BRCA1 e BRCA2.
Mulheres que possuem mutaes no gene BRCA1 tm 80% de chance de
desenvolver cncer de mama e 60% para cncer de ovrio. Foram
identificadas trs mutaes especficas mais relevantes para auxiliar o
prognstico para cncer de mama: as mutaes 185delAG e 5382insC, no
gene BRCA1 e a mutao 6174delT, no gene BRCA2. O gene BRCA1
localiza-se no cromossomo 17 (17q21) e composto por 24 xons e o
gene BRCA2 localiza-se no cromossomo 13 (13q12) e possui 27 xons.
Estes genes pertencem a uma classe conhecida como supressores de
tumor que, em clulas normais, ajudam a impedir o seu crescimento
descontrolado (BERNARDI, 2008).
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Diagnstico Molecular
3) Sequenciamento

O primeiro passo a obteno de fitas simples do DNA que se deseja
sequenciar.
Essas fitas podem ser separadas pelo aquecimento que quebra as pontes
de hidrognio entre as bases do DNA e que mantm as fitas unidas.

Com as fitas separadas, liga-se um oligonucleotdeo sinttico (primer)
uma regio pr-determinada de uma das fitas do vetor de clonagem (pela
complementariedade das bases nitrogenadas).

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A enzima DNA polimerase adiciona desoxinucleotdeos (dNTPs)
sequencialmente na extremidade 3 do iniciador (primer),
complementar ao DNA molde.

Na prtica, ao tubo de reao, alm do DNA a ser sequenciado,
adiciona-se a enzima DNA polimerase, o iniciador adequado e os
quatro desoxinucleotdeos (dNTPs):- ATP, TTP, CTP e GTP. A
mistura de reao tambm inclui uma pequena quantidade de
didesoxinucleotdeos (ddNTPs).
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Quando um anlogo didesoxinucleotdeo incorporado ao
polinucleotdeo crescente no lugar de um desoxinucleotdeo
normal (dNTP), o crescimento da cadeia terminada,
pois a adio do prximo nucleotdeo requer uma hidroxila
(OH) 3 livre, que no est presente nos didesoxinucleotdeos
que no possuem hidoxilas nas posies 2 e 3.

Os vrios fragmentos de DNA gerados contendo
em uma das extremidades um ddNTP colorido so separados de
acordo com seus tamanhos por eletroforese em gel.
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A fluorescncia identificada assim que o didesoxinucleotdeo passa por
um feixe de laser e esta informao enviada diretamente para um
computador que a converte em um grfico de picos.

Uma vez determinada a sequncia de nucleotdeos de um gene, ela
precisa ser analisada. Para isso ela comparada (alinhada) com
sequncias de genes j estudadas depositadas em bancos pblicos que
renem sequncias de DNA e de aminocidos e estruturas de
protenas. Os principais bancos so o GenBank, o EBI (European
Bioinformatics Institute), o DDBJ (DNA Data Bank of Japan) e o PDB (Protein
Data Bank).
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( verde - A, azul - C, amarelo - G e vermelho - T ).
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