Procesamiento de los frotis de

Papanicolaou en el Laboratorio de
Citopatologa

Carlos Zamorano
1
& Julieta Seplveda
1


1
Licenciado en Tecnologa Mdica, U. de Concepcin, Concepcin, Chile


Introduccin
La deteccin del cncer
cervicouterino en etapas tempranas es
fundamental para evitar complicaciones
posteriores o incluso la muerte por esa
patologa. Por esto es que se ha
implementado en Chile el programa de
pesquisa de cncer de cuello uterino, el
cual, mediante la tcnica de
Papanicolaou (PAP) realiza un
screening citolgico en la poblacin
femenina en busca de la deteccin de
lesiones precursoras al cncer.
En el Laboratorio de
Citopatologa es donde se realiza todo el
procesamiento del frotis de
Papanicolaou (PAP), desde su recepcin
hasta el diagnstico pasando por una
serie de etapas de identificacin de la
muestra, ingreso al sistema
computacional, tincin y observacin al
microscopio de la citologa para
detectar estructuras y cambios celulares
que orienten al diagnstico.
En este artculo se abordara, de
forma general, como se realiza el
procesamiento de los frotis de PAP en
el Laboratorio de Citopatologa para
obtener el diagnstico citolgico.

Descripcin del laboratorio y su
funcionamiento
El Laboratorio de Citopatologa
puede estar ubicado dentro de un
complejo Hospitalario, dentro del
Servicio de Anatoma Patolgica de un
Hospital o en alguna consulta privada.
Por lo general, se encuentra dividido en
2 secciones o etapas: (1) recepcin,
identificacin y tincin de muestras y
(2) microscopa.
El proceso comienza en la etapa
de recepcin, identificacin y tincin
de muestras donde la secretara recibe
las muestras, realiza el ingreso de las
fichas de las pacientes a un sistema
computacional (ej. Cito-Expert, AniTa),
le asigna un nmero o folio y se indica
la existencia de antecedentes previos
cuando estos existan. Luego, las
lminas son debidamente rotuladas por
el Tcnico Paramdico, o por alumnos
en prctica. Los frotis de las pacientes
provienen del mismo Hospital, de
Consultorios y/o de otros centros de
Salud y se obtienen extrayendo clulas
del cuello uterino mediante la tcnica de
Papanicolaou, por Mdicos
especializados en Ginecologa u
Obstetras.
Es fundamental llevar un
registro diario de la cantidad de
exmenes recibidos y organizar las
solicitudes agrupndolas por lugar de
proveniencia, cdigo y fecha de ingreso.
Esto ser de utilidad para identificar los
casos que presenten algn problema, ya
sea, de rotulacin, prdida de muestras,
lminas en mal estado (quebradas), etc.
Una vez identificadas las
lminas o portaobjetos el Tecnlogo
Mdico de la mencin de
Morfofisiopatologa y Citodiagnstico
realiza el proceso de tincin de
Papanicolaou, ya sea, de forma
automatizada o manual.
Contacto: carlzamorano@udec.cl

Posteriormente el Citotecnlogo
realiza el screening citolgico, y en
conjunto con el Mdico especializado
en Patologa o Citopatlogo, se
determina el diagnstico para
posteriormente ingresarlos en el sistema
computacional. Finalmente se entregan
los informes de diagnsticos a su
consultorio u hospital respectivo para
informar al Mdico y paciente sobre la
situacin.
De esta forma se lleva a cabo el
funcionamiento ptimo del Laboratorio
de Citopatologa permitiendo el
diagnstico oportuno, tanto de los casos
negativos como positivos, y la
derivacin de estos ltimos a la Unidad
de Patologa Cervical.

Proceso de recepcin e identificacin
de muestras
El proceso de recepcin de
muestras es el primer paso dentro de la
cadena y comienza al recibir las
muestras de exmenes PAP de los
distintos consultorios y/o hospitales de
la regin y/o comuna. Estos exmenes
son entregados al personal encargado
del transporte de biopsias y citologas y
una vez recibidos, por la secretaria en el
Laboratorio de Citopatologa, estos se
ingresan al sistema computacional
registrando los datos que se requieran
de la paciente.
A continuacin se toman los
exmenes, se revisa que la cantidad
entregada coincida con lo recibido y se
identifica la unidad muestra-solicitud
revisando que cada solicitud traiga la
muestra rotulada de forma clara y
legible y que los portaobjetos vengan
adjuntos a la ficha que le corresponde.
Luego se procede a foliar las solicitudes
de examen con un nmero nico para
que ingresen al sistema de
almacenamiento de datos.
Luego de que las muestras
fueron recibidas e identificadas se les
aplica la tincin de PAP y las fichas son
ingresadas en el programa
computacional registrando los datos
completos de las pacientes. Finalmente
una vez que los exmenes han sido
analizados por microscopa se ingresa el
diagnstico de cada paciente en el
programa computacional, se imprime el
informe para ser entregado al servicio
correspondiente y se registra la entrega
en un libro de salida de informes.

Proceso de Tincin y montaje de
frotis de Papanicolaou
El proceso de tincin se puede
dividir en 4 etapas principales:
1) Fijacin
2) Coloracin de ncleos
3) Coloracin de citoplasmas
4) Aclaramiento
La fijacin se realiza al
momento de la toma de muestra del
Papanicolaou aplicndole Alcohol por
Spray (CitoSpray) evitando una fijacin
inadecuada por exceso o falta de esta.
Adems, es fundamental que el tiempo
entre la toma de muestra y fijacin sea
el mnimo posible (menos de 5
segundos).
La coloracin nuclear se realiza
mediante la aplicacin de Hematoxilina
de Harris, la cual, es un colorante
alcohlico basfilo.
La tincin citoplasmtica se
realiza mediante colorantes alcohlicos
los cuales tien de forma diferencial
cada tipo celular de la muestra debido a
la existencia de una diferencia en la
afinidad electroesttica por las protenas
que tiene cada colorante. Adems, la
diferencia en los tamaos moleculares
de los colorantes determina la tincin
diferencial de los citoplasmas segn el
grado de diferenciacin celular. El
Orange G, tie citoplasmas de clulas
maduras bien diferenciadas con
hiperqueratosis las que poseen
queratinas de alto peso molecular
generando una coloracin orangeoflica.
El colorante EA-50 es una mezcla de
colorantes que tien el citoplasma y est
compuesto por la Eosina, Verde luz y
Contacto: carlzamorano@udec.cl

Pardo Bismarck. La eosina posee mayor
afinidad electroesttica desplazando al
Orange G, por lo que, tie los
citoplasmas de todas las clulas pero
finalmente son las superficiales e
intermedias las que poseen coloracin
eosinfila o acidfila. El verde luz tie
el citoplasma de las clulas menos
diferenciadas ya que poseen una matriz
permeable quedando finalmente las
clulas basales y parabasales teidas de
azul (basfilas o cianfilas). El Pardo
Bismarck tiene afinidad por la tincin
de la mucina, por lo que, es el
citoplasma de las clulas endocervicales
las que se tien con este colorante.
El aclaramiento es el paso final
de la tincin donde se produce la
transparencia celular, para lo cual, se
utiliza xilol como solucin aclaradora.
Finalmente las muestras se
montan por medio de la unin del
portaobjeto y el cubreobjeto con una
resina, la cual, es un medio de montaje
soluble en el agente aclarante y debe
tener un ndice refraccin que coincida
con ambos. De esta forma se obtiene
una muestra cubierta y protegida contra
el arrugamiento, secado del material
celular y oxidacin de la muestra. Con
esto se logra una imagen lo ms
transparente posible permitiendo la
observacin en el microscopio.
El protocolo de tincin tiene
variaciones en los tiempos,
concentraciones y volmenes de los
reactivos segn el Laboratorio donde se
aplique pero se basa en los fundamentos
explicados anteriormente. En la prctica
por lo general se usan los siguientes
pasos:
1) Lavado en agua corriente:
utilizado para hidratar y limpiar
las muestras, y darle cierto
carcter acuoso. Es importante
estilar bien las muestras para
evitar la dilucin y prdida de
capacidad de tincin del
colorante utilizado en el paso
siguiente.
2) Hematoxilina de Harris:
utilizado para realizar la tincin
nuclear de las clulas del frotis.
3) Lavado en agua corriente:
utilizado para eliminar los
excesos de colorante que queden
en las muestras. Es importante
estilar bien las muestras para
evitar diluir y, por lo tanto,
disminuir la concentracin del
reactivo del paso siguiente.
4) Agua cida o Alcohol cido:
utilizado para realizar una
diferenciacin de la coloracin
nuclear por la Hematoxilina,
proceso llamado Coloracin
regresiva. Es importante que las
inmersiones sean rpidas para
evitar una disminucin excesiva
de la tincin nuclear.
5) Alcohol 95%: utilizado para
darle carcter alcohlico a las
muestras para que reaccionen
con el colorante del siguiente
paso. Es importante estilar bien
las muestras para evitar la
dilucin de los Alcoholes y la
prdida de capacidad de tincin
del colorante utilizado en el paso
siguiente.
6) Orange G: colorante alcohlico
que tie el citoplasma de color
anaranjado, el cual tiene
afinidad electroesttica con las
protenas, de todas las clulas en
una primera instancia.
Finalmente son las clulas
escamosas superficiales
queratinizadas las que obtienen
una tincin orangeoflica.
7) Alcohol 95%: utilizado para
eliminar el exceso de colorante
de las muestras. Es importante
estilar bien las muestras para
evitar la dilucin de los
Alcoholes y la prdida de
capacidad de tincin del
colorante utilizado en el paso
siguiente.
Contacto: carlzamorano@udec.cl

8) EA-50: EA-50 es una mezcla de
colorantes con afinidad por los
citoplasmas celulares
compuestos por la Eosina que
tie clulas superficiales e
intermedias, el Verde luz que
tie clulas basales y parabasales
y el Pardo Bismarck que tie
clulas endocervicales.
9) Alcoholes 95% y 100%: es
importante estilar bien las
muestras para evitar la dilucin
de los Alcoholes, alteracin del
Xilol y su prdida de capacidad
como mordiente. Las
inmersiones no deben ser por
mucho tiempo debido a que
disminuyen la coloracin de los
colorantes citoplasmticos.
10) Xilol: utilizado para el
aclaramiento de la muestra.
Debe cambiarse si aparece
teido con colorantes, y
tambin, si tiene agua la
solucin (aspecto lechosa
macroscpicamente) lo cual
alterara el proceso de tincin.
El paso final del proceso
consiste en el montaje del frotis de
Papanicolaou. Para esto se le agregan
un par de gotas de medio de montaje al
cubreobjetos de vidrio y se presiona
sobre el portaobjetos, o viceversa. Hay
que evitar la formacin de burbujas de
aire en la lmina que se producen por la
evaporacin muy rpida del solvente o
por la disposicin irregular de la
muestra. Adems, hay que tener
cuidado con el espesamiento del medio
de montaje producto de la evaporacin
del solvente lo que dificulta su
aplicacin. Tambin es importante
evitar que los frotis se sequen antes de
ser montados y cubiertos con resina
porque esto produce una coloracin caf
en el ncleo y/o citoplasma dificultando
la posterior observacin al microscopio.
Es fundamental realizar una
mantencin de la batera de tincin
filtrando la Hematoxilina todos los das
y cambindola, por lo menos una vez al
mes. Tambin se debe filtrar
diariamente la ltima cubeta de xilol
para retirar material celular que se haya
desprendido o en el caso que sea
necesario reemplazarlo por reactivo
nuevo. Igual de importante es cambiar
los colorantes Orange G y EA-50, por lo
menos, cada 20 das ya que pierden su
poder de tincin progresivamente
despus de este periodo. Hay que
descartar los Alcoholes de enjuague
cuando ya se encuentren sobresaturados
de colorante, por lo menos, el primer
da de cada semana y, adems, cambiar
la solucin de HCl 0.5% (agua cida),
por lo menos, cada 15 das.


El rol del Citotecnlogo en el
diagnstico
Una vez procesada la muestra en
el rea u oficina de microscopa el
Tecnlogo Mdico especializado en
Citologa (Citotecnlogo), realiza el
screening citolgico, propiamente tal,
mediante la observacin clula por
clula del frotis identificando
variaciones en la morfologa celular,
presencia o ausencia de componentes
inflamatorios, microoganismos, y
cualquier caracterstica que permita
asignar un diagnstico ya sea de
lesiones precursoras, neoplasias,
inflamacin, calidad de muestra, entre
otros. El informe del screening por lo
general se entrega en una nomenclatura
diagnostica que va de la A-Z donde
cada letra corresponde a ciertas
caractersticas observadas en el frotis.
Finalmente el Patlogo determina y le
asigna un diagnstico final y en base a
eso se determina el posible tratamiento
en el caso que sea necesario.

Conclusiones
Es necesario que la muestra
circule por una serie de pasos a lo largo
del procesamiento en el Laboratorio de
Contacto: carlzamorano@udec.cl

Citopatologa para poder realizar el
diagnstico.
Es clave que el proceso se
realice de la forma ms rigurosa
posible, ya que, cualquier error en
alguno de los pasos podra generar una
confusin a lo largo del procedimiento
generando la prdida de la muestra y la
necesidad de volver a realizar el
examen. Adems, es fundamental que
cada persona realice con la mayor
eficiencia posible los roles que tienen
designados.
Cada da es importante realizar
una rutina para ingresar las solicitudes y
sus diagnsticos al programa
computacional para tener una base de
datos confiable y de fcil acceso.
El trabajo que se realiza en el
Laboratorio de Citopatologa es
indispensable dentro del programa de
pesquisa de cncer de cuello uterino y
es posible gracias al trabajo
multidisciplinario del equipo de salud
especializado.

Carlos Zamorano es el autor principal de este
artculo realizado con la colaboracin de Julieta
Seplveda. Para mayor informacin sobre el
tema contactar al correo ubicado al pie de
pgina.

www.morfocitologia.blogspot.com