Dissertação Ciclodextrina

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CINCIAS FSICAS E MATEMTICAS

CURSO DE PS-GRADUAO EM QUMICA

ESTUDOS DE FORMAO DE COMPLEXOS DE
INCLUSO EM CICLODEXTRINAS

ROSANE MARIA BUDAL

Florianpolis/SC
2003

ROSANE MARIA BUDAL

ESTUDOS DE FORMAO DE COMPLEXOS DE
INCLUSO EM CICLODEXTRINAS

Tese apresentada ao Curso de Ps-Graduao em
Qumica da Universidade Federal de Santa Catarina,
para obteno do grau de Doutor em Qumica
Orgnica.

Orientador: Prof. Dr. Rosendo A. Yunes (DQ- UFSC)
Co-orientadoras: Prof
a
Dr
a
Maria da Graa Nascimento (DQ- UFSC)
Prof
a
Dr
a
Aida Jover Ramos (DQF-USC/Espanha)

Florianpolis/SC
2003

ii
ROSANE MARIA BUDAL

ESTUDOS DE FORMAO DE COMPLEXOS DE INCLUSO EM
CICLODEXTRINAS

Esta tese foi julgada e aprovada para a obteno do ttulo de Doutor em Qumica no
Programa de Ps-Graduao em Qumica da Universidade Federal de Santa Catarina.
Florianpolis, 01 de dezembro de 2003.

____________________________________
Prof. Faruk J os Nome Aguilera
Coordenador do Curso de Ps-Graduao

BANCA EXAMINADORA

__________________________________
Rosendo Augusto Yunes
Orientador
__________________________________
Maria da Graa Nascimento
Co-orientadora
__________________________________
Ademir Farias Morel
__________________________________
Aura Echevarria Aznar
__________________________________
Marcus Csar Mandolesi S
__________________________________
Ricardo J os Nunes
__________________________________
Miguel Soriano Balparda Caro

iii

Em especial aos meus queridos pais
Jarcy (in memoriam) e Amlia, e minha
querida filha Flvia, pelo amor, apoio,
compreenso e incentivo.

iv

AGRADECIMENTOS

A Deus, por Sua bondade e poder infinitos, dando sabedoria, coragem e serenidade
para enfrentar os momentos difceis desta jornada.
Aos professores Dr. Rosendo A. Yunes (orientador) e Dra Maria da Graa Nascimento
(co-orientadora), pelas orientaes e valiosas sugestes prestadas durante todas as etapas
deste trabalho. Pelo incentivo, apoio e amizade oferecidos durante todos estes anos.
Ao Prof. Dr J os Vzquez Tato, Diretor do Grupo de Investigao do Departamento
de Qumica - Fsica da Universidade de Santiago de Compostela/Espanha, proporcionando a
realizao deste trabalho junto a este grupo de pesquisa, dando apoio, sugestes, orientaes e
amizade.
Prof
a
Dra Aida J over Ramos (co-orientadora), pela amizade, apoio, colaborao e
dedicao constantes durante todo o perodo e aps a realizao do trabalho na Universidade
de Santiago de Compostela.
Aos professores e colegas do Departamento de Qumica- Fsica/USC, Mercedes,
Wajih, Meijide e Pedro.
s companheiras cubanas Hayde e Minerva pela amizade e constantes palavras de
estmulo.
Aos professores pertencentes ao Departamento de Cincias Farmacuticas pelo
incentivo, apoio e amizade.
Aos professores e funcionrios do Curso de Ps-Graduao em Qumica da UFSC.
Aos companheiros de laboratrio em geral, pela amizade e incentivo.
Universidade Federal de Santa Catarina pelo apoio institucional.
CAPES pela oportunidade e apoio financeiro.
E a todos aqueles que direta ou indiretamente contriburam para a realizao deste
trabalho.

v

SUMRIO

LISTA DE FIGURAS_____________________________________________________ VII
LISTA DE TABELAS ____________________________________________________XIII
LISTA DE ESQUEMAS __________________________________________________ XV
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ____________________________________XVI
RESUMO______________________________________________________________ XVII
ABSTRACT __________________________________________________________ XVIII
1 - INTRODUO_________________________________________________________ 1
1.1 - CICLODEXTRINAS _____________________________________________________ 3
1.1.1 - Estrutura __________________________________________________________________ 3
1.1.2 - Complexos de incluso _______________________________________________________ 6
1.1.3 - Aplicaes das ciclodextrinas na rea farmacutica ________________________________ 8
1.1.4 - Mtodos de obteno de complexos de Incluso. __________________________________ 16
1.1.5 - Complexao de Esterides __________________________________________________ 17
1.1.6 - Caracterizao dos complexos de incluso_______________________________________ 22
1.1.7 - Equilbrio de formao do complexo de incluso e a constante de estabilidade __________ 24
1.2 - SUBSTNCIAS DE INTERESSE PARA ESTUDO DOS COMPLEXOS DE INCLUSO________ 25
1.2.1 - Furoato de diloxanida_______________________________________________________ 25
1.2.2 - Fusidato de sdio __________________________________________________________ 27
1.2.3 - Helvolato de potssio _______________________________________________________ 29
1.2.4 - CHAPS e CHAPSO_________________________________________________________ 31
2 - JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS _______________________________________ 33
3 - MTODOS E TCNICAS EXPERIMENTAIS _____________________________ 35
3.1 - DIAGRAMA OU ISOTERMA DE SOLUBILIDADE _______________________________ 35
3.2 - RESSONNCIA MAGNTICA NUCLEAR ____________________________________ 39
3.2.1 - RMN na determinao da estrutura do complexo__________________________________ 39
3.2.2 - Aplicaes da Ressonncia Magntica Nuclear no estudo de Processos de Incluso:
estequiometria e constantes de associao. ____________________________________________ 41
3.3 - MTODO CINTICO ___________________________________________________ 49

vi
4 - PARTE EXPERIMENTAL ______________________________________________ 54
4.1 - MTODOS DE AVALIAO DE FORMAO DO COMPLEXO FUROATO DE
DILOXANIDA:-CD __________________________________________________ 55
4.2 - AVALIAO DE FORMAO DOS COMPLEXOS HELVOLATO DE POTSSIO, FUSIDATO
DE SDIO, CHAPS E CHAPSO EM - E - CD POR RMN._____________________ 57
5 - RESULTADOS E DISCUSSO __________________________________________ 59
5.1 - ESTUDO DO COMPLEXO DE INCLUSO FUROATO DE DILOXANIDA: -CD. _________ 59
5.1.1 - Diagrama ou Isoterma de Solubilidade _________________________________________ 59
5.1.2 - Mtodo Cintico ___________________________________________________________ 61
5.1.3 - Fluorescncia _____________________________________________________________ 70
5.1.4 - Ressonncia Magntica Nuclear_______________________________________________ 71
5.2 - RESOLUO DOS ESPECTROS POR RMN DE 1H E 13C_________________________ 74
5.2.1 - Helvolato de potssio _______________________________________________________ 75
5.2.2 - Fusidato de sdio __________________________________________________________ 84
5.2.3 - CHAPS __________________________________________________________________ 94
5.2.4 - CHAPSO _________________________________________________________________ 98
5.2.5 - Espectros de RMN de - e -CD ______________________________________________ 103
5.3 - ESTUDO DOS COMPLEXOS DE INCLUSO POR RMN _________________________ 106
5.3.1 - Complexos Fusidato de Sdio e Helvolato de Potssio : -CD_______________________ 107
5.3.2 - Complexos Fusidato de Sdio e Helvolato de Potssio : -CD ______________________ 114
5.3.3 - Complexos CHAPS e CHAPSO: -CD _________________________________________ 120
5.3.4 - Complexos CHAPS e CHAPSO:-CD _________________________________________ 127
6 - CONCLUSES _______________________________________________________ 151
7 - PERSPECTIVAS DE TRABALHO ______________________________________ 155
REFERNCIA __________________________________________________________ 156
ANEXOS _______________________________________________________________ 176
ANEXO A - OUTROS ESTUDOS SOBRE AGREGAO DE SAIS BILIARES ____ 177
ANEXO B CLCULO POR INTEGRAO DE REAS PARA AJ USTE DOS
SINAIS EM RMN _________________________________________________ 182
PRODUO CIENTFICA (PERODO AGO/1997-2003)_________________________ 196

vii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1 - Ciclodextrinas naturais_____________________________________________ 4
Figura 1.2 - Representao esquemtica das ciclodextrinas. __________________________ 4
Figura 1.3 - Estrutura e dimenses das ciclodextrinas. ______________________________ 4
Figura 1.4 - Estrutura funcional da ciclodextrina_________________________________ 5
Figura 1.5 - Principais tipos de complexos de incluso______________________________ 7
Figura 1.6 - Estrutura dos complexos 1:1 NaC/-CD e 1:2 NaDC/-CD.______________ 19
Figura 1.7 - Estrutura anfiflica dos cidos biliares.________________________________ 21
Figura 1.8 - Estrutura do furoato de diloxanida___________________________________ 26
Figura 1.9 - Estrutura do fusidato de sdio ______________________________________ 27
Figura 1.10 - ons fusidato e colato: a (Fus) e b (NaC), frmulas estruturais; c (Fus) e d
(NaC), modelos espaciais com posio dos grupos polares na cor vermelha;
e (Fus) e f (NaC), interface ar-gua ou leo-gua. (Carey, 1971). __________ 28
Figura 1.11 - Estrutura do helvolato de potssio.__________________________________ 29
Figura 1.12 - Modelos espaciais da molcula de helvolato de potssio com todos os
grupos polares direcionados face _________________________________ 30
Figura 1.13 - Estrutura do CHAPS (R=H) e CHAPSO (R=OH). _____________________ 31
Figura 3.1 - Tipos de diagrama de solubilidade. __________________________________ 36
Figura 3.2 - Espectro ROE do complexo cido 6-(p-toluidin) naftalen-2-sulfnico
(TNS): -CD em D
2
O.____________________________________________ 40
Figura 3.3 - Representao esquemtica da formao dos complexos 1:1 e 2:1 para o
sistema -CD: TNS, deduzido a partir do experimento ROESY. ___________ 41

viii
Figura 3.4 - Sinais observados em RMN.________________________________________ 42
Figura 3.5 - Variao do deslocamento qumico de um determinado ncleo da
ciclodextrina em funo da frao complexada_________________________ 44
Figura 3.6 - Representao de J ob para um complexo 1:1 em funo da frao molar de
ciclodextrina ou de hspede. _______________________________________ 45
Figura 5.1 - Diagrama de solubilidade do furoato de diloxanida em -CD com valor de
K
c
=427,4 M
-1
; S
o
=1,35x10
-4
; r=0,9959. ______________________________ 60
Figura 5.2 - Logartmo da constante de velocidade de primeira ordem em funo do pH
para a hidrlise do furoato de diloxanida em gua, -CD e -CD sulfatada,
37
o
C. ________________________________________________________ 62
Figura 5.3 - Variao da constante de velocidade de primeira ordem em funo de
concentraes crescentes de -CD para a hidrlise do furoato de diloxanida
(6,66x10
- 5
M) em pH 10,75, =0,5 M (KCl), =260 nm e 37
o
C; k
o
=1,76
x 10
-3
s
-1
. ______________________________________________________ 63
concentraes crescentes de -CD sulfatada para a hidrlise do furoato de
diloxanida (6,66x10
-5
M) em pH 10,0, =0,5 M (KCl), =260 nm e 37
o
C;
k
o
=3,16 x 10
-4
s
-1
._______________________________________________ 65
Figura 5.5 - Espectros de UV para a reao de hidrlise do furoato de diloxanida por 7
dias, a pH 7,0 e 37
o
C.___________________________________________ 66
Figura 5.6 - Perfil de [-CD]/(k
o
- k
obs
) versus [-CD] para a hidrlise do furoato de
diloxanida (6,66x10
-5
M), pH=10,75, =0,5M (KCl), =260nm 37
o
C. ___ 68
Figura 5.7 - Espectros de Fluorescncia do furoato de diloxanida (3,0x10
-5
M e 0,2% de
etanol) e -CD (1,2x10
-2
M);
Ex
=338 nm. ___________________________ 70
Figura 5.8 - Espectro de
1
H do furoato de diloxanida e -CD (4mM) em metanol/gua,
300MHz. ______________________________________________________ 72
13
C do furoato de diloxanida e -CD (10mM) em
acetonitrila/gua, 75MHz. _________________________________________ 72

ix
Figura 5.10 - Espectros de RMN de
1
H, furoato de diloxanida (4mM) e -ciclodextrina
(4mM) em propores 10:0, 8:2, 6:4, 4:6 e 2:8 em sistema CD
3
OD/D
2
O
(50:50), 300MHz. _______________________________________________ 73
13
C de -CD/FD (10mM) em sistema CD
3
CN/D
2
O
(40:60), 75MHz. ________________________________________________ 74
Figura 5.12 - Procedimento relativo ao assinalamento completo dos espectros de RMN. __ 75
Figura 5.13 -Espectros monodimensionais do helvolato de potssio 10mM: (a)
13
C; (b)
DEPT 135; (c) DEPT 45; (d) DEPT 90; solues em D
2
O, 125 MHz._______ 76
Figura 5.14 -Espectro de
1
H-RMN do helvolato de potssio 10mM em D
2
O, 500MHz. ___ 77
1
H-
1
H COSY do helvolato de potssio 10mM em D
2
O. ________ 79
Figura 5.16 -Espectro parcial de
1
H-
1
2
O. __ 80
Figura 5.17 -Espectro de correlao
1
H-
13
C do Helvolato de potssio 10mM em D
2
O. ____ 81
Figura 5.18 -Espectro ROESY do complexo helvolato de potssio- -CD 10mM, em
D
2
O, 500MHz.__________________________________________________ 82
Figura 5.19 - Espectros monodimensionais do fusidato de sdio 10mM: (a)
13
C; (b)
DEPT 135; (c) DEPT 90; (d) DEPT 45, em D
2
O, 125 MHz. ______________ 85
1
H-RMN do fusidato de sdio 10mM, em D
2
O, 500 MHz. _____ 86
1
H-
1
H COSY do fusidato de sdio 10mM, em D
2
O. __________ 87
Figura 5.22 - Espectro bidimensional COSY
1
H-
1
H do fusidato de sdio 10mM, em
D
2
O. __________________________________________________________ 88
Figura 5.23 - Espectro de correlao
13
C-
1
H do fusidato de sdio 10mM, em D
2
O._______ 89
Figura 5.24 - Espectro J -resolvida do fusidato de sdio 10mM, em D
2
O._______________ 91
Figura 5.25 - Espectro Noesy
1
H-
1
2
O. _____________ 92
Figura 5.26 - Espectros monodimensionais do CHAPS 10mM: (a) DEPT 135; (b) DEPT
90; (c) DEPT 45; (d)
13
C, em D
2
O, 125 MHz.__________________________ 94
1
H do CHAPS 10mM em D
2
O, 500 MHz. __________________ 95
Figura 5.28 - Espectro bidimensional de
1
H-
1
H COSY do CHAPS 10mM, em D
2
O.______ 97

x
Figura 5.29 - Espectro parcial bidimensional
1
H-
1
2
O. __ 97
1
H-
13
C do CHAPS 10 mM, em D
2
O.______________ 98
Figura 5.31 - Espectro monodimensional de
1
H do CHAPSO 10mM, em D
2
O, 500
MHz. _________________________________________________________ 99
Figura 5.32 - Espectro bidimensional
1
H-
1
H COSY do CHAPSO 10mM, em D
2
O.______ 100
13
C-
1
2
O.____________ 102
1
H-RMN da -CD em soluo (10mM), D
2
O, 300 MHz, com
supresso do solvente. ___________________________________________ 105
13
C da -CD em D
2
O, 75 MHz. _________________________ 105
Figura 5.36 - Curva de J ob obtida com os deslocamentos qumicos dos carbonos da -
CD para o complexo (a) helvolato:-CD e (b) fusidato:-CD;
[helvolato/fusidato]
o
=[-CD]
o
=10mM); 75 MHz._____________________ 108
Figura 5.37 -
obs
para diferentes tomos de carbono da -CD complexada com
helvolato de potssio. [helvolato]
o
=[-CD]
o
=10mM. __________________ 109
Figura 5.38 -
obs
fusidato sdico . [fusidato]
o
=[-CD]
o
=10mM. _______________________ 110
Figura 5.39 - Espectro ROESY referente ao complexo de incluso helvolato: -CD em
D
2
O 10mM, 500 MHz. __________________________________________ 113
Figura 5.40 - Modelos espaciais tericos do complexo (helvolato)
1
: (-CD)
1
, com vistas
laterais (a) e (b) e frontais (c) e (d)._________________________________ 114
Figura 5.41 - Curva de J ob para os cinco carbonos de uma unidade de glicose de -CD
para o complexo (a) helvolato: -CD e (b) fusidato: -CD.
[helvolato/fusidato]
o
=[-CD]
o
=10mM, 75 MHz. _____________________ 115
Figura 5.42 -
obs
helvolato de potssio; (a) ajuste para complexo 1:1, (b) ajuste para
complexo 1:2__________________________________________________ 117

xi
Figura 5.43 -
obs
fusidato de sdio; (a) ajuste para complexo 1:1, (b) ajuste para complexo 1:
2. ___________________________________________________________ 117
Figura 5.44 - Estruturas esquemticas para os complexos formados entre (a) fusidato de
sdio e -CD; (b) helvolato de potssio e -CD; (c) helvolato de potssio e
-CD; e (d) fusidato de sdio e -CD._______________________________ 120
Figura 5.45 - Curva de J ob obtida com os deslocamentos qumicos dos carbonos da -
CD para o complexo (a) CHAPS:-CD e (b) CHAPSO:-CD.
([CHAPS]=[CHAPSO]=[-CD]=10mM; 75 MHz._____________________ 121
Figura 5.46 -
obs
para diferentes tomos de carbono da -CD complexada com (a)
CHAPS e (b) CHAPSO. _________________________________________ 122
Figura 5.47 - Espectro ROESY do complexo CHAPS:-CD, em D
2
O, 500MHz.________ 124
Figura 5.48 - Espectro ROESY do complexo CHAPSO:-CD, em D
2
O, 500 MHz.______ 124
Figura 5.49 - Representao espacial do complexo CHAPS:-CD.___________________ 126
Figura 5.50 - Representao espacial do complexo CHAPSO:-CD. _________________ 127
Figura 5.51 - Espectros de
13
C com diferentes concentraes de (a) CHAPS ou (b)
CHAPSO e -CD, na seguinte ordem: 10 mM -CD e 0 mM CHAPS, 7
mM -CD e 3 mM CHAPS, 5 mM -CD e 5 mM CHAPS, 1 mM -CD e 9
mM CHAPS; solues em D
2
O, pH natural (5,0-6,0), 75MHz. ___________ 130
1
H com diferentes concentraes de (a) CHAPS e (b)
CHAPSO com concentraes nos espectros em ordem decrescente de
10mM, 5 mM e 2 mM; solues em D
2
O, pH natural (5,0-6,0), 300MHz. __ 131
1
H sobrepostos de CHAPS 10 mM (vermelho) em soluo,
com a -CD 10 mM (preto) (solues em D
2
O, pH natural; 500 MHz). ____ 132
1
H com diferentes concentraes de CHAPS e -CD: azul
escuro: 1 mM -CD e 9 mM CHAPS; azul claro: 3 mM -CD e 7 mM
CHAPS, verde: 5 mM -CD e 5 mM CHAPS; vermelho: 8 mM -CD e 2
mM CHAPS. Solues em D
2
O, pH 5-6 (natural da soluo), 500 MHz. ___ 133

xii
1
H com diferentes concentraes de CHAPS 1mM e -CD
9mM (vermelho), CHAPS 5 mM e -CD 5 mM (verde), CHAPS 7 mM e
-CD 3 mM (azul claro) e CHAPS 10 mM (azul escuro). Solues em
D
2
O, pH natural (5,0-6,0), 500 MHz. Os smbolos L indicam
hidrognios da substncia livre e C complexada. ____________________ 134
1
H parciais sobrepostos de CHAPS 2 mM e -CD 8 mM
(vermelho), CHAPS 5 mM e -CD 5 mM (azul escuro), CHAPS 7 mM e
-CD 3 mM (azul claro) e CHAPS 8mM e -CD 2 mM (verde); solues
em D
2
O, pH natural (5,0-6,0), 500 MHz. ____________________________ 134
Figura 5.57 - Curvas de J ob das reas dos hidrognios de CHAPS (a) 18, 25 e 12
complexados, (b) 19 complexado e (c) 5 complexado da -CD; solues
em D
2
O, pH natural, 500 MHz. ____________________________________ 137
Figura 5.58 - Curvas de J ob das reas dos hidrognios de CHAPSO (a) 18 e 25
complexados, (b) 19 complexado e (c) 5 complexado da -CD; solues
em D
2
O, pH natural, 500 MHz. ____________________________________ 137
Figura 5.59 - ROESY de uma soluo 10 mM de -CD e 10mM de CHAPS (solues
em D
2
O, pH natural ) 500 MHz. ___________________________________ 138
Figura 5.60 - ROESY de uma soluo 10 mM de -CD e 10mM de CHAPSO (solues
em D
2
O, pH natural); 500MHz.____________________________________ 139
Figura 5.61 - Curvas experimentais e tericas da rea dos hidrognios do CHAPS (a) e
CHAPSO (c) regio da cadeia lateral, CHAPS (b) e CHAPSO (d) regio
do anel A; solues em D
2
O, pH natural. ____________________________ 143
Figura 5.62 - Curvas experimentais e tericas da rea do hidrognio 5 da -CD
complexada com (a) CHAPS e (b) CHAPSO; solues em D
2
O, pH natural
(5,0-6,0). _____________________________________________________ 145
Figura 5.63 - Formao de um complexo 1:2 de um hspede ditpico a partir de dois
possveis complexos 1:1. _________________________________________ 146
Figura 5.64 - Representao espacial do complexo CHAPS:-CD. __________________ 149
Figura 5.65 - Representao espacial do complexo CHAPSO: -CD. ________________ 150

xiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1.1 - Exemplos de alguns frmacos em forma de complexos de incluso. _________ 9
Tabela 3.1 - Posio do mximo de J ob para alguns complexos de incluso. ____________ 46
Tabela 4.1 - Variveis utilizadas na Preparao das Solues para o Estudo de
Complexao por RMN. __________________________________________ 58
Tabela 5.1 - Dados de absorbncia e diferentes concentraes de furoato de diloxanida
(FD) e de -CD para construo do diagrama de solubilidade; T=37
o
C, pH
7,0, =260 nm. _________________________________________________ 60
Tabela 5.2 - Logartmo da constante de velocidade de primeira ordem em funo do pH
para a reao de hidrlise do furoato de diloxanida em gua, -CD e -CD
sulfatada; [FD]=6,66x10
-5
M; =260 nm; T=37
o
C; =0,5 M (KCl) ______ 61
Tabela 5.3 - Constantes de velocidade de primeira ordem em funo da concentrao de
-CD no estudo da reao de hidrlise do FD em pH 10,75 e 37
o
C. ________ 62
Tabela 5.4 - Constantes de velocidade de primeira ordem em funo da concentrao de
-CD sulfatada no estudo da reao de hidrlise do FD em pH 10,0 e 37
o
C.__ 63
Tabela 5.5 - Perfil [-CD]/(k
o
k
obs
) vs [-CD] para estudo da reao de hidrlise do
furoato de diloxanida a pH 10,75 e 37
o
C. ____________________________ 67
Tabela 5.6 -Deslocamentos qumicos dos espectros de
1
H e
13
C do helvolato de potssio
10mM em D
2
O, pH 7,5.___________________________________________ 83
Tabela 5.7 - Deslocamentos de
1
H e
13
C do Fusidato de sdio 10mM, em D
2
O. _________ 93
1
H e
13
C do CHAPS e CHAPSO 10mM, em D
2
O, pH 5-
6. ___________________________________________________________ 103
Tabela 5.9 - Valores de
max
obtidos para os tomos de carbono da -CD na
complexao com fusidato de sdio e helvolato de potssio. _____________ 111

xiv
Tabela 5.10 - Experimento ROE com as interaes entre os prtons (Pn) do helvolato ou
fusidato e os prtons (Hn) das ciclodextrinas - ou -CD. _______________ 112
max
obtidos para os tomos de carbono da -CD aps
complexao com CHAPS e CHAPSO. _____________________________ 123
Tabela 5.12 - Interaes observadas no ROESY (solues 10 mM de -CD e 10mM de
CHAPS ou CHAPSO, em D
2
O, pH natural ) entre prtons (Pn) do CHAPS
ou CHAPSO e prtons (Hn) da -CD._______________________________ 125
Tabela 5.13 - Relao entre as reas dos sinais das metilas nas posies 18 e 19 com a
rea dos prtons situados na cadeia lateral do CHAPS (31 e 32) e
CHAPSO (prton 12). ___________________________________________ 129
Tabela 5.14 - Interaes observadas no espectro ROESY (soluo em D
2
O, pH natural,
10 mM de -CD e 10 mM de CHAPS/CHAPSO), entre prtons (Pn) de
CHAPS e CHAPSO e prtons (Hn) da -CD._________________________ 140
Tabela 5.15 - -Resultados dos ajustes das reas de prtons do CHAPS e CHAPSO, no
qual descreve um comportamento de complexo 1:1.____________________ 142
Tabela 5.16 - Resultados dos ajustes das reas dos prtons do CHAPS e CHAPSO na
qual descreve comportamento do pseudo-complexo 1:1. ________________ 145

xv

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1.1 - Processo de absoro do complexo no trato gastrointestinal. ____________ 11
Esquema 3.1 - Equilbrios slido-lquido para a formao de um complexo de incluso. __ 36
Esquema 3.2 - Mecanismo cintico de hidrlise do furoato de diloxanida na presena e
ausncia de ciclodextrina (CD) _____________________________________ 50
Esquema 5.1 - Representao do mecanismo de catlise nucleoflica envolvendo o
centro reativo do furoato de diloxanida e a -CDSO
3
Na. _________________ 64
Esquema 5.2 - Reao de hidrlise do furoato de diloxanida (FD) versus complexao. ___ 65

xvi

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

CD - ciclodextrina
-CD - alfa ciclodextrina
-CD - beta ciclodextrina
-CD - gama ciclodextrina
-CDSO
3
Na - beta ciclodextrina sulfatada
FD - furoato de diloxanida
1
HRMN - Ressonncia Magntica Nuclear de
1
H
13
CRMN - Ressonncia Magntica Nuclear de
13
C
COSY - Espectrometria bidimensional de correlao
NOE - Nuclear Overhauser Effect
ROE - Rotating-frame nuclear OverhauserEffect
DEPT - Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
J - constante de acoplamento (Hz)
- deslocamento qumico (ppm)
obs
- variao de deslocamento qumico observado
max -
variao mxima observada de deslocamento
K
11
/ K
c -
constante de estabilidade ou equilbrio de formao do
complexo de incluso
f
CD
/ f
C
- fraes de ciclodextrina livre e complexada
Cn / C
11
/ C
12
- complexo de incluso 1:1 / 1:2
RM
CD
/
CD
- relao ou frao molar de ciclodextrina
CHAPS - 1-propanosulfonato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilamnio]
CHAPSO - hidroxi derivado de 1-propanosulfonato de 3-[(3-
colamidopropil)dimetilamnio]

xvii

RESUMO

Ciclodextrinas so um grupo de oligossacardeos cclicos, os quais tm sido
reconhecidos como excipientes farmacuticos de grande utilidade. Apresentam uma cavidade
central hidrofbica, cuja estrutura permite formar complexos de incluso estveis. Neste
trabalho, foram utilizados mtodos de solubilidade e cintico para estudo do complexo de
incluso furoato de diloxanida/-ciclodextrina, bem como as tcnicas de RMN e de
fluorescncia. Estudos cinticos e de solubilidade demonstraram estequiometria 1:1 para o
complexo FD/-CD. Os estudos de complexao dos antibiticos, fusidato de sdio e
helvolato de potssio, bem como dos compostos 1-propanosulfonato de 3-[(3-
colamidopropil)dimetilamnio] (CHAPS) e seu hidroxi-derivado (CHAPSO) com as - e -
CD foram feitos por tcnicas de RMN de
1
H e
13
C (mono e bidimensionais). Estes hspedes
com estruturas esteroidais em comum, formaram complexos 1:1 com a -CD. Na presena de
-CD, fusidato de sdio e helvolato de potssio formaram complexos 1:1 e 1:2, enquanto que
com CHAPS ou CHAPSO ocorreu formao de dois complexos 1:1 distintos em soluo.
Ambos os antibiticos fusidato de sdio e helvolato de potssio, comportaram-se como
hspedes monotpicos e ditpicos quando complexados com - e -CD, respectivamente.
CHAPS e CHAPSO na presena de - e -CD, demonstraram comportamentos diferenciados
de intercmbio do hspede em relao escala de tempo de RMN. Assim, com a -CD
verificou-se um intercmbio rpido enquanto que com a -CD foi lento. Foram apresentados e
analisados os espectros ROESY, os quais permitiram definir as interaes existentes entre as
molculas hspedes e as ciclodextrinas. No caso dos quatro compostos esteroidais, as
constantes de equilbrio foram discutidas em termos das estruturas propostas para os
complexos. Foram revisados os espectros de RMN do fusidato de sdio e apresentados os
assinalamentos completos do helvolato de potssio, CHAPS e CHAPSO, atravs dos
espectros de RMN de
1
H e
13
C.

xviii

ABSTRACT

Cyclodextrins are a group of cyclic oligosaccharides which have recently been
recognized as useful pharmaceutical excipients. They present an hydrophobic central cavity
whose structure allows the formation of stable inclusion complex. In this work, solubility and
kinetic methods, as well NMR and fluorescence techniques were used for studying the
inclusion complex of diloxanide furoate / -cyclodextrin. Kinetics and solubilities studies
showed stoichiometry 1:1 for the FD/-CD complex. The complexation studies of two steroid
antibiotics, sodium fusidate and potassium helvolate, as well as the compounds 3-[(3-
cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulphonate (CHAPS) and its hydroxy
derivative (CHAPSO) by - and -CD were by
13
C and
1
H NMR techniques (mono and
bidimensional). These guests with steroid structures in common, formed 1:1 complexes by -
CD. In the presence of -CD, sodium fusidate and potassium helvolate formed 1:1 and 1:2
complexes, while with CHAPS and CHAPSO were through two distinct 1:1 complexes in
solution. Both the antibiotics, sodium fusidate and potassium helvolate, behaved as monotopic
and ditopic guests when they complexed by - and -CD, respectively. CHAPS and CHAPSO
showed different behaviors of interchange guest in relation to NMR time scale to both - and
-CD. Therefore, with -CD a fast interchange was observed while by -CD it was slow. The
ROESY spectra were also presented and analysed, which permited to define the interactions
between the guests and cyclodextrins. The obtained equilibrium constants were discussed in
terms of the proposed structures for the complexes to the four steroid compounds. NMR
spectra of sodium fusidate were revised, and a full assignment of the
1
H and
13
C NMR spectra
was presented for potassium helvolate, CHAPS and CHAPSO.

1 - INTRODUO

A procura por novos excipientes e tecnologias, tem levado a indstria farmacutica e a
comunidade cientfica pesquisa por novas formulaes que resultem em preparaes mais
estveis e melhoras teraputicas. As ciclodextrinas na forma de complexos de incluso tm
sido um dos principais recursos empregados dentro da rea farmacutica nestes ltimos anos.
Sua conformao espacial em forma de cone, com caractersticas hidroflicas em sua parte
externa e cavidade interna relativamente apolar, permite a formao de complexos de incluso
com vrias molculas. Na rea farmacutica, o encapsulamento molecular de princpios ativos
sem dvida a aplicao das ciclodextrinas que mais tem sido explorada. Muitos trabalhos
tm demonstrado as diversas aplicaes em termos de modificao das caractersticas fsico-
qumicas intrnsecas das molculas hspedes, no que se refere solubilidade, estabilidade,
biodisponibilidade, proteo contra a oxidao, reduo, racemizao, isomerizao,
polimerizao, hidrlise e/ou decomposio do princpio ativo, assim como converso de
substncias lquidas em microcristalinas, reduo das irritaes gastrointestinais ou oculares e
outros efeitos secundrios, alm da preveno a uma decomposio enzimtica.
1- 4

Apesar da importncia da utilizao das ciclodextrinas em tecnologia farmacutica,
escasso o conhecimento das vantagens quanto utilizao destes complexos moleculares.
normal observar dentro da classe mdica, o desconhecimento das melhorias nas propriedades
fsico-qumicas destes complexos, como o caso dos antiinflamatrios no esteroidais,
Brexin e Cicladol (complexos de piroxicam com -ciclodextrina), comparados ao
princpio ativo piroxicam (Feldene). Inmeros trabalhos demonstram os benefcios na
complexao do piroxicam por -ciclodextrina, podendo-se citar melhora da
hidrosolubilidade, biodisponibilidade e reduo dos efeitos irritantes sobre a mucosa
gastrointestinal.
5-11

Dentro deste contexto, cabe ressaltar que os princpios ativos indicados como objetos
de anlise desta tese de doutorado, apresentam caractersticas peculiares que os colocam como
Introduo

2
sistemas apropriados ao estudo de complexao em ciclodextrinas, em concordncia aos
objetivos deste trabalho. Entre estas, destacam-se:
i) Os problemas de solubilidade e instabilidade em gua apresentados pelo furoato de
diloxanida, o que limita a possibilidade do alcance deste no fluido intestinal e provvel
eliminao do local onde deveria exercer seu efeito teraputico.
12, 13

ii) Efeitos secundrios apresentados pelo cido fusdico, relacionados com transtornos
do trato gastrointestinal.
14

iii) Efeitos txicos apresentados pelo cido helvlico no retardamento do crescimento
de gramneas,
15
assim como a ao inibitria do epitlio ciliar respiratrio humano.
16

iv) Os sais biliares triidroxlicos e dihidroxlicos ao serem complexados por -CD,
comportam-se como hspedes monotpicos e ditpicos, respectivamente.
17
Esta caracterstica
tem sido utilizada para demonstrar a formao de conglomerados supramoleculares.
18-21
Estes
estudos sugerem a busca por novos hspedes ditpicos, a fim de obter-se complexos com a -
CD mais estveis que com os sais biliares. Os possveis efeitos estricos oriundos da presena
da primeira molcula de -CD devem ser minimizados para que favorea a complexao por
parte da segunda -CD. Estes fatores estricos impostos pela estrutura espacial de ambas as
molculas de ciclodextrina contribuem negativamente na formao destes complexos. A
preveno a estes efeitos estricos definidos por Connors et al.
22, 23
atravs de parmetros de
cooperao, podem ser obtidos atravs da utilizao de hspedes esterides, cujos anis C e D
apresentem um baixo grau de incluso e os anis A e B (segunda posio da complexao),
estejam suficientemente livres para serem complexados pela segunda ciclodextrina. Esta
condio pode ser alcanada com os esterides cidos fusdico e helvlico, cujas cadeias
laterais rgidas e hidrofbicas, permitem o livre acesso complexao por parte da segunda
molcula de ciclodextrina. Do mesmo modo, aplicvel s molculas CHAPS e CHAPSO,
por possurem cadeias laterais alongadas em relao aos sais biliares. Cabe enfatizar que a
cooperatividade um processo de relevncia nas interaes moleculares frmaco-protena, o
que justificaria o uso destes sistemas como modelos para os processos de reconhecimento
molecular.
24

Introduo

3
v) As caractersticas estruturais apresentadas pelos quatro esterides e cujas estruturas
esto apresentadas no item 1.2 p.25 (cidos fusdico e helvlico, CHAPS e CHAPSO),
permitem classific-los como timos sistemas para realizao de uma anlise global dos
deslocamentos qumicos dos sinais de RMN de
1
H e
13
C. Sabe-se que a RMN uma tcnica
instrumental bastante utilizada para a determinao da estrutura, estequiometria e constante de
equilbrio de formao dos complexos de incluso. No entanto, as publicaes existentes
mostram uma srie de deficincias relacionadas anlise dos dados experimentais. Nestes
casos, a anlise fica centrada unicamente em um nico sinal (prton ou carbono) ou quando
em mais de um feita de maneira independente, o que conduz muitas vezes a valores
inconsistentes. Em se tratando de estequiometrias mltiplas, como no caso de hspedes
ditpicos, a anlise individual no permite a determinao de mais de uma constante de
equilbrio envolvida em um nico processo de complexao.
O presente trabalho vem contribuir com o estudo dos complexos de incluso de
substncias de interesse em ciclodextrinas, atravs da anlise destes quanto estequiometria,
estrutura e constante de formao de equilbrio, utilizando as tcnicas de RMN de
1
H e
13
C
(mono e bidimensionais), bem como atravs de mtodos cintico e de solubilidade.

1.1 - Ciclodextrinas
1.1.1 - Estrutura
As ciclodextrinas so um grupo de molculas naturais cclicas constitudas por
unidades de glicopiranose unidas por ligaes (1,4). Estes oligossacardeos so obtidos por
degradao enzimtica do amido sob ao da enzima glicosiltransferase (CGT amilase do
Bacillus macerans), que produz uma reao intramolecular sem a participao de uma
molcula de gua. Foram descobertas em 1891 por Villiers e os primeiros detalhes de sua
preparao foram descritos por Schardinger em 1903.
25

As ciclodextrinas naturais so macromolculas contendo um nmero de unidades de
glicose compreendidas entre 6 e 8, denominando-se respectivamente, -, - e -CD (Figura
1.1). A Figura 1.2 apresenta a representao esquemtica das ciclodextrinas mais usuais.
Introduo

4

O
H
H
HO
H
O
OH
H
H
OH
O
H
H
HO
H
HO
H
H
OH
O
O
H
H OH
H
O
HO
H
H
OH
O
H
H
OH
H
O
HO
H
H
HO
O
H
H
OH
H
OH
H
H
HO
O
O
H
H HO
H
O
OH
H
H
HO
O
H
H
HO
H
O
OH
H
H
OH
O
H
H
OH
H
O
HO
H
H
OH
O
H
H
OH
H
O
HO
H
H
HO
O
H
H
OH
H
O
OH
H
H
HO
O
H
H
HO
H
O
OH H
H
HO
O
H
H OH
H
O
HO
H
H
OH
O
H
H
HO
H
O
OH
H
H
HO
O
H
H
HO
H
O
OH
H
H
OH
O
H
H
HO
H
O
HO
H
H
OH
O
H
H
OH
H
HO
H
H
OH
O
O
H
H
OH
H
O
HO
H
H OH
O
H
H
OH
H
O
HO
H
H
HO
O
H
H
OH
H
O
OH
H
H
HO
O
H
H
HO
H
OH
H
H
HO
O
O
H
H
HO
H
O
OH
H
H HO
-CD -CD -CD
O
H
H
HO
H
O
OH
H
H
OH
O
H
H
HO
H
HO
H
H
OH
O
O
H
H OH
H
O
HO
H
H
OH
O
H
H
OH
H
O
HO
H
H
HO
O
H
H
OH
H
OH
H
H
HO
O
O
H
H HO
H
O
OH
H
H
HO
O
H
H
HO
H
O
OH
H
H
OH
O
H
H
OH
H
O
HO
H
H
OH
O
H
H
OH
H
O
HO
H
H
HO
O
H
H
OH
H
O
OH
H
H
HO
O
H
H
HO
H
O
OH H
H
HO
O
H
H OH
H
O
HO
H
H
OH
O
H
H
HO
H
O
OH
H
H
HO
O
H
H
HO
H
O
OH
H
H
OH
O
H
H
HO
H
O
HO
H
H
OH
O
H
H
OH
H
HO
H
H
OH
O
O
H
H
OH
H
O
HO
H
H OH
O
H
H
OH
H
O
HO
H
H
HO
O
H
H
OH
H
O
OH
H
H
HO
O
H
H
HO
H
OH
H
H
HO
O
O
H
H
HO
H
O
OH
H
H HO
-CD -CD -CD

Figura 1.1 - Ciclodextrinas naturais

Figura 1.2 - Representao esquemtica das ciclodextrinas.

Mediante difrao de raios X, se determinou que as ciclodextrinas possuem uma
estrutura cnica truncada (Figura 1.3).

Figura 1.3 - Estrutura e dimenses das ciclodextrinas.

Introduo

5
As unidades de glicopiranose esto unidas em conformao 1-4 glicosdica, estando
todos os grupos OH secundrios situados na parte mais larga, enquanto que os grupos OH
primrios na parte mais estreita (Figura 1.4). O interior da cavidade est constitudo por
hidrognios H
3
, H
5
e H
6
e oxignios glicosdicos. Os pares de eltrons no-ligantes destes
oxignios pertencentes a ligao glicosdica, se encontram orientados em direo ao interior
da cavidade, o que origina uma alta densidade eletrnica, deixando a molcula com
caractersticas de base de Lewis.

Figura 1.4 - Estrutura funcional da ciclodextrina

Os grupos hidroxilas secundrios OH(2) e OH(3) esto em posio equatorial, porm
com o OH(2) apontando para o interior e o OH(3) para o exterior da cavidade, bem como a
hidroxila primria OH(6). Isto faz com que exista o dobro de grupos OH voltados para fora do
que para dentro da cavidade, o que leva a um momento dipolar da molcula relativamente
grande.
26
Devido distribuio dos grupos funcionais que formam a ciclodextrina, a parte
externa adquire carter hidroflico e a interna hidrfoba ou de natureza apolar. O grupo
OH(C2) de uma unidade de glicopiranose pode formar pontes de hidrognio com o OH(C3)
da unidade adjacente. No caso da -ciclodextrina, estas ligaes formam um cinturo
secundrio completo, o que lhe confere uma estrutura bastante rgida. Esta uma possvel
explicao da menor solubilidade da -ciclodextrina com relao as restantes. No caso da -
ciclodextrina, o cinturo formado a partir das ligaes de pontes de hidrognio no
completo, pois uma das molculas das unidades de glicopiranose est em uma posio
distorcida, de maneira que, somente quatro das seis possveis unies atravs de pontes de
hidrognio podem ser estabelecidas. No caso da -ciclodextrina, esta possui uma estrutura no
coplanar, o que a torna mais flexvel e portanto a mais solvel das trs.
26

1
2
3
4
5
6
HO
O
H
H
HO
H
HO
OH
H
H
OH
1
2 3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
HO
O
H
H
HO
H
HO
OH
H
H
OH
1
2 3
4
5
6
HO
O
H
H
HO
H
HO
OH
H
H
OH
HO
O
H
H
HO
H
HO
OH
H
H
OH
1
2 3
4
5
6
Introduo

6

1.1.2 - Complexos de incluso
Devido a sua cavidade hidrofbica, na qual substratos podem ser aprisionados para
formarem complexos de incluso, as ciclodextrinas podem hospedar distintos compostos, cuja
estequiometria mais usual 1:1. A qumica do fenmeno de incluso molecular demonstra um
sistema de complexidade estrutural dentro da qumica supramolecular, onde a ciclodextrina
o hospedeiro (em ingls, host) e o substrato o hspede (em ingls, guest), os quais se
mantm juntos principalmente atravs de foras de Van der Waals, interaes hidrofbicas e
pontes de hidrognio.
26, 27
A formao do complexo de incluso facilita em alguns casos, a
solubilizao de substncias pouco solveis e em outros, precipita algum componente em
soluo ou suspenso. No primeiro caso tem-se como exemplo a solubilizao do
naproxeno,
28
j a formao do complexo colesterol--CD,
29
conduz uma precipitao em
soluo aquosa, caracterstica que tem sido utilizada para extrao do colesterol em alimentos.
Esta caracterstica peculiar de formao de complexos de incluso estveis, tem levado a
diversas aplicaes, como por exemplo na indstria de alimentos, farmacutica, cosmtica,
biotecnologia, qumica analtica, agricultura e tecnologia ambiental.
26, 30, 31
Em soluo, a
molcula hspede vai estar localizada, inteira ou parcialmente, dentro da cavidade da
ciclodextrina, estando o complexo solvatado ou rodeado por molculas do solvente,
geralmente a gua. No estado cristalino, a molcula hspede pode estar localizada, no
somente dentro da cavidade da ciclodextrina, mas tambm nos espaos intersticiais formados
pela rede cristalina do complexo. As molculas includas normalmente ficam orientadas de
modo que se alcance o mximo contato entre a parte hidrofbica da molcula hspede e a
cavidade da ciclodextrina de natureza apolar.
26
Quando em uma soluo aquosa de ciclodextrina se adiciona um composto menos
polar que a gua, tendo ambos forma e dimenso compatveis, as molculas de gua que
preenchem a cavidade da ciclodextrina, estando em um estado energeticamente menos
favorvel, so substitudas pela nova molcula. A cavidade central da ciclodextrina vai atuar
ento como uma molcula hospedeira, podendo alojar uma molcula hspede total ou
parcialmente, caso haja compatibilidade para formar o complexo de incluso.
26

Introduo

7
As ciclodextrinas formam complexos de incluso com substncias que possuem
tamanho, polaridade e forma geomtrica compatveis com a dimenso de sua cavidade.
Alternativas para a formao de complexos com molculas significativamente maiores que
sua cavidade, podero ser atravs de uma interao parcial do hspede ou mediante a
formao de complexos ciclodextrina-hspede de estequiometria diferente de 1:1. Conforme
Figura 1.5, os complexos de incluso so classificados em:
32

Figura 1.5 - Principais tipos de complexos de incluso

Completa: quando a molcula hspede de tamanho pequeno e entra totalmente na
cavidade da ciclodextrina (Figura 1.5 a).
Parcial: quando a molcula somente entra parcialmente na cavidade da ciclodextrina
(Figura 1.5 c).
Axial: quando a molcula hspede de tamanho longo e estreito e se estende atravs do
eixo mediano da ciclodextrina (Figura 1.5 b).
Tipo sandwich: quando a molcula hspede muito grande e necessita de duas
molculas de ciclodextrina para formar o complexo (Figura 1.5 d).
Complexos de estequiometria superior: so exemplificados pela incluso 1: 2, onde duas
molculas hspede interagem com uma ciclodextrina (Figura 1.5 e) ou duas molculas
hspedes para duas ciclodextrinas (Figura 1.5 f).

Outros compostos formam complexos de ordem superior, podendo-se mencionar:
rotaxanos e polirrotaxanos,
33
catenanos,
34
estruturas tubulares,
35
teres coroas,
36
polmeros
supramoleculares de incluso,
19, 20
dendrmeros, etc.
18, 37

Introduo

8
1.1.3 - Aplicaes das ciclodextrinas na rea farmacutica
Nos ltimos anos tm havido um grande interesse na melhoria da qualidade das
formulaes farmacuticas. A pesquisa de formulaes que melhorem a eficcia de novos
princpios ativos, assim como de alguns frmacos j conhecidos, tm levado aplicao de
complexos de incluso em ciclodextrinas. A razo para o crescimento do nmero de
publicaes e patentes dentro da rea farmacutica tambm se deve ao custo bastante baixo na
obteno das -, - e -ciclodextrinas. O tamanho favorvel do dimetro interno da cavidade
das ciclodextrinas permite a formao de complexos de incluso com a maioria dos frmacos,
cuja melhoria das suas propriedades fsico-qumicas
26, 31, 38
esto expressas pelas seguintes
vantagens:
compostos lquidos transformados em formas cristalinas slidas
eliminao de incompatibilidades entre o princpio ativo e os outros constituintes da
formulao
estabilidade qumica e/ou fsica
aumento da velocidade de dissoluo e biodisponibilidade
melhora da solubilidade de frmacos pouco solveis
reduo dos efeitos secundrios
eliminao de maus odores e sabores
reduo da volatilidade de certos princpios ativos

Algumas das aplicaes mais freqentes na rea farmacutica so apresentados na
Tabela 1.1.
Introduo

9
Tabela 1.1 - Exemplos de alguns frmacos em forma de complexos de incluso.
Propriedade Princpio ativo ciclodextrina referncias
Aumento da solubilidade
Gliclazide
Glibornuride
Albendazol
Mebendazol
-CD
, e -CD
, e -CD e HP--CD
, e -CD e HP--CD
39
40
41
42
Melhora da
biodisponibilidade
Naproxeno
Ketoprofeno
-CD
-CD
HP--CD
43
44
Diminuio de efeitos
secundrios
Piroxicam
Naproxeno
Pilocarpina
-CD
-CD
HP--CD
DM--CD
45
46
47
Inibio da degradao
Melfalano e carmustina
Prostaciclina
Indometacina
Doxorubicina

Aspirina
SBE--CD e HP--CD
, e -CD
-CD, HP--CD e -CD
HP--CD, HP--CD e CD
HP--CD
48
49
50
51

52
Aumento da degradao
Espironolactona
Antibiticos lactmicos
- , -CD e derivados
DM-CD, HP-CD e HP-
CD
53
54

As ciclodextrinas podem ser administradas a seres humanos ou animais, fazendo parte
de medicamentos ou alimentos, seja na forma livre ou como complexos de incluso. Se a
ciclodextrina administrada por via oral, fazendo parte do complexo, ocorre sua dissociao
no trato gastrointestinal, sendo processos separados, a absoro da molcula hspede e da
ciclodextrina. Estas por sua vez, so degradadas a acares absorvveis no clon intestinal
pela microflora, e finalmente excretadas como dixido de carbono e gua.
31

Biodisponibilidade
O termo biodisponibilidade definido atravs do grau e da velocidade de absoro de
um frmaco a partir de sua forma farmacutica para dentro da circulao sangnea. De
acordo com esta definio, a absoro de um frmaco administrado atravs da via intravenosa
Introduo

10
rpida e completa. No entanto, por razes de convenincia e estabilidade, muitos frmacos
so administrados por via oral, e portanto o grau e a velocidade de absoro no so
precisamente conhecidos.
55
H vrios fatores fsico-qumicos que podem afetar a biodisponibilidade total de um
frmaco. Entre eles, cita-se a solubilidade, estabilidade, tamanho da partcula, pK
a
, pH e
coeficiente de partio.
55
Quando um frmaco administrado por via oral em uma forma farmacutica slida,
indispensvel que ocorra sua solubilizao nos fluidos biolgicos, como passo inicial a etapa
de absoro. Se a velocidade de dissoluo (k
d
) bastante alta, com relao a velocidade de
absoro (k
a
), no se recomenda o uso de complexos de incluso, j que a biodisponibilidade
deste princpio ativo no ser limitada pelo processo de dissoluo. No entanto, um grande
nmero de frmacos apresentam baixa biodisponibilidade, precisamente por apresentarem
problemas de solubilidade (k
d
<< k
a
) e, nestes casos justifica-se a utilizao destes
complexos.
31, 55, 56

Uma vez que o complexo de incluso se encontra no fluido biolgico, antes de haver
absoro para a corrente sangnea, deve sofrer um processo de dissociao, considerando
que somente o frmaco livre capaz de atravessar as membranas biolgicas. Portanto, a
absoro vai depender tanto da velocidade de dissoluco (k
d
), como da dissociao do
complexo formado, determinado pela constante de estabilidade (K
c
). O complexo dissolvido
vai estar em equilbrio com as formas dissociadas, ciclodextrina e frmaco no complexados.
O esquema 1.1, se refere ao processo de absoro para os complexos de incluso no trato
gastrointestinal.
31, 55

Introduo

11
[CD-frmaco]
slido
[CD-frmaco]
dissolvido
CD+frmaco absoro
k
d
K
c
k
a

Esquema 1.1 - Processo de absoro do complexo no trato gastrointestinal.

Portanto, esperada uma rpida absoro do frmaco, se o valor da constante de
estabilidade do complexo for baixa. Com complexos muito estveis, ou valores da constante
de estabilidade ou formao do complexo muito elevados, a concentrao do frmaco livre
absorvido baixa e, nestes casos esta a etapa limitante de velocidade.
31

A velocidade de absoro de frmacos pode assim ser acelerada ou diminuda atravs
da avaliao prvia do valor da constante de equilbrio do complexo. Complexos com baixos
valores da constante de estabilidade (inferiores a 200 M
-1
), conduzem a uma liberao rpida
e prematura do princpio ativo, podendo ocasionar sua precipitao no fluido biolgico, o que
ir diminuir sua absoro. Por outro lado, se os valores da constante so superiores a 5000M
-1

ou existe uma concentrao excessiva de ciclodextrina, o equilbrio vai ser deslocado em
direo a formao do complexo de incluso, diminuindo assim a liberao da forma livre do
frmaco e conseqentemente sua absoro.
26, 31

Solubilidade
Em geral, supe-se que a formao de complexos de incluso em ciclodextrinas, leva
ao aumento da solubilidade e da velocidade de dissoluo de princpios ativos lipoflicos, o
que pode refletir em um aumento de sua biodisponibilidade ou em diminuio de seus efeitos
secundrios.
2, 43, 46, 47

Geralmente, a solubilidade de um frmaco aumenta com a quantidade de ciclodextrina
adicionada. O aumento da solubilidade parece estar relacionado com a solubilidade intrnseca
Introduo

12
do hspede, bem como com a habilidade de incluso da molcula hospedeira em gua, onde
estes fatores estaro refletindo na magnitude da constante de estabilidade do complexo.
55

Ahn et al., estudaram a influncia que haveria sobre a velocidade de dissoluo do
frmaco antiinflamatrio no esteroidal ketoprofeno, aps formao de complexos de incluso
na presena de algumas ciclodextrinas. Foi observado que o perfil de dissoluo deste
frmaco foi consideravelmente favorvel na presena tanto de -CD bem como de HP--CD,
o que reflete de forma positiva em sua biodisponibilidade.
44

Gliclazida, frmaco alternativo utilizado no tratamento de diabetes mellitus,
caracterizado por sua baixa solubilidade nos fluidos gstricos e, portanto baixa velocidade de
dissoluo e biodisponibilidade. A formao do complexo gliclazida-CD, foi avaliada
atravs de estudos de RMN de
1
H e
13
C e de solubilidade. Os autores mostraram a formao
do complexo, com uma constante de estabilidade de 1094 M
-1
e estequiometria 1:2.
39

Torres Labandeira et al., atravs de estudos de solubilidade e
1
H-RMN na
complexao de glibornurida com , e -CD, mostraram que a solubilidade deste frmaco
melhora significativamente na presena de ciclodextrinas.
40
Daz et al., estudaram a complexao e a solubilidade de albendazol e mebendazol,
devido a baixa solubilidade destes frmacos no trato gastrointestinal. Estudos de solubilidade
mostraram que as ciclodextrinas aumentam a solubilidade do mebendazol no fluido intestinal
simulado.
42
Estudos de velocidade de dissoluo do albendazol, mostraram uma melhora em
presena de diferentes ciclodextrinas.
41

Estabilidade
Princpios ativos quando presentes em soluo aquosa, esto sujeitos muitas vezes,
reaes de degradao, os quais so levados a uma diminuio de atividade teraputica ou
mesmo formao de produtos de degradao indesejveis e prejudiciais sade. Quando
fazem parte de um complexo de incluso, podero estar protegidos das situaes de
degradao ou inestabilidade. Do ponto de vista da rea farmacutica, os frmacos devem
permanecer suficientemente estveis, no somente durante a estocagem, mas tambm nos
Introduo

13
fluidos biolgicos, j que nas reaes que resultam em produtos farmacologicamente inativos
ou menos ativos, tero sua efetividade teraputica reduzida.
31, 55

O aumento da temperatura tem influncia direta na estabilidade fsica de muitas
formas farmacuticas tais como solues, emulses, suspenses e supositrios. Estas
alteraes incluem desde modificaes reolgicas, o que vai interferir significativamente na
viscosidade, assim como desestabilizao de sistemas emulsionados. Favorece tambm a
evaporao de solventes volteis, contribuindo assim para uma provvel recristalizao.
57

Foram observados que certos frmacos, ao formarem complexos de incluso com
ciclodextrinas, aumentam sua estabilidade com relao a temperatura, reduzindo-se assim
perdas em sua forma farmacutica, ocasionadas por uma sublimao ou volatilizao.
58

Geralmente, no so observados os processos de fuso, evaporao, sublimao ou
decomposio do princpio ativo, at que se produza a decomposio da ciclodextrina (250-
300
o
C).
31
O processo de oxidao de uma substncia cristalina, frente ao oxignio atmosfrico,
em geral bastante lento e poder ser acelerada se for aumentada sua superfcie de contato. Por
outro lado, a formao de complexos de incluso, permite estabilizar alguns compostos
insaturados, tais como os cidos graxos, aldedos e vitaminas lipossolveis. Este resultado
de extrema importncia para as indstrias de alimentos e cosmtica, permitindo a
estabilizao de substncias bastante utilizadas nesta rea.
31
A decomposio fotoqumica decorrente da absoro de luz ou energia radiante pela
molcula do frmaco fotossensvel. Parece claro que, esse tipo de alterao depende da
facilidade com que a luz se propaga no meio no qual est contido o frmaco. Formas
farmacuticas tais como solues, xaropes e elixires so mais susceptveis s alteraes que as
suspenses, emulses, ps e comprimidos.
57

A felodipina, frmaco antihipertensivo, apresenta problemas de baixa solubilidade e
decomposio fotoqumica. Atravs de estudos de estabilidade, as ciclodextrinas foram
utilizadas para melhorar suas propriedades fsico-qumicas.
59

A digoxina, um dos potentes glicosdeos cardacos, susceptvel a hidrlise em meio
cido e, como resultado, sua eficincia teraputica bem como sua biodisponibilidade oral
Introduo

14
podem ser diminudas. No decorrer da degradao da digoxina, a preveno ao aparecimento
da digoxigenina, pode ser clinicamente importante, porque a cardioatividade da digoxigenina
aproximadamente 1/10 da digoxina. Na presena de ciclodextrinas, a hidrlise cida da
digoxina evitada na ordem que vai de - > - > -ciclodextrina, onde a -CD inibe a
converso do digoxdeo a digoxigenina quase completamente.
60

Efeitos secundrios
Quando o princpio ativo est includo dentro da cavidade da ciclodextrina, se reduz a
possibilidade de seu contato direto com os componentes biolgicos e desta maneira os efeitos
secundrios.
Um dos grupos teraputicos mais amplamente estudados o dos antiinflamatrios no
esteroidais, devido a sua potente ao ulcerognica. Esta ao desfavorvel tem sido
amenizada atravs da formao de complexos de incluso em ciclodextrinas, como no caso do
naproxeno em -CD.
46

As ciclodextrinas tambm protegem os eritrcitos das mudanas morfolgicas
ocorridas com subseqente hemlise, induzidas por vrios frmacos perturbadores de
membrana. Esta reduo vai depender da quantidade de frmaco que se encontra na forma
livre e, portanto, depender da magnitude da constante de estabilidade do complexo.
Exemplos so os complexos de clorpromazina e cido flufenmico, onde a inibio da
hemlise se produz na seguinte ordem - > - > -ciclodextrina. Neste caso, a ao protetora
das ciclodextrinas devida menor disponibilidade de unio do frmaco com as membranas
dos eritrcitos.
55

A pilocarpina usado topicamente para controle da presso intraocular elevada,
associada ao glaucoma, porm sua biodisponibilidade ocular baixa devido a perda rpida da
rea precorneal. Apesar da existncia de um pr-frmaco (dister do cido pilocrpico) que
apresenta melhor absoro ocular com prolongada durao de ao, foram observados
problemas de fortes irritaes oculares, impedindo assim seu uso clnico. Com o uso de
derivados de ciclodextrina, como a 2-hidroxipropil--ciclodextrina e sulfobutil--
Introduo

15
ciclodextrina, observou-se um decrscimo da irritao oftlmica deste pr-frmaco, com
nenhum decrscimo na sua ao teraputica.
61
Montassier et al., efetuaram estudos com a tretinona, substncia usada no tratamento
da acne, com caractersticas de forte poder de irritao cutnea, elevada instabilidade na
presena de oxignio, luz e calor, assim como baixa solubilidade em gua. A fim de melhorar
suas caractersticas, os autores propuseram a formao de complexos de incluso em
ciclodextrinas (-CD, hidroxi-propil--CD e dimetil--CD).
62

Toxicidade
Nos ltimos anos tm sido realizados numerosos estudos com o objetivo de avaliar a
toxicidade das ciclodextrinas, observando-se que a doses considerveis, podem interagir com
compostos endgenos, tais como os cidos biliares, fosfolipdeos de membranas e colesterol,
o que depende em grande parte, do tamanho da cavidade da molcula.
63, 64
Considerando que os efeitos aos danos celulares, so uma conseqncia da
complexao da ciclodextrina com componentes da parede celular, tais como colesterol e
fosfolipdeos, foi verificado que a -CD e particularmente seus derivados mais hidrofbicos,
como a dimetil--CD, so consideradas as mais txicas. No entanto, a dimetil--CD apresenta
alta capacidade de solubilizao, o que leva a sua utilizao em baixas dosagens, por exemplo
em gotas nasais, cuja toxicidade desaparece. A -CD, cuja toxicidade bastante baixa, pode
ser usada atravs das vias parenteral e oral em altas dosagens, embora muitos de seus
complexos com frmacos apresentem uma solubilidade limitada. A hidroxipropil--CD (HP-
-CD), por sua vez, bastante solvel e apresenta boa capacidade de solubilizao, porm a
solubilizao e transporte do colesterol para o interior do rim, poder gerar srias
conseqncias, em tratamentos por longos perodos de tempo.
65

Introduo

16
1.1.4 - Mtodos de obteno de complexos de Incluso.
Para a grande maioria dos substratos, as tcnicas de complexao utilizadas so
procedimentos simples e a escolha do mtodo experimental, depende fundamentalmente das
caractersticas do substrato que se est trabalhando e, se preparado em escala laboratorial ou
industrial.
Na bibliografia so descritos diversos mtodos de preparao dos complexos de
incluso, entre os que se pode destacar:
26, 66

Complexos em Soluo: Um mtodo bastante freqente atravs da dissoluo de
ambos, hspede e ciclodextrina em um solvente comum, temperatura ambiente ou atravs
do aquecimento, com agitao durante um tempo suficiente para garantia do estado de
equilbrio, geralmente de 24 a 48 horas. Para obteno do complexo, se faz ento a remoo
do solvente mediante evaporao, liofilizao, refrigerao ou spray-drying. A presena de
gua absolutamente necessria, pura ou em um sistema contendo solvente orgnico, onde
este ser utilizado para solubilizao da molcula hspede. So usados como cosolventes,
lcoois de cadeia curta como metanol, etanol, isopropanol ou em certos casos, a acetona.
Complexos em Suspenso: Neste caso, as ciclodextrinas no necessitam estar
completamente dissolvidas, agitando o hspede em uma suspenso aquosa de ciclodextrina, o
complexo formado em um intervalo de 2 a 24 horas em temperatura ambiente. Este
procedimento considerado o mais recomendado para processos em grande escala e tem sido
utilizado para complexao de leos essenciais, terpenos, aromas e fragncias lipoflicas. Um
exemplo a fendilina, leo viscoso de baixa solubilidade em gua. Pode formar um complexo
2:1 -ciclodextrina/fendilina, por adio de 30g desta base oleosa, dissolvidos em 100mL de
etanol em uma suspenso de 300g de -ciclodextrina em 100 mL de gua, com uma agitao
vigorosa no intervalo de 12 horas, onde se obtm o produto atravs de filtrao e secagem a
uma temperatura de 40
o
C.
Complexos por macerao: Consiste em misturar quantidades estequiomtricas do
substrato e ciclodextrina, com adio de uma pequena quantidade de gua ou soluo
hidroalcolica. A mistura ento macerada at que se evapore a fase lquida, formando-se
uma pasta que ir ser submetida a uma secagem at a eliminao total do solvente.
Introduo

17
Coprecipitao: Consiste na adio de um excesso de substncia ativa a uma soluo
saturada de ciclodextrina. Em alguns casos, este simples procedimento pode levar formao
do complexo de incluso, porm freqentemente recorre-se a mtodos adicionais como
agitao, ultrasom ou aquecimento da soluo para precipitao do produto final.
Liofilizao: Consiste no mtodo em soluo, onde se submete ao processo de
liofilizao, a soluo na qual substrato e ciclodextrina encontram-se em concentraes
estequiomtricas. Pode-se empregar algum solvente, com a finalidade de obter ambas as
substncias totalmente dissolvidas. As condies nas quais se procede a liofilizao, vai
influir de forma determinante nas caractersticas do produto final. Assim, por exemplo, a
velocidade de congelamento prvia liofilizao, condiciona a estrutura do complexo. Um
rpido congelamento na presena de nitrognio lquido, geralmente favorece a formao de
produtos amorfos, enquanto que um congelamento mais lento leva a produtos cristalinos.

1.1.5 - Complexao de Esterides
A interao entre esterides, entre os quais os hormnios,
67, 68
colesterol,
29, 69- 75

sais biliares
20, 76
e ciclodextrinas, tornou-se um assunto de grande interesse, devido a diversas
razes:
i) por um lado, a grande importncia dos esterides e por outro, a crescente utilizao
das ciclodextrinas em tecnologia farmacutica. Foram demonstrados em estudos in vivo, os
efeitos sobre o metabolismo dos sais biliares em animais submetidos a dietas especiais
contendo quantidades variadas de ciclodextrinas.
77, 78
Em seus estudos, Nakanishi et al.
79
demonstraram que as interaes entre sais biliares e a -CD influram na absoro do frmaco
sulfametiazol administrado por via oral em forma de complexos de incluso.
ii) tm sido utilizadas colunas cromatogrficas com ciclodextrinas para separao de
epmeros de esterides, cuja soluo no pode ser conseguida mediante colunas tradicionais.
80

A adio de ciclodextrinas fase mvel, tambm promove uma melhora da separao
81, 82
e a
combinao de ciclodextrinas/esterides (principalmente os sais biliares) est sendo utilizada
em procedimentos cromatogrficos e eletroforticos para separao quiral.
83, 84,

85
Por outro
lado, mtodos cromatogrficos esto sendo utilizados para determinao das constantes de
associao e estequiometria de hormnios esteroidais com ciclodextrinas.
86- 90

Introduo

18
iii) devido s caractersticas de bioadaptabilidade, os esterides com ciclodextrinas
podem ser administrados atravs de vrias vias.
61, 91
Assim, derivados de ciclodextrinas
permitem a administrao oral de esterides
92
e promovem melhora de sua
biodisponibilidade.
93
As ciclodextrinas tambm reduzem os efeitos secundrios dos
esterides
94
e aumentam sua liberao.
95, 96, 97
No caso de nebulizadores
98
e formulaes
sublinguais
99
tem sido sugerido como alternativa de tratamento aos esterides, o uso na forma
de complexos de incluso.
iv) as ciclodextrinas podem ser utilizadas para extrao do colesterol de monocamadas
de eritrcitos humanos.
100, 101
Por outro lado, o complexo ciclodextrina-colesterol tem sido
proposto como padro primrio para a anlise qumica.
72
v) a interao esteride/ciclodextrina tem sido utilizada como modelo para os
processos de reconhecimento celular por parte das interaes esterideprotena.
24

vi) finalmente, o colato e o desoxicolato de sdio ao serem complexados por -CD,
comportam-se como hspedes monotpicos e ditpicos, respectivamente. Esta diferena
originria da distinta polaridade existente entre os sais biliares tri- e dihidroxlicas. Esta
caracterstica tem sido utilizada para demonstrar a formao de conglomerados (oligmeros e
polmeros) supramoleculares.
18-21

Por sua importncia para o presente trabalho, cabe aqui mostrar as estruturas do colato
(NaC) e desoxicolato de sdio (NaDC), as quais podero servir como modelos aos demais sais
biliares. Na Figura 1.6, observa-se o colato de sdio/-CD com estequiometria 1:1, e o
desoxicolato de sdio/-CD com 1:2.
17

Alguns dos hspedes, objetos de estudo da presente tese de doutorado (em particular,
fusidato de sdio, helvolato de potssio, CHAPS e CHAPSO, cujas propriedades esto
descritas no item 1.2), possuem dupla caracterstica. Por um lado, seu ncleo fundamental
constitudo pelo sistema estrutural tetracclico do perhidrociclopentanofenantreno, comum a
todos os esterides. Por outro, em soluo aquosa comportam-se como agentes tensoativos
(exceo ao helvolato de potssio), formando agregados conhecidos comumente por micelas.
Sendo os sais biliares, a famlia de compostos mais prxima aos sistemas estudados neste
trabalho de tese e sobre o qual existe maior informao na bibliografia cientfica a respeito de
Introduo

19
complexos de incluso em ciclodextrinas, cabe aqui apresentar uma reviso das caractersticas
fsico-qumicas destes compostos esteroidais.

Figura 1.6 - Estrutura dos complexos 1:1 NaC/-CD e 1:2 NaDC/-CD.

Os cidos biliares so produtos finais do metabolismo do colesterol e seus sais sdicos
so amplamente solveis em gua. Nos mamferos, os sais biliares possuem um hidrognio
em configurao 5, resultado da configurao cis apresentada pelos anis A e B. Os grupos
funcionais substituintes no ncleo esteroidal ficam quase que exclusivamente limitados aos
grupos hidroxilas e a um cido carboxlico terminal presente no final da cadeia lateral
isopentanica. Possuem ainda, grupos metila nas posies C-10 e C13. Do mesmo modo,
esto presentes grupos hidroxila na posio C-3 (proveniente do colesterol) e outro grupo
hidroxila em C-7. Usualmente, est presente um terceiro grupo hidroxila, podendo encontrar-
se na posio C-12 ou C-6. A partir do fgado, os cidos biliares so excretados no intestino
delgado, onde durante o processo digestivo, iro solubilizar os cidos graxos provenientes da
dieta. Os cidos biliares so praticamente reabsorvidos a partir do intestino delgado, onde

O H
CH

3(19)
OH
O H
C H 3(18)
C O O
-
C H 3( 2 1)
H3
H5
H6

OH
OH
CH
3(18)

COO
-

CH
3(21)

H3
H5
H6
H3
H5
H6

Introduo

20
atravs da circulao enteroheptica e sob ao de bactrias intestinais so biotransformados.
Exemplos tpicos dos cidos biliares so o cido clico e seu derivado 7-desoxi e o cido
desoxiclico, os quais esto presentes em muitas espcies de mamferos.
102

Os cidos biliares conjugados com os aminocidos glicina e taurina so mais solveis
ao pH do intestino delgado, resistentes precipitao por ons Ca
2+
e impermeveis
membrana. Estas propriedades permitem que os cidos biliares conjugados estejam presentes
em elevadas concentraes na secreo biliar e no trato intestinal.
Os cidos biliares so estruturas anfiflicas planas, possuindo uma parte hidrfoba
(face , sem a presena de grupos hidroxila) e parte hidrfila (face , contendo os grupos
hidroxila) (Figura 1.7).
103
Em gua se associam para formar multmeros acima de uma
concentrao denominada de concentrao micelar crtica (cmc).
104
Alguns autores
consideram que a ligao de hidrognio est envolvida na formao destes agregados
105
, as
quais segundo outros autores, so as responsveis pela estrutura helicoidal.
106
A ligao de
hidrognio tambm estaria participando da formao da estrutura cristalina dos cidos
biliares.
107, 108
Na formao destas ligaes de hidrognio participam os grupos hidroxilas
pertencentes ao esqueleto esteroidal e o grupo carboxlico da cadeia lateral. Tais grupos
podem atuar como agentes doadores e/ou receptores da ligao de hidrognio.
108

Dependendo do nmero de grupos hidroxila, os sais biliares so classificados em:
sais biliares trihidroxlicas: exemplo mais caracterstico o colato de sdio, que
apresenta seus trs grupos OH nas posies 3, 7 e 12.
sais biliares dihidroxlicas: tem-se como exemplo o desoxicolato de sdio, cujos
grupos -OH se encontram nas posies 3 e 12.
sais biliares monohidroxilados: o litocolato de sdio o mais abundante, apresentando
o grupo OH na posio 3.

So pequenas as mudanas que ocorrem nas dimenses moleculares dos diferentes sais
biliares com a presena de um, dois ou trs grupos hidroxilas, constituindo assim uma famlia
de molculas de forma e tamanho praticamente idnticas. No entanto, estas pequenas
diferenas so refletidas na polaridade da molcula e expressas pelo balano hidrfilo-lipfilo
(BHL) existente entre as faces e . Assim, a existncia de vrios grupos polares na face
Introduo

21
vai refletir numa maior diferena de polaridade com relao . Portanto, o BHL dos sais
biliares trihidroxlicos maior que o dos dihidroxlicos e estes por sua vez, maior que o dos
sais biliares monohidroxlicos. A amidao do grupo carboxlico com aminocidos como
glicina ou taurina tambm contribui com a polaridade, e assim os tauroderivados so mais
hidroflicos que os glicoderivados, os quais por sua vez so mais que os sais originais.
109

OH
OH
OH
COONa
A
B
C
D
face
face
eixo molecul ar
face regio polar
face
regi o apolar
OH
OH
OH
COONa
A
B
C
D
OH
OH
OH
COONa
A
B
C
D
face
face
OH
OH
OH
COONa
A
B
C
D
OH
OH
OH
COONa
A
B
C
D
face
face
eixo molecul ar
face regio polar
face
regi o apolar
eixo molecul ar
face regio polar
face
regi o apolar
OH
OH
OH
COONa
A
B
C
D
OH
OH
OH
COONa
A
B
C
D
OH
OH
OH
COONa
A
B
C
D

Figura 1.7 - Estrutura anfiflica dos cidos biliares.

Os sais biliares so molculas que por sua estrutura anfiflica apresentam um
comportamento de auto-associao, formando agregados em soluo aquosa. interessante
conhecer este comportamento a fim de predizer em que condies experimentais se
encontram, se sob a forma de ons livres (monmeros) ou de agregados. Este fato importante
nos processos de complexao dos sais biliares por ciclodextrinas, pois se tornam
simplificados quando predominam os monmeros em soluo. Deste modo, os sais biliares se
comportam como tensoativos, com tendncia a permanecer na superfcie do solvente
(interface gua-ar), a fim de reduzir as interaes desfavorveis existentes entre a parte
hidrofbica destas molculas e as da gua. Ao mesmo tempo, permitem que as fortes
interaes existentes entre as molculas de gua da superfcie sejam substitudas em parte, por
Introduo

22
interaes sal biliar-gua de natureza mais dbil, diminuindo assim a tenso superficial do
solvente. Esta propriedade foi utilizada nos estudos dos processos de incluso em
ciclodextrinas.
17
A formao de micelas em uma soluo de sais biliares ser espontnea
sempre que sua concentrao estiver acima de um valor mnimo de concentrao que se
denomina de cmc (concentrao micelar crtica) e a temperatura do sistema seja superior a um
determinado valor denominado de cmt (temperatura micelar crtica). Outros estudos
relacionados agregao de sais biliares esto sendo apresentados no Anexo A.

1.1.6 - Caracterizao dos complexos de incluso
No garantido, que um p obtido da mistura da ciclodextrina e algum substrato em
soluo, ou suspenso, ou como pasta, seja um verdadeiro complexo de incluso. Muitos
compostos no podem ser complexados, outros formam complexos de incluso em soluo,
mas no no estado slido. O produto slido final pode ser uma mistura de hspede e
hospedeiro, hspede no complexado e ciclodextrina hidratada.
Vrios mtodos tm sido usados para detectar a formao de complexos de incluso.
No estado slido, os compostos de incluso se comportam como espcies estveis, com
estequiometria bem definida. Nestes casos, os mtodos de deteco e caracterizao mais
comumente utilizados so a anlise trmica, difrao de raios-X, espectroscopia infra-
vermelho e ressonncia magntica nuclear.
1, 26, 31

O mtodo de anlise atravs da difrao de raios-X, pode ser empregado para a
deteco dos compostos de incluso, devido a que os padres de difrao dos complexos
obtidos so claramente diferentes dos obtidos a partir dos componentes individuais. O
emprego desta tcnica se baseia na comparao dos difratogramas das substncias puras e do
complexo.
26, 31

A calorimetria diferencial (DSC) e termogravimetria (TG) so mtodos trmicos, que
permitem observar claramente a existncia de um complexo de incluso. Quando uma
molcula se encontra dentro da cavidade da ciclodextrina, as modificaes ocasionadas pela
variao da temperatura (fuso, sublimao, degradao e inclusive mudanas de transio
Introduo

23
polimrfica), desaparecem ou no so observadas, at que se produza a degradao da
ciclodextrina (250300
o
C).
31
A espectroscopia infravermelho (IV), um mtodo indispensvel para a caracterizao
de compostos orgnicos, pois permite detectar grupos funcionais, cuja presena pode ser
difcil atravs de outros mtodos. Quando se forma o complexo, pequenos deslocamentos das
bandas das ciclodextrinas podero mascarar a do hspede, se este ltimo estiver presente em
pequenas quantidades. No entanto, se o hspede apresentar grupos funcionais caractersticos,
como no caso do grupo carbonila, a banda ser significativamente encoberta e deslocada aps
complexao por ciclodextrina.
31

A caracterizao de complexos em soluo, se baseia na investigao da interao
molecular entre a ciclodextrina e hspede, determinao da constante de estabilidade e
estequiometria do complexo. So utilizadas as determinaes relacionadas com mudanas
espectrais, como no caso da Ressonncia Magntica Nuclear (RMN), espectroscopia por
ultravioleta e fluorescncia, alm de estudos de solubilidade e mtodos cinticos.
1, 26, 31
A
espectroscopia de Ressonncia Magntica Nuclear (RMN), muito utilizada para a
caracterizao dos complexos de incluso, atravs da observao das mudanas que ocorrem
com os sinais de prton (
1
H) ou de carbono (
13
C) pertencentes na molcula da ciclodextrina
ou no hspede, ao estarem complexados.
110

As mudanas que ocorrem no espectro de UV, devido a formao do complexo, so
geralmente deslocamentos batocrmicos e/ou alargamento das bandas. O deslocamento do
mximo de absoro no UV, pelo efeito da formao do complexo pode ser explicado atravs
da proteo parcial dos eltrons excitveis e cromforos presentes na cavidade da
ciclodextrina. Quando a formao do complexo manifestada atravs de mudanas
significativas, com decrscimo da absorbncia, ao variar a concentrao de ciclodextrina e
mantendo-se constante a concentrao do hspede, pode-se determinar o valor da constante de
estabilidade com o uso da equao de Benesi-Hildebrand.
26, 110

A fluorescncia provocada pela absoro de energia radiante e reemisso de parte
desta energia sob a forma de luz. Na fluorescncia, a absoro e a emisso ocorrem dentro de
um intervalo de tempo curto, na ordem de 10
-12
a 10
-9
segundos. A fluorescncia de um
composto depende da estrutura molecular e na maioria das vezes est associada a sistemas .
Introduo

24
A adio de ciclodextrina a uma soluo aquosa, freqentemente vai resultar em uma melhora
significativa do espectro de fluorescncia. A mudana que ocorre com a adio de
ciclodextrina, semelhante observada quando o frmaco dissolvido em solventes menos
polares, tais como dioxano e etanol, sugerindo assim que este foi transferido de um ambiente
aquoso cavidade apolar da ciclodextrina. Portanto, um aumento na intensidade da
fluorescncia freqentemente observado para as molculas que so totalmente encapsuladas
dentro da cavidade da ciclodextrina.
26

As tcnicas por diagrama ou isoterma de solubilidade, mtodo cintico e RMN sero
abordados com mais detalhes no item 3.

1.1.7 - Equilbrio de formao do complexo de incluso e a constante de
estabilidade
Um complexo de incluso em soluo est sempre em equilbrio termodinmico com
seus componentes livres, de acordo com a equao 1.1,
mH +nCD CD
n
H
m
K
mn
(1.1)

onde CD =ciclodextrina, H =hspede (substrato) e CD
n
H
m
ou C
nm
=complexo de incluso.
Este equilbrio descrito quantitativamente mediante a constante de estabilidade (K
mn

ou K
c
), definida de acordo com a equao 1.2,
[ ]
[ ] [ ]
n m
m n
mn
CD H
H CD
K = (1.2)

Em solues diludas, a estequiometria 1:1 prevalece, mas tambm so observadas
estequiometrias 1:2, 2:1 ou 2:2, quando se tem concentraes mais elevadas ou hspedes
especficos. Por exemplo, pirenosulfonato de sdio forma complexos 1:1 de baixa estabilidade
na presena de -CD e 2:1 com -CD de elevada estabilidade em soluo aquosa.
26, 31

Os parmetros so significativamente afetados pelas condies experimentais tais
como diluio ou concentrao, mudanas na temperatura, pH e polaridade do solvente. Se
um terceiro componente adicionado ao sistema, vai competir pela cavidade da ciclodextrina
resultando em um decrscimo na concentrao original do complexo.
111
No caso de hspedes
Introduo

25
ionizveis, uma mudana do pH da soluo, vai deslocar o equilbrio em direo onde a forma
no ionizada predominantemente includa na cavidade. Isto devido a incluso favorvel do
hspede de natureza hidrofbica, comparado com o de natureza hidroflica. Assim,
substncias de carter cido so includas mais facilmente na cavidade da ciclodextrina em
uma regio cida, enquanto que se dissociam em uma regio alcalina. A fora inica tambm
exerce seu efeito na formao do complexo, porque o efeito hidrofbico tem um papel
importante no processo de interao.
55, 111

Considerando que a formao do complexo usualmente um processo exotrmico, a
dissociao ser facilitada pela elevao da temperatura.
111

O requisito para a complexao, que o grupo hidrofbico da molcula a ser includa
se ajuste total ou parcialmente na cavidade da ciclodextrina. No caso do complexo
prostaglandina (PG)-ciclodextrina (CD), a -CD devido a sua cavidade menor, inclui
preferencialmente a cadeia aliftica da molcula da prostaglandina, enquanto que a -CD
acomoda melhor o anel de 5 membros pertencente a estrutura. Por sua vez, a maior cavidade
da -CD, capaz de incluir a molcula da prostaglandina, de tal forma que, toda a estrutura
incorpora-se na cavidade.
111

Portanto, uma vez conhecidos os parmetros tais como constante de estabilidade,
estequiometria e parmetros termodinmicos, o comportamento do sistema
quantitativamente reproduzvel, desde que o processo de complexao envolva o equilbrio
nas mesmas condies.
55

1.2 - Substncias de interesse para estudo dos complexos de incluso

1.2.1 - Furoato de diloxanida
O furoato de diloxanida (Furamida, FD), quimicamente o 2-furoato de 4-(N-
metildicloroacetamida) de fenila (Figura 1.8). No estado slido um p branco, inodoro e
com um ponto de fuso entre 114-116
o
C. ligeiramente solvel em gua, etanol (1g/100mL)
e clorofrmio (1g/2,5 mL). fotossensvel e deve ser protegido da luz. Seu efeito adverso
Introduo

26
mais comum durante o tratamento a flatulncia, podendo ocorrer ocasionalmente vmitos,
prurido e urticria.
112, 113

um amebicida da luz intestinal com atividade principalmente no intestino delgado e
utilizado no tratamento da amebase cstica assintomtica caracterizada pela presena de E.
histoltica. Em pacientes com amebase invasiva, faz-se necessrio sua administrao
associado amebicidas tissulares tais como o metronidazol e tinidazol.
112

O
O
C
O
N
CH
3
CHCl
2
O
C

Figura 1.8 - Estrutura do furoato de diloxanida

Considerando a importncia apresentada pelo coeficiente de partio lipdeo/gua e a
unio dos frmacos aos lipdeos do sangue, Sengupta et al.

determinaram o coeficiente de
partio n-octanol/gua (logP) para o furoato de diloxanida (FD), hidrocloreto de emetina
(HE) e metronidazol (MZ) e desenvolveram um mtodo que permitiu esclarecer o mecanismo
de ao do furoato de diloxanida. Estes autores consideraram que o elevado valor do
coeficiente de partio do furoato de diloxanida limita a molcula a permanecer na luz
intestinal. Sua unio aos fosfolipdeos da membrana dos oocistos provoca a desintegrao de
sua matriz lipdica, com conseqente ruptura e morte do microorganismo.
114

O elevado valor do coeficiente de partio, assim como a pouca solubilidade em gua,
permite explicar a aplicao do furoato de diloxanida na teraputica da amebase intestinal
aguda e a limitada ao na forma crnica ou invasiva desta enfermidade.
114, 115
O frmaco
uma vez dissolvido no trato gastrointestinal, susceptvel hidrlise formando a diloxanida,
cuja efetividade menor que sua forma ster, j que possui uma lipossolubilidade moderada.
13

Nieto Reyes demonstrou em seus estudos biofarmacuticos, que o FD apresenta
melhora da velocidade de dissoluo e de solubilidade na presena de -CD em solues
contendo suco gastrointestinal simulado (pH 1,2 e 6,8). Em estudos de estabilidade in situ,
verificou que a constante de velocidade de degradao do furoato de diloxanida foi
Introduo

27
significativamente menor, demonstrando uma maior estabilidade do frmaco quando
complexado.
12
Nos estudos in vivo, foi demonstrado que com o uso do complexo de
incluso FD/-CD, ocorreu uma diminuio significativa na intensidade da infeco em ratos
neonatos com oocistos de Cryptosporidium parvum.
12, 116

Os problemas de solubilidade e instabilidade em gua apresentado pelo furoato de
diloxanida, limita a possibilidade do alcance deste no fluido intestinal, assim como uma
provvel eliminao do local onde deveria exercer seu efeito teraputico. Portanto, a -CD
estaria protegendo o composto da ao das esterases presentes na poro do trato
gastrointestinal.

1.2.2 - Fusidato de sdio
O cido fusdico (cido 3, 11- dihidroxi-16-acetoxifusida-17(20)-[16-21-cis],
24-dien-21-ico (Figura 1.9) apresenta estrutura esteroidal e pertence ao grupo de antibiticos
fusidanos.
103
Apresenta baixa solubilidade em gua, em contraste com seu sal de sdio que
bastante solvel. Relacionado estruturalmente ao cido helvlico, inibe a sntese de protenas,
tanto em clulas procariticas como em eucariticas.
117, 118

Foi isolado a partir de culturas de Fusidium coccineum e sua atividade antimicrobiana
est indicada para a maioria dos patgenos mais comuns existentes na pele, incluindo
Staphylococcus aureus, contra o qual um dos antibiticos mais potentes.
119

HO
OH
OCOMe
CO
2
-
Na
+
1
2
3
4
30
19
10
5
6
7
9
8
32
11
18
12
13
14
15
16
17
20
22
23
24
25
26
27
21
34 33

Figura 1.9 - Estrutura do fusidato de sdio

Quimicamente pertence ao grupo de triterpenos tetracclicos e como esteride da
famlia dos fusidanos, representam uma classe de compostos anfiflicos solveis, os quais
apresentam similaridade estrutural com os sais biliares.
120
Uma comparao da estrutura do
fusidato com o colato de sdio (NaC) por exemplo, mostra a semelhana estrutural, porm
Introduo

28
com uma estereoqumica diferente. A Figura 1.10 mostra a analogia existente entre o fusidato
(Fus) e o colato de sdio (NaC), em termos de frmula estrutural (a e b), modelo espacial (c e
d), e representao das molculas numa interface ar-gua ou leo-gua (e e f). H que se
destacar, que suas propriedades em soluo aquosa so comparveis aos dos sais biliares. o
caso da propriedade de solubilizao das solues de fusidato de sdio com lecitina e
monolena como micelas mistas, comparadas capacidade de solubilizao dos sais biliares
para estes mesmos lipdios.
121, 122

COO-
OCHOCH
3
H
OH
OH
OH
OH
COO-
OH
a b
e
f
c
d
COO-
OCHOCH
3
H
OH
OH
OH
OH
COO-
OH
a b
e
f
c
d

Figura 1.10 - ons fusidato e colato: a (Fus) e b (NaC), frmulas estruturais;
c (Fus) e d (NaC), modelos espaciais com posio dos grupos polares na cor
vermelha; e (Fus) e f (NaC), interface ar-gua ou leo-gua. (Carey, 1971).

Entre os efeitos do fusidato de sdio, cabe mencionar: i) potencializador de
absoro, em que o taurodihidrofusidato de sdio mostra-se eficaz e seguro na
potencializao da absoro intranasal da insulina;
123
ii) ao bacteriosttica, com atividade
dirigida aos Staphylococcus ealgumas espcies anaerbicas gram-negativas. Mostra atividade
in vitro contra Neisseria sp e Bordetella pertussis;
124
iii) dermatologia, sendo indicada
para a maioria dos patgenos mais comuns da pele, incluindo Staphylococcus aureus.
utilizado no tratamento de infeces da pele, como nos casos de impetigo, foliculite,
furunculoses e abcessos. recomendvel como alternativa de tratamento para a acne tipo
fulminans, caracterizada por leses inflamatrias e dolorosas. Seu elevado grau de
Introduo

29
penetrao similar ao dos esterides, garante uma alta concentrao do frmaco no local da
infeco;
125
iv) propriedades imunossupressoras similares s ciclosporinas, sendo de
grande utilidade em pacientes com enfermidade de Crohn , cujo tratamento convencional
no efetivo;
126
v) outras aes, como no tratamento da colite causada por Clostridium
difficili e infeces estafiloccicas em pacientes portadores de fibrose cstica.
127

Normalmente o cido fusdico bem tolerado e apresenta poucos efeitos secundrios
graves. Em estudos mais recentes com pequenos grupos de pacientes, foram verificados que
os principais estavam relacionados com transtornos do trato gastrointestinal, diarria e dor de
cabea. Casos relacionados com hepatoxicidade foram publicados a partir de 1972. Raramente
so verificados efeitos secundrios relacionados com granulocitopenia, trombocitopenia e
espasmos venosos.
14

1.2.3 - Helvolato de potssio
O cido helvlico (cido 6, 16-diacetoxifusida-1-en-3,7-diona-17(20)-[16,21-
cis],24-dien-21-ico) (Figura 1.11), apresenta uma estrutura semelhante ao cido fusdico.
Pertence tambm ao grupo dos fusidanos. Em sua forma cida ligeiramente solvel em
gua, metanol e etanol, sendo mais solvel em clorofrmio, acetato de etila, acetona e
piridina. Apresenta absoro mxima em etanol em 231nm (log = 4,24) sendo a
absortividade molar.
128
Como faz parte do grupo dos fusidanos, apresentar propriedades de
agregao similares s molculas pertencentes a este grupo como o fusidato de sdio e
tambm a dos sais biliares.
O
OCOMe
O
OCOMe
CO
2
-
K
+
1
2
3
4
30
19
10
5
6
7
9
8
32
11 18 12
13 14
15
16
17
20
22
23
24
25
26
27
21
34 33
36 35

Figura 1.11 - Estrutura do helvolato de potssio.

Introduo

30
produzido a partir do Aspergillus fumigatus e de cultivo de Cephalosporium
caerulens.
129
Okuda et al.
130
estudaram a estrutura do cido helvlico a partir de ensaios
qumicos e espectroscpicos, propondo o mesmo esqueleto que o do cido fusdico.
Produzido de forma aerbia em cultivos de Acrocylindrium oryzae,
131
foi possvel a
introduo de funes oxigenadas no esqueleto dos fusidanos.
O helvolato de potssio pertence tambm ao grupo dos triterpenos tetracclicos, o que
confere similaridade estrutural com os sais biliares, da mesma forma que o fusidato de sdio.
No caso do helvolato de potssio (Figura 1.12), no se tem tanta diferena de polaridade entre
as duas regies, devido existncia em soluo de diferentes epmeros nas posies 6 e 16, j
que os steres podem estar tanto na face como na , enquanto que os grupos cetona e cido
sempre se encontram na face da molcula.

Figura 1.12 - Modelos espaciais da molcula de helvolato de potssio com todos os grupos
polares direcionados face

Trata-se de um metablito microbiano com atividade antibitica contra as bactrias
gram-positivas, o qual inibe a sntese de protenas nas clulas procariticas.
118
Vrios
experimentos demonstraram que o cido helvlico um novo inibidor de acidificao de
lisossomas e endossomas, sendo o primeiro composto esteroideo com esta ao. Esta
atividade pode explicar sua habilidade em inibir o metabolismo do colesterol LDL oxidado
em clulas do macrfago J 774. Portanto, este cido pode ser uma ferramenta til para a busca
de mecanismos bioqumicos do colesterol e outros metabolismos celulares.
117

Estudos demonstraram os efeitos txicos apresentados pelo cido helvlico na
semeadura de gramneas com retardamento no crescimento,
15
bem como ao inibitria do
epitlio ciliar respiratrio humano.
16

Introduo

31
A aplicao do cido helvlico na rea dermatolgica foi mencionada por Freeman,
132

onde faz referncia a atividade desta substncia contra patgenos mais comuns da pele
(Staphylococcus e Bacillus anthracis). Tambm so citadas atividades nas infeces oculares
e de ouvido produzidas pelo patgeno Proteus vulgaris e nas infeces produzidas pela
Escherichia coli presentes no trato urinrio.

1.2.4 - CHAPS e CHAPSO
CHAPS (1-propanosulfonato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilamnio]) e CHAPSO
(29-hidroxi derivado) (Figura 1.13), so derivados zwiterinicos dos sais biliares. So
compostos cuja estrutura lhes confere ao detergente comparvel aos sais biliares devido a
mesma topologia hidrfoba/hidroflica. Estes surfactantes tm sido amplamente utilizados em
estudos biolgicos, como no caso da solubilizao e reconstituio de protenas em
membranas.
133- 135

CHAPS foi designado em princpios dos anos oitenta, para a purificao de protenas
de membrana.
134
Na cromatografia tem sido utilizado como agente eluente para melhorar a
seletividade ou mesmo evitar a adsoro nos materiais de coluna.
136, 137
A micelizao do
CHAPS talvez seja a caracterstica do tensoativo mais estudada, em que a cmc tem sido
avaliada atravs de diferentes tcnicas e em amplo intervalo de condies experimentais.
138-

144

OH
OH
OH
H
N N
+
SO
3
-
O
R
H
H
H
H
H
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
21
20
22
23
24
25
26
27
31
32
28
29
30

Figura 1.13 - Estrutura do CHAPS (R=H) e CHAPSO (R=OH).

Introduo

32

Estudos realizados com relao a algumas das caractersticas fisico-qumicas destas
substncias, envolvendo propriedades de adsoro e formao de micelas so de importncia
considervel quando se refere ao dos frmacos, uma vez que os requisitos estruturais para
a atividade superficial e formao de micelas so, muitas vezes, similares queles
relacionados com a interao de um determinado princpio ativo com seus stios receptores,
protenas sricas ou mesmo componentes da prpria membrana.
145

CHAPS e CHAPSO, assim como os esterides da famlia dos antibiticos fusidanos,
cidos fusdico e helvlico, representam uma classe de substncias solveis anfiflicas, os
quais so estruturalmente anlogos aos sais biliares, biodetergentes presentes nos vertebrados.
120

A similaridade estrutural destes compostos com sais biliares, sugerem um merecedor
trabalho de pesquisa como modelos para uma ao detergente, nos casos de sndrome de
deficincia de sais biliares e possvel reposio.
146- 148

2 - JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS

Considerando as justificativas apresentadas para estudo de complexos de incluso,
entre as quais:
1) Os problemas de solubilidade e instabilidade em gua apresentados pelo furoato de
diloxanida.
2) Efeitos secundrios apresentados pelo cido fusdico relacionados com transtornos
do trato gastrointestinal.
3) Efeitos txicos apresentados pelo cido helvlico no retardamento do crescimento
de gramneas, assim como ao inibitria do epitlio ciliar respiratrio humano.
4) Caractersticas estruturais apresentadas pelos quatro esterides, os quais permitem
classific-los como timos sistemas para realizao de uma anlise global dos
deslocamentos qumicos dos sinais de RMN de
1
H e
13
C.
5) Busca por novos hspedes ditpicos a fim de obter-se complexos com -CD mais
estveis que com os sais biliares.
6) Estudo de novos sistemas esterides/ciclodextrina, os quais sirvam de modelo para
a resoluo de sistemas complexos em que coexistem mais de uma estequiometria.

Conduzem aos objetivos gerais deste trabalho:
Estudar o fenmeno de incluso do furoato de diloxanida, atravs dos mtodos cintico e
de solubilidade, assim como atravs das tcnicas de Ressonncia Magntica Nuclear (
1
H e
13
C) e fluorescncia.
Estudar o fenmeno de incluso das substncias com estruturas esteroidais: fusidato de
sdio, helvolato de potssio, CHAPS e CHAPSO atravs da tcnica de Ressonncia
Magntica Nuclear (
1
H e
13
C).

Justificativas e Objetivos

34
A partir dos objetivos gerais, tem-se como objetivos especficos:
Estudar a reao de hidrlise do furoato de diloxanida (FD) em meio bsico e na presena
de -ciclodextrina (-CD) e -ciclodextrina sulfatada.
Determinar a constante de associao ou estabilidade do complexo FD/-CD atravs dos
mtodos cintico e de solubilidade.
Avaliar o fenmeno de incluso do complexo FD/-CD atravs das tcnicas de
Ressonncia Magntica Nuclear (
1
H e
13
C) e de fluorescncia.
Caracterizar as estruturas de: fusidato de sdio, helvolato de potssio, CHAPS e CHAPSO
atravs das tcnicas de RMN monodimensionais (
1
H,
13
C, DEPT) e bidimensionais
(NOESY, ROESY, COSY
1
H-
1
H e
1
H-
13
C, J -resolvida.
Determinar a estequiometria dos complexos atravs das tcnicas de RMN
monodimensionais e do mtodo das variaes contnuas ou mtodo de J ob, para os
complexos fusidato de sdio, helvolato de potssio, CHAPS e CHAPSO em - e -CD.
Determinar as constantes de estabilidade ou formao dos complexos de incluso: fusidato
de sdio, helvolato de potssio, CHAPS e CHAPSO em -CD e -CD, com os dados
obtidos a partir das tcnicas de RMN de
1
H e
13
C (mono e bidimensionais).
Elucidar a estrutura dos complexos de incluso fusidato de sdio, helvolato de potssio,
CHAPS e CHAPSO em - e -CD, atravs da tcnica de RMN bidimensional ROESY
1
H-
1
H.

3 - MTODOS E TCNICAS EXPERIMENTAIS

Entre as vrias tcnicas para determinar a constante de equilbrio de formao do
complexo, tambm denominada de constante de estabilidade, associao ou de formao, ser
dada nfase neste item, aos mtodos por diagrama ou isoterma de solubilidade, ressonncia
magntica nuclear (RMN) e mtodo cintico.

3.1 - Diagrama ou isoterma de solubilidade
A maioria dos estudos relacionados com o clculo da constante de formao, se baseia
na determinao das mudanas que ocorrem na solubilidade do substrato quando na presena
de diferentes concentraes de ciclodextrina. Mediante este procedimento, possvel
determinar a formao do complexo de incluso, tipo de complexo e calcular sua constante.
Os diagramas de solubilidade foram propostos por Higuchi e Connors.
149
construdo,
representando graficamente a solubilidade da molcula hspede (substrato), no eixo vertical,
com relao concentrao da molcula hospedeira (ciclodextrina), no eixo horizontal
(Figura 3.1).
A solubilidade total aparente do substrato hspede (S
t
) aumenta linearmente devido a
formao do complexo de incluso solvel. No entanto, no ponto A, a solubilidade do
complexo alcana seu limite. A S
t
da molcula hspede constante entre os pontos A e B, j
que os trs equilbrios apresentados no esquema 3.1, se mantm inalterados nesta regio.
Depois do ponto B, uma vez que se consumiu todo o substrato slido, com a adio de maior
quantidade de ciclodextrina, ocorre diminuio da concentrao do substrato no complexado
em soluo, por formao do complexo e precipitao concomitante de complexo insolvel.
Isto se traduz em uma diminuio da solubilidade at um valor constante que corresponde a
solubilidade inerente do complexo de incluso (S
c
).
Mtodos e Tcnicas Experimentais

36
[CD] mol /L
A
p
A
N
A
L
A
B
B
i
S
c
S
o
St
mol / L
B
S

Figura 3.1 - Tipos de diagrama de solubilidade.

Esquema 3.1 - Equilbrios slido-lquido para a formao de um complexo de incluso.

Estes autores propuseram ento, a existncia de dois tipos de perfs (diagramas do tipo
A e B), nos quais podero haver certas modificaes.
Tipo A: quando se forma um complexo de incluso solvel.
Tipo B: quando se forma um complexo com solubilidade definida.

Diagramas do tipo A: estes indicam a formao de complexos solveis a qualquer
concentrao de agente complexante, apresentando os distintos comportamentos:
1. Tipo A
L
: mostra uma dependncia linear da solubilidade total do substrato (S
t
) com a
concentrao de ciclodextrina (CD), obtendo-se assim complexos de primeira ordem
com relao a concentrao de ciclodextrina.
S +CD CD-S
(soluo)
S
(slido)
CD-S
(slido)
K
11
S +CD CD-S
(soluo)
S
(slido)
CD-S
(slido)
K
11

37
2. Tipo A
P
: apresentam um desvio positivo da linearidade a concentraes elevadas de
ciclodextrina e correspondem a formao de complexos de maior ordem molecular.
3. Tipo A
N
: se distingue atravs de um desvio negativo da linearidade a concentraes
elevadas de ciclodextrinas, um dos sistemas que menos frequentemente so
observados na prtica e sua ocorrncia pode ser explicada devido a interaes
complexas soluto-soluto e soluto-solvente.
Diagramas do tipo B: indicam a formao de complexos de incluso com
solubilidade limitada e bem definida:
1. Tipo B
S
: pode-se diferenciar nitidamente trs fases, primeiramente um aumento linear
da solubilidade, relacionado com a formao do complexo. Em uma segunda etapa, se
observa um plat, que corresponde a mxima solubilidade e finaliza quando o
substrato que se encontra no estado slido consumido. A fase descendente
corresponde a diminuio de todo substrato no complexado em soluo, por
formao de complexo de incluso insolvel.
2. Tipo B
i
: interpretado da mesma forma, com a diferena de que o complexo que se
forma to insolvel que o aumento inicial na solubilidade do substrato no
detectvel.

A partir dos diagramas de solubilidade, pode-se calcular a constante de estabilidade ou
de formao do complexo de incluso, tomando-se como critrio a etapa inicial ascendente do
grfico.
Supondo o caso mais simples e freqente, que a obteno de compostos de incluso
com uma relao molar 1:1, pode-se propor o esquema 3.1.
Considera-se S o substrato ou tambm denominado por H (hspede), CD a
ciclodextrina e CDS ou C o complexo de incluso.
Fazendo-se o balano de massas, tem-se as equaes (3.1) e (3.2);
[ ] [ ] [ ] C CD CD
o
+ = (3.1)

[ ] [ ] [ ] C S S
dis
+ = (3.2)


38
e portanto,
[ ]
[ ][ ] S CD
C
K =
11
(3.3)

Analisando o comportamento linear da[S]
dis
, com relao a variao da [CD], nos
diagramas de solubilidade, tem-se a equao (3.4);
[ ] [ ]
o dis
CD b a S + = (3.4)

onde a =S
o
e S
o
=concentrao do substrato em gua e b =inclinao da curva
Substituindo a equao (3.2) na (3.4) e considerando a =S
o
tem-se a equao (3.5):
[ ] [ ] [ ] S CD b S C
o o
+ = (3.5)

Supondo que a [S] se mantm constante, devido ao excesso de substrato no estado
slido, ento [S] =S
o
e obtm-se a equao (3.6):
[ ] [ ]
o
CD b C =

(3.6)

Substituindo (3.6), (3.1) e (3.5) em (3.3), finalmente obtm-se a equao (3.7):
) 1 (
11
b S
b
K
o

= (3.7)

S
o
representa o limite de solubilidade do substrato e a inclinao obtida da parte
linear do grfico.
No caso de que os complexos de incluso apresentam um diagrama com um perfil B
S
,
a estequiometria do complexo pode ser calculada a partir do plat, mediante a resoluo da
equao (3.8):
) (
T
S
molar Razo
B A
A
CD
S
= (3.8)

onde, S
T
corresponde ao substrato total adicionado ao sistema, S
A
a quantidade de
substrato em soluo no ponto A e CD
(A-B)
a quantidade de ciclodextrina correspondente a
regio do plat. A estequiometria assim calculada pode ser comparada e confirmada com a

39
obtida atravs de outras tcnicas, como espectroscopia UV-Vis, RMN de
1
H e
13
C e
fluorescncia.
26, 110

3.2 - Ressonncia Magntica Nuclear
A espectroscopia de RMN uma ferramenta instrumental bastante poderosa j que: i)
mediante experimentos ROE, permite a deteco das interaes espaciais existentes entre os
prtons do hspede e hospedeiro, levando determinao da estrutura do complexo formado
com suficiente preciso das regies do hspede e hospedeiro envolvidos no processo; ii)
atravs da anlise dos deslocamentos qumicos dos sinais dos espectros monodimensionais de
13
C e
1
H, permite determinar as constantes de associao e estequiometria dos complexos das
ciclodextrinas com diferentes hspedes; iii) atravs do assinalamento completo dos sinais de
1
H e
13
C das molculas hspedes, permite determinar sua estrutura. Este assinalamento foi
possvel, graas realizao dos espectros monodimensionais de
1
H,
13
C, DEPT 45, 90 e 135,
assim como espectros bidimensionais de correlaes homonucleares
1
H-
1
H COSY,
heteronucleares
1
H-
13
C e NOE. Tratando-se de experimentos de uso rotineiro e no tendo sido
realizado nenhum tratamento especfico dos dados, no sero abordados aspectos e
fundamentos tericos destes processos acima mencionados.
J no caso dos experimentos ROE, estes so considerados de relevncia na
determinao da estrutura do complexo, o que implica em uma maior reflexo destes
espectros bidimensionais.

3.2.1 - RMN na determinao da estrutura do complexo
Efeito Nuclear de Overhauser (NOE)
Baseia-se na relaxao nuclear via interao dipolar atravs do espao de espcies
homo (
1
H-
1
H) ou heteronucleares (
1
H-
13
C) na mesma ou em diferentes molculas. Vrias
interaes intra e intermoleculares so consideradas como sistemas de contribuio a estes
mecanismos de relaxao, entre as quais as dipolares. Na relaxao dipolar, o regresso ao
estado fundamental se d atravs de interaes dipolares entre ncleos que se encontram a

40
uma distncia de at 4 A
o
. Destas interaes pode-se obter concluses referentes
conformao de uma dada espcie ou entre diferentes molculas.
150,

151
Experimentos NOE
tornam-se imprprios para molculas com massas moleculares intermdias (entre 1000 e
3000). No caso dos complexos de incluso em ciclodextrinas, com massa molecular situada
na faixa de 1500-2000, recorre-se aos experimentos ROE como alternativa de elucidao
estrutural.
152

O experimento ROE permite a determinao das interaes dos hidrognios da
ciclodextrina que se encontram em direo ao interior, com os do hspede includos dentro da
cavidade. A informao obtida a partir do espectro revela qual a estrutura do complexo
formada. Na Figura 3.2, se pode observar uma seco de um espectro ROESY realizado para
o complexo cido 6-(p-toluidin) naftalen-2-sulfnico (TNS): -CD em D
2
O.
153

H-3
H-6
H-2 H-5 H-4
P-10
P-11
P-12
P-9
P-5
P-7
P-8
P-4
P-3
P-1
H-3
H-6
H-2 H-5 H-4
P-10
P-11
P-12
P-9
P-5
P-7
P-8
P-4
P-3
P-1

Figura 3.2 - Espectro ROE do complexo cido 6-(p-
toluidin) naftalen-2-sulfnico (TNS): -CD em D
2
O.

Em cada eixo representado o espectro de RMN monodimensional do complexo. A
partir da anlise das interaes intermoleculares entre os hidrognios H-3, H-5 e H-6 da -CD
com os pertencentes aos grupos toluidino e naftalensulfonato do TNS (considerando a
concentrao do complexo 2:1 desprezvel), se deduz que existem dois tipos diferentes de
complexos 1:1. Um deles formado pela incluso do grupo toluidino no interior da
ciclodextrina (interaes dos hidrognios H-3, H-5 e H-6 da -CD com os P-10 ao P-14 do
TNS), enquanto que o outro implica na complexao do grupo naftalensulfonato (interaes
dos H-3, H-5 e H-6 da -CD com os P-1 ao P-8 do TNS). Das interaes consideradas fortes

41
entre o H-3 com os hidrognios P-5 e P-7 e P-10, P-11, P-13 e P-14, possvel concluir que a
incluso em ambos os casos, ocorre atravs da face secundria da ciclodextrina. O grupo
naftalensulfonato se encontra totalmente complexado no interior da ciclodextrina (interaes
do H-6/P-1), com o grupo sulfonato estando na parte externa da cavidade, possivelmente
formando pontes de hidrognio com as hidroxilas primrias. Por outro lado, o grupo toluidino
se encontra totalmente complexado no interior da ciclodextrina (interaes fortes e mdias do
H-3 e H-5 com todos os hidrognios do anel aromtico e interao fraca do H-6 com o grupo
metila). A partir destas interaes, Alvarez Parrilla et al.,
153
propuseram a estrutura
representada na Figura 3.3 .
K
1a
K
1b
K
2a
K
2b
H6 H5 H3
H6 H5 H3
TNS
C11N
C11T
H6 H5 H3
C12
H6 H5 H3
C21
K
1a
K
1b
K
2a
K
2b
H6 H5 H3
H6 H5 H3
TNS
C11N
C11T
H6 H5 H3
C12
H6 H5 H3
C21

Figura 3.3 - Representao esquemtica da formao dos complexos 1:1 e 2:1 para o sistema
-CD: TNS, deduzido a partir do experimento ROESY.

3.2.2 - Aplicaes da Ressonncia Magntica Nuclear no estudo de Processos de
Incluso: estequiometria e constantes de associao.
Considerando o processo de formao de um complexo de incluso entre uma
molcula hspede (substrato) e n unidades de ciclodextrina;
nCD+H C
n
(3.9)
em que
n
C o complexo formado. O processo caracterizado por uma constante de equilbrio
n
K , representada pela equao (3.10):
[ ]
[ ][ ]
n
n
n
CD H
C
K = (3.10)


42
possvel encontrar uma relao entre a composio de equilbrio descrita pelas
equaes (3.9) e (3.10) e o deslocamento qumico de alguns dos ncleos atmicos da
molcula da ciclodextrina ou do hspede.
Durante o processo de complexao, os tomos situados em direo ao interior da
cavidade da ciclodextrina vo sofrer uma mudana considervel em torno de seu ambiente,
causado basicamente pela sada de molculas de gua e entrada de uma molcula de carter
apolar. O mesmo vai suceder com os ncleos da molcula hspede que vo ser includos no
interior da ciclodextrina, passando de um meio polar (soluo) para um de carter apolar
(cavidade da ciclodextrina). Portanto, os sinais de RMN tanto da ciclodextrina como da
molcula hspede, tero uma variao de deslocamento qumico, por estarem envolvidos no
processo de complexao.
154

A variao de deslocamento qumico dos diferentes ncleos nos espectros de RMN,
observada de forma distinta em funo da velocidade com que ocorre o processo de
complexao quando comparado com a escala de tempo de RMN. Assim, as possveis
situaes observadas em RMN para o processo de complexao em ciclodextrina esto
representadas na Figura 3.4:
154

(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
CD
obs
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
CD
obs
CD
obs

Figura 3.4 - Sinais observados em RMN.
(a) Sinal caracterstico de um determinado ncleo de
ciclodextrina livre.
(b) Sinal caracterstico deste mesmo ncleo
complexado.
(c) Espectro observado sob regime deintercmbio
lento.
(d) Espectro observado sob regime deintercmbio
rpido

Se o processo est sob regime de intercmbio rpido (caso d), o processo de entrada e
sada da molcula hspede bastante rpida em comparao com a escala de tempo de RMN.
Portanto, somente se detecta um nico sinal, cuja posio um ponto mdio das espcies
presentes, ciclodextrina livre e complexada.
110


43
Assim, a posio de um sinal observada experimentalmente (
obs
) ser dada pela
equao (3.11),
110

C C CD CD obs
nf f + = (3.11)

onde f
CD
e f
C
representam as fraes de ciclodextrina livre e complexada e ambos os termos
satisfazem a condio,
1 = +
C CD
nf f (3.12)

No frequente utilizar valores absolutos de deslocamento qumico (
obs
), mas a
variao observada para a posio do sinal com relao a ciclodextrina livre (
CD
). Assim,
substituindo a equao (3.12) na (3.11) e reordenando, obtm-se como resultado a equao
(3.13):

[ ]
[ ]
max max
= =
o
n
C obs
CD
C n
nf (3.13)

considerando que
CD obs obs
= (3.14)

e

CD C
=
max
(3.15)

Da equao (3.13) se pode obter informaes referentes composio de equilbrio do
sistema. Ao aumentar a frao de ciclodextrina complexada obtm-se um aumento linear no
valor do deslocamento qumico observado. Quando a ciclodextrina estiver saturada,
obs
alcana seu valor mximo (Figura 3.5).

44
0
1
obs

comple
f
obs

mx

0
1
obs

complexo
f
obs

mx

0
1
obs

obs

comple
f
comple
f
obs

obs

mx

mx

0
1
obs

obs

complexo
f
complexo
f
obs

obs

mx

mx

Figura 3.5 - Variao do deslocamento qumico de um determinado
ncleo da ciclodextrina em funo da frao complexada

Determinao da estequiometria do complexo de incluso. Mtodo de Job

O mtodo das variaes contnuas ou mtodo de J ob
17, 155, 156
vlida para qualquer
tcnica experimental em que se mede uma magnitude diretamente proporcional a
concentrao do complexo formado. Se baseia no fato de que qualquer funo que dependa
diretamente da concentrao do complexo, apresenta um mximo com relao a frao molar
de um dos componentes que formam este complexo. Da posio de seu mximo pode-se obter
o coeficiente estequiomtrico. Do ponto de vista experimental, consiste em realizar uma srie
de experimentos em que se varia a relao molar de ciclodextrina e de hspede, porm a
quantidade total de moles mantida constante (M), isto ,
[ ] [ ] M H CD
o o
= + (3.16)

A forma de satisfazer esta condio, misturando diferentes volumes de duas solues
de concentraes idnticas (uma de ciclodextrina e outra de hspede), mantendo-se constante
o volume total de amostra. recomendvel que a relao entre os moles de cada um dos
componentes varie de zero a um (0 a 1) com intervalos pequenos, onde se obter os espectros
de RMN de cada uma destas solues, identificando em cada um a posio do sinal
pertencente a um determinado ncleo da ciclodextrina ou hspede.
155

A partir da equao de equilbrio geral de formao de complexos de incluso entre m
molculas hspede e n molculas de ciclodextrina, conforme equao (1.2), onde C
n
ou C
nm

representa o complexo, e considerando que em RMN sob regime de intercmbio rpido, existe
uma relao entre o deslocamento qumico observado para um determinado ncleo e a frao

45
de ciclodextrina complexada em soluo conforme a equao (3.13), uma vez que se mantm
constante a quantidade total de ciclodextrina e hspede, multiplicam-se ambos os termos da
equao (3.13) pela relao molar (RM
CD
) ou frao molar (X
CD
) de ciclodextrina (CD)
( ( )
H CD CD CD
n n n X + = ). Desta maneira, obtm-se as equaes (3.17) e (3.18), onde so expressas
as fraes molares de ciclodextrina e hspede no mximo,

( )
[ ]
[ ] [ ] m n
n
n
m
H CD
CD
X
CD
+
=
+
=
+
=
1
1
max max
max
max
(3.17)

( )
[ ]
[ ] [ ] m n
m
n
m
n
m
H CD
H
X
H
+
=
+
=
+
=
1
max max
max
max
(3.18)

Desta forma, fica demonstrado que uma representao da funo considerada (X
CD
.
obs
) com relao a frao molar de ciclodextrina (X
CD
) ou de hspede (X
H
) apresentar um
mximo que obtido pelas expresses (3.17) ou (3.18) respectivamente, de acordo com a
Figura 3.6 e a Tabela 3.1.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
x
CD
x
H
obs
x
CD
( )
m n
n
x
max CD
+
=
( )
m n
m
x
max H
+
=
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
x
CD
x
H
obs
x
CD
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
x
CD
x
H
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
x
CD
x
H
obs
x
CD
( )
m n
n
x
max CD
+
=
( )
m n
m
x
max H
+
=
ou
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
x
CD
x
H
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
x
CD
x
H
obs
x
CD
( )
m n
n
x
max CD
+
=
( )
m n
m
x
max H
+
=
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
x
CD
x
H
obs
x
CD
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
x
CD
x
H
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
x
CD
x
H
obs
x
CD
( )
m n
n
x
max CD
+
= ( )
m n
n
x
max CD
+
=
( )
m n
m
x
max H
+
= ( )
m n
m
x
max H
+
=
ou

Figura 3.6 - Representao de J ob para um complexo 1:1 em funo da frao
molar de ciclodextrina ou de hspede.


46
Assim, a partir de uma srie de solues em que se varia a frao molar dos
componentes que formam o complexo de incluso, pode-se obter a estequiometria do mesmo.
155

Tabela 3.1 - Posio do mximo de J ob para alguns complexos de incluso.
complexo n m (X
CD
)
max
(X
H
)
max

CD
1
H
1
1 1 0,5 0,5
CD
2
H
1
2 1 0,67 0,33
CD
1
H
2
1 2 0,33 0,67
CD
2
H
2
2 2 0,5 0,5

Apesar da grande importncia na determinao da estequiometria para estudos dos
complexos de incluso, o mtodo de J ob apresenta algumas limitaes. Entre estas podem ser
citadas:
1. No se obtm valores absolutos, mas uma relao n/m. Desta forma, complexos com
estequiometria 1:1, 2:2, 3:3 (ou 1:2, 2:4, 3:6, etc) apresentam o mximo na mesma
posio.
2. Somente se estabelece a existncia de um nico tipo de complexo sem verificar a
coexistncia em soluo de outros tipos. Por exemplo, para um sistema que apresenta
estequiometria 1: 2, primeiro se formar um complexo 1:1 e posteriormente o
complexo 1: 2 e sempre existir uma frao de ambos em soluo.
3. O mtodo vai perdendo sensibilidade medida que aumenta a relao dos coeficientes
estequiomtricos, de tal forma que para relaes n:m superiores a 1:3, torna-se difcil
determinar com exatido a posio do mximo da curva.
4. Se a interao entre a ciclodextrina e a molcula hspede apresenta uma constante de
equilbrio pequena (carter fraco), a curva apresentar um mximo pouco definido.

Determinao da constante de estabilidade do complexo.
Os diferentes mtodos utilizados para a determinao da constante de estabilidade, se
baseiam na relao que existe entre a concentrao do complexo no equilbrio e a variao
observada para o deslocamento qumico dos ncleos da ciclodextrina ou do hspede.
17, 20,

21,

110, 157, 158, 159


47

Complexos de estequiometria 1:1
A equao que descreve a posio do sinal observado em RMN para um determinado
ncleo de ciclodextrina sob um regime de intercmbio rpido em uma estequiometria do tipo
1:1, cujo equilbrio descrito na equao (3.19) ,

CD+H C
(3.19)

[ ]
[ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] ( )
+ + + +

=
0 0
2
0 0 0 0
0
4
1 1
2
H CD H CD
K
H CD
K CD
mx
obs
(3.20)

Para obter o valor da constante de associao, se realiza um ajuste no linear global
em um programa Origin 6.0, considerando a concentrao do hspede e de ciclodextrina de
cada experimento como variveis independentes e os deslocamentos no espectro de
13
C-RMN
dos ncleos de cada srie (
obs)
como variveis dependentes. A equao (3.20) aplicada ao
programa Origin 6.0, somando ao segundo termo um parmetro
offset
, que leva em
considerao a determinao do valor de
CD
.

Complexos de estequiometria 1: 2
No caso de que uma molcula hspede seja complexada por duas unidades de
ciclodextrina, deve-se estabelecer dois processos de equilbrio sucessivos,
CD+H C
11
(3.21)

CD+C
11
C
12
(3.22)

e as constantes de equilbrio so fornecidas pelas expresses,
[ ]
[ ][ ] CD H
C
K
11
11
= (3.23)
[ ]
[ ][ ] CD C
C
K
11
12
12
= (3.24)

48
A ciclodextrina est presente em soluo nas trs diferentes espcies: sem complexar
(CD), complexo de estequiometria 1:1 (C
11
) e complexo de estequiometria 1:2 (C
12
). Nestas
condies e sob um regime de intercmbio rpido, a posio que apresentar o sinal de um
determinado ncleo da ciclodextrina em um espectro de RMN fornecida pela equao
(3.25);

12 12 11 11
2
C C C C CD CD obs
f f f + + = (3.25)

que pode ser transformada em,
2 max 1 max
12 11
2 + =
C C obs
f f (3.26)

onde
11
C
f e
12
C
f representam a frao de complexos 1:1 e 1:2 respectivamente e
1 max
e
2 max
,
o deslocamento mximo que corresponde a cada um dos dois tipos de complexos.
Para calcular as concentraes de equilbrio, estabelece-se em primeiro lugar os
correspondentes balanos de massa para as espcies presentes em soluo, que combinadas
com as equaes (3.23) e (3.24), obtm-se uma equao de terceiro grau que relaciona as
constantes de associao com a concentrao de ciclodextrina,

[ ] [ ] [ ] { }[ ] [ ] [ ] { }[ ] [ ] 0 1 1 2
11 11
2
12 12 11
3
12 11
= + + + +
o o o o o
CD CD CD K H K CD CD K H K K CD K K

(3.27)

Atravs de um programa matemtico realizado no Origin 6.0, possvel encontrar
uma soluo a esta equao de terceiro grau. Uma vez conhecida a concentrao de equilbrio
de ciclodextrina livre, possvel conhecer tambm a dos complexos C11 e C12 e
conseqentemente as fraes dos complexos 1:1 (
11
C
f ) e 1:2 (
12
C
f ), as quais sero utilizadas na
equao (3.26). Com os resultados dos experimentos em que se varia a concentrao de
ciclodextrina e/ou hspede, realizando-se um ajuste por mnimos quadrados no linear,
obtm-se os valores otimizados de
11
K ,
12
K ,
1 max
e
2 max
para cada um dos ncleos da
molcula de ciclodextrina.
160


49
3.3 - Mtodo cintico
Em estudos de estabilidade, onde devem ser investigados os efeitos da concentrao
de ciclodextrina na velocidade de degradao de uma determinada substncia, deve-se
procurar realizar estudos cinticos. Neste caso, a constante de estabilidade ou de formao do
complexo, poder ser determinada atravs dos efeitos de estabilizao ou desestabilizao,
exercida pela molcula de ciclodextrina sobre o substrato.
1, 2, 26, 110

A habilidade em estabilizar alguns e desestabilizar outros, tem sido explicada atravs
das diferenas ocorridas na formao da estrutura do complexo. Pode haver aumento da
velocidade de degradao do substrato, se a parte lbil da molcula se localizar prxima aos
grupos hidroxilas da molcula de ciclodextrina. Se o substrato interagir mais profundamente
dentro da cavidade, a parte lbil da molcula poder estar protegida e resultar em sua
estabilizao.
1, 2

Portanto, as ciclodextrinas podero diminuir, acelerar ou no exercer nenhum efeito
sobre a reatividade de uma determinada reao, podendo exibir um comportamento cintico
comparvel s reaes enzimticas, isto , atravs da formao complexo-substrato, inibio
competitiva, saturao e interao estereoespecfica.
1, 2, 26, 27, 61

Devido a cintica de saturao, a constante de velocidade de primeira ordem
observada para a reao (k
obs
), vai se aproximar de um valor mximo (catlise) ou mnimo
(inibio), com o aumento da concentrao de ciclodextrina.
1, 2

A constante de velocidade de primeira ordem para a degradao do substrato
(hspede) na presena de ciclodextrina (k
c
) e a constante de estabilidade ou de formao,
podem ser determinadas atravs de mtodos anlogos a anlise de Michaelis-Menten,
utilizados na cintica enzimtica.
161
Os estudos cinticos so normalmente feitos com
solues diludas, supondo-se formao de complexos 1:1. Considerando o Esquema 3.2:


50
CD +S CD-S
K
11
Produtos de decomposio
k
o
k
c
CD +S CD-S
K
11
Produtos de decomposio
k
o
k
c

Esquema 3.2 - Mecanismo cintico de hidrlise do furoato de
diloxanida na presena e ausncia de ciclodextrina (CD)

Onde: [CD.S] a concentrao do complexo 1:1 formado na reao entre
ciclodextrina (CD) e substrato (S); k
o
a constante de velocidade para a reao no catalisada;
k
c
a constante de velocidade da reao em presena de CD; K
11
a constante de estabilidade
ou formao do complexo formado entre CD e S, considerando estequiometria 1:1.
No caso da constante de equilbrio da equao (3.3), onde [CD.S] ou [C] a
concentrao do complexo 1:1 e considerando, [CD]
o
>> [S]
o
, ento [CD
o
] [CD]. O balano
de matria exige que,
[ ] [ ] [ ] C S S
o
+ = (3.28)

Isolando [S] da equao de equilbrio (3.3), tem-se:
[ ]
[ ]
[ ] CD K
C
S
11
= (3.29)

Substituindo (3.29) em (3.28) e isolando [C] obtm-se,
[ ]
[ ] [ ]
[ ] CD K
CD S K
C
o
11
11
1+
= (3.30)

A constante de velocidade de primeira ordem observada na degradao do substrato
(kobs) considerada a mdia das constantes k
o
e k
c
, onde:

[ ]
[ ] [ ] [ ] C k S k S k
dt
S d
c o o obs
o
+ = = (3.31)

51
Isolando [S] e [C] das equaes (3.28)-(3.30), e substituindo-as em (3.31) obtm-se,

[ ]
[ ] CD K
k CD K k
k
o c
obs
11
11
1+
+
= (3.32)

E finalmente, rearranjando e considerando o inverso, de acordo com o mtodo de
Lineweaver-Burk,
26
chega-se a equao (3.33):

( ) [ ]
c o c o obs o
k k CD K k k k k
+
1 1 1
11
(3.33)

Na equao (3.33), assume-se que a [CD] a concentrao total no meio reacional,
isto , a ciclodextrina livre e na forma de complexo. Para isto ser justificado, esta
concentrao deve ser ao menos dez vezes maior que a do substrato. O valor de k
o
obtido
quando nenhuma ciclodextrina est presente no meio reacional; k
obs
determinado a trs ou
quatro concentraes de ciclodextrina e os valores de k
c
e K
11
so calculados a partir da
interseo e inclinao do grfico ( )
obs o
k k / 1 versus [ ] CD / 1 , que fornece uma linha reta (se
a suposio do complexo de estequiometria 1:1 estiver correta). A baixas concentraes, a
maioria dos complexos substratociclodextrina so de estequiometria 1:1.
1, 2, 31

Alguns trabalhos sugerem o mtodo cintico como o mais aplicvel para avaliao do
valor de K
11
, quando existem problemas de instabilidade qumica por parte do substrato
(hspede) e quando o valor de K
11
no puder ser determinado de outra maneira.
1, 48, 53
No
estudo do frmaco espironolactona, antagonista da aldosterona, a degradao foi devida ao
uso da - e -CD e alguns derivados, sugerindo uma atividade cataltica das ciclodextrinas.
Neste trabalho foi estudada a complexao da espironolactona (SP) em ciclodextrinas e o
efeito do pH na reao de deacetilao catalisada por -ciclodextrina (-CD), hidroxipropil--
ciclodextrina(HP--CD), sulfobutileter--ciclodextrina (SBE--CD), -ciclodextrina (-CD) e
sulfobutileter--ciclodextrina (SBE--CD). Estes estudos foram realizados atravs de mtodos
cinticos, diagrama de solubilidade e Ressonncia Magntica Nuclear.
53
No estudo da
estabilidade qumica dos frmacos melfalano e carmustina, dois agentes antineoplsicos
bastante instveis, foi verificado uma diminuio da velocidade de hidrlise de ambos os
frmacos na presena de concentraes crescentes das ciclodextrinas estudadas. Os dois
agentes antineoplsicos, melfalano e carmustina, foram avaliados do ponto de vista de

52
estabilidade e solubilidade, com o uso de derivados de ciclodextrinas, sulfobutileter--
ciclodextrina e hidroxipropil--ciclodextrina.
48

Loftsson et al., estudaram o efeito das ciclodextrinas na solubilidade e estabilidade dos
frmacos acetato de medroxiprogesterona e megestrol em soluo aquosa. Dos resultados
cinticos obtidos a partir do estudo da reao de degradao, foi constatado que em presena
dos derivados, hidroxipropil--CD e metil -CD, estes frmacos apresentavam uma melhora
na sua estabilidade qumica.
162
Doxoribicina e daunorubicina, drogas antineoplsicas usadas na quimioterapia do
cncer, so instveis em soluo aquosa, podendo sofrer hidrlise, com perda da estabilidade
e atividade. Bekers et al., estudaram o comportamento destas substncias com relao s
ciclodextrinas -, - e -, observando que na regio cida, as velocidades de degradao de
ambas as substncias decresce na presena de -CD, enquanto que nenhum efeito foi
observado em meio cido e alcalino frente a - e -CD. Acima de pH 4, a degradao da
daunorrubicina acelerada atravs da -CD, enquanto que para a doxorrubicina este efeito
observado somente em solues fortemente alcalinas.
163
A indometacina um antiinflamatrio no-esteroidal, com ao inibitria da
biossntese da prostaglandina (inibio da ciclooxigenase), e portanto com atividade
analgsica, antipirtica e antiinflamatria. pouco solvel em gua e instvel em soluo
aquosa. Esta substncia foi estudada do ponto de vista da estabilidade, atravs do efeito da -,
- e -ciclodextrinas, assim como os derivados hidroxipropil e hidroxietil-CD. Os autores
verificaram que a velocidade de hidrlise de indometacina em soluo alcalina altamente
suprimida por - e -ciclodextrinas, enquanto que em -ciclodextrina ocorre o oposto.
50

Prostaciclina (PGI
2
) um potente agente teraputico no tratamento da trombose e
relaxamento da musculatura lisa vascular. Entretanto, este composto hidrolisado facilmente
em soluo aquosa, com perda da atividade em poucos minutos. Na presena de
ciclodextrinas, a velocidade de hidrlise da PGI
2
diminuiu na ordem de - > -> -CD. Esta
afirmao consistente com a magnitude da constante de estabilidade do complexo
determinado cineticamente, indicando que a relao entre as molculas hspede e hospedeiro
importante na mudana de velocidade.
49


53
No estudo da velocidade de hidrlise da benzocana em soluo aquosa, foi
demonstrado que este frmaco interage com a -CD para formar um complexo 1:1, levando a
uma inibio de sua velocidade quando em meio alcalino.

Similarmente, estudos da hidrlise
de procana, atropina, aspirina e fenilbutazona em soluo aquosa, mostraram uma diminuio
na velocidade na presena de -CD.
164

4 - PARTE EXPERIMENTAL

O furoato de diloxanida (FD) foi de procedncia do Lab. Knoll S.A., o cido helvlico
procedente da Sigma, fusidato de sdio do Laboratrio Leo Pharmaceutical Products e
CHAPS e CHAPSO da ICN Biomedicals Inc.
As ciclodextrinas - (doadas por Roquette, Frana) , - (Wacker, Alemanha) e -CD
sulfatada (Cerestar, USA) eram de pureza 98%, o que no exigiam nenhum processo prvio
de purificao para eliminao de impurezas. No entanto, quando necessrio, estas eram
submetidas a um processo de dupla recristalizao em gua com posterior secagem em estufa
(Gallenkamp) aumentando gradualmente a temperatura de 40-200
o
C, at peso constante. Os
pesos moleculares das ciclodextrinas para a -, - e -CD sulfatada so de 1153 g.mol
-1
, 1297
g.mol
-1
e 2563 g.mol
1
, respectivamente . O grau de substituio para a -CD sulfatada igual
a 14.

D
2
O (99%) foi fornecida por SDS, Frana. A acidez do meio foi ajustado quando
necessrio, com KOD 10
-4
M (Aldrich, 40% em D
2
O).
As medidas de RMN foram realizadas em um espectrmetro da BRKER modelo
AMX 500, pertencente ao Centro de Ressonncia Magntica Nuclear de Galcia do Campus
de Santiago de Compostela da Universidade de Santiago de Compostela (Espanha), com uma
freqncia de trabalho de 500 MHz para
1
H e 125 MHz para
13
C e um espectrmetro
BRKER modelo AC 300, pertencente ao Servio Geral de Apoio Investigao Fsico-
Qumica e Tecnologia de Alimentos do Campus de Lugo, pertencente Universidade de
Santiago de Compostela (Espanha), com uma freqncia de operao de 300 MHz para
1
H e
75 MHz para
13
C.
Para as medidas de fluorescncia foi usado um equipamento da Edimburgh
Instruments Modelo F900.
Parte Experimental

55
As medidas cinticas foram realizadas em um espectrofotmetro UV-VIS Varian
DMS-80, acoplado a um microcomputador IBM-XT.
4.1 - Mtodos de avaliao de formao do complexo furoato de
diloxanida:-CD

Diagrama de Solubilidade
Os diagramas de solubilidade foram elaborados segundo o mtodo proposto por
Higuchi e Connors.
149
Em tubos apropriados para anlise, foram adicionadas quantidades em excesso do
frmaco, correspondente 1,0 mM e solues aquosas de -CD nas concentraes entre 0,0 e
22,0 mM. As amostras foram mantidas durante um perodo de 07 (sete) dias em agitao e
temperatura de 37
o
C. Para cada uma das amostras foram feitas triplicatas. Aps este perodo,
procedeu-se a filtrao do sobrenadante, utilizando-se membranas de filtro de acetato de
celulose (Milipore), cujo dimetro do poro era de 0,45 m. Com o filtrado realizaram-se
diluies 1/10, procurando manter a temperatura constante. A concentrao de frmaco
dissolvida foi determinada por espectrofotometria UV, no mesmo comprimento de onda na
qual foi obtida a curva de calibrao.

Curva de Calibrao
Preparou-se uma soluo aquosa do furoato de diloxanida com concentrao de
6,1x10
-2
mM. Foi mantida em agitao 37
o
C por aproximadamente 24 horas. A partir desta
soluo e por diluio, foram preparadas solues cujas concentraes estavam entre 6,1 e
6,1x10
-3
mM. As absorbncias foram medidas a 260 nm, que corresponde ao comprimento de
onda mximo do furoato de diloxanida. Graficando os valores de absorbncia versus
concentrao do FD, obtm-se a curva de calibrao, sendo os parmetros; Abs=- 0,0088 +
18162 X, com um coeficiente de correlao r=0,9999.

Parte Experimental

56
Ressonncia Magntica Nuclear de
1
H e
13
C
Considerando que a solubilidade do frmaco muito baixa em gua, procurou-se
realizar medidas em misturas de solventes como gua/metanol e gua/acetonitrila em
diferentes propores (20:80, 30:70, 40:60 e 50:50).
No caso da tcnica de
1
H-RMN, prepararam-se separadamente duas solues com
misturas de solventes nas propores de 50:50 metanol/gua deuterados em iguais
concentraes, isto , 4mM de furoato de diloxanida (hspede) e 4mM de -CD. Estas foram
mantidas em banho-maria e ultrasom por aproximadamente duas horas, para completa
solubilizao.
No caso da tcnica de
13
C-RMN, prepararam-se solues de -CD 10mM em mistura
de CH
3
CN: D
2
O 40:60 e de furoato de diloxanida (FD) e -CD em iguais concentraes,
sendo de 10mM na mistura CH
3
CN: D
2
O 40:60.

Fluorescncia
Para evidenciar a formao do complexo furoato de diloxanida--CD, foram utilizados
feixes de excitao e emisso de 3,0 e 5,0 mm respectivamente, com um mximo de
excitao de 338 nm. A concentrao de furoato de diloxanida foi de 3,0 x10
-5
M (0,2% de
etanol) e a de -CD de 1,2 x10
-2
M.

Estudo cintico
As medidas cinticas foram realizadas em um espectrofotmetro UV-VIS Varian
DMS-80, acoplado a um microcomputador IBM-XT e a um banho termostatizado, calibrado a
uma temperatura de 37
o
C.
As determinaes cinticas foram realizadas em soluo aquosa (0,4% de etanol),
37
o
C, fora inica 0,5M (KCl), atravs do monitoramento da hidrlise do furoato de
diloxanida (FD) (6,66x10
-5
M) a 260 nm.
Parte Experimental

57
4.2 - Avaliao de formao dos complexos helvolato de potssio,
fusidato de sdio, CHAPS e CHAPSO em - e - CD por RMN.

Resoluo dos espectros
Foram feitos estudos de RMN monodimensionais de
13
C,
1
H, DEPT 45, 90 e 135, e
bidimensionais 2D
1
H-
1
H e
13
C-
1
H, NOESY
1
H-
1
H e ROESY
1
H-
1
H. A referncia externa
utilizada foi o tetrametilsilano (TMS).
As solues dos cidos fusdico e helvlico foram neutralizados com NaOD e KOD
respectivamente, a fim de se obter o fusidato de sdio e helvolato de potssio totalmente
ionizados e assim uma melhor solubilizao destas substncias na presena de - e -CD.
Foram preparadas solues de fusidato de sdio, helvolato de potssio, CHAPS e
CHAPSO e das ciclodextrinas (- e -CD) em uma concentrao de 10 mM em D
2
O. A
temperatura foi mantida em aproximadamente 25
o
C, o pH das solues dos compostos
CHAPS e CHAPSO em 5,0-6,0 (pH natural) e do helvolato de potssio e fusidato de sdio em
pH 7,0-8,0.

Estudos de Formao dos Complexos de Incluso
Foram preparadas solues das amostras, fusidato de sdio, helvolato de potssio,
CHAPS e CHAPSO e das ciclodextrinas (- e -CD) nas mesmas condies que foram
utilizadas para a caracterizao dos espectros.
Para determinao da estequiometria dos complexos atravs do mtodo de J ob, foram
preparadas solues diretamente em tubos de RMN, atravs da mistura de diferentes volumes,
de ciclodextrina (- ou -CD) e de hspede (fusidato de sdio, helvolato de potssio, CHAPS
ou CHAPSO), variando a relao molar (RM) de CD e hspede de idnticas concentraes
(10mM), e mantendo sempre o mesmo volume final, conforme Tabela 4.1.

Parte Experimental

58
Tabela 4.1 - Variveis Utilizadas na Preparao das Solues para o Estudo de Complexao por RMN.
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
V
H(mL)
0 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45
V
CD
(
mL
) 0,5 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05
RM
H
a
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
RM
CD
b
1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1
a
RM
H
=relao molar de hspede(H),
b
RM
CD
=relao molar de ciclodextrina(CD)

5 - RESULTADOS E DISCUSSO

Neste item so apresentados resultados referentes ao estudo do complexo de incluso
do amebicida furoato de diloxanida em presena de -CD, envolvendo estudos cinticos, de
solubilidade, tcnicas de fluorescncia e RMN de
1
H e
13
C. Tambm so apresentados estudos
cinticos referentes ao furoato de diloxanida em presena de -CD sulfatada (-CDSO
3
Na).
Constam tambm resolues dos espectros e estudos de complexao do fusidato de
sdio e helvolato de potssio, CHAPS e CHAPSO em - e -CD, atravs das tcnicas de
RMN de
1
H e
13
C mono (
1
H,
13
C, DEPT) e bidimensionais (
1
H-
1
H, correlao
1
H-
13
C,
ROESY, NOESY) e mtodo de J ob.

5.1 - Estudo do Complexo de Incluso Furoato de diloxanida: -CD.
5.1.1 - Diagrama ou Isoterma de Solubilidade
A maioria dos estudos relacionados com o clculo da constante de formao, se baseia
na determinao das mudanas de solubilidade do frmaco observadas na presena de
diferentes concentraes de ciclodextrina.
De acordo com a Tabela 5.1 e Figura 5.1, pode-se observar o diagrama de solubilidade
do furoato de diloxanida em -CD. Para as determinaes analticas se fez uso da reta de
calibrao, cujo coeficiente de absortividade molar de 18.162 serviu para a determinao das
concentraes de frmaco dissolvidas em cada um dos tubos contendo diferentes
concentraes de -CD no diagrama de solubilidade. Estas concentraes so expressas pela
solubilidade FD, M no referido diagrama. As medidas foram realizadas segundo a tcnica
de Higuchi e Connors
149
, pH 7,0, 37
o
C e agitao durante 7 dias.
O furoato de diloxanida apresentou um perfil B
s
, no qual existe um aumento linear da
solubilidade relacionada com a formao do complexo com a ciclodextrina. Em uma segunda
etapa, observou-se um plat que corresponde a mxima solubilidade e finalmente uma fase
Resultados e discusso

60
descendente que corresponde diminuio da concentrao do furoato de diloxanida livre em
soluo, por formao de complexo de incluso insolvel. Neste caso, a constante de
estabilidade obtida foi de 427,4 M
-1
(r =0,9959). Este valor foi coincidente com o obtido por
Nieto Reyes.
12

Tabela 5.1 - Dados de absorbncia e diferentes concentraes de furoato de diloxanida (FD) e de -CD para
construo do diagrama de solubilidade; T=37
o
C, pH 7,0, =260 nm.
Absorbncia
260 nm
10
4
x[FD]/M [-CD]/M
0,2411 1,327 0,0
0,4791 2,638 0,0022
0,6863 3,778 0,0044
0,8565 4,716 0,0066
1,1548 6,358 0,0088
1,1300 6,222 0,011
0,8823 4,858 0,0132
0,7368 4,057 0,0154
0,6249 3,441 0,0176
0,5749 3,165 0,0198
0,5041 2,776 0,022
0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025
0.0
1.0x10
-4
2.0x10
-4
3.0x10
-4
4.0x10
-4
5.0x10
-4
6.0x10
-4
7.0x10
-4
s
o
l
u
b
i
l
i
d
a
d
e

F
D
,

M
[-CD], M

Figura 5.1 - Diagrama de solubilidade do furoato de diloxanida em -CD com valor de K
c
=427,4 M
-1
;
S
o
=1,35x10
-4
; r=0,9959.

61

5.1.2 - Mtodo Cintico
Em estudos de estabilidade, onde devem ser investigados os efeitos da concentrao
de ciclodextrina na velocidade de degradao de uma determinada substncia, deve-se realizar
estudos cinticos. Neste caso, a constante de estabilidade ou de formao do complexo,
poder ser determinada atravs dos efeitos de estabilizao ou desestabilizao exercida pela
molcula de ciclodextrina sobre o frmaco.
1, 2, 26, 110

Figura 5.2 mostra o perfil do logaritmo da constante de velocidade de primeira ordem
(k
obs
) em funo do pH, no estudo da hidrlise do furoato de diloxanida em gua, -CD e -
CD sulfatada (-CDSO
3
Na). Dados encontram-se na Tabela 5.2. O perfil de velocidade em
funo do pH para a reao de hidrlise do furoato de diloxanida (FD) indicam
comportamentos diferenciados na ausncia e presena da -CD e -CDSO
3
Na. A reao de
hidrlise foi observada na faixa de pH bsico enquanto que abaixo de 7,0 no foi constatada
reao nas condies experimentais em estudo. Observa-se nesta regio de pH bsico, que a
-CD inibe a reao de hidrlise, enquanto que a -CDSO
3
Na acelera. A inibio de
velocidade no caso da -CD, pode ser explicada pelo fato de que esta protege o substrato do
ataque da gua durante a reao. No perfil log k
obs
versus pH so mostradas linhas paralelas
com inclinao prxima de 1,0, sugerindo assim uma catlise bsica.
Tabela 5.2 - Logartmo da constante de velocidade de primeira ordem em funo do pH para a reao de
hidrlise do furoato de diloxanida (FD) em gua, -CD e -CDSO
3
Na; [FD]=6,66x10
-5
M; =260 nm; T=37
o
C; =0,5 M (KCl)
pH log k
obs

H
2
O -CD -CDSO
3
Na.
7,0 -4,83 -- --
7,5 -- -4,74 --
8,0 -4,56 -4,52 --
8,5 -4,45 -- -4,23
9,0 -4,4 -4,44 -3,8
9,5 -4,0 -4,14 -3,3
10,0 -3,5 -4,0 -2,8
10,5 -3,0 -3,5 -2,3
11,0 -2,5 -3,0 -1,8


62
5 6 7 8 9 10 11
-6,0
-5,5
-5,0
-4,5
-4,0
-3,5
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
B-CD
sulf
GUA
B-CD
l
o
g

k
o
b
s
pH

Figura 5.2 - Logartmo da constante de velocidade de primeira ordem em funo do pH
para a hidrlise do furoato de diloxanida em gua, -CD e -CD sulfatada, 37
o
C.

Atravs do mtodo cintico, observou-se que a -CD inibiu a degradao do frmaco
furoato de diloxanida em pH bsico, sendo que a pH 10,75 ocorreu uma diminuio na
velocidade de hidrlise com o aumento da concentrao de -CD. Neste caso, observou-se
inibio da reao, com um perfil de cintica de saturao, caracterstico de reaes
enzimticas (Tabela 5.3 e Figura 5.3).
Tabela 5.3 - Constantes de velocidade de primeira ordem em funo da concentrao de -CD no estudo da
reao de hidrlise do FD em pH 10,75 e 37
o
C.
10
4
x[-CD]/M 10
4
x k
obs
/s
-1

0 17,6 (k
o
)
12,5 14,8
25,0 12,5
37,5 11,3
50,0 10,8
62,5 10,4
87,5 9,99

63
0 20 40 60 80 100
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
1
0
4

k
o
b
s
,

s
e
g
-
1
10
4
[-CD], M

concentraes crescentes de -CD para a hidrlise do furoato de diloxanida (6,66x10
-
5
M) em pH 10,75, =0,5 M (KCl), =260 nm e 37
o
C; k
o
=1,76 x 10
-3
s
-1
.

Por outro lado, quando se observa a influncia da -CDSO
3
Na na reao de hidrlise,
constata-se um efeito oposto ao da -CD, isto , ao aumentar a concentrao de -CDSO
3
Na,
ocorre aumento de velocidade de reao de hidrlise. Neste caso, os grupos sulfatos ligados
ciclodextrina devem facilitar o ataque da gua, atravs provavelmente de um mecanismo de
catlise nucleoflica (Tabela 5.4 e Figura 5.4).
Vrios mecanismos de reaes de hidrlise com diversos substratos, com
envolvimento de estruturas de complexos de incluso com a -CDSO
3
Na tem sido descritos
na literatura.
165-167
Em analogia a estes mecanismos, o Esquema 5.1 demonstra que na
presena da -CDSO
3
Na, a catlise nucleoflica pode ocorrer tanto pelos grupos sulfatos
substitudos no O-2, como pelos grupos hidroxilas secundrios auxiliados pelos sulfatos
substitudos no O-3 da ciclodextrina, e que atravs de pontes de hidrognio deixa o oxignio
O-2 mais nucleoflico. O grupo carbonila pertencente ao furoato de diloxanida est sendo
representado nas proximidades da cavidade da ciclodextrina, a fim de demonstrar a interao
dos grupos sulfatos da ciclodextrina com o carbono eletroflico. Esta proposta vlida desde
que o grau de substituio por grupos sulfatos de 14, distribudos nos oxignios 2, 3 e 6.
168,
169


64
O
O
OR
RO
ROH
2
C
0
RO
CH
2
OR
OR
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
0
0
O
2
S
O
O
-
O
O
2
H
_
O
S
O
O
3
O
HO
3
O
C
+

R=H ou SO
3
-

Esquema 5.1 - Representao do mecanismo de catlise nucleoflica envolvendo o centro reativo do furoato de
diloxanida e a -CDSO
3
Na.

Tabela 5.4 - Constantes de velocidade de primeira ordem em funo da concentrao de -CD sulfatada no
estudo da reao de hidrlise do FD em pH 10,0 e 37
o
C.

10
4
x[-CD
sulf
.]/M 10
4
x k
obs
/s
-1

0,0 3,16 (k
o
)
10,0 4,94
20,0 5,56
34,0 6,74
60,0 8,05
80,0 9,64
100,0 11,0


65
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010
0,0004
0,0006
0,0008
0,0010
0,0012
k
o
b
s
,

s

-
1
[b-CD sulf.], M

concentraes crescentes de -CD sulfatada para a hidrlise do furoato de
diloxanida (6,66x10
-5
M) em pH 10,0, =0,5 M (KCl), =260 nm e 37
o
C; k
o
=
3,16 x 10
-4
s
-1
.

Dados cinticos demonstraram que a pH 7,0, aps 07 dias e 37
o
C (iguais condies
experimentais para avaliao da constante de estabilidade do complexo pelo mtodo de
Higuchi,
149
tem-se a hidrlise do furoato de diloxanida, conforme observado na Figura 5.5.
Segundo o Esquema 5.2, a reao de hidrlise compete com a de complexao e altera
portanto a solubilidade aparente do frmaco.

FD
sol
FD
diss
+CD Complexo
K
c
hidrlise
Produtos

Esquema 5.2 - Reao de hidrlise do furoato de diloxanida (FD) versus complexao.


66
200 250 300
A
b
s
o
r
b
n
c
i
a
0
1
/nm
200 250 300
A
b
s
o
r
b
n
c
i
a
0
1
/nm

Figura 5.5 - Espectros de UV para a reao de hidrlise do furoato
de diloxanida por 7 dias, a pH 7,0 e 37
o
C.

Nos estudos de ensaio de estabilidade in vitro, Nieto Reyes demonstrou a pH 9,0 um
efeito catalisador da -CD na hidrlise do furoato de diloxanida. Por outro lado, atravs de
ensaios in situ com animais de laboratrio, foi verificado por esta mesma autora que a
constante de degradao do furoato de diloxanida que forma parte do complexo de incluso
FD/-CD significativamente menor comparado ao mesmo ensaio sem a presena da -CD.
12
Em nossos estudos, observou-se inibio da velocidade de hidrlise na regio de pH bsico
na presena de -CD, corroborando com os ensaios in situ realizados por Nieto Reyes.
Portanto, a -CD estaria protegendo o composto da ao das esterases presentes na poro do
trato gastrointestinal.
A constante de velocidade de primeira ordem para a hidrlise do furoato de diloxanida
(FD) na presena de -CD e a constante de estabilidade ou equilbrio podem ser determinadas
atravs de mtodos anlogos aos de Michaelis-Menten para a cintica enzimtica,
161
de
acordo com o apresentado no Esquema 3.2. A partir da equao 3.33 pode-se escrever a
equao 5.1, cuja aplicao demonstrada na Figura 5.6 e Tabela 5.5, j que graficando
[ ] ( )
obs o
k k CD / versus [ ] CD ,
11
K e
c
k podero ser calculados a partir dos valores da

67
interseo e coeficiente angular, se a suposio do complexo 1:1 estiver de acordo com a
formao de uma reta.
1, 2,

48

[ ]
( )
[ ]
c o c o obs o
k k
CD
K k k k k
CD
11
1
(5.1)

Foram observadas relaes lineares para a formao dos complexos FD/-CD e FD/-
CD sulfatada, confirmando a formao de complexo 1:1. O valor de
11
K foi de 517,0 e 116,8
M
-1
respectivamente para a -CD e -CD sulfatada.
O maior valor da constante para a -CD em relao a -CD sulfatada, pode ser
explicado pela maior interao da -CD com o referido frmaco, onde provavelmente neste
caso, ocorra uma maior proteo do grupo ster ao ataque da gua, constatado atravs da
inibio da reao de hidrlise.

Tabela 5.5 - Perfil [-CD]/(k
o
k
obs
) vs [-CD] para estudo da reao de hidrlise do furoato de diloxanida a pH
10,75 e 37
o
C.
10
4
x[-CD]/M [-CD]/(k
o
k
obs
)/M.s
0 --
12,5 4,46
25,0 4,90
37,5 5,95
50,0 7,35
62,5 8,68
87,5 11,5

68
0 20 40 60 80 100
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
[
-
C
D
]
/
(
k
0

-

k
o
b
s
)
10
4
[-CD], M

Figura 5.6 - Perfil de [-CD]/(k
o
- k
obs
) versus [-CD] para a hidrlise
do furoato de diloxanida (6,66x10
-5
M), pH=10,75, =0,5M (KCl),
=260nm 37
o
C.

O efeito do aumento na concentrao de sais inorgnicos poder ocasionar tanto
aumento quanto diminuio da constante de estabilidade na formao do complexo.
26
A fim
de avaliar a influncia da fora inica (0,5M de KCl) no processo de formao do complexo
FD/-CD, realizou-se o estudo de complexao na ausncia de KCl, mantendo-se as mesmas
condies experimentais utilizadas em presena de KCl. Os estudos demonstraram ento que
o valor da constante de formao do complexo FD/-CD na ausncia de KCl foi de 509,0 M
-1

(r=0,9861).
No estudo do efeito da fora inica na velocidade de degradao do agente
antineoplsico doxorrubicina, Brewster et al. verificaram que o aumento na velocidade estava
relacionado com a formao de um estado de transio polar.
51
Hirayama e Uekama
170
verificaram um aumento da velocidade com adio de certos ctions e nions, no estudo da
catlise de incluso de ciclodextrinas na isomerizao da prostaglandina A
1
. No caso de
sistemas tais como KI, KClO
3
e KBrO
3
, a velocidade de isomerizao foi significativamente
diminuda, indicando uma competio entre os sais e a molcula hspede pela incluso na
ciclodextrina.
A diferena no valor obtido para a constante de equilbrio atravs do mtodo cintico
comparado ao de solubilidade, pode ser explicado considerando que no perodo de 07 dias,
que foi o tempo utilizado neste ltimo mtodo, parte do furoato de diloxanida pode ter sido

69
hidrolisado, levando a considerveis erros na determinao da constante de formao do
complexo. Os produtos de hidrlise do furoato de diloxanida, cido furico e diloxanida,
podem competir com o furoato de diloxanida pela complexao com a -CD. Desta forma
diminui a solubilidade aparente do furoato de diloxanida e o valor da constante de formao
do complexo ser menor quando determinado pelo mtodo de solubilidade.
Este fato tambm foi observado na determinao da constante de formao do
complexo do frmaco antineoplsico melfalano com sulfobutil ter--CD ([SBE]7m--CD) e
hidroxipropil--CD (HP--CD). Aps 24 horas, houve a formao de dois produtos de
degradao, hidroximelfalano e dihidroximelfalano, os quais competiam pela complexao
com as ciclodextrinas, diminuindo a solubilidade aparente do melfalano.
48


70
5.1.3 - Fluorescncia
A adio de ciclodextrina a uma soluo aquosa, normalmente resulta em melhora
significativa no espectro de fluorescncia. A mudana semelhante quela observada para
compostos dissolvidos em solventes menos polares, tais como dioxano e etanol, sugerindo
assim que o composto foi transferido de um ambiente aquoso cavidade apolar da
ciclodextrina.
26
O aumento da intensidade de fluorescncia produzida pelo processo de
complexao em ciclodextrina, foi avaliado tambm qualitativamente no trabalho
desenvolvido por Ma et al.
48
com os agentes antineoplsicos melfalano e carmustina.
Porm, neste trabalho no foram observadas diferenas significativas nos espectros de
excitao e emisso do furoato de diloxanida na presena e ausncia da -CD nas condies
experimentais testadas. Postula-se que esta pequena diferena se deve baixa solubilidade em
gua e pouca fluorescncia do furoato de diloxanida (Figura 5.7).
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
FD semCD
FD comCD
i
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e

f
l
u
o
r
e
s
c
n
c
i
a

(
u
.
a
.
)
250 300 350 400 450 500
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
emissao
excitaao
/ nm

Figura 5.7 - Espectros de Fluorescncia do furoato de diloxanida (3,0x10
-5
M e 0,2%
de etanol) e -CD (1,2x10
-2
M);
Ex
=338 nm.


71
5.1.4 - Ressonncia Magntica Nuclear
A espectroscopia de Ressonncia Magntica Nuclear (RMN), tambm tem sido muito
utilizada para a caracterizao dos complexos de incluso, atravs da observao das
mudanas que ocorrem com os sinais de hidrognio (
1
H) ou de carbono (
13
C) da molcula da
ciclodextrina ou hspede, ao estarem complexados.
110
Vrios trabalhos
17, 20, 21, 171, 172

reportaram o uso desta tcnica,

pois trata-se de uma ferramenta til nos estudos de formao
de complexos de incluso. Este processo vai sempre ocorrer quando existir compatibilidade
geomtrica e de polaridade entre a ciclodextrina e a molcula hspede.
26

Atravs de experimentos preliminares (Figuras 5.8 e 5.9) e pelas estimativas tericas
de deslocamento de
1
H e
13
C (Programa ChemOffice 6,0), pode-se situar os hidrognios e
carbonos pertencentes molcula de furoato de diloxanida dentro do intervalo de
respectivamente de 2,5 a 8,0 ppm e de 30,0 a 155,0 ppm. No espectro de
1
H (Figura 5.8),
observam-se somente 6 (seis) sinais dentro do intervalo de de 6,2 a 8,0 ppm, com
possibilidade de sobreposio do singlete (b) com o metanol utilizado como solvente. Os
sinais correspondentes -CD somente so observados no espectro de
1
H no intervalo de 3,0
e 5,0 ppm (Figura 5.10). No espectro de
13
C (Figura 5.9), onde deveriam ser observados 12
(doze) sinais, apenas 7 (sete) so mostrados dentro do intervalo de de 40,0 a 132,0 ppm,
estando os C2, C7, C8 e C12 deslocados do intervalo de deslocamento de
13
C observado neste
espectro. Tambm so mostrados os sinais correspondentes molcula de -CD dentro do
intervalo de de 63,0 a 105,0 ppm.
Com a tcnica de Ressonncia Magntica Nuclear de
1
H (Figura 5.10) e
13
C (Figura
5.11), agora com variaes nas propores de furoato de diloxanida e de -CD, no foram
observadas mudanas significativas nos deslocamentos qumicos e isto provavelmente se deve
baixa solubilidade do frmaco em gua e a mistura de solventes utilizadas (gua-metanol e
gua-acetonitrila) proporcionar um ambiente mais hidrofbico que desfavorece a
complexao. Portanto, esta tcnica no foi suficientemente sensvel para detectar a
complexao nas condies experimentais testadas.


72

1.
00
26
0.
68
17
1.
62
10
2.
12
08
1.
05
12
0.
87
32
Int
eg
ral
(ppm)
3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0
b
a
h
c / f
d / e
g i
H
2
O MetOH

O
O
N
O
Cl
Cl
O
a
b
c
d
e
f
g
h
i

1
H do furoato de diloxanida e -CD (4mM) em metanol/gua,
300MHz.

13
1.
77
63
12
6.
70
14
12
3.
89
10
12
1.
80
84
11
5.
90
46
10
5.
08
75
84
.2
42
0
76
.2
96
1
75
.1
63
8
74
.9
01
0
67
.2
68
4
63
.1
84
2
41
.5
50
2
3.
92
31
(ppm)
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130
3
1
10 /11
9 / 4
1 CD
4 CD
6 CD
2, 3 e 5 CD
Anel benznico
solvente
solvente

O
O
N
O
Cl
Cl
O 1
2
3
4
5
6
7
6' 5'
8
9
10 11
12

13
C do furoato de diloxanida e -CD (10mM) em
acetonitrila/gua, 75MHz.


73
Aumento da
proporo de
furoato
Aumento da
concentrao
de
ciclodextrina
Furoato
-CD
MeOH
Furoato Ci clodextrina
d d
1
i l d i ( ) f ( )

1
H, furoato de diloxanida (4mM) e -ciclodextrina (4mM) em
propores 10:0, 8:2, 6:4, 4:6 e 2:8 em sistema CD
3
OD/D
2
O (50:50), 300MHz.


74
F
F
F F F
C
C
C
C
C
C
S
-CD pura
-CD +Furoato

F F
F F F
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
S
S
Furoato de diloxanida: F
-CD: C
solvente: S

13
C de -CD/FD (10mM) em sistema CD
3
CN/D
2
O
(40:60), 75MHz.

5.2 - Resoluo dos espectros por RMN de
1
H e
13
C

Com o auxlio de programas computacionais Brcker WINNMR 1D e 2D,
ChemOffice 6.0 e modelos espaciais, procedeu-se ao assinalamento dos sinais de RMN de
1
H
e de
13
C, de acordo com a Figura 5.12.

75
Atravs do programa computacional Brcker WINNMR 2D, foi possvel realizar o
assinalamento dos sinais de
1
H e
13
C, porm as representaes nos espectros bidimensionais
so apenas ilustrativas e no possibilitam a identificao dos sinais neste trabalho de tese.

Atribuio total
1
H,
13
C
NOESY
ROESY
13
C-
1
H COSY
1
H atribuio
parcial
DEPT
J- resolvida
l id
13
C atribuio
parcial
1D-
13
C 1D-
1
H
1
H-
1
H COSY

Figura 5.12 - Procedimento relativo ao assinalamento completo dos espectros de
RMN.

5.2.1 - Helvolato de potssio
De acordo com Iwasaki et al.,
173
a estrutura do cido helvlico apresenta dois grupos
cetona nos C3 e C7, trs duplas ligaes entre C1-C2, C17-C20 e C24-C25, dois grupos
acetatos nos C6 e C16 e um carboxilato no C20. H oito grupos metila (C18, C19, C26, C27,
C30, C32, C34 e C36), cinco metilenos (C11, C12, C15, C22 e C23), nove metnicos (C1, C2,
C4, C5, C6, C9, C13, C16 e C24) e onze carbonos quaternrios (C3, C7, C8, C10, C14, C17,
C20, C21, C25, C33 e C35). Os grupos acetatos em C6 e C16 so vicinais aos grupos cetona
(C7) e vinlico (C17-C20), respectivamente. Portanto, estes dois tomos de carbono podem
facilmente mudar suas configuraes e originar uma mistura de quatro diastereoismeros em
soluo. O smbolo // indica os sinais pertencentes aos diastereoismeros relacionados.


76
Espectro monodimensional de
13
C e DEPT
Nos espectros DEPT (Figura 5.13) so observados diferentes tomos de carbono,
permitindo identificar no espectro de
13
C alguns dos carbonos quaternrios, tercirios,
secundrios e primrios. Pode-se localizar os carbonos C7 e C3 correspondentes aos grupos
cetona, na regio do espectro mais deslocados esquerda, entre 210-220 ppm. O C21
correspondente ao grupo carboxilato em torno de 180-185 ppm e os quaternrios
pertencentes aos grupos acetato C6 e C16, com valores de entre 170-175 ppm.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
(ppm)
p
(a)
(d)
(c)
(b)
4 3
3
1
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
(ppm)
p
(a)
(d)
(c)
(b)
4 3
3
1
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
(ppm)
p
(a)
(d)
(c)
(b)
4 3
3
1

Figura 5.13 -Espectros monodimensionais do helvolato de potssio 10mM: (a)
13
C; (b)
DEPT 135; (c) DEPT 45; (d) DEPT 90; solues em D
2
O, 125 MHz.

Espectro Monodimensional de
1
H
Pelas estimativas tericas de deslocamento de
1
H realizadas em um programa
ChemOffice 6.0, pode-se situar a posio de alguns hidrognios, como observado na Figura
5.14. Os H(1) e H(2) com de 6,57 e 6,07 ppm, esto em campo baixo. Depois localizam-se
os H(24), H(6) e H(16), cujos valores tericos de deslocamento de
1
H so 5,20, 4,68 e 4,64
ppm respectivamente. Pela integrao observa-se que a estes sinais lhes confere, da esquerda
para a direita, os valores de integrao de 1,0 ( 7,46 ppm), 1,0 ( 5,71 ppm), 1,0 ( 5,42
ppm), 1,0 ( 5,07 ppm) e dois sinais a 4,95 e 3,86 ppm, cuja soma das integraes igual a

77
1,0. Os dados obtidos a partir do Programa ChemOffice 6.0 servem de base na estimativa dos
deslocamentos qumicos dos sinais, devendo levar-se em considerao suas limitaes. Ao
analisar a estrutura da molcula de helvolato de potssio, verifica-se que ocorrem diferenas
no nmero de sinais quando so comparados dados tericos e experimentais, devendo-se neste
caso existncia dos carbonos quirais C6 e C16 e diferentes diastereoismeros em soluo.

1
.
0
8
8
3
0
.
8
7
5
5
0
.
9
7
4
8
0
.
9
4
2
4
0
.
3
7
8
4
0
.
5
5
3
5
1
.
0
4
1
3
3
.
7
1
2
5
1
.
4
7
7
4
1
0
.
0
1
5
9
.
8
2
3
5
3
.
0
0
7
6
6
.
9
4
7
0
3
.
0
0
0
0
I
n
t
e
g
r
a
l
(ppm)
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5
16, 24, 6
H
2
O
1, 2
COO
-
H
H
H
OCOCH 3
1
2
3
4
5
6
9
8
7
10
11
12
13
14
15
16
17
19
18
32
30
33
34
20 21
22
23
24
25
26
27
O
OCOCH 3
O
35
36
1
.
0
8
8
3
0
.
8
7
5
5
0
.
9
7
4
8
0
.
9
4
2
4
0
.
3
7
8
4
0
.
5
5
3
5
1
.
0
4
1
3
3
.
7
1
2
5
1
.
4
7
7
4
1
0
.
0
1
5
9
.
8
2
3
5
3
.
0
0
7
6
6
.
9
4
7
0
3
.
0
0
0
0
I
n
t
e
g
r
a
l
(ppm)
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5
16, 24, 6
H
2
O
1, 2
1
.
0
8
8
3
0
.
8
7
5
5
0
.
9
7
4
8
0
.
9
4
2
4
0
.
3
7
8
4
0
.
5
5
3
5
1
.
0
4
1
3
3
.
7
1
2
5
1
.
4
7
7
4
1
0
.
0
1
5
9
.
8
2
3
5
3
.
0
0
7
6
6
.
9
4
7
0
3
.
0
0
0
0
I
n
t
e
g
r
a
l
(ppm)
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5
16, 24, 6
H
2
O
1, 2
16, 24, 6
H
2
O
1, 2
COO
-
H
H
H
OCOCH 3
1
2
3
4
5
6
9
8
7
10
11
12
13
14
15
16
17
19
18
32
30
33
34
20 21
22
23
24
25
26
27
O
OCOCH 3
O
35
36

1
H-RMN do helvolato de potssio 10mM em D
2
O, 500MHz.

Espectro Bidimensional de
1
H-
1
H COSY
Para proceder com o assinalamento, a molcula dividida em cinco fragmentos, os
quais so separados atravs dos tomos de carbono quaternrio C3, C7, C10, C14, C17, C20 e
C25. O primeiro fragmento constitudo por uma ligao dupla entre C1-C2 e os hidrognios
envolvidos devem aparecer a campo baixo com um nico sinal relacionando-os entre si.
Somente os sinais em 7,465 e 5,706 ppm no espectro
1
H-
1
H COSY obedecem esta condio
e portanto devem corresponder aos H(1) e H(2), respectivamente. Tal fato corrobora com a
localizao do H(1) mais esquerda e H(2) direita e, com uma significativa diferena de
deslocamento qumico devido proximidade do H(2) com a carbonila e possibilidade de
conjugao desta com a dupla , - insaturada.


78
O segundo fragmento constitudo pelos C4-C6 e C30. O grupo metila C(30)H
3
apresenta interao a trs ligaes com o H(4), com dois sinais idnticos a 2,908//2,838 ppm
e integrando por 1,0. Os dois sinais correspondentes ao H(4)

a 2,908// 2,838 ppm levam a
dois sinais H(5)

a 2,348// 2,187 ppm, os quais integram por 1,0 e interagem entre si (2,187
com 2,908 e 2,348 com 2,838). Cada H(5) correlaciona com um dos dois sinais
correspondentes ao H(6) a 4,958// 3,860 ppm, cujos sinais tambm integram por 1,0. O
maior nmero de sinais que o esperado na molcula do helvolato, corroboram com a
existncia de diastereoismeros em soluo. Observa-se que quanto mais prximo do tomo
de carbono quiral C6, maior a diferena entre os dois valores de deslocamento dos
diastereoismeros relacionados, observados nos dois H(4) e H(5), cuja representao se faz
atravs do smbolo //. Este acrscimo entre os dois valores de pode ser atribuda
diferena de ambiente eletrnico.
Na faixa de 37 ppm, somente dois sinais permanecem sem identificao. Eles
devem corresponder aos prtons vinlicos H(24) e aos H(16) vizinhos a dupla ligao C17-
C20. H(24) apresenta acoplamento a quatro ligaes com as metilas em C26 e C27, como o
que demonstrado no espectro
1
H-
1
H COSY com os sinais em 1,462 e 1,523 ppm
respectivamente. O assinalamento foi feito a partir do experimento Roesy, no qual evidencia
interaes entre H(24) e H(27). Assim o sinal em 5,073 ppm corresponde ao H(24) e em
5,416 ppm ao H(16). Espera-se para o H(16) interaes com os H(15),

uma vez que esto a
trsligaes. Embora somente dois sinais deveriam ser esperados, o espectro bidimensional
claramente mostra na direo do H(16) trs interaes em distintos locais, localizando os
H(15) a 1,559 e 1,486 ppm e outro sinal mais amplo, cujo centro localiza o outro H(15) a
2,069 ppm. Isto sugere a existncia de diastereoismeros em soluo devido mudana de
configurao no C16 e neste caso se esperaria quatro sinais. No entanto, a vizinhana do
H(16), seja qual for sua orientao, no suficientemente diferente para que os sinais estejam
separados e assim menos sinais que o previsto so observados ( 2,069 e 1,486//1,559 ppm, os
quais correspondem aos H15 e 15, respectivamente). O grupo metila C(18)H
3
tambm
afetado pela mudana na configurao do C16 e os dois sinais com soma das integraes igual
a 3,0 em 0,752// 0,698 ppm concordam com este fato. A existncia de duas interaes
H(15)-H(15) observadas no espectro
1
H-
1
H-COSY tambm confirma a presena de dois C16
diastereoismeros.

79
A identificao dos H(23) em 1,840 e 1,901//1,921 ppm e dos H(22) em 2,046 e
2,405 ppm feita diretamente, uma vez que o H(24) j foi assinalado.
O ponto de partida do quinto fragmento se localiza na metila C(18)H
3
, a qual permite
o assinalamento do H(13) em 2,444//2,459 ppm atravs de interao a quatro ligaes. Este
assinalamento permite identificar os H(12) em 1,582 e 2,169//2,186 ppm, H(11) em
1,416//1,456 e 1,778//1,807 ppm e H(9) em 2,459//2,502 ppm. Observa-se que as mudanas
na configurao nos C6 e C16 afetam claramente o ambiente eletrnico destes hidrognios,
porm com menos intensidade nos H(12).
A Figura 5.15 mostra interaes referentes aos fragmentos envolvendo C1-C2 na cor
verde, C4-C6, C4-C30 na cor laranja e C24-23, C24-26 e 27 na cor azul. A Figura 5.16
mostra interaes referentes ao quinto fragmento na colorao laranja, da metila C(18)H
3

localizada em 0,752 e 0,698 ppm com os H(13), levando por sua vez aos H(12), H(11) e
finalmente ao H(9). Observa-se tambm interao da metila C(18)H
3
com os H(15) j
identificados.
Figura 5.15-Espectro de 1H-1H COSY do helvolato de potssio 10mM em D2O.

80

Figura 5.16 -Espectro parcial de
1
H-
1
2
O.

Espectro bidimensional de correlao de deslocamentos heteronucleares
13
C-
1
H
(HMQC)
No espectro de correlao
1
H-
13
C, possvel identificar facilmente os grupos metila,
os quais aparecem na tonalidade laranja na Figura 5.17. Esto sendo representados tambm
alguns dos carbonos secundrios na colorao azul tais como os C22, C23, C12 e C11.
Observa-se que em ambos os espectros de
1
H e
13
C existem mais sinais correspondentes aos
grupos CH
3
que na estrutura da molcula de helvolato. Alm disso, alguns dos sinais no
integram por trs. Portanto, conclui-se que a amostra encontra-se contaminada por alguma
impureza ou trata-se de uma mistura de diferentes diastereoismeros de helvolato. Neste caso,
o somatrio das reas correspondendo ao mesmo grupo metila de diferentes diastereoismeros
deveria integrar por trs como sendo a mesma rea do sinal proporcional a concentrao do
diastereoismero. Exemplos so os sinais a 0,752 e 0,698 ppm referente a C(18)H
3
,
confirmando a segunda possibilidade.
Devido a existncia de quatro diastereoismeros, os dois grupos metila C(34)H
3
e
C(36)H
3
, vo produzir quatro sinais na faixa de 1,72-1,99 ppm no espectro de RMN-
1
H, os
quais estaro integrando por 6,0.

81

Figura 5.17 -Espectro de correlao
1
H-
13
C do Helvolato de potssio 10mM em D
2
O.

Espectro Bidimensional ROESY
A partir do experimento ROE possvel obter informaes quanto a orientao do
hidrognio ( ou ) atravs das interaes espaciais e interaes intranucleares como as que
ocorrem com o H(4) e a metila C(19)H
3
em 1,307//1,301 ppm, metila C(19)H
3
com o
hidrognio em 7,465 ppm, confirmando o sinal correspondente ao H(1), assim como a
metila C(34)H
3
em 1,849//1,992 ppm com os H(23) e H(15).
De acordo com modelos espaciais e com base no programa computacional Brcker
WINNMR 2D, so verificadas algumas interaes intramoleculares conforme Figura 5.18, em
que exemplifica interao da metila C(30)H
3
(posio ), com um dos epmeros H(6) que se
encontra do mesmo lado e do mesmo modo, interao do H(6) com o H(5), confirmando a
posio deste ltimo na face da molcula (representao em cor laranja). Portanto, o
espectro Roesy corrobora com a observao j verificada no
1
H-
1
H Cosy para ambos
epmeros H(6) nas posies e . Pode-se tambm diferenciar as metilas C(26)H
3
e C(27)H
3

atravs da interao 27-24, posicionando a metila C(27)H
3
do mesmo lado do H(24), sendo
representado em cor verde.

82
(ppm)
7.00 6.00 5.00 4.00 3.00 2.00 1.00
7.00
6.00
5.00
4.00
3.00
2.00
1.00
(ppm)
30-
6-
5-
6-
24
27
26
(ppm)
7.00 6.00 5.00 4.00 3.00 2.00 1.00
7.00
6.00
5.00
4.00
3.00
2.00
1.00
(ppm)
30-
6-
5-
6-
24
27
26

Figura 5.18 -Espectro ROESY do complexo helvolato de potssio- -CD
10mM, em D
2
O, 500MHz.

Os assinalamentos dos carbonos quaternrios foram obtidos a partir dos valores
tericos de deslocamento qumico. Tabela 5.6 resume o assinalamento total da molcula do
helvolato de potssio, com de hidrognios e carbonos de molculas diastereoismeras, as
quais so representadas atravs de dupla barra (//).

83

Tabela 5.6 -Deslocamentos qumicos dos espectros de
1
H e
13
C do helvolato de potssio 10mM em D
2
O, pH
7,5.
Posio -
1
H (ppm) -
13
C (ppm)
1 7,465 165,9
2 5,706 129,3
3 - 210,7 // 210,0
4 2,908 // 2,838 43,1 // 42,9
5 2,348 // 2,187 49,3 // 48,6
6
6
4,958 //
3,860
77,4 //
76,2
7 - 220,7 // 216,3
8 - 56,2
9 2,502 // 2,459 44,5
10 - 41,2
11
11
1,807 // 1,778
1,456 // 1,416
26,5 // 26,3
12
12
2,169 // 2,186
1,582
28,6
13 2,444//2,459 50,5
14 - 55,8
15
15
1,559 // 1,486
2,069
43,6 // 43,4
16
16
5,416

77,3 // 76,2

17 - 140,8
18 0,752 // 0,698 20,5 // 20,4
19 1,307//1,301 29,8
20 - 138,0
21 - 182,3
22
22
2,405
2,046
31,8

23
23
1,921 // 1,901
1,840
30,3
24 5,073 126,8
25 - 136,7
26 1,462 20,0
27 1,523 27,9
30 1,007 14,9 // 14,5
32 0,961 20,9
33 - 175,8
34 1,992 // 1,849 23,2
35 - 177,6
36 1,836 // 1,723 23,5

O assinalamento total da molcula de helvolato de potssio atravs da espectroscopia
de RMN, confirma a estrutura proposta por Iwasaki et al.
173
Em artigos anteriores,
174, 175
os
autores propuseram uma mudana nos deslocamentos qumicos dos grupos cetona e ster, os
quais estariam localizados em C6 e C7, respectivamente. Se isto ocorresse, H(4) deveria
somente interagir com H(5) e H(30) e o hidrognio em C7 estaria rodeado por tomos de
carbono quaternrio.

84

5.2.2 - Fusidato de sdio
Os espectros do fusidato de sdio foram assinalados por Barber et al.
176
Realizou-se
nova resoluo dos espectros da molcula de fusidato de sdio, utilizando D
2
O como solvente
e pH em torno de 7,0-8,0. O assinalamento dos sinais no presente trabalho leva a uma
coincidncia quase completa dos deslocamentos qumicos () observados tanto de
1
H como de
13
C com exceo dos H(6) e H(7), intercambiados entre si. Pequenas variaes nos valores
de comparados ao trabalho desenvolvido por Barber et al., deve-se provavelmente
diferena nos pHs em ambos os trabalhos, cujos valores usados foram de 9,3 (
1
H e
13
C) e
7,1 (
1
H e
1
H-
1
H).

13
C e DEPT
O experimento monodimensional desacoplado de
13
C (BB), unido aos DEPT 135,
DEPT 90 e DEPT 45 (Figura 5.19), permite diferenciar entre carbonos primrios, secundrios,
tercirios e quaternrios.
Tendo em vista os deslocamentos qumicos tericos de
13
C, pode-se assinalar alguns
dos carbonos, como os 21 e 33, carbonos quaternrios correspondentes aos grupos cido e
ster respectivamente, onde aparecem na regio do espectro com deslocamentos entre 175-
180 ppm, devendo ser o do grupo cido, aquele que aparece a maiores deslocamentos.
Tambm h outro bem definido que o 24, localizando-se a maiores deslocamentos entre os
tercirios, j que est unido a uma dupla ligao com em 125ppm.

1
H
No espectro monodimensional de
1
H (Figura 5.20), pode-se assinalar alguns
hidrognios atravs da forma, integrao e deslocamentos qumicos dos sinais. Por exemplo,
os correspondentes aos grupos metila que aparecem como singletes e integram por trs. o
caso do 34 aparecendo a deslocamentos mais altos ( 1,861 ppm) e 26 e 27 prximos a uma

85
dupla ligao e tambm a deslocamentos altos ( 1,40-1,60 ppm). A metila 30 seria o dublete
devido proximidade do H(4), localizando-se a menores valores de deslocamento ( 0.702
ppm). Igualmente estaro bem diferenciados os H(24) e H(16), situando-se em valores de
maiores que o resto dos hidrognios no intervalo entre 5,0 e 5,5 ppm, devido proximidade
de uma dupla ligao e grupo ster, respectivamente. Os H(3) e H(11), por suas proximidades
a grupos hidroxilas, vo estar localizados entre os H(24) e H(16) e os anteriores (entre 3,5 e
4,5 ppm).
21 33 24
13
C
Dept 135
Dept 90
Dept 45

Figura 5.19 - Espectros monodimensionais do fusidato de sdio 10mM: (a)
13
C; (b) DEPT 135; (c)
DEPT 90; (d) DEPT 45, emD
2
O, 125 MHz.


86
COO
-
OH
H
OH
H
H
OCOCH3
1
2
3
4
5
6
9
8
7
10
11
12
13
14
15
16
17
19
18
32
30
33
34
20 21
22
23
24
25
26
27
A B
C D

1
H-RMN do fusidato de sdio 10mM, em D
2
O, 500 MHz.

Espectro bidimensional
1
H-
1
H COSY
Mediante o espectro bidimensional de
1
H-
1
H COSY (Figuras 5.21 e 5.22), pode-se
avaliar as relaes que se estabelecem entre os diferentes hidrognios, observando-se os
acoplamentos que se estabelecem com seus vizinhos, sendo geminais ou vicinais e em certos
casos, acoplamentos a longa distncia.
Para efeito de estudo, a estrutura da molcula pode ser dividida em quatro
fragmentos, os quais so separados por tomos de carbono quaternrio C8, C10, C14, C17 e
C20.

87

1
H-
1
H COSY do fusidato de sdio 10mM, em D
2
O.

Partindo-se do H(30) em 0,702 ppm (Figura 5.21), cujo sinal j havia sido assinalado
atravs do espectro monodimensional, pode-se observar somente uma interao com outro
hidrognio, indicando o H(4) como vizinho em posio axial em 1,439 ppm. Este por sua
vez, apresenta interao com o H(3) ( 3,602 ppm) e H(5) ( 1,832 ppm), estando o H(3) a
maiores deslocamentos, j que antes havia sido observado tratar-se de um dos hidrognios
prximos a um dos grupos hidroxilas. Fixando-se por sua vez no H(3), observa-se que alm
da interao com o H(4), h outros dois vizinhos que so os H(2) em 1,509 e 1,722 ppm.
Cada um por sua vez, interage com os H(1) em 1,336 e 1,848 ppm. A partir do H(5),
seguindo a linha contnua vertical em 1,832 ppm, deveria ser demonstrado trs interaes,
porm somente duas so observadas em 1,439 ppm (correspondendo ao H(4) e em 0,97-
0,99 ppm. Este ltimo sinal integra por dois no espectro de
1
H e deveria corresponder aos
H(6) e H(6). Correlaes destes hidrognios so demonstradas atravs de uma linha
contnua horizontal com os sinais em 1,561 e 1,457 ppm (linhas verticais pontilhadas), os
quais devem corresponder aos H(7) e H(7). Estas interaes so visualizadas na Figura

88
5.22. O assinalamento das posies e foram feitas a partir dos experimentos Noesy, os
quais evidenciam interaes entre a metila C(18)H
3
com o H(7) em 1,561 e o H(5) com o
outro H(7) em 1,457 ppm. Partindo-se do H(11), observa-se em 4,195 ppm, interao com
outros trs sinais, correspondentes aos H(12) em 2,086 e 1,722 ppm e ao H(9) em 1,483
ppm. Dos H(12) se chega ao H(13) em 2,708 ppm (Figura 5.21).
O terceiro fragmento representado pelos C15-C16, cuja posio deste segundo
carbono feita a partir do experimento J-resolvida (HOM2DJ), no qual permite a
identificao das posies do H(16) em 5,445 e H(24) em 5,072 ppm. Uma vez definida
estas posies, possvel ento identificar os H(15) em 1,972 e 1,107 ppm.
No quarto fragmento, parte-se do H(24) j identificado, levando aos H(23) em 1,906
e 1,874 ppm e aos H(22) em 2,340 e 2,047 ppm. Assim como ocorre na molcula de
helvolato, o H(24) apresenta acoplamento a quatro ligaes com as metilas em C26 e C27 em
1,471 e 1,527 ppm, respectivamente Estas interaes so devido a presena de dupla
ligao, fazendo com que estas metilas se localizem em distintas posies.

Figura 5.22 - Espectro bidimensional COSY
1
H-
1
2
O.

89

Para assinalamento das metilas restantes, as interaes a mais de trs ligaes tambm
foram avaliadas no espectro
1
H-
1
H COSY. A metila C(18)H
3
assinalada a partir das
interaes H(15)-H(18) e H(13)-(18), localizando-a em 0,756 ppm. A metila C(19)H
3
em
0,827 ppm pela interao H(1)-(19) e a C(32)H
3
em 1,147 ppm, a partir das interaes H(7)-
(32) e H(9)-(32).

13
C-
1
H
1
H-
13
C (Figura 5.23), possvel identificar facilmente os
grupos metila, os quais aparecem na tonalidade rosa. Esto sendo representados tambm
alguns dos carbonos secundrios em verde e tercirios em laranja. Como exemplos, a metila
C(30)H
3
no espectro monodimensional de hidrognio em 0,702 ppm, corresponde a um
carbono primrio, segundo os DEPT, com um deslocamento de 16.8 ppm. Da mesma forma, o
H(4) em 1,439 ppm, relaciona-se com um sinal no espectro
13
C em 37,9 ppm,
correspondente a um carbono tercirio. O C(2)H
2
em 1,509 e 1,722 ppm no espectro de
1
H,
corresponde com o sinal em 22,2 ppm no espectro de
13
C.

13
C-
1
2
O.

90

Espectro Bidimensional Homonuclear
1
H-
1
H (2D) J - resolvida (HOM2DJ)
Atravs da representao dos deslocamentos qumicos em um dos eixos e as
multiplicidades dos sinais (acoplamentos J ) em outro, possvel discernir entre aqueles sinais
que ainda apresentam alguma dvida. o caso dos hidrognios situados nos carbonos 16 e 24
(Figura 5.24).
Se analisar a vizinhana do H(16), tem-se como vizinhos os dois hidrognios do
C(15). Conforme os ngulos, vai mostrar uma constante de acoplamento (J ) diferente com
cada um. Ter uma constante (J ) grande, ao redor de 8Hz, com o hidrognio no qual forma
um ngulo aproximado de 20
o
e uma constante pequena, por volta de 2Hz, com o que forma
um ngulo em torno de 90
. Segundo a estrutura do fusidato de sdio, o H(16) pode apresentar

somente uma interao com os hidrognios H(22), os quais situam-se na cadeia lateral, o que
d lugar a uma constante (J ) de aproximadamente 1 Hz. O sinal do H(16) dever ser o dublete
que aparece em primeiro lugar, sendo na realidade um dublete de quadriplete que no aparece
bem definido. Descarta-se ento que o primeiro sinal do espectro monodimensional de
hidrognio corresponde ao H(24), como nos indica os deslocamentos tericos de
13
C e de
1
H.
Em uma mesma anlise em relao vizinhana do H(24), observa-se que vai interacionar
com os H(23), com uma constante de acoplamento (J ) entre 8-6 Hz, e com os hidrognios do
carbono 22 com um J em torno de 2Hz e outro ao redor de 1Hz. Portanto, pode-se concluir
que o sinal que aparece em primeiro lugar, a um de 5,445 ppm corresponde ao H(16) e o
que aparece em 5,072 ppm ao H(24).


91
Figura 5.24 - Espectro J-resolvida do fusidato de sdio 10mM, em D
2
O.

Espectro bidimensional NOESY
1
H-
1
H
Este experimento permite o estudo das interaes espaciais por proximidade entre os
distintos hidrognios de uma dada molcula. Pode-se diferenciar entre os hidrognios e da
molculade fusidato de sdio, por exemplo paraa metila C(18)H
3
com 7() em 1,561 ppm
e o H(5) com 7() em 1,457 ppm (Figura 5. 25).

( ppm )
4. 8 4. 0 3. 2 2. 4 1. 6 0. 8
2308
2304
2300
2296
2292
( Hz )
( p p m )
5 . 2 0 5 . 0 0
2 30 8
2 30 4
2 30 0
2 29 6
2 29 2
( Hz )
16
24
24
16

92
Figura 5.25 - Espectro Noesy
1
H-
1
2
O.

A partir dos experimentos de RMN monodimensionais de
1
H,
13
C e DEPT e
bidimensionais
1
H-
1
H COSY, de correlao
13
C-
1
H, Noesy
1
H-
1
H e J -resolvida e segundo
estimativas tericas de deslocamento qumico dos carbonos quaternrios, pode-se realizar o
assinalamento total da molcula de fusidato de sdio, sendo apresentados na Tabela 5.7.

(ppm)
2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4
2.8
2.4
2.0
1.6
1.2
0.8
(ppm)
7-18
7-5 7
5
7
18
(ppm)
2.8
(ppm)
2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4
2.8
2.4
2.0
1.6
1.2
0.8
(ppm)
7-18
7-5 7
5
7
18

93

1
H e
13
C do Fusidato de sdio 10mM, em D
2
O.
Posio
1
H(ppm)
13
C (ppm)
1
1
1,848
1,336
31,2
2
2
1,509
1,722
22,2
3 3,602 73,3
4 1,439 37,9
5 1,832 37,6
6
6
0,988
0,977
32,8
7
7
1,457
1,561
32,7
8 ---- 40,6
9 1,483 50,5
10 ---- 30,2
11 4,195 69,9
12
12
2,086
1,722
36,8
13 2,708 43,7
14 ---- 49,9
15
15
1,972
1,107
40,1
16 5,445 77,1
17 ---- 147,0
18 0,756 18,4
19 0,827 24,0
20 --- 138,3
21 --- 180,6
22 2,340
2,047
30,6
23 1,906
1,874
28,9
24 5,072 125,4
25 ----- 135,1
26 1,471 18,5
27 1,527 26,3
30 0,702 16,8
32 1,147 24,0
33 ----- 176,1
34 1,861 22,0


94

5.2.3 - CHAPS
Tendo em vista as estimativas tericas de
13
C (Programa ChemOffice 6,0), pode-se
assinalar alguns dos carbonos, como o C(24) pertencente ao grupo amida, com um valor de
terico de 174,7 ppm. Os tercirios C(3), C(7) e C(12), que por estarem localizados prximos
a grupos hidroxilas, apresentam valores de tericos de 68,9, 71,9 e 82,0 ppm,
respectivamente. Os secundrios C(27) ( 63,1) e C(28) ( 64,0), e primrios C(31) ( 47,5) e
C(32) ( 47,5), pertencentes cadeia lateral e prximos ao on nitrnio, deslocando-os para
campo baixo, por efeito de desblindagem eletrnica (Figura 5.26).
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180
(ppm)
24 3, 7 e 12
27 / 28
31 / 32
Dept 135
Dept 90
Dept 45
13
C

Figura 5.26 - Espectros monodimensionais do CHAPS 10mM: (a) DEPT 135; (b) DEPT 90; (c)
DEPT 45; (d)
13
C, em D
2
O, 125 MHz.

Espectro Monodimensional de
1
H
Pelas estimativas tericas de deslocamentos qumicos de
1
H (Programa ChemOffice
6.0), integrao e acoplamentos, pode-se situar a posio de alguns hidrognios, como o que
se observa na Figura 5.27. Os H(3), H(7) e H(12) com tericos de 3,21, 3,20 e 3,19 ppm

95
respectivamente, localizando-os mais esquerda do espectro por influncia de grupos
hidroxilas, estando um destes separado e coincidindo com algum pertencente cadeia lateral.
Os hidrognios H(25) ( 3,20), H(27) ( 3,24), H(28) ( 3,24), H(30) ( 3,41), assim como as
metilas C(31)H
3
( 3,30) e C(32)H
3
( 3,30) pertencentes cadeia lateral e prximos aos
grupos amida, sulfato e nitrnio, vo estar deslocados em campo baixo. Pela integrao dos
sinais, o que est em torno de 3,3 ppm, permite pensar que um dos hidrognios prximos ao
grupo hidroxila e coincide com algum pertencente cadeia lateral. As metilas C(18)H
3
,
C(19)H
3
e C(21)H
3
com tericos de 1,16, 1,16 e 1,06 ppm respectivamente, com o dublete
em torno de 0,80 ppm justifica os hidrognios do C(21)CH
3
.
1.0
000
1.0
116
3.1
599
1.8
981
1.8
274
6.3
909
2.1
876
0.9
774
3.1
562
5.6
317
10.
926
5.1
467
0.9
602
3.9
563
2.9
299
2.9
668
(ppm)
0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8
25, 27, 28, 30, 31 e 32
18, 19 e 21
3, 7 e 12
1.0
000
1.0
116
3.1
599
1.8
981
1.8
274
6.3
909
2.1
876
0.9
774
3.1
562
5.6
317
10.
926
5.1
467
0.9
602
3.9
563
2.9
299
2.9
668
(ppm)
0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8
25, 27, 28, 30, 31 e 32
18, 19 e 21
3, 7 e 12
OH
OH
OH
H
N N
SO
3
-
O
R
H
H
H
H
H
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
21
20
22
23
24
25
26
27
31
32
28
29
30
1.0
000
1.0
116
3.1
599
1.8
981
1.8
274
6.3
909
2.1
876
0.9
774
3.1
562
5.6
317
10.
926
5.1
467
0.9
602
3.9
563
2.9
299
2.9
668
(ppm)
0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8
25, 27, 28, 30, 31 e 32
18, 19 e 21
3, 7 e 12
1.0
000
1.0
116
3.1
599
1.8
981
1.8
274
6.3
909
2.1
876
0.9
774
3.1
562
5.6
317
10.
926
5.1
467
0.9
602
3.9
563
2.9
299
2.9
668
(ppm)
0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8
25, 27, 28, 30, 31 e 32
18, 19 e 21
3, 7 e 12
OH
OH
OH
H
N N
SO
3
-
O
R
H
H
H
H
H
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
21
20
22
23
24
25
26
27
31
32
28
29
30

1
H do CHAPS 10mM em D
2
O, 500 MHz.

Espectro Bidimensional
1
H-
1
H COSY
Para efeito de estudo, a molcula dividida em cinco fragmentos, dos quais o primeiro
corresponde poro constituda pelos C(12), C(11) e C(9). No espectro bidimensional
1
H-
1
H
COSY (Figuras 5.28 e 5.29), observa-se que o H(12) em 3,855 ppm, apresenta apenas duas
interaes, os quais posicionam os H(11) em 1,383 e 1,415 ppm. Dos H(11) se vai ao H(9)
com em 1,922 ppm.

96
A segunda poro corresponde aos C(6), C(7) e C(8), onde a partir do H(7) em 3,697
ppm, vai posicionar os H(6) em 1,784 e 1,345 ppm e o H(8) em 1,408 ppm. Do H(6) se
chega ao H(5) em 1,242 ppm.
O ponto de partida do terceiro fragmento em 3,302 ppm o H(3), que parece
coincidir com sinais pertencentes cadeia lateral e teoricamente deveria conter quatro
interaes, os correspondentes aos H(2) e H(4). Dos quatro sinais de interao na direo do
H(3), um corresponde cadeia lateral e os outros aos H(2) em 1,161 e 1,452 ppm e aos H(4)
em 1,502 e 1,868 ppm. Dos H(2) se vai aos H(1) em 1,601 e 0,820 ppm e dos H(4) se
chega ao H(5) em 1,242 ppm, j identificado.
O quarto fragmento se origina do H(8) j assinalado em 1,408 ppm. No espectro
1
H-
1
H COSY (Figura 5.29) observa-se que da interao 8-14 com o H(14) em 1,625 ppm, se
chega aos H(15) em 1,521 e 0,935 ppm. Destes possvel localizar os H(16) em 1,728 e
1,073 ppm e o H(17) em 1,534 ppm. Das metilas com valores de estimativas tericas de
1
H
campo alto, esto as C(18)H
3
, C(19)H
3
e C(21)H
3
, onde esta ltima seria o dublete em
0,802 ppm. Do 21 se vai ao H(20) em 1,219 ppm e aos H(22) e H(23) respectivamente
situados em 1,188 e 1,552 e 2,012 e 2,138 ppm. Uma interao a quatro ligaes na direo
do C(18)H
3
com o H(17), vai situar este ltimo em 1,534 ppm, confirmando tambm a
posio das metilas 18 ( 0,516 ppm) e 19 ( 0,719 ppm).
Para definio da cadeia lateral, primeiramente se faz uma importante observao, que
o fato de que a cadeia apresenta uma certa rigidez at o grupo amida e a partir do C(25) gira
livremente, fazendo com que os hidrognios dos C(25), C(26), C(27), C(28), C(29) e C(30) se
situem numa mesma regio. Por comparao com a molcula CHAPSO, pode-se definir
distintamente dois grupos: C(25), C(26) e C(27) e outro constitudo pelos C(28), C(29) e
C(30). Para definio dos CH
2
28 ou 30 e 25 ou 27, uma anlise das estimativas tericas de
13
C, juntamente com os espectros de
1
H-
1
H-COSY e correlao
1
H-
13
C-, definem os dos
CH
2
em 3,0990 ppm H(25), 1,821 ppm H(26), 3,159 ppm H(27), 3,290 ppm H(28), 2,021
ppm H(29) e 2,790 ppm H(30). As metilas C(31)H
3
e C(32)H
3
so representadas pelo singlete
em 2,923 ppm, posio esta definida atravs das estimativas de
1
H e integrao. Os CH
2


97
H(25), H(27), H(28) e H(30) pertencentes cadeia lateral, assim como as metilas C(31)H
3
e
C(32)H
3
, so visualizados no espectro de correlao
1
H-
13
C (Figura 5.30).

Figura 5.28 - Espectro bidimensional de
1
H-
1
2
O.

Figura 5.29 - Espectro parcial bidimensional
1
H-
1
2
O.

98

13
C-
1
H.
Pode-se observar no espectro de correlao
1
H-
13
C (Figura 5.30), se os sinais
assinalados no espectro
1
H-RMN, correspondem aos respectivos tomos de carbono,
demonstrando assim tratar-se de carbono primrio (CH
3
), secundrio (CH
2
) ou tercirio (CH),
como o que est sendo demonstrado para os grupos CH C(3), C(7) e C(12) , os CH
2
C(25),
C(27), C(28) e C(30) e as metilas C(31)H
3
e C(32)H
3
.

1
H-
13
C do CHAPS 10 mM, em D
2
O.

5.2.4 - CHAPSO

Espectros monodimensionais de
13
C , DEPT e
1
H.
A diferena entre as molculas CHAPS e CHAPSO, que esta ltima apresenta em
sua estrutura, um grupo hidroxila no C(29) pertencente cadeia lateral. Isto faz com que
aparea um novo sinal em campo baixo. No experimento monodimensional de
13
C e DEPT, o

99
C(29) vai estar localizado em 65,7 ppm. Nesta mesma regio do espectro, aparecem os
sinais referentes aos carbonos C(3), C(7) e C(12), cujos valores de so os mesmos em
ambas molculas, respectivamente em 74,6, 71,4 e 76,2 ppm. Os carbonos C(27) e C(28)
tambm em campo baixo, apresentam alguma diferena nos valores de deslocamento qumico,
cujos so 66,4 e 70,1 ppm, respectivamente.
O espectro monodimensional de
1
H (Figura 5.31), mostra os H(3), H(7), H(12) e
H(29) mais esquerda do espectro, este ltimo diferenciando-se dos outros devido
proximidade com o grupo hidroxila e outros grupos funcionais pertencentes cadeia lateral,
que o desloca para altos valores de deslocamento. Assim como na molcula CHAPS, os
hidrognios H(25), H(27), H(28) e H(30) e as metilas C(31)H
3
e C(32)H
3
pertencentes
cadeia lateral, tambm so levados em campo baixo. Porm, ocorrem certas variaes no
valor de , principalmente nos prximos ao grupo hidroxila C(29), como o caso dos
hidrognios H(28) e H(30). Diferente do que ocorre no CHAPS, a molcula de CHAPSO
mostra desdobramento dos sinais referentes aos C(28)CH
2
, situando-os em distintas posies.
Como na estrutura CHAPS, as metilas com valores de estimativa de
1
H em campo alto, so as
metilas C(18)H
3
, C(19)H
3
e C(21)H
3
, onde esta ltima seria o dublete em torno de 0,80 ppm.
1
.0
1
6
0
1
.0
0
0
0
0
.9
9
1
1
1
.4
8
8
0
4
.0
7
6
7
1
.9
8
7
1
8
.0
5
0
5
0
.9
9
8
0
0
.9
7
0
3
5
.9
8
6
6
1
1
.0
4
2
4
.9
5
5
9
2
.0
1
0
8
3
.8
9
0
7
2
.9
9
0
0
3
.0
3
8
9
(ppm)
0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4
29
12
18
19
21
7
3, 25 e 27, 28 e 30, 31 e 32

Figura 5.31 - Espectro monodimensional de
1
2
O, 500 MHz.

Espectro Bidimensional
1
H-
1
H COSY
O espectro
1
H-
1
H-COSY (Figura 5.32) referente molcula CHAPSO, apresenta
sinais falsos, devido ao aparecimento de muito rudo. Por comparao com o espectro
CHAPS, possvel identificar aquelas que so as verdadeiras interaes, como o que se
observa com os sinais referentes aos hidrognios H(3), H(7), H(12) e H(29).

100
Na direo do H(12) em 3,865 ppm, identifica-se um sinal de interao significativo
que poder levar aos H(11), em 1,413 e 1,403 ppm, que por sua vez leva ao H(9) em 1,919
ppm. A interao H(11)-(9) coincide com a H(8)-(9), levando ao H(8) em 1,422 ppm.
O H(7) em 3,706 ppm, vai apresentar interao com os H(6) em 1,347 e 1,799 ppm
e com o H(8), j identificado.
Aqui tambm ocorre sobreposio do H(3) com os hidrognios pertencentes aos CH
2

da cadeia lateral. Em sua direo em 3,309 ppm, observam-se sinais de interao com os
H(2) em 1,161 e 1,447 e com os H(4) em 1,864 e 1,503 ppm.

Figura 5.32 - Espectro bidimensional
1
H-
1
H COSY do CHAPSO 10mM, em D
2
O.

A hidroxila no C29 na molcula CHAPSO, permite diferenciar dois grupos distintos:
C(25), C(26) e C(27) e outro, constitudo pelos C(28), C(29) e C(30). O novo sinal em campo
baixo, que vai corresponder ao hidrognio do C29(OH), vai apresentar interao com o
segundo grupo. Por comparao, pode-se ento definir perfeitamente a posio dos

101
hidrognios pertencentes aos carbonos 29 ( 4,473 ppm) e 26 ( 1,854 ppm), os quais sero os
pontos intermdios para cada um destes grupos (Figura 5.32).
Devido proximidade do grupo OH no C(29), os CH
2
C(25), C(27), C(28) e C(30)
pertencentes cadeia lateral, apresentam certa diferena nos valores de deslocamento qumico
quando comparados molcula CHAPS, situando-se respectivamente em 3,103 H(25),
3,261H(27), 3,457 e 3,340 H(28) e 2,963 H(30) ppm. No caso dos H(28), o
desdobramento em distintos sinais, se deve a maior proximidade com o grupo OH,
diferenciando-se da molcula CHAPS.
Entre 3,4 e 3,5 ppm e entre 0,9 e 1,0 ppm (Figura 5.32), tm-se sinais correspondentes
a uma impureza de etanol, cujas integraes de 0,4 e 1,0 correspondem a um quadruplete
(CH
2
) e a um triplete (CH
3
) desta molcula. As estimativas de
1
H confirmam as zonas de
aparecimento destes sinais correspondentes ao CH
2
e CH
3
do etanol.

13
C-
1
H
1
H-
13
C (Figura 5.33), procura-se identificar e confirmar os
carbonos, os quais esto sendo representados alguns dos primrios em azul, secundrios em
verde e tercirios em rosa. Como exemplos, o C(15)H
2
no espectro monodimensional de
hidrognio em 0,950 e 1,515 ppm, corresponde a um carbono secundrio, segundo os
DEPT, com um deslocamento de 25,9 ppm. Da mesma forma, o C(16)H
2
em 1,731 e 1,080
ppm, relaciona-se com um sinal no espectro
13
C em 30,3 ppm. O CH(20) em 1,213 ppm
no espectro de
1
H, corresponde com o sinal em 38,0 ppm no espectro de
13
C. Assim, os
CH(14) e CH(17) respectivamente em 1,619 e 1,533 ppm no espectro de
1
H, correspondem
com os sinais em 44,6 e 49,4 ppm respectivamente, no espectro de
13
C.

102

13
C-
1
2
O.

O assinalamento dos carbonos quaternrios foram obtidos a partir dos tericos. A
Tabela 5.8 traz os valores dos deslocamentos qumicos dos compostos CHAPS e CHAPSO
com os experimentos de RMN mono (
1
H,
13
C e DEPT) e bidimensionais (
1
H-
1
H-COSY e de
correlao
1
H-
13
C).

103
1
H e
13
C do CHAPS e CHAPSO 10mM, em D
2
O, pH 5-6.
CHAPS CHAPSO
Localizao
1
H
13
C
1
H
13
C
1
1
1,601
0,820
37,8
1,608
0,832
37,7
2
2
1,161
1,452
32,3
1,161
1,447
34,7
3 3,302 74,6 3,309 74,6
4
4
1,868
1,502
41,4
1,864
1,503
41,4
5 1,242 44,1 1,250 44,0
6
6
1,345
1,784
36,9
1,347
1,799
36,8
7 3,697 71,3 3,706 71,4
8 1,408 42,2 1,422 42,1
9 1,922 29,4 1,919 29,4
10 --- 37,4 --- 37,3
11
11
1,383
1,415
30,7
1,403
1,413
30,7
12 3,855 76,1 3,865 76,2
13 --- 49,1 --- 49,1
14 1,625 44,6 1,619 44,6
15
15
0,935
1,521
25,9
0,950
1,515
25,9
16
16
1,728
1,073
30,3
1,731
1,080
30,3
17 1,534 49,3 1,533 49,4
18 0,516 15,1 0,525 15,0
19 0,719 25,0 0,727 25,0
20 1,219 38,1 1,213 38,0
21 0,802 19,7 0,806 19,7
22
22
1,188
1,552
34,7
1,178
1,554
32,3
23
23
2,012
2,138
35,6
2,020
2,137
35,6
24 --- 180,8 --- 180,8
25 3,099 39,0 3,103 39,0
26 1,821 25,3 1,854 25,4
27 3,159 64,9 3,261 66,4
28 3,290 65,3
3,457
3,340
70,1
29 2,021 21,2 4,473 65,7
30 2,790 50,2 2,963 58,2
31
32
2,923

53,8
3,020
3,006
55,1
54,9

5.2.5 - Espectros de RMN de - e -CD
importante conhecer-se os deslocamentos qumicos nos espectros de RMN de
1
H e
13
C, tanto do hspede (fusidato de sdio, helvolato de potssio, CHAPS ou CHAPSO) quanto

104
das ciclodextrinas (- e -CD), para poder estudar a partir destes, os deslocamentos que
sofrem uma e a outra molcula envolvidas no processo de complexao.
A forma do espectro da - e -CD so iguais, uma vez que so constitudas por
unidades de glicopiranose, com diferena apenas nas integraes, reflexo do nmero de
unidades constituintes.
Para o assinalamento dos hidrognios da ciclodextrina, faz-se uso do programa Chem
Office 6,0, conforme estimativas tericas dos deslocamentos qumicos e forma dos sinais. De
acordo com a Figura 5.34, observado para o caso da -CD em presena de helvolato de
potssio, o sinal que aparece em torno de 4,86 corresponde ao H
CD1
, o qual se apresenta
como um dublete.
O H
CD2
em torno de 3,43 e em posio axial, apresenta uma constante de
acoplamento com o H
CD1
em posio equatorial, diferente da constante de acoplamento com o
H
CD3
em posio axial. Portanto, o que se espera para este sinal um duplo dublete, o qual
integra por 1.
O H
CD3
por volta de 3,73 e em posio axial, possui dois vizinhos (H
CD4
e H
CD2
),
ambos em posio axial, portanto as constantes de acoplamento so aproximadamente iguais e
o sinal deveria aparecer como um triplete.
O H
CD4
prximo de 3,47 e em posio axial, possui dois vizinhos na mesma situao
(H
CD3
e H
CD5
), portanto o sinal tambm se manifesta como um triplete, e que integra por 1. O
H
CD3
e H
CD4
deveriam ambos apresentar-se como triplete, porm segundo estimativa terica, o
que est situado a valores mais baixos de deslocamento supe-se tratar-se do H
CD4
.
O H
CD5
em torno de 3,55 e em posio axial, possui trs vizinhos, sendo dois deles
os H
CD6
e o outro seria o H
CD4
. Sendo distintas as constantes de acoplamento J
3
H
5
-H
6
e J
3
H
5
-
H
4
, o sinal esperado seria um duplo dublete.
O H
CD6
em torno de 3,67 apresenta somente um vizinho e estes integram por 2. Este
sinal se encontra sobreposto com o sinal correspondente ao H
CD3
, cujo conjunto integra por 3.


105
7.0
00
0
21.
32
4
7.2
39
1
14.
24
2
(ppm) 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4.0 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9
HCD1
HCD5
HCD2
HCD4
HCD3
HCD6
7.0
00
0
21.
32
4
7.2
39
1
14.
24
2
(ppm) 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4.0 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9
7.0
00
0
21.
32
4
7.2
39
1
14.
24
2
(ppm) 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4.0 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9
HCD1
HCD5
HCD2
HCD4
HCD3
HCD6

1
H-RMN da -CD em soluo (10mM), D
2
O,
300 MHz, com supresso do solvente.

O espectro de RMN de
13
C bastante simples, correspondendo aos seis tomos de
carbono da unidade de glicose da ciclodextrina em singletes bem definidos, conforme
estimativas tericas dos deslocamentos qumicos e de acordo com os assinalamentos dos
tomos de carbono apresentados na Figura 5.35.
C5
C
1
1
C
4
C
3
C
6
C
2
(ppm)
50 60 70 80 90 100 110 120
C5
C
1
1
C
4
C
3
C
6
C
2
(ppm)
50 60 70 80 90 100 110 120

13
C da -CD em D
2
O, 75 MHz.


106
5.3 - Estudo dos Complexos de Incluso por RMN

A espectroscopia por RMN considerada uma tcnica de relevncia nos estudos de
complexao, por fornecer informaes com relao a composio e estrutura, assim como
parmetros que caracterizam o processo de complexao.
A caracterizao das interaes hspede-hospedeiro, atravs da determinao da
estequiometria e da constante de formao do complexo, utiliza tcnicas de RMN como uma
das mais comuns. Consiste na anlise dos deslocamentos qumicos dos tomos de carbono
(
13
C) ou hidrognio (
1
H) pertencentes molcula hspede e ciclodextrina, em misturas de
diferentes propores [hspede]/[CD]. As principais desvantagens no uso destas tcnicas, se
baseiam no pequeno nmero de amostras em cada experimento (fornecendo habitualmente
menos de dez valores correspondentes a cada ncleo, carbono ou hidrognio), necessidade de
boa resoluo devido aos valores de deslocamento qumico observados muito prximos
durante o processo de complexao e aplicada somente a hspedes com alta solubilidade.
Muitos autores tm conduzido uma anlise individual dos deslocamentos qumicos
de cada um dos ncleos, levando freqentemente a valores inconsistentes das constantes de
formao dos complexos. Deste modo, esta metodologia pode no ser efetiva no caso de
misturas com estequiometrias 1:1 e 1:2. Geralmente a anlise de apenas um ncleo, no
permite a determinao de duas ou mais constantes de associao envolvidas em um nico
processo de complexao.
Para minimizar alguns destes problemas, faz-se uso da anlise global dos dados a qual
permite a obteno de um nico valor da constante de equilbrio, atravs do estudo do
conjunto de dados de todos os ncleos.
160
Esta anlise pode ser realizada em um software
comercial como Origin 6.0. A anlise global de dados especialmente relevante no caso de
estequiometrias de maior ordem (1:2 ou mais), devido ao grande nmero de parmetros e
interdependncias matemticas.


107
5.3.1 - Complexos Fusidato de Sdio e Helvolato de Potssio : -CD

Uma grande variedade de substncias pertencentes ao grupo dos surfactantes podem
formar micelas quando em soluo aquosa. Os antibiticos esteroidais, cidos fusdico e
helvlico, contendo estruturas anfiflicas semelhantes aos sais biliares, tambm possuem a
propriedade de formar agregados micelares. Durante os estudos de complexao, necessrio
garantir que no ocorra formao de micelas, caso contrrio ocorrero possveis interferncias
na determinao da constante de formao do complexo. Para se evitar estas interferncias,
deve-se utilizar a concentrao do esteride abaixo da concentrao micelar crtica (cmc).
21

Tambm vantajoso trabalhar com excesso de concentrao de um dos reagentes, o que no
possvel neste caso. Por um lado, tem-se o limite de concentrao do esteride e por outro, a
mxima concentrao em soluo de ciclodextrina, que tambm limitada devido a
solubilidade, sendo particularmente importante no caso da -CD.
Estas restries sugerem que o mtodo da variao contnua
156
o mais apropriado
para estudo destes sistemas, cuja concentrao total igual a soma das concentraes das duas
espcies presentes em soluo (item 3).

Determinao da Estequiometria e da constante de equilbrio do complexo de
incluso
Para a determinao da estequiometria dos complexos de incluso formados entre a
ciclodextrina (-CD) e o hspede (fusidato ou helvolato), foi utilizado o mtodo de J ob.
Experimentalmente, de uma srie de 10 (dez) solues, com variao da relao molar
de ciclodextrina e hspede (fusidato ou helvolato) no intervalo de 0 (zero) a 1 (um), e a partir
dos espectros de RMN obtm-se a posio do sinal pertencente a um determinado ncleo de
ciclodextrina.

108
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
-0,05
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
o
b
s
*
R
M
-
C
D
/
p
p
m
RM-CD
1C
2C
3C
4C
5C
6C
(a)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
o
b
s
*
R
M
-
C
D
/
p
p
m
RM
-CD
1C
3C
4C
5C
6C
(b)
Figura 5.36 - Curva de Job obtida com os deslocamentos qumicos dos carbonos da -CD para o
complexo (a) helvolato:-CD e (b) fusidato:-CD; [helvolato/fusidato]
o
=[-CD]
o
=10mM); 75 MHz.

A Figura 5.36a mostra a curva de J ob para os seis carbonos de uma unidade de glicose
de -CD para o complexo helvolato:-CD. Os pontos representam os valores experimentais e
as linhas so o resultado do clculo referente aos tericos deste tipo de representao,
considerando o valor obtido a partir das constantes de associao e demais parmetros. O
mximo da curva observado em um valor de 0,5, o que sugere a formao de complexo de
estequiometria 1:1 (helvolato:-CD).
No caso do fusidato de sdio, a representao de J ob feita com apenas cinco dos seis
tomos de carbono de uma unidade de glicose da ciclodextrina, devido a pouca variao dos
deslocamentos qumicos do C2. A Figura 5.36b demonstra a curva de J ob para o complexo
fusidato:-CD. Neste caso, o mximo da curva tambm observado em 0,5, o que sugere a
formao de complexo de estequiometria 1:1 (Fusidato:-CD).
Os valores das constantes de equilbrio de formao dos complexos helvolato:-CD

e
fusidato:-CD foram calculados em um programa Origin verso 6,0, utilizando a equao
3.20 (item 3), atravs de um ajuste global por mnimos quadrados no linear para os tomos
de carbono e estabelecendo a condio de um valor de
11
K constante em todas as sries e
diferentes valores de
max

para cada tomo de carbono.
A Figura 5.37, mostra a variao dos deslocamentos qumicos observados (
obs
) dos
tomos de carbono da -CD, em funo da concentrao inicial de helvolato de potssio
([helvolato K]
o
). Os pontos representam os dados experimentais e as linhas so o resultado do

109
ajuste da equao (3.20). Para avaliao do ajuste terico foi representado na parte inferior
deste mesmo grfico (Figura 5.37), uma anlise dos erros residuais (diferena entre os valores
de experimentais e tericos) para cada tomo de carbono, podendo demonstrar desvios
sistemticos ou erros aleatrios, dependendo do nmero de dados disponveis, parmetros de
correlao e intervalos de confiana. Deduz-se ento que o modelo proposto para a formao
de um complexo 1:1 considerado satisfatrio, cujo valor obtido para a constante de
associao do complexo helvolato de potssio: -CD : K
helvolato:-CD
=(22 9)10
3
L
.
mol
-1
.
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010
-0,04
-0,02
0,00
0,02
0,04

o
b
s
/
p
p
m
1C
2C
3C
4C
5C
6C
[helvolato K]
o
/M

e
r
r
o

r
e
s
i
d
u
a
l

Figura 5.37 -
obs
para diferentes tomos de carbono da -CD
complexada com helvolato de potssio. [helvolato]
o
=[-CD]
o
=10mM.

A fim de comprovar a validade do modelo anterior, foram feitos clculos supondo-se
simultaneamente a existncia de estequiometrias 1:1 e 1:2. Nesta ltima suposio, apesar de
apresentar menores erros residuais, o valor da constante de K
12
(0,110
3
L mol
-1
) indicou
que somente haveria formao de uma pequena frao de complexo 1:2.
De forma semelhante ao helvolato de potssio, foram realizados estudos de
complexao por -CD com o fusidato de sdio. A Figura 5.38 mostra a variao dos
deslocamentos qumicos observados (
obs
) dos tomos de carbono da -CD, em funo da
concentrao inicial de fusidato de sdio ([fusidato]
o
). Os dados experimentais foram
analisados conforme o que foi mostrado para o helvolato de potssio e de acordo com a
equao 3.20 (item 3). Neste caso, o valor de
11
K resultante : K
fusidato:-CD
=(60 24)10
3

L
.
mol
-1
.

110
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010
-0,02
0,00
0,02
0,04

e
r
r
o

r
e
s
i
d
u
a
l
[fusidato Na]
o
/M
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

o
b
s
/
p
p
m

Figura 5.38 -
obs
para diferentes tomos de carbono da -CD
complexada com fusidato sdico . [fusidato]
o
=[-CD]
o
=10mM.

Estes valores esto entre as mais altas constantes de equilbrio encontradas para
complexos de incluso de esterides em ciclodextrinas do tipo 1:1. Estes valores so quase
uma ordem de magnitude maior que para os sais biliares, refletindo a formao de complexos
mais estveis.
21

A Tabela 5.9 apresenta os valores de
max
para os tomos de carbono da -CD
resultantes da complexao de ambos os esterides. Estes so relativamente altos e indicam
uma forte interao hspede - ciclodextrina, o que poderia justificar os elevados valores
obtidos para as constantes de equilbrio.

111
max
obtidos para os tomos de carbono da -CD na complexao com fusidato de
sdio e helvolato de potssio.
max
/ppm tomo de C
-CD
fusidato de sdio helvolato de potssio
C1 0.857 0.008 0.78 0.01
C2 0.193 0.008 0.59 0.01
C3 0.572 0.008 0.26 0.01
C4 0.343 0.008 0.14 0.01
C5 -0.406 0.008 0.24 0.01
C6 -0.31 0.01

Determinao da estrutura do complexo
As estruturas dos complexos podem ser deduzidas a partir dos espectros ROESY,
conforme ser demonstrado para o complexo helvolato: -CD (Figura 5.39). A Tabela 5.10
mostra as interaes intermoleculares observadas entre os respectivos hspedes (fusidato ou
helvolato) e a molcula hospedeira (-CD). A partir das observaes obtidas dos experimentos
ROE, possvel fazer algumas consideraes:
i) nenhum dos tomos de hidrognio dos carbonos C1 a C7, localizados nos anis
esteroidais A e B, assim como o grupo metila C(30)H
3
localizado no C4 do anel A,
apresentam interaes com os tomos de hidrognio da -CD.
ii) as principais interaes do H6 pertencente -CD, so com os dos grupos metila
C(26)H
3
e C(27)H
3
localizados na cadeia lateral, com os dos grupos metila C(32)H
3
,
C(34)H
3
e C(18)H
3
e com os hidrognios H11. No caso do cido helvlico, os
hidrognios da metila C(19)H
3
tambm mostram uma fraca interao. A maior parte
destes tomos de hidrognio est localizada na parte central do esqueleto esteroidal.
iii) H3 sempre observado como um dos tomos de interao da -CD. As interaes do
H3 com os hidrognios dos grupos metila pertencentes cadeia lateral so
particularmente fortes.
iv) no so observadas interaes intramoleculares entre a cadeia lateral e os ncleos
esteroidais.

112
v) presume-se que os esterides incorporam-se na cavidade da -CD atravs da cadeia
lateral, assim como ocorre com os sais biliares.
21
Porm, ao alcanar a regio central,
a ciclodextrina se afasta atravs da mesma regio, observao procedente pela
ausncia de interao com os hidrognios pertencentes ao anel A do esqueleto
esteroidal.
vi) a ausncia de interao com os hidrognios H22 e H23 se deve ao dimetro da
cavidade da -CD, que no possibilita desenvolver um efeito de blindagem suficiente.
No entanto, algumas destas interaes so observadas com a -CD, devido ao menor
dimetro interno da cavidade da ciclodextrina.

Tabela 5.10 - Experimento ROE com as interaes entre os hidrognios (Pn) do helvolato ou fusidato e os
hidrognios (Hn) das ciclodextrinas - ou -CD.
-CD -CD
Fusidato Helvolato Fusidato Helvolato
Localizao C-atomo
H-3 H-5 H-6 H-3 H-5 H-6 H-3 H-5 H-6 H-3 H-5 H-6
P1 F F
P 2 m F m f f
P 3 F
P 4 F F

Anel A
P 30 F F m
P 6 m
Anel B
P 7

f
Anis B/C P 9

f
Anel C P 11 F F m m m f m
Anis C/D P 13 m m
P15 m m
Anel D
P16 m m

Anis C/D P 18 F F F F F f m f

Anis A/B P 19 F m F m f F f m f
P 22 m
P 23 m

F f m
P 24 m f m F m m
P 26 F m m F f F F F m F F F
Cadeia
lateral
P 27 F m m F f F F F m F F F
Anis B/C P 32 F F m F F m F f m f
P 34 F f f F F F f f f
Ester
P 36 f
Representao: Interaes fracas (f), mdias (m), fortes (F) e ausncia de interaes
(em branco).


113
Das interaes observadas no espectro ROESY (Figura 5.39), define-se a forma do
complexo de incluso helvolato:-CD , baseado nos hidrognios H3, H5 e H6 da -CD
situados em direo cavidade interior da ciclodextrina, com os hidrognios da molcula de
helvolato de potssio.
A partir dos dados analisados, prope-se modelos espaciais tericos para o complexo
(helvolato)
1
:(-CD)
1
,

com vistas laterais (a) e (b) e frontais (c) e (d), conforme Figura 5.40.

( pp m)
7. 00 6. 00 5. 00 4. 00 3. 00 2. 00 1. 00
7.
6.
5.
4.
3.
2.
1.
(pp m
H
C D 1
H
C D 3
H
C D 2
H
C D 4
H
C D 5
H
C D 6
H
C D3
H
18

H
32
H
19

H
CD3
H
26

H
27

H
11
H
C D3
H
22
H
CD3
H
5

H
13

H
9
H
CD3
H
16
H
CD3
H
1
H
CD5
H
18

H
32
H
19
H
C D5
H
26

H
27

H
11

Figura 5.39 - Espectro ROESY referente ao complexo de incluso helvolato: -CD em D
2
O
10mM, 500 MHz.


114

(a)

(b)

(c)

(d)

Figura 5.40 - Modelos espaciais tericos do complexo (helvolato)
1
: (-
CD)
1
, com vistas laterais (a) e (b) e frontais (c) e (d).

5.3.2 - Complexos Fusidato de Sdio e Helvolato de Potssio : -CD
Os sais biliares formam complexos 1:1 com a -CD, enquanto que com a -CD
formam complexos de estequiometria 1:1 e 1:2. Portanto, estes esterides comportam-se
como hspedes monotpicos e ditpicos respectivamente, se forem trihidroxlicos (por
exemplo, colato de sdio) ou dihidroxlicos (no caso, desoxicolato de sdio).
20, 21
Com base
nas estruturas do helvolato e fusidato e demonstraes experimentais, espera-se um
comportamento similar aos sais biliares.

Determinao da Estequiometria do complexo de incluso
Para a determinao da estequiometria dos complexos de incluso formados entre a -
CD e o hspede (fusidato ou helvolato), tambm foi utilizado o mtodo de J ob. A posio do
mximo das curvas com valores maiores que 0.5 (Figura 5.41), sugere para ambos os

115
complexos helvolato:-CD e fusidato:-CD a existncia de estequiometria 1:2, porm no
descarta a existncia de dois diferentes complexos 1:1. Neste caso, poderia existir duas
constantes diferentes K
11
e K
12
, na qual K
11
poderia representar a soma das constantes de
associao destes complexos 1:1. De fato, a posio do mximo das curvas no alcana o
valor de 0.67, o qual seria indicativo da existncia de um nico tipo de complexo 1:2 em
soluo. Estes resultados sugerem a formao de uma mistura em soluo dos complexos 1:1
e 1:2.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
-0.02
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
o
b
s
*
R
M
-
C
D
RM
-CD
1C
4C
3C
5C
6C
(a)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
-0.02
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
o
b
s
*
R
M
-
C
D
RM
-CD
1C
4C
3C
2C
5C
(b)
Figura 5.41 - Curva de Job para os cinco carbonos de uma unidade de glicose de -CD para o
complexo (a) helvolato: -CD e (b) fusidato: -CD. [helvolato/fusidato]
o
=[-CD]
o
=10mM, 75 MHz.

Determinao da constante de equilbrio de formao do complexo
Nos dois casos, tanto para o complexo helvolato:-CD quanto para o fusidato:-CD,
tem-se a formao de complexo com estequiometria 1:2 juntamente com 1:1, como mostra a
curva de J ob representada na Figura 5.41. A equao que descreve a existncia destes trs
tipos de complexos em soluo, foram deduzidas no item 3 (3.27), cuja resoluo implica em
uma equao de terceiro grau para a obteno das constantes K
11
e K
12
.
160
Foram realizadas
anlises globais no lineares para os deslocamentos qumicos destes compostos com a -CD
em um programa Origin 6.0.
Helvolato : -CD indica claramente uma mistura de estequiometrias 1:1 e 1:2. A
Figura 5.42 mostra os dados experimentais (smbolos) e o ajuste global no linear (linhas)
referente a equao 3.27. As Figuras 5.42 mostram a variao dos deslocamentos qumicos

116
observados (
obs
) dos tomos de carbono da -CD frente a concentrao inicial do helvolato
de potssio ([helvolato]
o
). Os valores das constantes obtidas so:
K
11 (helv.:-CD)
=(2,42 0,87)10
3
L mol
-1
K
12 (helv.:-CD)
=(0,06 0,09)10
3
L mol
-1
O mesmo processo foi utilizado para o fusidato de sdio com a -CD. A Figura 5.43
mostra a variao dos deslocamentos qumicos observados (
obs
) dos tomos de carbono da
-CD em funo da concentrao inicial do fusidato de sdio ([fusidato]
o
). Os pontos
representam os dados experimentais e as linhas so o resultado do ajuste terico baseando-se
na equao 3.27 para complexos de estequiometria 1:2. Uma anlise global no linear de
todos os tomos de carbono, assumindo a formao de complexo 1:1 (Figura 5.43a), produz
resduos com desvios sistemticos significativos. Para a mesma anlise, tambm admitindo a
formao de complexo 1:2, obtm-se um ajuste perfeito com os resduos distribudos
aleatoriamente (Figura 5.43b).
A fim de aumentar o nmero de ncleos analisados a partir da mesma amostra
fusidato:-CD, foram considerados simultaneamente os deslocamentos qumicos de
1
H-RMN
dos H3 e H5 juntamente com os tomos de carbono C1, C3, C4 e C5 da -CD. A formao de
ambos os complexos 1:1 e 1:2 esto de acordo com o grfico de J ob com o mximo entre X
-
CD
=0,5 (1:1) e X
-CD
=0,67 (1:2). O valor das constantes K
11
e K
12
so:
K
11 (fusid.:-CD)
=(0,74 0,13)10
3
L mol
-1

K
12 (fusid.:-CD)
=(0,210 0,075)10
3
L mol
-1


117
-0,15
-0,10
-0,05
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010
-0,04
-0,02
0,00
0,02
0,04

o
b
s
1C
4C
3C
5C
6C
[helvolato]
o
/M

e
r
r
o

r
e
s
i
d
u
a
l

(a)
-0,15
-0,10
-0,05
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0 2 4 6 8 10
-0,010
-0,005
0,000
0,005
0,010
0,015
o
b
s
1C
4C
3C
5C
6C
e
r
r
o

r
e
s
i
d
u
a
l

[helvolato]
o
/mM

(b)

Figura 5.42 -
obs
para diferentes tomos de carbono da -CD complexada com helvolato de potssio; (a)
ajuste para complexo 1:1, (b) ajuste para complexo 1:2

0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30

o
b
s
/
p
p
m
1C
4C
3C
2C
5C

0,000 0,002 0,004 0,006 0,008
-0,02
-0,01
0,00
0,01
0,02

e
r
r
o

r
e
s
i
d
u
a
l
[fusidato]
o
/M

(a)
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
o
b
s
/
p
p
m

1C
4C
3C
2C
5C

0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010
-0,010
-0,005
0,000
0,005
0,010
0,015
e
r
r
o

r
e
s
i
d
u
a
l

[fusidato]
o
/M

(b)
Figura 5.43 -
obs
para diferentes tomos de carbono da -CD complexada com fusidato de sdio; (a) ajuste
para complexo 1:1, (b) ajuste para complexo 1: 2.

Comentrios importantes podem ser feitos para K
11
. Os valores mais baixos de
max,C11
para os complexos formados entre fusidato (ou helvolato) e a -CD, comparados
com a -CD, sugere a existncia de uma estreita relao entre os valores de K
11
e
max.
Este
fato se deve mudana de ambiente eletrnico, devido interao hspedehospedeiro
ocorrida no processo de complexao com a -CD, levando a valores de K
11
mais elevados.
De forma anloga, esta avaliao tambm pode ser feita para os complexos formados entre
fusidato (ou helvolato) e a -CD, comparados com os sais biliares, evidenciando valores de

118
max
mais baixos para queles complexos. Isto pode ser explicado atravs da anlise das
estruturas propostas a partir dos experimentos ROE. Nos sais biliares tem-se a cadeia lateral
como uma parte da estrutura molecular facilmente flexvel. Porm, no caso do helvolato e
fusidato, tem-se esta parte da cadeia lateral como a mais rgida, devido a dupla ligao
carbono-carbono. Portanto, a cadeia lateral dos sais biliares pode adquirir uma conformao
dobrada dentro da cavidade da -CD, permitindo que os anis C (parcialmente) e D
(totalmente) sejam includos dentro da cavidade.
20
Esta observao corrobora com o maior e
significativo nmero de interaes entre o esqueleto esteroidal e a cadeia lateral nos sais
biliares com a cavidade da ciclodextrina, comparado aos dois antibiticos, levando a valores
mais elevados de K
11
para os complexos formados com os sais biliares.
21
Presume-se que a
menor incluso dos dois antibiticos esteroidais, fusidato e helvolato, para dentro da cavidade
da -CD comparados aos sais biliares, provavelmente devido a existncia do substituinte
acetoxi no C16.
Comentrios similares tambm so aplicveis a K
12
. Os valores de
max
,
C12
para os
complexos de sais biliares so quase duas vezes maior que com fusidato e helvolato e a
segunda -CD, mostrando um maior nmero de interaes no espectro ROESY com os anis
A e B no complexo fusidato que no helvolato. Assim, os valores de K
12
segue a seguinte
ordem, sais biliares > fusidato > helvolato. A partir dos valores da constante de equilbrio
conclui-se que tanto o fusidato quanto o helvolato so considerados maus hspedes ditpicos
para a -CD comparados aos sais biliares diidroxlicos,
20
e portanto iro conduzir a
conglomerados supramoleculares mais fracos quando complexados por dmeros de -CD.
19,

20

A Tabela 5.10 apresenta as interaes intermoleculares observadas entre os
respectivos hspedes (fusidato ou helvolato) e a molcula hospedeira (-CD). A partir das
observaes obtidas dos experimentos ROE, obtm-se algumas consideraes:
i) possvel observar ausncia de interao com os hidrognios da regio central da
estrutura molecular (anis C e D)

119
ii) so verificadas interaes correspondentes a dois grupos localizados em distintas
posies do ncleo esteroidal, queles correspondentes regio da cadeia lateral e os
correspondentes aos anis A e B. Esta anlise sugere que duas molculas de -CD esto
envolvidas no processo de complexao em diferentes regies. Isto poderia
corresponder existncia de dois complexos 1:1 diferentes ou formao de complexo
1:2, no qual duas molculas de -CD estariam simultaneamente complexando uma
molcula hspede.
iii) praticamente no foi observada interao entre os hidrognios dos anis C e D do
fusidato e helvolato
iv) nenhuma interao foi observada no espectro ROESY entre a cadeia lateral e o
esqueleto esteroidal dos respectivos antibiticos, sugerindo uma cadeia lateral rgida
(no dobrada), diferente do que ocorre nos sais biliares
v) interaes importantes foram observadas entre a cadeia lateral rgida destes antibiticos
e a primeira molcula de -CD no complexo 1:2
vi) atravs do espectro ROESY, foi demonstrado que a segunda molcula de -CD mostra
um maior nmero de interaes com os anis A e B no fusidato que no helvolato
vii) para a -CD, H3 sempre aparece como um dos tomos de interao da -CD, porm h
uma notvel ausncia de interaes com os hidrognios H5 e H6. Isto sugere que os
esterides incorporam a cavidade da -CD atravs de sua borda secundria, como
ocorre com os sais biliares e a -CD.
20, 21

A partir das consideraes anteriores, deduz-se a estrutura dos complexos formados
entre os dois antibiticos, fusidato e helvolato, na presena de - e -CD, e estes esto
representados esquematicamente na Figura 5.44.

120

COO
-
OH
OH
OCOCH
3
H
3
5
6

(a)
COO
-
OCOCH
3
H
O
COCH
3
O
3
5
6

(b)
COO
-
OCOCH
3
H
O
COCH
3
O
3 5 6
3
5
6

(c)
3 5 6
COO
-
OH
OH
OCOCH
3
H
3
5
6

(d)

Figura 5.44 - Estruturas esquemticas para os complexos formados entre (a) fusidato de sdio e -CD; (b)
helvolato de potssio e -CD; (c) helvolato de potssio e -CD; e (d) fusidato de sdio e -CD.

5.3.3 - Complexos CHAPS e CHAPSO: -CD
Como j havia sido comentado anteriormente, CHAPS e CHAPSO so compostos
com estruturas anfiflicas semelhantes aos sais biliares, e tambm possuem a propriedade de
formar agregados micelares. Devido as mesmas restries mencionadas para o estudo dos
complexos de incluso dos antibiticos esteroidais, cidos fusdico e helvlico, tambm
utilizado nestes experimentos o mtodo da variao contnua (J ob), como o mais apropriado
para estudo destes sistemas.
A Figura 5.45 mostra a curva de J ob para os carbonos de uma unidade de glicose de -
CD para o complexo CHAPS: -CD e CHAPSO: -CD. Os pontos representam os valores
experimentais e as linhas so o resultado do ajuste matemtico destes dados, para obter o
valor da constante de equilbrio de formao do complexo.

121
O mximo da curva observado em 0,5, o que sugere a formao de complexo de
estequiometria 1:1 para os dois complexos CHAPS:-CD e CHAPSO:-CD, sendo da mesma
estequiometria que os antibiticos estudados anteriormente e os sais biliares.
20, 21

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
o
b
s
*
R
M
-
C
D
/
p
p
m
RM
-CD
1C
4C
3C
2C
5C
6C
(a)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
o
b
s
*
R
M
-
C
D
/
p
p
m
RM
g-CD
1C
4C
3C
2C
5C
6C

(b)

Figura 5.45 - Curva de Job obtida com os deslocamentos qumicos dos carbonos da -CD para o
complexo (a) CHAPS:-CD e (b) CHAPSO:-CD. ([CHAPS]=[CHAPSO]=[-CD]=10mM; 75 MHz.

Os valores das constantes de equilbrio de formao dos complexos (CHAPS)
1
:(-
CD)
1
e (CHAPSO)
1
:(-CD)
1
tambm foram calculados atravs do programa Origin 6.0,
utilizando a equao (3.20), atravs de um ajuste global por mnimos quadrados no linear
para os tomos de carbono e estabelecendo a condio de um valor de K
11
constante em todas
as sries e diferentes valores de
max
para cada srie de tomos de carbono.
A Figura 5.46 mostra a variao dos deslocamentos qumicos observados (
obs
) dos
tomos de carbono da -CD em funo da concentrao inicial de (a) CHAPS e (b) CHAPSO
([CHAPS]
o
e [CHAPSO]
o
). Os dados experimentais so representados por pontos e as linhas,
o resultado do ajuste da equao (3.20) como complexo de estequiometria 1:1.

122
0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010
-0.02
0.00
0.02

e
r
r
o
r

r
e
s
i
d
u
a
l
[CHAPS]/M
-0.2
-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
1C
4C
3C
2C
5C
6C

o
b
s
/
p
p
m

(a)
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010
-0,01
0,00
0,01

e
r
r
o

r
e
s
i
d
u
a
l
[CHAPSO]/M
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
1C
4C
3C
2C
5C
6C

o
b
s
/
p
p
m

(b)
Figura 5.46 -
obs
para diferentes tomos de carbono da -CD complexada com (a) CHAPS e (b)
CHAPSO.

De acordo com a avaliao do ajuste terico representado pela anlise de erros
residuais para cada tomo de carbono e anlise global dos dados segundo modelo proposto
para formao de complexos 1:1, possvel assumir ajustes satisfatrios para a estequiometria
1:1, com os seguintes valores da constante de equilbrio:
K
CHAPS:-CD
=(3,6 0,4)10
3
L. mol
-1

K
CHAPSO:-CD
=(2,8 0,2)10
3
L. mol
-1

Pode-se observar que os valores das constantes de equilbrio so de mesma ordem de
magnitude que os obtidos para os sais biliares.
21
Este fato sugere que o esqueleto esteroidal
incorpora-se no interior da cavidade da ciclodextrina, j que esta a parte comum da estrutura
destes hspedes. Esta suposio ser confirmada atravs de estudos ROE.
A Tabela 5.11 mostra os valores obtidos para
max.
para os carbonos da -CD.
Destaca-se o erro pouco significativo nestes parmetros, resultado de um bom ajuste dos
dados experimentais ao modelo proposto (complexo 1:1).


123
max
obtidos para os tomos de carbono da -CD aps complexao com CHAPS e
CHAPSO.
Carbonos
CHAPS
max
/ppm
CHAPSO
max
/ppm
C1 0.74400.0095 0.76420.0075
C2 0.03890.0076 0.04980.0058
C3 0.16160.0077 0.17670.0059
C4 0.76830.0096 0.78700.0076
C5 0.28420.0079 0.29370.0060
C6 -0.15640.0077 -0.14730.0058

Como nos casos anteriores, foram realizados espectros ROESY para determinao da
estrutura do complexo, os quais so demonstrados nas Figuras 5.47 para o CHAPS e 5.48 para
o CHAPSO. A anlise segue a mesma sistemtica j comentada para o fusidato de sdio e
helvolato de potssio, o que torna desnecessria uma discusso mais detalhada, limitando-se
descrio das interaes observadas (ver Tabela 5.12) e respectivas estruturas propostas
(Figuras 5.49 para o CHAPS e 5.50 para o CHAPSO):
i) As interaes do H3 com os hidrognios da cadeia lateral e os anis C e D so
particularmente fortes
ii) Os hidrognios da cadeia lateral somente interagem com os hidrognios bastante
prximos e no com os dos anis da prpria estrutura
iii) Praticamente no foi observada interao dos hidrognios da -CD com os do anel A.
Assim, presume-se que os esterides entram na cavidade da -CD atravs da cadeia
lateral, assim como ocorre com os sais biliares, indo at o anel B e se afastam atravs da
mesma regio. Esta observao est justificada pela quase inexistncia de interao com
os hidrognios pertencentes ao anel A do esqueleto esteroidal.
iv) Os sinais pertencentes aos H(25) quando livres, tanto para o CHAPS quanto CHAPSO,
aparecem com um nico deslocamento qumico, porm ocorre desdobramento devido
ao fenmeno de complexao com a -CD, o que parece indicar uma certa rigidez da
cadeia lateral.

124
(ppm)
4.8 4.0 3.2 2.4 1.6 0.8
4.8
4.0
3.2
2.4
1.6
0.8
(ppm)

Figura 5.47 - Espectro ROESY do complexo CHAPS:-CD, em D
2
O, 500MHz.

(ppm)
4.8 4.0 3.2 2.4 1.6 0.8
4.8
4.0
3.2
2.4
1.6
0.8
(ppm)

Figura 5.48 - Espectro ROESY do complexo CHAPSO:-CD, em D
2
O, 500 MHz.

125
Tabela 5.12 - Interaes observadas no ROESY (solues 10 mM de -CD e 10mM de CHAPS ou CHAPSO,
em D
2
O, pH natural ) entre hidrognios (Pn) do CHAPS ou CHAPSO e hidrognios (Hn) da -CD.
-CD
CHAPS CHAPSO
Localizao tomo de
C
H-3 H-5 H-6 H-3 H-5 H-6
P-1
P-2
P-3
Anel A
P-4
Anel A/B P-5

P-6 m F Anel B
P-7
P-8

Anel B/C
P-9 m

P-11 F F Anel C
P-12 m F F F F
P-13 Anel C/D
P-14 F

P-15 F F m F m
P-16 F m
Anel D
P-17 F F F
Anel C/D P-18 F F F m F F
Anel A/B P-19 F F F F
P-20 f
P-21 F F
P-22 f F m
P-23 m f
P-24
P-25 f f f
P-26 F F
P-27 m
P-28 m f m m m
P-29 m m m
P-30 F F F m f m
P-31 F F F m F m
Cadeia
lateral
P-32 F F F m F m
Representao: interaes fracas (f), mdias (m), fortes (F) e ausncia de interaes (em
branco).

126

Figura 5.49 - Representao espacial do complexo CHAPS:-CD.

127

Figura 5.50 - Representao espacial do complexo CHAPSO:-CD.

5.3.4 - Complexos CHAPS e CHAPSO: -CD
No caso das substncias CHAPS e CHAPSO, os estudos dos complexos de incluso
na presena de - e -CD, demonstraram comportamentos diferenciados de intercmbio do
hspede em relao escala de tempo de RMN. Assim com a -CD, como ser visto a seguir,
foi verificado um processo de intercmbio lento da molcula hspede (CHAPS ou CHAPSO),
enquanto que com a -CD o intercmbio rpido. Portanto, antes de iniciar-se o estudo
detalhado destes sistemas, importante mencionar que :
O sistema est sob regime de intercmbio rpido, se o processo de entrada e sada da
molcula hspede for bastante rpido em comparao com a escala de tempo de RMN.

128
Neste caso, somente se detecta um nico sinal, cuja posio ser o ponto mdio das
espcies presentes em soluo (ciclodextrina livre e complexada).
154

Por outro lado, o sistema est sob regime de intercmbio lento, se o processo de entrada e
sada da molcula hspede for bastante lento em comparao com a escala de tempo de
RMN. Aqui, a deteco do sinal mais rpida que a entrada e sada do hspede do interior
da ciclodextrina. Neste caso, detecta-se no espectro de RMN dois estados bem
diferenciados da ciclodextrina (livre e complexada). A intensidade relativa de ambos os
sinais ser proporcional frao de cada uma das espcies presentes em equilbrio.
154

Anlises preliminares de espectros de
13
C correspondentes a uma srie de J ob para
determinao da estequiometria do complexo CHAPS ou CHAPSO e -CD, mostraram
alteraes de alguns sinais pertencentes molcula de -CD. A Figura 5.51 mostra
nitidamente desdobramento dos sinais correspondentes aos carbonos C1, C3 e C4
pertencentes molcula de -CD e no to claramente por estarem bastante prximos, os C2
e C5 da -CD.
Observa-se na Figura 5.51 um decrscimo gradual na intensidade dos sinais
correspondentes -CD livre em soluo medida que diminui sua concentrao e aumenta a
de CHAPS ou CHAPSO. Ao contrrio, observa-se um aumento gradual dos sinais dos
carbonos da -CD complexada com o esteride na mesma sequncia de concentraes.
Portanto, o aparecimento de dois sinais para um mesmo carbono na srie de J ob, indicativo
de um processo de complexao por intercmbio lento.
O aparecimento de dois sinais para um mesmo carbono na srie de J ob, deve-se a um
intercmbio lento na complexao. Como j foi mencionado, o intercmbio lento se refere ao
processo global de entrada e sada do hspede do interior da molcula hospedeira ocorrer
mais lentamente que os tempos de medida de RMN de
13
C. No caso de um processo rpido, a
observao seria feita atravs do aparecimento de um nico sinal deslocando-se da posio
referente -CD livre at a posio da -CD complexada.

129
Deve-se eliminar tambm a possibilidade de que a duplicao de sinais seja resultado
do efeito da micelizao tanto do CHAPS como do CHAPSO. Para isto, foram realizados
espectros de
1
H (Figura 5.52) em diferentes concentraes dentro do intervalo de 2-10 mM de
CHAPS ou CHAPSO em D
2
O (sem a presena de -CD). Foi observado que o
desdobramento dos sinais no devido ao processo de auto-associao destas molculas. Os
espectros da Figura 5.52 mostram portanto, que no existe nenhum desdobramento dos sinais,
como observado na presena de -CD.
A Tabela 5.13 tambm demonstra atravs dos resultados, que no existem mudanas
significativas dentro do intervalo das concentraes de 2-10mM dos compostos esteroidais.
Esta anlise foi baseada na relao entre as reas dos sinais das metilas 18 e 19 com as
situadas na cadeia lateral nas posies 31 e 32 (CHAPS), assim como nas reas dos sinais das
metilas 18 e 19 com relao ao 12 (CHAPSO). Estas consideraes permitem descartar que o
desdobramento seja devido formao de auto-agregao (micelas) do CHAPS ou CHAPSO.

Tabela 5.13 - Relao entre as reas dos sinais das metilas nas posies 18 e 19 com a rea dos hidrognios
situados na cadeia lateral do CHAPS (31 e 32) e CHAPSO (prton 12).
rea relativa
CHAPS CHAPSO
Concentrao
mM
A
18
/A
31-32
A
19
/A
31-32
A
18
/A
12
A
19
/A
12

10 0.4836 0.4152 3.0702 3.0858
5 0.4984 0.4105 3.0030 2.7914
2 0.4963 0.4088 2.8559 2.7749


130
62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 102 104 106
62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 102 104 106
62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 102 104 106
62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 102 104 106
(ppm)
62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 102 104 106
62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 102 104 106
62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 102 104 106
62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 102 104 106
(ppm)
SeparatePlot
(a)
(b)
C1 C2,5 C3 C4 C6
C1 C2,5 C3 C4 C6
62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 102 104 106
62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 102 104 106
62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 102 104 106
62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 102 104 106
(ppm)
62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 102 104 106
62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 102 104 106
62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 102 104 106
62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 102 104 106
(ppm)
SeparatePlot
(a)
(b)
C1 C2,5 C3 C4 C6
C1 C2,5 C3 C4 C6

13
C com diferentes concentraes de (a) CHAPS ou (b) CHAPSO e -CD, na
seguinte ordem: 10 mM -CD e 0 mM CHAPS, 7 mM -CD e 3 mM CHAPS, 5 mM -CD e 5 mM CHAPS, 1
mM -CD e 9 mM CHAPS; solues em D
2
O, pH natural (5,0-6,0), 75MHz.

131
0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0
0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0
0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0
(ppm)
12 30 21
19
18
(a)
(b)

1
H com diferentes concentraes de (a) CHAPS e (b) CHAPSO com concentraes
nos espectros em ordem decrescente de 10mM, 5 mM e 2 mM; solues em D
2
O, pH natural (5,0-6,0), 300MHz.

No caso dos esterides fusidato e helvolato, o parmetro experimental utilizado para
determinao da estequiometria e clculo da constante de formao do complexo foi o
deslocamento qumico dos sinais de
13
C, cuja propriedade proporcional concentrao tanto
de -CD como de hspede livres e complexados. Para os compostos CHAPS e CHAPSO na
presena de -CD, os espectros de
1
H foram outra alternativa no estudo dos complexos, em
que a rea dos sinais seria a propriedade a ser considerada no caso de um intercmbio lento.
0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0
0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0
0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0
(ppm)
12 25
21
19
18

132
O passo seguinte consistiu em selecionar os hidrognios, os quais so convenientes de
serem avaliados atravs de suas reas. Neste caso, para esta anlise, deve-se levar em
considerao alguns requisitos tais como: i) que os sinais correspondentes ao mesmo
hidrognio (da molcula associada com a -CD e livre) apaream suficientemente separadas
no espectro; ii) que estes sinais no apaream com o mesmo deslocamento qumico que o
sinal de outro hidrognio da mesma molcula; iii) tendo em soluo dois compostos, que a
anlise leve em considerao a no sobreposio com sinais dos hidrognios da outra
molcula.
Para ilustrar esta problemtica, a Figura 5.53 mostra como exemplo, os espectros do
CHAPS e a -CD puros. A anlise fornece uma idia bastante clara dos sinais que podem ser
descartados e os que devem ser considerados. o caso do sinal do P-7 pertencente molcula
do CHAPS, que no pode ser utilizado em estudos quantitativos, por encontrar-se sobreposto
aos sinais referentes aos H-3, H-6 e H-5 da -CD.
0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0
(ppm)

1
H sobrepostos de CHAPS 10 mM (vermelho) em soluo, com a -
CD 10 mM (preto) (solues em D
2
O, pH natural; 500 MHz).


133
Finalmente, a Figura 5.54 ilustra os sinais do hspede que esto suficientemente
separados entre si para serem analisados como independentes. Deduz-se ento, que os nicos
hidrognios possveis de anlise para determinao da estequiometria e da constante de
formao do complexo, so os dos carbonos 18, 19, 21, 25 e 12 do CHAPS e o 5 complexado
da -CD. Para o CHAPSO, o hidrognio 25 (complexado) no poder ser analisado, uma vez
que aparece com o mesmo valor de deslocamento qumico que os sinais correspondentes s
metilas 31 e 32.
0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8
(ppm)

1
H com diferentes concentraes de CHAPS e -CD: azul escuro: 1 mM -
CD e 9 mM CHAPS; azul claro: 3 mM -CD e 7 mM CHAPS, verde: 5 mM -CD e 5 mM CHAPS;
vermelho: 8 mM -CD e 2 mM CHAPS. Solues em D
2
O, pH 5-6 (natural da soluo), 500 MHz.

A Figura 5.55 mostra claramente o desdobramento dos sinais referentes aos
hidrognios P-18, P-19 e P-21 e deslocamento qumico dos H-6. Observa-se um decrscimo
gradual dos sinais de CHAPS quando est livre em soluo medida que diminui a sua
concentrao e aumenta a de -CD at seu completo desaparecimento. Por outro lado,
observa-se um aumento gradual dos sinais do CHAPS quando se encontra complexado com a
-CD na mesma seqncia de concentraes. Ver tambm a Figura 5.56.

134

1
H com diferentes concentraes de CHAPS 1mM e -CD 9mM (vermelho), CHAPS
5 mM e -CD 5 mM (verde), CHAPS 7 mM e -CD 3 mM (azul claro) e CHAPS 10 mM (azul escuro).
Solues em D
2
O, pH natural (5,0-6,0), 500 MHz. Os smbolos L indicam hidrognios da substncia livre e
C complexada.

18 CHAPS livre
18 CHAPS complexado
19 CHAPS livre
19 CHAPS complexado
21 CHAPS livre
21 CHAPS complexado
1 CHAPS livre
1 CHAPS complexado
15 CHAPS livre
6 CHAPS livre
6 CHAPS complexado
0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 2.2
(ppm)
18 CHAPS livre
18 CHAPS complexado
19 CHAPS livre
19 CHAPS complexado
21 CHAPS livre
21 CHAPS complexado
1 CHAPS livre
1 CHAPS complexado
15 CHAPS livre
6 CHAPS livre
6 CHAPS complexado
0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 2.2 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 2.1 2.2
(ppm)

1
H parciais sobrepostos de CHAPS 2 mM e -CD 8 mM (vermelho), CHAPS 5 mM
e -CD 5 mM (azul escuro), CHAPS 7 mM e -CD 3 mM (azul claro) e CHAPS 8mM e -CD 2 mM (verde);
solues em D
2
O, pH natural (5,0-6,0), 500 MHz.

18L
18C
19L
21L
21C
19C
0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00 1.05 1.10 1.15 1.20 1.25 1.30 1.35 40
(ppm)
6L 6C

135
Uma anlise mais criteriosa demonstra que ocorreu sobreposio da base dos sinais, o
que dificultou a utilizao do sistema de integrao normal oferecido pelos diferentes
programas de anlises dos espectros de RMN disponveis comercialmente. Portanto, para
obteno de valores confiveis a partir das reas a serem analisadas, foi utilizado um
programa em Mathcad Profissional 2001, cujo ajuste de dados de intensidade (I
RMN
-ppm) a
uma funo composta por Lorentzianas simula a zona do espectro de interesse para um
conjunto de sinais. Este programa permite a obteno de uma funo global que melhor
descreva a soma dos sinais, mediante um ajuste dos dados experimentais atravs do mtodo
de Levenberg-Marquardt. Uma vez obtidos os valores referentes aos parmetros da funo
global, estes so separados em funes, os quais descrevem cada um dos sinais e que so
passveis de integrao individual.
No Anexo B, demonstrado um exemplo de ajuste de varias zonas do espectro.
Portanto, a rea dos sinais ser a propriedade a ser considerada e relacionada com a
concentrao do complexo. Uma vez determinadas as reas de cada sinal do espectro,
necessrio buscar uma relao entre a rea e a concentrao do composto a ser avaliado, que
neste caso o complexo. Para esta anlise, necessria a escolha de um hidrognio
considerado como referncia, cujo sinal no apresenta desdobramento e que a rea esteja
diretamente relacionada concentrao inicial do esteride (CHAPS/CHAPSO) ou -CD.
Como hidrognios de referncia foram escolhidas as metilas 31 e 32 para o CHAPS e H-23
para o CHAPSO.
Deste modo, pode-se propor as equaes 5.2-5.4 em que,
[ ] C cte rea
C 1
= (5.2)
[ ]
o A
A cte rea
1
= (5.3)
[ ]
[ ] C
A
cte
rea
o
C
= (5.4)

Nestas equaes, A se refere a um hidrognio de referncia ou padro, C se refere ao
complexo, e rea
C
representa a rea de um hidrognio que sofre influncia no processo de
formao do complexo, diferenciando-se os sinais correspondentes molcula livre e

136
complexada. Neste trabalho de tese foi analisado unicamente os sinais dos hidrognios
referentes molcula complexada.
Finalmente, tendo a (5.4), transformam-se as equaes referentes concentrao em
funo dos deslocamentos qumicos, em equaes as quais relacionam as reas em funo das
concentraes e constante de associao, tanto para um complexo do tipo 1:1 como para 1:2.
Estas podem ser reescritas como:
Complexo 1:1:
[ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]
+ + + + =
o o o o o o
H CD H CD
K
H CD
K
C 4
1 1
2
1
2
11 11
11
(5.5)
Complexo 1:2:
[ ][ ]
[ ] [ ]
2
12 11 11
11
11
1 CD K K CD K
H CD K
C
o
+ +
=
(5.6)
[ ] [ ]
[ ] [ ]
2
12 11 11
2
12 11
12
1 CD K K CD K
H CD K K
C
o
+ +
=
(5.7)

[ ] [ ] [ ] { }[ ] [ ] [ ] { }[ ] [ ] 0 1 1 2
11 11
2
12 12 11
3
12 11
= + + + +
o o o o o
CD CD CD K H K CD CD K H K K CD K K
(5.8)

Antes de prosseguir na obteno das constantes de equilbrio, necessrio conhecer a
estequiometria dos complexos formados, utilizando-se para isto o mtodo de J ob e os
experimentos ROE.
A Figura 5.57 mostra a curva de J ob para a rea dos hidrognios da molcula de
CHAPS em (a) 18, 25 e 12 complexados, (b) 19 complexado e (c) para o hidrognio 5
complexado da -CD. Os pontos representam os valores experimentais e as linhas so o
resultado do ajuste matemtico destes dados. De modo anlogo, a Figura 5.58 mostra os
resultados obtidos para o CHAPSO.

137
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
r
e
a

C
H
A
P
S
*
R
M
C
H
A
P
S
RM
CHAPS
18 complexado
25 complexado
12 complexado

(a)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
r
e
a

C
H
A
P
S
*
R
M
C
H
A
P
S
RM
CHAPS
19complexado

(b)

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
r
e
a

-
C
D
*
R
M
-C
D
RM
-CD
5 complexada

(c)
Figura 5.57 - Curvas de Job das reas dos hidrognios de CHAPS (a) 18, 25 e 12 complexados, (b) 19
complexado e (c) 5 complexado da -CD; solues em D
2
O, pH natural, 500 MHz.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
r
e
a

C
H
A
P
S
O
*
R
M
C
H
A
P
S
O
RM
CHAPSO
18 complexado
12 complexado

(a)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
r
e
a

C
H
A
P
S
O
*
R
M
C
H
A
P
S
O
RM
CHAPSO
19complexado
(b)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
r
e
a

-
C
D
*
R
M
-C
D
RM
-CD
5complexada

(c)
Figura 5.58 - Curvas de Job das reas dos hidrognios de CHAPSO (a) 18 e 25 complexados, (b) 19
complexado e (c) 5 complexado da -CD; solues em D
2
O, pH natural, 500 MHz.

Os resultados anteriores sugerem que os complexos formados entre a -CD e os
compostos CHAPS e CHAPSO apresentam uma estequiometria do tipo 1:1. Como j foi
mencionado, tanto os sais biliares dihidroxlicos,
21
como o fusidato de sdio e helvolato de
potssio estudados nesta presente tese de doutorado, formam complexos do tipo 1:2. Para
confirmar a estequiometria determinada pelo mtodo de J ob, foram analisados os espectros
ROESY dos complexos, cujos resultados so visualizados nas Figuras 5.59 e 5.60 e Tabela
5.14.


138
(ppm)
4.8 4.0 3.2 2.4 1.6 0.8
4.8
4.0
3.2
2.4
1.6
0.8
(ppm)
(ppm)
2.0 1.6 1.2 0.8
2.0
1.6
1.2
0.8
(ppm)

(ppm)4.00 3.80 3.60 3.40 3.20 3.00 2.80
2.0
1.6
1.2
0.8
(ppm)
(ppm) 3.80 3.60 3.40 3.20 3.00 2.80
4.00
3.80
3.60
3.40
3.20
3.00
2.80
(ppm)

Figura 5.59 - ROESY de uma soluo 10 mM de -CD e 10mM de CHAPS (solues em D
2
O, pH natural ) 500
MHz.

139

(ppm)
4.8 4.0 3.2 2.4 1.6 0.8
(p
(ppm)
3.80 3.60 3.40 3.20 3.00
2.0
1.6
1.2
0.8
(ppm)

(ppm)
4.00 3.80 3.60 3.40 3.20 3.00 2.80
4.4
4.0
3.6
3.2
(ppm)

Figura 5.60 - ROESY de uma soluo 10 mM de -CD e 10mM de CHAPSO (solues em D
2
O, pH natural);
500MHz.


140
Tabela 5.14 - Interaes observadas no espectro ROESY (soluo em D
2
O, pH natural, 10 mM de -CD e 10
mM de CHAPS/CHAPSO), entre hidrognios (Pn) de CHAPS e CHAPSO e hidrognios (Hn) da -CD.
-CD
CHAPS CHAPSO
Localizao tomo de
C
H-3 H-5 H-6 H-3 H-5 H-6
P-1 m
P-2 m m F f
P-3
Anel A
P-4 m m
Anel A/B P-5
P-6 m

Anel B
P-7 m m m
P-8 Anel B/C
P-9 F F
P-11 m Anel C
P-12 F f F f
P-13 Anel C/D
P-14
P-15

P-16 f
Anel D
P-17

Anel C/D P-18 F f f F f
Anel A/B P-19 m m
P-20 m
P-21 F F F F F F
P-22 F m F
P-23 f f
P-24
P-25 F F f
P-26 F F
P-27 F
P-28 F m m F m m
P-29 f f m f
P-30 F m m F m m
P-31 F F F F F F
Cadeia
lateral
P-32 F F F F F F
Representao: interaes fortes (F), mdias (m) , fracas (f) e ausncia de interaes (em
branco).

A anlise do espectro bidimensional ROESY, diferencia claramente dois grupos de
sinais, queles correspondentes ao CHAPS/CHAPSO e -CD formando o complexo
(possuindo correlaes) e queles correspondentes tanto ao CHAPS/CHAPSO quanto -CD
livres (este ltimo grupo com ausncia de interaes). Os resultados obtidos conduzem a
algumas consideraes:
i) Os sinais das metilas 19, 18 e 21 livres no apresentam interao com a -CD.

141
ii) Tanto para o CHAPS quanto para o CHAPSO, no existem interaes
intramoleculares entre os hidrognios pertencentes cadeia lateral e os dos anis a
partir do C23 inclusive, o que sugere uma cadeia lateral mais rgida e em sua forma
estendida.
iii) Os sinais pertencentes aos H-25 quando livres, tanto para o CHAPS quanto CHAPSO,
aparecem com um nico deslocamento qumico. Porm se desdobram e mostram
deslocamentos qumicos e constantes de acoplamento distintos por ocorrncia de uma
certa rigidez desta regio da cadeia, resultado do efeito da complexao com a -CD.
iv) A entrada de apenas uma molcula de -CD pela regio da cadeia lateral, no justifica
o desdobramento da metila 19 em dois sinais distintos no processo de complexao, j
que a -CD no possui dimetro suficiente para atingir a referida estrutura at metade
destes anis.

A partir das consideraes, observa-se ento que:
i) Os grficos de J ob sugerem a formao de complexos 1:1
ii) Os espectros ROESY parecem indicar que participam do processo de complexao
duas molculas de -CD, uma atravs da regio da cadeia lateral do esteride e outra
atravs do anel A, ambas pela parte mais larga da cavidade da -CD. Isto quer dizer
que estes espectros sugerem a existncia de complexos 1:2.

Portanto, observa-se uma contradio entre ambos os experimentos.
Outra maneira de interpretar estes resultados, sem que ocorra contradio entre os
dados obtidos dos espectros ROESY e a representao de J ob seria considerar a possibilidade
de formao de dois complexos 1:1 diferentes em soluo. Os dados dos espectros ROESY
seriam idnticos nos dois casos, tanto para complexo 1:2 (duas molculas de -CD para uma
de esteride), quanto para dois complexos 1:1 diferentes, com uma molcula de -CD
complexando atravs da regio dos anis em uma molcula de esteride e outra -CD atravs
da cadeia lateral em outra molcula de esteride.


142

A possibilidade de existncia de dois complexos 1:1 diferentes em soluo, conduz
diviso dos hidrognios do esteride em duas regies distintas, os que se encontram prximos
do anel A e os que se encontram na regio da cadeia lateral. Assim, pode-se analisar
separadamente as reas das duas regies de acordo com a equao (5.4) e obter valores
distintos para cada uma das duas micro-constantes de associao que correspondem aos dois
complexos separados. Estas constantes sero denominadas
X
K
11
e
Y
K
11
. Os hidrognios
analisados presentes nestas duas regies so os H-12, H-18 e H-25, correspondentes regio
da cadeia lateral, e o H-19 correspondente ao anel A do hspede. Evidentemente esta anlise
somente se refere aos sinais dos hidrognios do hspede, j que a anlise dos sinais da
ciclodextrina conduzem obteno de uma macro-constante de equilbrio.
Com os devidos ajustes em um programa Origin 6,0 obtm-se atravs do mtodo
Levenberg-Marquardt os resultados apresentados na Tabela 5.15 e Figura 5.61.

Tabela 5.15 - Resultados dos ajustes das reas de hidrognios do CHAPS e CHAPSO, no qual descreve um
comportamento de complexo 1:1.
regio CHAPS CHAPSO
10
3 X
K
11
/M 1,390,39 2,91,1
2
0.0048 0.0038
Cadeia
lateral
R
2
0.9944 0.9944
10
3 Y
K
11
/M 1,340,59 1,480,67
2
0.0116 0.0078
anel A
R
2
0.9931 0.9932


143

0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
r
e
a

C
H
A
P
S
18complexado
25complexado
12complexado
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010
-0,2
-0,1
0,0
0,1
r
e
s
i
d
u
o
s
[-CD]/M

(a)
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
r
e
a

C
H
A
P
S
19complexado
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010
-0,2
0,0
0,2
r
e
s
i
d
u
o
s
[-CD]/M

(b)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
r
e
a

C
H
A
P
S
O
18complexado
12complexado
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010
-0,1
0,0
0,1
r
e
s
i
d
u
o
s
[-CD]/M

(c)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
r
e
a

C
H
A
P
S
O
19complexado
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010
-0,2
0,0
0,2
r
e
s
i
d
u
o
s
[-CD]/M

(d)
Figura 5.61 - Curvas experimentais e tericas da rea dos hidrognios do CHAPS (a) e CHAPSO (c) regio da
cadeia lateral, CHAPS (b) e CHAPSO (d) regio do anel A; solues em D
2
O, pH natural.

No entanto, as reas dos sinais dos hidrognios da -CD podem ser analisadas para
obter relaes entre as constantes. Neste caso, utilizam-se as equaes de equilbrio de
formao (5.9) e (5.10) dos complexos X e Y e as de balano de matria (5.11) e (5.12),
CD+ H X
X
K
11
(5.9)
CD+ H Y
Y
K
11
(5.10)
] [ ] [ ] [ ] [ Y X CD CD
o
= (5.11)
] [ ] [ ] [ ] [ Y X H H
o
= (5.12)

144
sendo CD, a -CD livre em soluo; H, o esteride (CHAPS ou CHAPSO) livres em soluo;
X e Y, os dois complexos 1:1 que se formam; [CD]
o
, a concentrao inicial de -CD e [H]
o
, a
concentrao inicial de CHAPS ou CHAPSO.
Os sinais dos hidrognios da -CD complexada, os quais correspondem ao complexo
X e Y, podem ser observados em deslocamentos qumicos diferentes e a equao que relaciona
as reas ser obtida pela (5.13),
( ) ] [ ] [
] [
Y X
CD
cte
rea
o
CD
+ =
(5.13)

Neste caso, o ambiente eletrnico das duas -CD, a que entra atravs da regio do anel
A e da cadeia lateral so to semelhantes, que no existe diferena nos deslocamentos
qumicos dos sinais dos hidrognios que correspondem a -CD complexada, e os sinais que se
observam no espectro correspondente a uma combinao dos dois complexos. Assim, a
deduo das equaes que leva obteno das constantes para um complexo de
estequiometria 1:1 obtida a partir das equaes (5.14)-(5.16) para as concentraes de
complexos X e Y e de -CD livres em soluo,
] )[ ( 1
] ][ [
] [
11 11
11
CD K K
H CD K
X
Y X
o
X
+ +
= (5.14)

] )[ ( 1
] ][ [
] [
11 11
11
CD K K
H CD K
Y
Y X
o
Y
+ +
= (5.15)

0
] [
] [
1
] [ ] [ ] [
11 11 11 11
2
=
+
+
+ +
Y X
o
Y X o o
K K
CD
CD
K K
CD H CD (5.16)

Considerando
Y X XY
K K K
11 11 11
+ = e substituindo as equaes (5.14) e (5.15) na equao
(5.13), obtm-se a equao (5.17),


145
+
=
] [ 1
] ][ [
] [
11
11
CD K
H CD K
CD
cte
rea
o
o
CD
(5.17)

A equao (5.17) indica que todo o conjunto comporta-se como um equilbrio de um
nico pseudo-complexo. Porm neste caso, a obteno da constante se d atravs da soma das
constantes dos equilbrios dos complexos X e Y demonstrados anteriormente.
Resolve-se a equao de segundo grau e substitui-se a concentrao de -CD na
equao (5.17). Os dados das reas do sinal do hidrognio 5 da -CD complexada so
ajustados atravs do Programa Origin 6,0. Os resultados so mostrados na Tabela 5.16 e
Figura 5.62.

Tabela 5.16 - Resultados dos ajustes das reas dos hidrognios do CHAPS e CHAPSO na qual descreve
comportamento do pseudo-complexo 1:1.
CHAPS CHAPSO
10
3
) (
11 11 11
Y X XY
K K K + = /M
2,200,60 2,91,5
2
0.00033 0.00124
R
2
0.9979 0.9936

0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
r
e
a

-
C
D
5complexada
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010
-0,03
0,00
0,03
r
e
s
i
d
u
o
s
[CHAPS]/M

(a)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
r
e
a

-
C
D
5 complexada
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010
-0,04
0,00
0,04
0,08
r
e
s
i
d
u
o
s
[CHAPSO]/M

(b)
Figura 5.62 - Curvas experimentais e tericas da rea do hidrognio 5 da -CD complexada
com (a) CHAPS e (b) CHAPSO; solues em D
2
O, pH natural (5,0-6,0).

Considerando que os sais biliares, fusidato de sdio e helvolato de potssio formam
complexos 1:2 com a -CD, cabe neste momento perguntar as razes pela ausncia de tal

146
complexo para o CHAPS e o CHAPSO? A seguir, estas questes interessantes sero
analisadas.
Considerando a formao de dois complexos diferentes 1:1, uma possvel formao de
um complexo 1:2 requer a introduo de uma segunda unidade de ciclodextrina em qualquer
dos complexos 1:1 indicados. De forma esquemtica, esta situao pode ser representada na
Figura 5.63 para qualquer hspede ditpico com duas posies de complexao X e Y no
equivalentes. Este sistema se assemelha aos equilbrios de protonao de um aminocido, os
quais foram analisados por Alvarez Parrilla et al.
153
para a complexao do cido 6-(p-
toluidin) naftalen-2-sulfnico (TNS) (ver Figura 3.3).

X
K
11
Y
K
11
Y
K
12
X
K
12
X Y
X
C
11
Y
C
11
12
C
X
K
11
Y
K
11
Y
K
12
X
K
12
X Y
X
C
11
Y
C
11
12
C

Figura 5.63 - Formao de um complexo 1:2 de um hspede ditpico a partir de dois possveis
complexos 1:1.

Neste sistema, observa-se que,
X Y Y X
K K K K
12 11 12 11
= (5.18)

Considerando que,
Y X
C C C
11 11 11
+ = (5.19)

pode-se definir as macro-constantes de equilbrio
XY
K
11
e
XY
K
12
,
Y X XY
K K K
11 11 11
+ = (5.20)

147

Y X
Y X
XY
K K
K K
K
12 12
12 12
12
+
=
(5.21)

em que as micro-constantes
X
K
11
,
Y
K
11
,
X
K
12
e
Y
K
12
so definidas a partir do esquema da Figura
5.63.
Definindo-se o parmetro de cooperao
XY
,
Y
Y
X
X
XY
K
K
K
K
11
12
11
12
= =
(5.22)

a equao 5.21 pode ser reescrita como,
XY
Y X
XY XY
K
K K
K
11
11 11
12

= (5.23)

O significado do parmetro de cooperao introduzido por Connors et al.,
22, 23

compreendido mais facilmente a partir de duas situaes extremas. Em primeiro lugar, se a
complexao de ambos os pontos se faz de forma independente (isto , a presena de uma
unidade de ciclodextrina no influencia na complexao da segunda posio), ento
X X
K K
12 11
= e
Y Y
K K
12 11
= e portanto 1 =
XY
. Ao contrrio, se a presena de uma unidade de
ciclodextrina influencia na complexao da segunda posio at ao ponto de imped-la, isto ,
0
12 12
= =
Y X
K K e 0 =
XY
. Portanto, valores pequenos de
XY
indicam que a formao do
complexo 1:2 a partir de qualquer dos dois complexos 1:1 est bastante desfavorecida.
Os valores publicados para a complexao do TNS
153
permitem calcular um valor de
XY
igual a 0,066 enquanto que Connors et al.,
22, 23
ao estudar a complexao de diversos
derivados simtricos disubstitudos do benzeno e bifenilas por -CD, obtiveram valores para
este parmetro, que se encontram nos intervalos de 11,7-0,071 e 33-0,5 para os derivados do
benzeno e bifenilas, respectivamente.

148
A no observncia de uma concentrao significativa de complexo 1:2, sugere que o
valor do parmetro
XY
para os sistemas aqui estudados deve ser muito pequeno. Utilizando
os dados experimentais, tem sido feitas tentativas de otimizao com base no esquema de
equilbrios representado na Figura 5.63. Os resultados obtidos sugerem que, efetivamente o
valor do parmetro
XY
bastante prximo a zero. Esta concluso concordante com a
determinao das constantes microscpicas
X
K
11
e
Y
K
11
, bem como com a macroscpica
XY
K
11
,
podendo comprovar a consistncia do modelo proposto para estes sistemas. Efetivamente, os
valores das constantes obtidas das Tabelas 5.15 e 5.16, mostram dentro do erro experimental,
uma concordncia excelente.

Estrutura dos complexos
A partir dos espectros ROESY, possvel propor a estrutura dos complexos de
incluso 1:1, que se formam entre o CHAPS e o CHAPSO com a -CD. As mesmas so
apresentadas nas Figuras 5.64 e 5.65.

149

Figura 5.64 - Representao espacial do complexo CHAPS:-CD.


150
Figura 5.65 - Representao espacial do complexo CHAPSO: -CD.

6 - CONCLUSES

Com relao aos estudos referentes ao furoato de diloxanida(FD), conclui-se que:
A determinao do valor da constante de formao do complexo, atravs do mtodo de
solubilidade, segundo Higuchi et al., foi de 427,4 M
-1
com um perfil do tipo Bs,
coincidente com o estudo determinado por Nieto Reyes , cujo valor da constante foi de
430,0 M
-1
.
As condies experimentais pelas quais se desenvolve o mtodo proposto por Higuchi et
al., indicam que aps 07 dias e a 37
o
C, observa-se hidrlise do FD.
A diferena no valor obtido para a constante de equilbrio ou de formao do complexo
FD/-CD atravs do mtodo cintico com o valor de 517,0 M
-1
comparado ao de
solubilidade de 427,4 M
-1
, pode ser explicado pela competio entre as reaes de
hidrlise e complexao. Isto faz com que diminua o valor da constante atravs do mtodo
de solubilidade e presume-se que o mtodo cintico o que apresenta maior
confiabilidade.
Considerando que no estudo da reao de hidrlise do FD, a -CD promove inibio da
reao com um perfil de cintica de saturao, enquanto que a -CD sulfatada promove
catlise, postula-se um comportamento caracterstico de reaes enzimticas devido
existncia de stios reativos e/ou grupos catalticos presentes na estrutura da ciclodextrina.
Utilizando a equao de Lineweaver-Burk modificada, foram observadas relaes lineares
para a formao dos complexos FD/-CD e FD/-CD sulfatada, confirmando a formao
de complexos 1:1, com valores de K
1:1
de 517,0 e 116,8 M
-1
respectivamente, para a -
CD e -CD sulfatada.
O maior valor da constante de formao do complexo para a -CD em relao a -CD
sulfatada, pode ser explicado pela maior interao da -CD com este frmaco, onde deve
ocorrer uma maior proteo do grupo ster ao ataque da gua, constatado atravs da
inibio da reao de hidrlise.
Concluses

152
O estudo da influncia da fora inica no processo de formao do complexo FD/-CD na
ausncia de KCl, apresentou o valor da constante de 509,0 M
-1
.
No foi possvel determinar a constante de formao do complexo FD/-CD atravs da
tcnica de fluorescncia, provavelmente devido baixa solubilidade do FD em gua e
pouca fluorescncia.
No foi possvel verificar a formao do complexo FD/-CD atravs da tcnica de
Ressonncia Magntica Nuclear de
1
H e
13
C, provavelmente devido baixa solubilidade
do FD em gua e as condies experimentais testadas.

Com relao aos estudos de formao dos complexos de incluso dos compostos
esteroidais: cidos fusdico e helvlico, CHAPS e CHAPSO, atravs das tcnicas de
Ressonncia Magntica Nuclear (RMN) de
1
H e
13
C , conclui-se que:
O assinalamento das molculas de fusidato de sdio, helvolato de potssio, CHAPS e
CHAPSO foram feitas atravs das tcnicas de RMN mono (
1
H,
13
C, DEPT) e
bidimensionais (
1
H-
1
H,
13
C-
1
H, NOESY
1
H-
1
H e ROESY
1
H-
1
H).
Os dados obtidos referentes aos deslocamentos qumicos de
1
H e
13
C para o assinalamento
do fusidato de sdio so similares aos nicos dados publicados at o momento por Barber
et al.
Os estudos de formao dos complexos de fusidato de sdio e helvolato de potssio com
- e -CD por RMN mono e bidimensionais e utilizando o mtodo de J ob, demonstraram
estequiometria do tipo 1:1 com a -CD e 1:2 com a -CD.
Os valores das constantes de formao dos complexos fusidato de sdio e helvolato de
potssio na presena de -CD so K
11
=(60 24)x10
3
L mol
-1
e K
11
=(22 9)x10
3
L mol
-1
,
respectivamente.
-CD forma complexos 1:1 e 1:2 com ambos os esterides, fusidato de sdio e helvolato
de potssio, com valores de K
11
moderados e baixo K
12
, sendo para o fusidato de sdio
K
11
=(0,74 0,13)x10
3
L mol
-1
e K
12
=(0,210 0,075)x10
3
L mol
-1
e para o helvolato de
potssio K
11
=(2,42 0,87)x10
3
L mol
-1
e K
12
=(0,06 0,09)x10
3
L mol
-1
.
Concluses

153
Ambos os esterides, fusidato de sdio e helvolato de potssio, incorporam-se no interior
da -CD atravs da cadeia lateral, atingindo a regio central do esteride (anis C e D),
permanecendo os anis A e B (parcialmente) fora da cavidade.
Na anlise dos complexos fusidato de sdio e helvolato de potssio com -CD, os
espectros ROESY mostraram uma notvel ausncia de interaes dos hidrognios
pertencentes aos anis C e D, enquanto interaes correspondentes aos anis A e B e
cadeia lateral foram fortemente evidenciadas.
Atravs da anlise das estruturas propostas a partir dos experimentos ROE, presume-se
que a menor incluso dos dois antibiticos esteroidais, fusidato e helvolato para dentro da
cavidade da -CD comparado aos sais biliares, seja provavelmente devido estrutura da
cadeia lateral considerada como a parte mais rgida da molcula, devido ligao dupla
carbono-carbono e presena do substituinte acetoxi no C16.
A partir do valor da constante de equilbrio (K
12
) possvel concluir que tanto o fusidato
de sdio quanto o helvolato de potssio no so considerados bons hspedes ditpicos
para a -CD, comparados aos sais biliares diidroxlicos.
Os estudos dos complexos de incluso dos compostos CHAPS e CHAPSO na presena de
- e -CD, demonstraram comportamentos diferenciados de intercmbio do hspede em
relao escala de tempo de RMN. Neste caso, foi verificado um processo de intercmbio
lento da molcula hspede (CHAPS ou CHAPSO) na presena de -CD e intercmbio
rpido para a -CD.
Os estudos de formao dos complexos CHAPS e CHAPSO com a -CD por RMN
monodimensional e utilizando o mtodo de J ob, demonstraram estequiometria do tipo 1:1,
cujos valores so K
11
= (3,6 0,4)x10
3
L mol
-1
e K
11
= (2,8 0,2)x10
3
L mol
-1
,
respectivamente.
A formao de dois complexos distintos 1:1 entre CHAPS ou CHAPSO com a -CD,
permite explicar a contradio existente entre ambos os experimentos, mtodo de J ob e
espectros ROESY, os quais sugerem estequiometrias 1:1 e 1:2 respectivamente.
Espectros ROESY diferenciam claramente dois grupos de sinais, queles correspondentes
ao CHAPS/CHAPSO e -CD formando o complexo (possuindo correlaes), e queles
correspondentes tanto ao CHAPS/CHAPSO quanto -CD livres (com ausncia de
interaes).
Concluses

154
No estudo do complexo com -CD, uma anlise individual dos hidrognios pertencentes
s duas regies da estrutura esteroidal (CHAPS/CHAPSO), os que se encontram prximos
ao anel A e os que se encontram na regio da cadeia lateral, conduzem a distintos valores
da constante de associao (micro-constantes), os quais descrevem um comportamento de
complexo 1:1. A anlise das constantes se refere aos sinais dos hidrognios do hspede, as
quais foram designadas por
X
K
11
e
Y
K
11
, cujos valores para o CHAPS e CHAPSO so
respectivamente, (1,390,39)x10
3
L mol
-1
, (2,91,1)x10
3
L mol
-1
e (1,340,59)x10
3
L
mol
-1
, (1,480,67)x10
3
L mol
-1
.
No estudo do complexo dos esterides CHAPS/CHAPSO com a -CD, uma anlise feita
atravs dos sinais da ciclodextrina leva obteno de uma macro-constante de equilbrio
(
XY
K
11
) igual a soma das micro-constantes, cujo valor para o CHAPS e CHAPSO so
respectivamente, (2,200,60)x10
3
L mol
-1
e(2,91,5)x10
3
L mol
-1
.
Os valores das constantes
X
K
11
,
Y
K
11
e
XY
K
11
, mostram uma excelente concordncia dentro
do erro experimental aceitvel, corroborando com a no observncia de uma concentrao
significativa de complexo 1:2 (curvas de J ob e espectros ROE) e com o modelo proposto
para complexos distintos 1:1.

Perspectivas de Trabalho

155

7 - PERSPECTIVAS DE TRABALHO

Em trabalhos de pesquisa, alm da soluo aos problemas inicialmente propostos,
novas possibilidades de campo de atuao so estabelecidas no transcorrer da investigao
cientfica, gerando novas perspectivas de trabalho e propostas a serem analisadas em um
futuro prximo. O projeto de pesquisa desenvolvido nesta tese de doutorado aponta alguns
aspectos a serem abordados como propostas de futuros temas, tais como:
a) Estudar a catlise na hidrlise do furoato de diloxanida com a -CD e -CD sulfatada,
assim como catalisadores bsicos como proposta de modelo de catlise enzimtica.
b) Estudar o efeito das ciclodextrinas na estabilidade qumica de outras substncias
farmacuticas de interesse em soluo aquosa.
c) Preparar os complexos de incluso no estado slido dos compostos esteroidais fusidato de
sdio e helvolato de potssio, por tcnicas de macerao, liofilizao, coprecipitao,
evaporao, etc.
d) Caracterizar os complexos de incluso no estado slido atravs de anlises trmicas,
espectroscopia IV, raios X, RMN, etc.
e) Utilizar derivados de ciclodextrinas, como os hidrofbicos (alquiladas ou alciladas) ou
hidroflicos (hidroxi-propil-ciclodextrina ou sulfobutileter-ciclodextrina), a fim de obter
informaes com relao a formulaes de liberao controlada e imediata,
respectivamente.
f) Aprofundar os estudos com relao a sistemas em ciclodextrinas contendo hspedes
ditpicos, a fim de determinar as constantes de equilbrio microscpicas.
Conclui-se que um dos campos de futura atuao poderia ser a busca por hspedes
ditpicos que demonstrem participao ou no nos processos de cooperao. Estes serviro
como modelos vlidos para conhecimento das interaes ligante-protena (entendendo por
ligante qualquer tipo de molcula neutra, on ou radical). Neste sentido vale mencionar que a
interao de esterides em ciclodextrinas tem sido usada como modelo para as interaes
esteride-protena e para a resoluo de sistemas biolgicos mais complexos.

REFERNCIAS

1- LOFTSSON, T. Effects of cyclodextrins on the chemical stability of drugs in aqueous
solutions. Drug Stability, v.1, p.22-33, 1995.
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Anexos

176

ANEXOS

Anexos

177
ANEXO A - OUTROS ESTUDOS SOBRE AGREGAO DE SAIS
BILIARES

Outros estudos em relao agregao de sais biliares esto sendo realizados h pelo
menos 50 anos, em especial colato (NaC) e desoxicolato de sdio (NaDC) e seus conjugados,
com os aminocidos glicina e taurina. Tem sido empregado nestes estudos, diversas tcnicas
experimentais invasivas e no invasivas, tais como espectrofotometria, condutividade,
calorimetria, cromatografia, densidade, ultracentrifugao, ressonncia de spin, fluorescncia,
tenso superficial e interfacial, osmometria de membrana, crioscopia, ressonncia magntica
nuclear, potenciometria, solubilizao, difuso, viscosidade, presso de vapor, raios-X, etc
(Carey, 1972; Coello, 1993, 1996; Conte, 1984; DAlagni, 1985; Esposito, 1983, 1987;
Giglio, 1988; Kawamura, 1989; Kratohvill, 1984, 1986; Small, 1968; Zana, 1978). Todavia,
existem controvrsias com relao a aspectos fundamentais na estrutura e nmero de
agregao. Em relao ao nmero de agregao, Kawamura (1989) defende um modelo tipo
disco, baseado no proposto por Small, onde os sais biliares formam agregados pequenos com
a face apolar em direo ao interior e a polar voltada para o sistema aquoso (Figura 1.1).

Por outro lado, Giglio (1988) prope aos agregados uma estrutura helicoidal estabilizada
por interaes polares. A superfcie externa definida pela parte apolar dos monmeros e em
direo ao interior esto dispostos os grupos polares (Figura 1.2).

(a) (b) (c) (a) (b) (c)

Figura 1.1- Agregado de um sal biliar segundo modelo tipo disco de Kawamura e
col; a) vista frontal, b) vista superior, c) vista lateral.

Anexos

178

Figura 1.2- Estrutura helicoidal do RbDC segundo Giglio. As linhas descontnuas
representam ligaes de hidrognio (direita) e interaes on-on e on-dipolo
(esquerda).

A determinao da frao de contra-ons associada aos agregados e a elucidao do
ambiente (hidrfobo ou hidrfilo) no interior dos mesmos, permite declinar a favor de um ou
outro dos modelos aqui mencionados. O modelo de Giglio estabelece uma frao de contra-
ons igual a 1, o que sugere agregados eletricamente neutros. Os valores publicados so
relativamente baixos (tanto para os sais di- como trihidroxlicas), j que esto compreendidas
entre os valores de 0 e 0,3 (Coelho, 1993 e 1996; Gustavsson, 1975; J ana, 1991; Lindheimer,
1981; Lindman, 1976, 1980 e 1984; Murata, 1987; Small, 1969). Somente em duas
referncias so constatados valores consideravelmente maiores, como o de 0,7 para o NaC
(Sugihara, 1982) e o de 0,54 para o NaTC (Simers, 1993). Na primeira referncia se faz uso
de um mtodo de determinao questionvel, enquanto que na segunda, o parmetro
avaliado a partir de dados de tenso superficial, indicando os prprios autores que o valor
obtido superior ao real. Estes parmetros mostram evidncias a favor do modelo de
Kawamura, ao menos para agregados de pequeno tamanho.
Por outro lado, a relao de intensidade I
1
/I
3
do primeiro e terceiro sinais do espectro
de fluorescncia do pireno, uma medida da polaridade do microambiente em que se encontra
(Malliaris, 1988). Assim, por exemplo, a referida relao toma o valor de 1,96 em gua
(Hashimoto, 1984; Vethamuthu, 1982) e 0,54-0,61 em ciclohexano (Hashimoto, 1984;
Meyerhoffer, 1991; Zana, 1985). Todos os valores publicados para o pireno no interior dos
Anexos

179
agregados de sais biliares so inferiores a unidade (J over, 1996; Li, 1994; Matsuzaki, 1989;
Meyerhoffer, 1991; Ueno, 1987; Vethamutu, 1982; Zana, 1985), reforando o modelo
proposto por Kawamura, no qual a molcula de pireno est no interior da micela formada pelo
cido biliar, em um ambiente de carter marcadamente apolar.
A controvrsia tambm se estende a outros parmetros como o nmero de agregao e
a concentrao micelar crtica (cmc). Vzquez Tato e col. (Coelho, 1996), realizaram uma
completa reviso dos valores publicados, os quais esto sendo apresentados na Figura 1.3.
Entre as razes que justificam as discrepncias observadas entre os diversos autores, cabe
citar a pouca pureza dos sais biliares utilizados nos experimentos. Do mesmo modo, o pH
apresenta uma importncia fundamental, j que nem sempre se trabalha em condies em que
o cido biliar est totalmente ionizado. Os valores de pKa destes sais so os seguintes: clico,
4,98; desoxiclico, 5,3; gliclico, 3,95; glicodesoxiclico, 4,69; tauroclico, 1,85 e
taurodesoxiclico, 1,93.

0
20
40
60
80
NaC NaDC NaTC NaTDC
0
10
20
30
40
NaC NaTC NaTDC
NaDC
0
100
200
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
NaC NaDC NaTC NaTDC

n
n
cmc/mM
0
20
40
60
80
0
20
40
60
80
NaC NaDC NaTC NaTDC NaC NaDC NaTC NaTDC
0
10
20
30
40
0
10
20
30
40
NaC NaTC NaTDC
NaDC
0
100
200
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
NaC NaDC NaTC NaTDC

n
n
cmc/mM

Figura 1.3- Valores mximos e mnimos publicados para a cmc, nmero de agregao (n),
e frao de contra-ons para os sais biliares: colato de sdio (NaC), desoxicolato de sdio
(NaDC), taurocolato de sdio (NaTC) e taurodesoxicolato de sdio (NaTDC).

Anexos

180
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ANEXO B CLCULO POR INTEGRAO DE REAS PARA
AJUSTE DOS SINAIS EM RMN

Anexos 182
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Anexos 195
Anexos

196
PRODUO CIENTFICA (perodo ago/1997-2003)

Participaes em Congressos

1- BUDAL, R.M.; BRIGHENTE, I.C.; VZQUEZ TATO, J .; YUNES, R.A.
Utilizao de -ciclodextrina sulfatada no estudo da hidrlise do furoato de diloxanida em
soluo aquosa. In: VI Encontro de Qumica da Regio Sul- SBQ/Sul, Maring-PR, 1998.
2- BUDAL, R.M.; DAL MAGRO, J .; BRIGHENTE, I.C.; VZQUEZ TATO, J .;
YUNES, R.A. Estudo Comparativo entre as Constantes de Associao do Furoato de
Diloxanida com -ciclodextrina e -ciclodextrina sulfatada. In: 23
a
Reunio Anual da
Sociedade Brasileira de Qumica/SBQ, Poos de Caldas- MG, 2000.
3- BUDAL, R.M.; J OVER RAMOS, A.; NASCIMENTO, M. G.; YUNES, R.A.;
VZQUEZ TATO, J . Estudos de Formao dos Complexos de Incluso de Fusidato de sdio
e Helvolato de potssio em - e -CD por RMN de
1
H e
13
C. In: 25
a
Reunio Anual da
Sociedade Brasileira de Qumica/SBQ, Poos de Caldas- MG, 2002.
4- BUDAL, R.M.; J OVER RAMOS, A.; NASCIMENTO, M. G.; YUNES, R.A.;
VZQUEZ TATO, J . Estudos de Formao dos Complexos de Incluso CHAPS e CHAPSO
em - e -CD por RMN de
1
H e
13
C. In: 26
a
Reunio Anual da Sociedade Brasileira de
Qumica/SBQ, Poos de Caldas- MG, 2003.

Anexos

197
Artigos Publicados

1- AL-SOUFI, W.; RAMOS CABRER, P.; J OVER, A.; BUDAL, R.M.; VZQUEZ
TATO, J . Determination of second-order association constants by global analysis of
1
H and
13
C NMR chemical shifts. Application to the complexation of sodium fusidate and potassium
helvolate by - and - cyclodextrin. Steroids, 68, 43-53, 2003.
2- J OVER, A.; BUDAL, R.M.; AL-SOUFI, W.; MEIJ IDE, F.; VZQUEZ TATO, J .;
YUNES, R.A. Spectra and structure of complexes formed by sodium fusidate and potassium
helvolate with - and - cyclodextrin. Steroids, 68, 55-64, 2003.
3- BUDAL, R.M.; NASCIMENTO, M.G.; DAL MAGRO, J .; VZQUEZ TATO, J .;
YUNES, R.A. Studies on the Inclusion Complex of Diloxanide Furoate- -Cyclodextrin (Em
elaborao).

Dissertação Ciclodextrina

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CINCIAS FSICAS E MATEMTICAS

. Segundo a estrutura do fusidato de sdio, o H(16) pode apresentar

NaC NaDC NaTC NaTDC

NaC NaDC NaTC NaTDC

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