Extraccin y anlisis de DNA Plasmdico| Sebastin Basavilbaso

Grupo 1 | Gustavo Schottlender

Joaqun Sucunza
IBMC INFORME DE LABORATORIO


INTRODUCCIN
Plsmidos: definicin y caractersticas.

Un plsmido tpico es una molcula de ADN bicatenario y circular en conformacin
superenrrollada cuyo tamao es 20 veces menor que un cromosoma. Los plsmidos no
son esenciales para la supervivencia de la bacteria pero pueden contener genes que le
otorguen caractersticas adicionales, permitindoles sobrevivir o crecer en condiciones
especficas. Por lo general se replican independientemente del cromosoma del
hospedador aunque usan la maquinaria de ste para hacerlo. Los plsmidos estn
presentes en las clulas en un nmero definido por clula lo cual se denomina nmero de
copias, existen plsmidos con bajo, mediano y alto nmero de copias. Una misma clula
puede contener distintos tipos de plsmidos, entre estos plsmidos puede darse
incompatibilidad (al compartir parte de la maquinaria replicativa puede que solo uno de
ellos se mantenga al pasar las generaciones).
Los plsmidos son importantes para la biologa molecular, ya que se utilizan como
vectores de clonado y expresin. En el primer caso se inserta una secuencia de DNA que
se quiera clonar en la secuencia de un plsmido con alto nmero de copias y al
reproducirse las bacterias con este inserto se logra amplificar la secuencia insertada. Para
ser utilizados como vectores de expresin, adems del inserto, se colocan promotores
para regular la expresin del inserto y estudiar la funcin de la protena codificada por
dicho inserto.
En nuestro trabajo prctico, se utiliz bacterias Escherichia coli conteniendo en un alto
nmero de copias del plsmido pBluescript II. Esto facilita la extraccin/minipreparacin
de una gran cantidad DNA plasmdico a partir de poca cantidad de bacterias.


Electroforesis

La electroforesis en gel de agarosa se basa en la migracin de partculas con carga neta al
que experimentan una fuerza de atraccin hacia el polo que posee carga opuesta al ser
sometidas a un campo elctrico. La agarosa en un polisacrido que forma un gel inerte y
se utiliza en esta tcnica para dar un soporte que ofrezca resistencia a la migracin de las
molculas cargadas, pudiendo ser regulada la resistencia de acuerdo a la concentracin de
agarosa. Adems el gel reduce la difusin de las molculas ya que forma un tamiz que
dificulta el movimiento de estas. Esta resistencia a la migracin es proporci onal al peso
molecular de la molcula y depende de la forma que sta tenga.
Teniendo en cuenta estos factores, y la fuerza elctrica con la cual son atradas, cada tipo
de molculas migrar a una velocidad constante determinada (la velocidad constante se
alcanzar una vez que se igualen la intensidad de la fuerza de rozamiento y de la fuerza
elctrica). Las molculas de mayor peso molecular migrarn menos en el gel mientras que
las de menor peso migrarn ms y as podremos separarlas, siguiendo en general una
relacin lineal entre el logaritmo del peso molecular y la distancia recorrida.
La solucin de agarosa debe contener un buffer y adems debe estar inundada con l. Las
funciones del buffer son mantener el pH constante y aportar los iones necesarios para la
conduccin de la electricidad.
DESARROLLO
Extraccin del plsmido

La extraccin se realiz utilizando el mtodo de lisis alcalina descripto inicialmente por
Birnboim y Doly que nos permito obtener un DNA los suficientemente limpio como para
su posterior anlisis por electroforesis.
El mtodo consiste en exponer primero a las bacterias a una solucin de resuspensin que
contenga Tris-HCl y EDTA. El Tris-HCl funciona como buffer. El EDTA forma complejos con
los iones Ca+2 o Mg+2 inhibiendo a las nucleasas (los cationes Ca+2 y Mg+2 son cofactores
de las nucleasas) y desestabilizando la membrana externa de las bacterias que presenta
grupos cargados negativamente.
Luego se agrega la solucin de lisis alcalina que contiene NaOH y SDS. El hidrxido de
sodio aumenta el pH de la solucin desnaturalizando protenas y DNA. El SDS solubiliza los
fosfolpidos de las membranas formando micelas y desnaturaliza a las protenas.
Finalmente se coloca la solucin de renaturalizacin que contiene K+AcO- pH 4.8. La
misma neutraliza el pH bsico provocado por el agregado del hidrxido de sodio, los iones
K+ evitan la repulsin entre las hebras de DNA permitiendo su renaturalizacin, aunque
solo se renaturaliza correctamente el DNA plasmdico por ser ms pequeo, no as el DNA
genmico ya que sus largas hebras sufren interacciones con protenas y restos de
membrana. Se hace precipitar el DNA Plasmdico mediante el agregado de isopropanol,
alcohol que disminuye la interaccin del DNA con el solvente haciendo que el DNA
precipite junto con otros componentes. Para quitar estos componentes que co-precipitan
con el DNA (previa centrifugacin) se lava el pellet con etanol y luego se lo seca. Se agrega
RNasa para degradar el RNA que contamina la muestra.

Electroforesis en gel de agarosa

Antes de la corrida electrofortica se le coloca a la muestra un buffer compuesto por
xilene-cianol, azul de bromofenol y glicerol. El buffer le otorga densidad a la muestra
impidiendo que difunda una vez colocada en el pocillo. Adems permite tener una idea
del avance de la corrida al otorgarle color a la muestra ya que el xilene-cianol y el azul de
bromofenol corren como ADN lineal de doble cadena de 5 y 0,5 kpb, respectivamente.
La muestra inundada por una solucin TAE 50X se coloca en los pocillos de la cuba
electrofortica, la cual contiene una solucin de agarosa, bromuro de etidio y TAE 1X. El
bromuro de etidio se intercala entre las bases del ADN aumentando su fluorescencia, y el
TAE funciona como buffer. Adems de los plsmidos se siembran simultneamente con
marcadores de peso molecular, plsmidos tratados con EcoR I (enzima de restriccin con
un sitio de corte), plsmidos tratados con Pvu II (enzima de restriccin con dos sitios de
corte).
Una vez colocadas todas las muestras se las hace correr a voltaje constante hasta que el
colorante BPB corra lo suficiente para una ptima resolucin de las bandas. Luego se
coloca el gel sobre un transiluminador ultravioleta y se toma una fotografa para su
posterior anlisis.

RESULTADOS
Realizada ya la electroforesis en gel, se obtuvieron las bandas que muestra la fotografa

Para poder interpretar los datos dados por la experiencia realizada, es necesario medir la
distancia recorrida por cada banda que apareci en la calle correspondiente al marcador
de peso molecular. Para realizar esto, se midi directamente de la pantalla, utilizando una
regla sobre la imagen en un tamao mayor al mostrado en la fotografa.
Distancia (Cm) | Pares Bases

Si se realiza un grfico de la distancia en funcin del logaritmo del peso molecular se
obtiene lo siguiente:

Podemos observar que la asemeja a una recta de pendiente negativa por lo que a mayor
distancia, el logaritmo de PM disminuye.


La ecuacin correspondiente al grfico para determinar el peso molecular de las muestras
es la siguiente:







0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
2.60 3.47 5.30 5.76 7.00 7.36 7.91
L
0
g

P
M

Distancia
En los plsmidos extrados por los grupos, podemos observar dos tipos de resultados:
Los grupos sin RNAsa: se obtuvieron dos bandas observables correspondientes a un peso
molecular de 2000pb y otra mucho mayor en tamao y menor en peso molecular,
correspondiente a las molculas de RNA que contaminaban la solucin.
Los grupos con RNAsa: nosotros (grupo 1), observamos que la banda correspondiente
al RNA no estaba presente debido a que ste haba sido degradado por la enzima.


En las calles sembradas por los docentes, podemos observar cuatro calles distintas:
Eco RI: Se puede observar una sola banda, ya que el plsmido fue tratado con una
enzima de restriccin que solo produce un corte en la cadena. Esto, produce que la
cadena de DNA obtenga una conformacin lineal. Es por tener esta forma que la
migracin del DNA es distinta y por lo tanto su peso molecular, comparando con el
marcador de peso molecular obtenemos que se trata de un fragmento de 3000pb.
Pvu II: Este DNA fue tratado con una enzima de restriccin especial que produce dos
cortes, dando as dos conformaciones lineales de PM estimadas en 450 pb y 2500pb.
Marcador de peso molecular (PM): Se observan una serie de bandas correspondientes a
distintos pesos moleculares utilizados como referencia.
Plsmido de docentes: En esta calle se puede observar una secuencia de bandas muy
similar a las de los grupos con RNAsa.
Observando estos datos y entendiendo, que las distintas bandas obtenidas en el
corrimiento de los plsmidos de los grupos corresponden a un mismo peso molecular, es
que observamos que la banda correspondiente a los supuestos 2000pb,en realidad es una
banda correspondiente a 3000pb, pero con una estructura tridimensional distinta(ccc),
que es mucho ms abundante en nuestra solucin que las dems




CONCLUSIONES
A partir de los resultados obtenidos, podemos decir que los objetivos de los dos trabajos
prcticos en conjunto fueron cumplidos, tanto la extraccin de DNA plasmdico de
Escherichia coli, como el corrimiento en gel de nuestra muestra.
Tambin podemos analizar los mtodos utilizados en las dos experiencias en lo que
concluimos que el primero, es decir, el que usamos para la extraccin de DNA plasmdico
de Escherichia coli, lisis alcalina, es poco eficiente si uno quiere una purificacin alta,
aunque con fines cualitativos es un mtodo eficaz, ya que nos sirve para las experiencias
de los siguientes TPs relacionados con ste (TP2 y TP3), adems de que es ms econmico
y ms rpido que otros.
En el utilizado para la electroforesis, podemos concluir que el mtodo no es preciso
cuantitativamente, ya que la cantidad de errores introducidos a la hora de realizar el
experimento, por ms que se siga al pie de la letra y se realice exitosamente todo, es muy
grande. Sin embargo como mtodo cualitativo, para la observacin de los diferentes
compuestos presentes en la solucin, separando por tamaos y formas, es muy til.

BIBLIOGRAFIA
Gua de TP de IBMC
Alberts et al. Biologa Molecular de la Clula, traduccin al espaol de la 4a.
edicin en ingls. - Editorial Omega, Barcelona (2004). En Bs. As. distribuye
Cspide.