Inusual humoral de origen natural y celulares mutadas Epitopos

de Hepatitis B Virus en una argentina con infeccin crnica

Paciente con anticuerpos anti-HBs.

Del Virus de la hepatitis srica B (VHB) se extrajo el ADN de un paciente infectado crnicamente con circulacin simultnea de la hepatitis B antgeno de superficie
(HBsAg) y anticuerpos anti-HBs. se obtuvieron genes por PCR directo y secuencias de clon derivado de la S y solapados P. Secuencias de ADN y anlisis
filogentico atribuyen este aislamiento al genotipo A (adw2 serotipo). Cinco de los seis clones de ADN del VHB mostraron mutaciones puntuales dentro y fuera de la
regin hidroflica importante, mientras que el sexto clon mostr un genotipo de una secuencia de aminocidos "de tipo salvaje". se observaron remplazoa en los que
se incluyen tanto la respuesta humoral y / o celular (complejo mayor de histocompatibilidad de clase I [MHC-I] y MHC-II) eptopos de HBV mutantes, tales como
S45A, P46H, L49H, C107R, T125A, M133K, I152F, P153T, T161S, G185E , A194T, G202R, y I213L.Ninguno de estos mutantes estaban individualmente presente
dentro de un clon dado. La sustitucin I213L era el nico observada en los cinco clones que llevan mutaciones no sinnimas en el gen S. Algunas de las
sustituciones de aminocidos se informa, conocidos por ser responsables de la aparicin de mutantes de escape inmune. el reemplazo C107R impide el enlace
disulfuro, perturbando as el primer bucle del HBsAg. La circulacin de algunos de estos mutantes puede representar un riesgo potencial para la comunidad, ya que
ni las vacunas contra la hepatitis B actuales, ni hiperinmune inmunoglobulina de hepatitis B son eficaces para impedir la enfermedad heptica asociada a la
misma. Por otra parte, algunas de las variantes HBsAg registradas pueden influir en la precisin de los resultados obtenidos con las pruebas de diagnstico utilizados
actualmente.
Adems de las infecciones agudas, la hepatitis B (VHB) puede estar asociada con la hepatitis crnica, la cirrosis del hgado, y carcinoma
hepatocelular. Tanto el huesped y los factores relacionados con los virus han sido implicados en la persistencia viral. Entre estos ltimos, la
variabilidad viral es considerado como una estrategia clave en el intento de evitar tanto las respuestas inmunes humorales y celulares. Varios
informes han documentado la aparicin de mutantes de escape de anticuerpos protectores anti-HBs, as como de linfocitos T citotxicos clones
de linfocitos especficos. Las mutaciones espontneas de clulas T en los sitios de contacto del receptor dentro de eptopos virales individuales
pueden derogar o antagonizar el reconocimiento de la correspondiente de tipo salvaje. Tales mutaciones pueden contribuir a la persistencia
viral (antagonismo de receptor de clulas T), aunque su relevancia clnica parece estar limitada . La cubierta de VHB se compone de lpidos
derivados del husped y tres protenas relacionadas: protenas: largo (LHBsAg), mediano (mHBsAg), y pequeos (SHBsAg). La protena S es
la ms importante, est codificada por el gen S, compuesto por 226 aminocidos (aa). Como se observa en la figura 1 , todas las tres protenas
de la envoltura contienen los sitios antignicos SHBsAg. Los anticuerpos dirigidos contra HBsAg confieren inmunidad protectora y son
cruciales para el despacho de VHB en los pacientes, as como los marcadores asociados con una proteccin profilctica tanto activa como
pasiva.

Sin embargo, un estudio reciente llevado a cabo en los pases insulares del Pacfico se ha sugerido que variantes de escape de la vacuna no son
una causa importante para no prevenir la transmisin del VHB en esta rea geogrfica.
Algunos mutantes S pueden afectar a la secuencia de la protena polimerasa de HBV debido a la naturaleza de solapamiento de ambos marcos
de lectura abiertos. Como resultado, las mutaciones en el gen S puede o no afectar el dominio cataltico del gen de la polimerasa y
viceversa. Las mutaciones en el factor determinante y el fragmento correspondiente de la polimerasa viral (A y B las regiones dentro de la
transcriptasa inversa [RT]) se observan con mayor frecuencia entre los portadores crnicos con anticuerpos anti-HBc como el nico marcador
serolgico para el VHB en comparacin con los pacientes HBsAg-positivos.
Las mutaciones fuera de la FCM, alrededor de codones 44 a 49 y 152 a 213 de la protena S, que tambin se han descrito, lo que afecta a varias
de las clulas B y del complejo mayor de histocompatibilidad I (MHC- I) y eptopos de clulas T de MHC-II que podran estar asociados con la
persistencia viral.
En este estudio, se presenta una prueba ms de la infeccin por hepatitis B crnica a pesar de la circulacin simultnea de anticuerpos por lo
general de proteccin anti-HBs. Por otra parte, la deteccin simultnea de S y eptopos del MHC-I y MHC-II-P mutados en un genotipo de un
paciente infectado por el VHB.
MATERIALES Y MTODOS
Paciente.
Se estudi un hombre argentino de 43 aos de edad, con hepatitis B crnica. l no haba sido vacunado contra HBV y no tena factores de
riesgo conocidos para la contratacin de la hepatitis viral, como el abuso de drogas intravenosas, transfusiones, trasplantes, preferencias
sexuales, cirugas y / o estancia prolongada en zonas endemicas del VHB. Sin embargo, su pareja sexual (no vacunadas para el VHB) result
positivo para anti-HBs, anti-HBe, y los anticuerpos anti-HBc total y negativa para HBsAg. Ella recibi una transfusin de sangre en 1986, el
origen de un persistente virus de hepatitis C (VHC). Los sntomas relacionados con la hepatitis viral estuvieron ausentes hasta la fecha.
Ninguno de sus tres descendientes (en la actualidad 20, 16 y 14 aos, respectivamente) presentan marcadores serolgicos de infeccin por el
VHB. La fuente de infeccin de cualquier miembro de la pareja sigue siendo desconocido.
En junio de 2002, el paciente recibi atencin mdica en el Hospital Argerich, en la ciudad de Buenos Aires, exhibiendo la artritis reactiva,
mialgia, transaminasas sricas elevadas (aspartato aminotransferasa, 98 UI / ml; alanina aminotransferasa, 242 UI / ml) y la seropositividad
para HBsAg , HBeAg, anti-HBc total, y anti-HBs anticuerpos (33,6 mUI / ml) y negativos para los anticuerpos anti-HBe. Marcadores
serolgicos para el VHC y el virus de la inmunodeficiencia humana fueron negativos.
La seropositividad simultnea de anticuerpos de HBsAg y anti-HBs se evalu en tres ocasiones y realizada de forma independiente en dos
laboratorios.

Figura 1
Representacin esquemtica de la protena S (posiciones 101 a 160), incluyendo los primero y segundo
bucles, de acuerdo con el segundo modelo propuesto por Carman y col. Crculos sombreados representan
residuos de Cys. Los enlaces disulfuro se muestran mediante barras dobles. Mutado ...
La estructura tridimensional exacta de la protena S es desconocido. Sin embargo, est ampliamente
aceptado que HBs antigenicidad es principalmente dependiente de la conformacin de laun determinante,
colocado dentro de la gran regin hidrfila (MHR) de la HBsAg . El MHR abarca los aminocidos 101 a 160
de la HBsAg y est expuesto en la superficie de ambos viriones y partculas subvirales. Esta regin es
altamente inmunognica y es potencialmente bajo presin selectiva de la sistema inmune. El MHR incluye
una regin conformacional compleja nombrado el determinante que es dependiente de la unin disulfuro
entre los residuos Cys altamente conservadas. Se cree que el factor determinante consiste en dos bucles
mantenidos por puentes disulfuro entre Cys 107 y Cys 138 y 139 y 147. Una gran proporcin de suero anti-
HBs se dirige contra este determinante principal, el principal eptopo de neutralizacin. Las sustituciones
de aminocidos dentro el determinante puede llevar a cambios conformacionales, que a su vez, pueden
afectar a la unin de los anticuerpos neutralizantes. Sin embargo, el significado clnico de la mayora de
estos mutantes es an incierto. La importancia epidemiolgica de tales HBs mutantes con el apoyo de los
informes procedentes de Taiwn, donde el programa de vacunacin contra el VHB se asoci con un
aumento de la prevalencia de los mutantes de HBsAg, coincidiendo con una disminucin de 10 veces en la
tasa de portadores HBs en los nios . Estos datos implicaran que la presin selectiva inducida por la
vacunacin podra promover la aparicin de cepas de la vacuna-resistente.

Los sntomas clnicos desaparecieron despus de 3 semanas, y el paciente se mantuvo asintomtico a partir de entonces. Una biopsia heptica
se realiz en junio de 2003, y la histologa mostr hepatitis crnica con actividad necroinflamatoria moderada, fibrosis y esteatosis. En febrero
de 2004, la carga viral fue de 1,87 10
5
genomas por mililitro de suero (Amplicor HBV MONITOR y Roche Diagnostic Systems, Branchburg,
NJ). Las transaminasas en suero siguieron siendo altas (aspartato aminotransferasa, 181 UI / ml; alanina aminotransferasa, 406 UI / ml). El
paciente no haba recibido tratamiento durante el seguimiento hasta octubre de 2004. Teniendo en cuenta la deteccin simultnea de HBsAg y
anti-HBs, los niveles de transaminasas elevadas, y el ADN del VHB en circulacin, el paciente fue remitido entonces al Laboratorio de
Hepatitis, Departamento de Microbiologa, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, a realizar estudios de biologa
molecular. Despus de eso, la paciente comenz el tratamiento con interfern pegilado alfa 2b (120 g de polietileno glicol-INTRON semanal
durante 6 meses). Se obser decremento inicial en ambas transaminasas sricas de carga y virales. Despus de 1 ao, el paciente todava estaba
en evaluacin clnica y virolgica. Los niveles de transaminasas sricas permanecen todava elevada.
Escrito el consentimiento informado fue proporcionado por el paciente para llevar a cabo todos los estudios aqu descritos. Los resultados
mostrados en este estudio corresponden a una muestra de sangre obtenida antes del tratamiento con interfern.
Serologa.
Las pruebas serolgicas para HBsAg, anti-HBs, HBeAg, anti-HBe, y los anticuerpos anti-HBc total se llevaron a cabo mediante el uso de la
enzima de micropartculas estndar procedimientos de ensayo inmunolgicos disponibles comercialmente (AxSYM, Abbott Laboratories,
Ill). Las pruebas serolgicas para el virus de la inmunodeficiencia humana y el VHC tambin se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones del
fabricante (Abbott).
La amplificacin por PCR.
El ADN viral se extrajo de 100 l de suero mediante el uso de un kit de extraccin de ADN (Macherey-Nagel, Alemania) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. La amplificacin por PCR del gen S (541 pb Spanning posiciones de los nucletidos 256 a 796) se realiz siguiendo
un protocolo descrito previamente utilizando Taq ADN polimerasa y cebadores P7 (sentido, 5'-GTG GTG GAC TTC TCT TTT CAA TC 3 ') y P8
(antisentido, 5'-CGG TA [A / T] AAA GGG ACT CA [A / C] GAT-3'). los productos de PCR abarcan una regin de solapamiento de ambos genes
S y P. Las reglas de Kwok y Higuchi fueron estrictamente seguidas. Su eficacia se evalu de forma rutinaria por anlisis de muestras de suero
negativas conocidas y controles de reactivos.
Clonacin.
Los productos de PCR correspondientes al gen S de HBV del suero del paciente se clonaron en el sistema vector pGEM-T Easy (Promega,
Madison, WI) segn las instrucciones del fabricante. Las colonias de Escherichia coli transformadas se seleccionaron inicialmente para el gen S
de HBV ADN por PCR, y el ADN plasmdico a partir de colonias de PCR-positivos se purific mediante el uso de la lisis de polietileno-glicol;
procedimiento de precipitacin alcalina modificado.
La secuenciacin del ADN.
El ADN de cada clon y a partir del producto de la PCR obtenido a partir de suero fue secuenciado bidireccionalmente mediante el uso de la
qumica de Big-Dye, la terminacin (Applied Biosystems) con cebadores P7 y P8, y los productos de secuenciacin se analizaron con un ABI
3100 Avant-(Applied Biosystems) capilar- secuenciador automtico basado. La secuencia de derivado por PCR se obtuvo a partir de tres
reacciones de secuenciacin independientes.
El potencial tasa de incorporacin errnea Taq ADN dependiente fue investigado bidireccionalmente por secuenciacin de productos de PCR
derivados de un clon de virus de virus GB C / de la hepatitis G como se ha descrito previamente. Un fragmento de ADNc de 325 pb se amplific
por triplicado y se secuenci con especficos cebadores directos e inversos.
VHB anlisis filogentico.
Inicialmente, una alineacin de las secuencias de ADN obtenidas a partir de clones, as como a partir del producto de PCR y a partir de aislados
seleccionados depositados en la base de datos GenBank atribuidos a cada uno de los ocho genotipos del VHB se llev a cabo. El anlisis
filogentico se realiz posteriormente mediante el uso de varios programas incluidos en el paquete Phylip (versin 3.5.c).
El nmero de acceso de secuencias de nucletidos.
Las secuencias de nucletidos se han depositado en el GenBank con los siguientes nmeros de acceso: clones 1-6, DQ350602 a
DQ350607respectivamente; secuencia, derivados de PCR DQ350608 .
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RESULTADOS
Clonacin VHB, la secuenciacin y anlisis filogentico.
El anlisis filogentico de las secuencias de ADN corresponde al gen S de HBV obtenido a partir de seis clones, as como de productos de PCR,
genotipo A asignado a este aislamiento (datos no mostrados). Todos los 16 aminocidos que determinan el subtipo adw2 del HBsAg
demostraron ser conservada cuando se tradujo la secuencia de ADN.
Se detectaron variantes de superficie de la hepatitis B en 5 de los 6 clones analizados, mientras que el restante
exhibieron un virus de tipo salvaje. Ni las inserciones ni eliminaciones se registraron dentro del gen S. Las
mutaciones puntuales de nucletidos Nonsynonymous se asociaron con sustituciones en los codones 45, 46, 49,
107, 125, 133, 152, 153, 161, 185, 194, 202, y 213, algunos de ellos tambin afectan a la polimerasa por superposicin
ORF. Un resumen de la participacin de tales sustituciones en B-, MHC-I-, y eptopos restringidos por MHC-II se
representa en la figura.

La figura. 3.
Se muestran clulas mutadas de T-restricted-eptopos derivados de la protena S y B-. Se observaron eptopos Pol-mutado (se subraya la regin
solapada dentro de la protena S) dentro de los aminocidos 455-463 (L463S en clon 1) y 504-512 (P509H en el clon ...

TABLA 1.
Los cambios de aminocidos en el HBsAg y el marco de lectura abierto de la polimerasa superposicin de los 5 clones que muestran variaciones
en el gen S
un

Anlisis de la S de HBV ORF en los 5 clones con variantes de superficie.
Las secuencias de aminocidos del antgeno S como se deduce del anlisis de secuencia de ADN de estas variantes demostraron
diversidad. Como se muestra en la Tabla , todos los clones mutados mostraron al menos una sustitucin dentro del HBsAg, ya sea dentro y / o
fuera de la MHR, adems del cambio de aminocido I213L. Las mutaciones en el gen S fueron ms frecuentes fuera que dentro de esta
regin. La mayora de las sustituciones de aminocidos dentro de la un determinante se produjo en el primer bucle. Algunas de estas
sustituciones afectadas profundamente el perfil de hidrofilicidad de la protena S, como se observa en. Fig. .

La figura. 2.
Patrones de hidrofilicidad obtenidos para los clones de HBV. Se muestra un anlisis parcial de la protena S (posiciones de aminocidos 101 a
160) que abarca la MHR (programa BioEdit, 1999). La secuencia de aminocidos correspondiente a la de tipo salvaje (wt) secuencia (como se
observa ...
Como se muestra en la Tabla, tres de seis clones exhiben sustituciones de aminocidos dentro de una regin conocida segn los informes
(posiciones 28 a 51) que abarca un eptopo de clase I de clulas T de la HBsAg, al igual que S45A (dos clones), P46H, y L49H. Por otra parte ,
dos clones exhiben intercambios de aminocidos en la clase II, eptopos T auxiliares (posiciones 136 a 155) , como eran I152F y P153T, mientras
que 5 clones mostraron la sustitucin en I213L otra clase II eptopo de clulas T (posiciones 213 a 226).
Cinco clones mostraron variaciones dentro de eptopos de clulas B (HBsAg 44 a 49, 115 a 155, 124 a 147, y 160 a 207)
Un clon exhibi Arg en lugar de Cys en la posicin 107 (C107R), lo que evita la formacin de primer bucle de acuerdo con el ltimo modelo de
Carman.
Anlisis de la ORF de la polimerasa del VHB superposicin en los 5 clones con variantes de superficie.
Como el gen P es en el marco 1 de lectura con respecto al gen S se solapan, tambin se examin la secuencia de aminocidos deducida del
fragmento correspondiente de la polimerasa viral. Este fragmento representa una parte importante de la dominio RT, incluyendo las regiones
B y C, que puede estar asociada con la resistencia a los anlogos de nuclesidos tales como lamivudina. El motivo YMDD, que es esencial para
la actividad enzimtica de muchos RTS, se conserva en los 5 clones que muestran variaciones en el antgeno de superficie. Varios residuos del
fragmento de polimerasa de ADN del VHB que se solapa con el ORF que codifica HBsAg, se vieron afectados por variantes de superficie en este
estudio. La sustitucin en la posicin 569 (I569F) se detect en los 5 clones que muestran variaciones en el antgeno S, pero particip en
ninguno de los eptopos B-nor-clulas T. Esta posicin corresponde al aminocido 213 de HBsAg. Un solo clon exhibi un codn de parada en
la posicin 489 (es decir, la posicin 133 del antgeno S).
Un clon mostr un intercambio de aminocidos en la 455-463 eptopo restringido de MHC-I-(L463S). Los dos clones mencionados
anteriormente que presenta sustituciones de aminocidos en el restringidas por MHC-II 136-155 S eptopo (I152F y P153T) tambin mostraron
las sustituciones correspondientes (H508L y P509H) tanto en el MHC-II 503-517 eptopo Pol y la anidada MHC-I 504-512 Pol eptopo. Hasta
la fecha, no hay eptopos Pol de clulas B se han reportado hasta el momento dentro de la regin amplificada por PCR en el presente
documento se describe.
La secuenciacin directa de los productos derivados de PCR: anlisis de VHB S y ORF polimerasa.
Como era de esperar despus de anlisis de la secuencia de los clones, tambin se detectaron mutaciones dentro de los productos de PCR en las
posiciones 45 (S45A) y 213 (I213L) del gen S. Las mutaciones no sinnimas observadas correspondan a los cambios en la primera base de
ambos codones: un TCA transversin ACG para la ex reemplazo, y una transversin TTA ATA para este ltimo. Coincidentemente, fueron
representados tales sustituciones dentro de la ORF P (I401S y I569F) tambin. En contraste, en ninguna de las sustituciones restantes se
observ como mutaciones en el genoma de un clon dado (de seis estudiado) demostrado ser detectable dentro de la secuencia de los productos
de PCR. No hay evidencia de poblaciones mixtas de HBV en una posicin de nucletido dada se registr en la regin genmica analizada. Doce
nucletidos no podan ser fielmente asignados, aunque todos ellos eran uniformemente la misma base en la posicin correspondiente en todos
los 6 clones analizados. Sin embargo, ninguno de estos nucletidos sin asignar en la secuencia derivada de PCR se encuentra en las posiciones
mutadas como se observa en los clones estudiados. Por lo tanto, la PCR de secuencia ambigedades, sin duda, fueron resueltos por la clonacin
de genes.
DISCUSIN
En este estudio, se detecto un total de 13 intercambios gen S de aminocidos nonsynonymous (S45A, P46H, L49H, C107R, T125A, M133K,
I152F, P153T, Y161S, G185E, A194T, G202R y I213L) se detectaron en cinco de los seis clones analizados en un paciente que mostr hepatitis
crnica activa a pesar de la presencia de (por lo general de neutralizacin) anticuerpos anti-HBs con cocirculantes HBsAg. La secuencia
derivada de PCR confirm ambas sustituciones S45A y I213L. Curiosamente, cuando se obtuvo la secuencia consenso (datos no mostrados), la
sustitucin S45A podra no ser detectado, lo que refleja el hecho de que slo 2 de 6 clones mostraron la base mutada, por lo tanto, haciendo
hincapi en el valor intrnseco de los productos de PCR de secuenciacin, parece probable que si ms clones haban sido secuenciados, la
secuencia consenso y la secuencia de derivado por PCR podra haber sido idntica. Desde intercambio S45A se coloca tanto en un T-y un
eptopo de clulas B (posiciones 44 a 49), esta sustitucin podra ser crucial para el escape inmunolgico, como el caso puede ser para P46H y
L49H.
Las sustituciones restantes antes mencionadas no parecen ser artefactos de PCR, ya que hemos considerado los siguientes elementos: (i) la tasa
de incorporacin errnea informa, conocida de ADNTaq polimerasa por nucletido polimerizado se estima en el rango de 12,1 10
-5
a 8 10
-
6
, (ii) no se observaron mutaciones cuando un virus no relacionado GB / virus de la hepatitis T clon de ADNc se amplific por triplicado y se
secuenciaron bidireccionalmente (975 nucletidos examinaron dos veces), y (iii) la longitud corta (541 pb) de los productos amplificados. Por
otra parte, la probabilidad, P, de que la sustitucin C107R drstica (ver ms abajo) habra producido meramente por casualidad es igual a
0,0005 (1/497 1/4), donde 497 es el nmero de nucletidos de Taq-polimerizadas (entre los cebadores) y 4 es el nmero de posibles
nucletidos en una posicin dada.
Este estudio muestra una infeccin persistente con una mezcla de ambos un as llamado "tipo salvaje" (1 clon) y S variantes de genes (5 clones)
(Tabla (Tabla 1).1 ). A medida que el paciente informado nunca haba recibido la hepatitis B inmunoprofilaxis inmunoglobulina o la vacuna de
HBsAg o estado en la terapia antiviral, se sugiere que las variantes de superficie podran haber surgido o se han seleccionado a pesar de la
presin inmune del husped. La fuente de la infeccin se desconoce en la actualidad. Sin embargo, un supuesto papel de su compaero no
puede descartarse debido a una infeccin oculta pasado eventual (es decir, el ADN del VHB positivo por PCR y HBsAg negativo).
Segn Ogura et al. ( 28 ), mutaciones en el factor determinante durante el curso natural de la infeccin se observan predominantemente dentro
del primer bucle (aa 107-138) ( 5 , 6 , 35 ), mientras que los inducidos bajo presin inmune debido a la inmunizacin activa y / o pasiva se
observan con mayor frecuencia en el segundo bucle (aa 139 a 147) ( 16 , 29 , 31 , 34 ).
En este estudio, no hay cambios de aminocidos se produjeron dentro del segundo bucle, mientras que se observaron tres sustituciones de
aminocidos dentro del primer bucle (C107R, T125A, y M133K) (fig. (Fig. 1,1 , parte superior). Tal aminocido reemplazos podran afectar
significativamente / drsticamente la estructura de bucle y su perfil de hidrofilicidad (Fig. (Fig. 2),2 ), ya que de Cys, Thr, Met y residuos de
exhibir un ndice de accesibilidad de -10, 7.1, y 1.9, respectivamente, en En contraste con la asignada para Arg, Ala, y residuos de Lys (9.8, 2.7, y
10, respectivamente). Adems, C107 es conocido para participar en el enlace de disulfuro de la protena S (fig. (Fig. 1)1 ) y es indispensable para
la secrecin de las partculas de 20 nm ( 24 ). su sustitucin por un cido grande y amino cargado positivamente, tal como Arg, implica la
imposibilidad de mantener la conformacin correcta de la un determinante, evitando de este modo la unin de anticuerpos neutralizantes. Un
participacin significativa de los reemplazos de Cys en la aparicin de variantes a pesar de la presencia de anticuerpos anti-HBs Recientemente
se ha descrito ( 25), aunque es la primera vez que se observa esta sustitucin C107R en particular (cromatograma disponibles bajo peticin).
Las mutaciones fuera de la FCM son frecuentes y tienden a agruparse en dos regiones en torno a los codones 44 a 49 y 152 a 213. La primera
regin contiene tanto un eptopo de clulas T restringido de MHC-I-y un eptopo de clulas B, mientras que la segunda regin, al menos hasta
el aminocido 207, exposiciones ambos MHC-II eptopos auxiliares T (posiciones 136 a 155, 163 a 174, y 213 a 226) (2), as como eptopos de
clulas B ( 14 , 30 ). Tambin se inform ( 14 ) que los cambios dentro de esta segunda regin, que se encuentra inmediatamente aguas abajo de
la un determinante, pueden alterar la conformacin de este determinante inmunognico. De acuerdo con esta idea, Hou et al. ( 17 )
demostraron que las inserciones y deleciones de aminocidos en esta regin abolir la unin a anticuerpos anti-HBs.
Teniendo en cuenta que slo una nica mutacin se observ en todos los cinco clones mutados dentro del antgeno de superficie (I213L), una
bsqueda de GenBank se llev a cabo para determinar su frecuencia entre el VHB en todo el mundo aislamientos. Despus de la alineacin de
genotipo como secuencias parciales de genes (n =
35,incluyendo V00866 , M57663 , X02763 , X51970 , Z35717 ,E00010 , X70185 , Z72478 , L13994 , y S50225 ) (datos no mostrados), se
observ que un residuo Leu en la posicin 213 era extremadamente inusual, ya que slo uno de ellos exhiben tal sustitucin. Por otra parte, la
observacin de un residuo Leu en la posicin 213 ha sido reportado en 1 de 37 (ADW2)individuos no vacunados infectados con VHB, aunque se
observ en 1 ayw1 aislado ( 16 ). Esta sustitucin intrigante predominante (como se observa en 5 de 6 clones del genotipo del VHB Un aislado
aqu reportado) podra sugerir un posible papel dentro del eptopo ayudador T evadir CD4
+
(eptopo VHB) especficos de las clulas. Sin
embargo, se sabe segn se informa de que los aminocidos situados en el extremo de un eptopo MHC-II dada tienen poco efecto, si lo hay, en
la especificidad de unin del pptido. Del mismo modo, dichos residuos no estn implicados en el reconocimiento del TCR.Alternativamente, la
existencia de una zona bastante extendida humoral inmune reactiva aguas abajo de la MHR que incluye residuo 213 (como se muestra
recientemente para los residuos 178 a 186) ( 30 ) o una influencia crucial eventual de dicha sustitucin I213L sobre la estructura
conformacional de la protena S debe investigarse ms a fondo. En cualquier caso, este y / o los S restantes cambios en los genes podra afectar
a la protena S unirse a anticuerpos anti-HBs, lo que podra proporcionar una explicacin putativa para la circulacin simultnea libres tanto
de HBsAg y anti-HBs. Dado que la estructura tridimensional de la protena de superficie del VHB es an sin resolver ( 3 ), la prediccin de los
efectos conformacionales, bioqumicos, y funcionales como consecuencia de estas sustituciones de aminocidos es meramente
especulativo. Sin embargo, los experimentos que implican mutagnesis dirigida al sitio y posterior anlisis antignico de todos los cambios de
aminocidos en el presente documento son reportados en curso.
Teniendo en cuenta la estructura de superposicin de los genes S y P de VHB (Fig. (Fig. 1),1 ), las sustituciones de aminocidos en el gen S
puede o no puede dar cuenta de las sustituciones de aminocidos en el gen P y viceversa . En este estudio, el anlisis del fragmento de la
superposicin de la polimerasa del VHB mostr varios cambios de aminocidos. Una de las mutaciones observadas (codn 489) dio lugar a la
terminacin prematura de la protena Pol (tabla (Tabla 1).1 ). Se supone que, dado que ciertas mutaciones en el gen P pueden perjudicar la
replicacin del virus en un grado diferente, con una poblacin menor de genomas intactos debe estar presente para ayudar a la formacin de
partculas virales por complementacin ( 38 ).
Como era de esperar para los pacientes no tratados con lamivudina, el sitio activo de la enzima RT exhibi la secuencia de aminocidos de tipo
salvaje (YMDD) (fig. (Fig. 1),1 ), donde Met se sustituye por lo general ya sea Val o Ile en los aislados resistentes a lamivudina.
Adems, se sugiere que la circulacin de algunos de los eptopos de HBV mutantes observados podra representar un potencial de riesgo de la
poblacin, ya que ni las vacunas de la hepatitis B actual ni inmunoglobulina de hepatitis B previene eficazmente la enfermedad heptica
asociada con algunos de ellos. Por otra parte, algunas de las variantes de antgeno HBs registrados pueden influir en la precisin de los
resultados obtenidos con las pruebas de diagnstico que se utilizan actualmente, segn ha informado con mutantes estudiados anteriormente
( 9 , 12 , 13 , 19 , 20 , 30 , 37 ), ya que algunos de ellos pueden resultar indetectable, aunque otros pueden no dar lugar a una prdida completa
de la antigenicidad ( 17 ).
En resumen, este estudio pone de relieve la deteccin simultnea inusual de ambos eptopos de HBV mutadas humorales y celulares durante el
curso natural de una infeccin crnica por VHB a pesar de la presencia de anticuerpos anti-HBs. La sustitucin extremadamente raro C107R
(revisado en las referencias 32 y 37 ) y la sustitucin inusual I213L (solo y en combinacin con los intercambios de este documento reportado)
merecen estudiarse ms a fondo en el futuro los estudios in vitro de las interacciones de anticuerpos HBsAg anti-HBs, ya que pueden ser
inmunognico, aunque con una especificidad modificada ( 42 ).
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AGRADECIMIENTOS
Estamos en deuda con AM Andreetta, J. Trinks, y Mara de los ngeles Oubia por su excelente asistencia tcnica. Estamos verdaderamente
agradecidos a Mara Victoria Illas para mejorar la legibilidad.
Este estudio fue apoyado en parte por las siguientes subvenciones: BID 1201/OC-AR-PICT 10,871 de la Agencia Nacional de Promocin
Cientfica y Tecnolgica (ANPCyT), 842 y PIP PIP 6.065 del Consejo Superior de Investigaciones Cientficas (CONICET) y UBACYT M057 de la
Universidad de Buenos Aires.
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